Name: 제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 배우세요 산화 스트레스 정량 분석 방법을 Danio rerio 배아에서 활성산소종을 측정합니다. 공초점 현미경과 세포형광측정법을 활용하여 생체 내 산화 스트레스를 정성적·정량적으로 평가할 수 있습니다.

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Massimo Santoro 연구실의 지원은 HFSP, Marie Curie Action, Telethon 및 AIRC에서 제공합니다. 원고를 비판적으로 읽어준 다프네 게이스(Dafne Gays)와 에밀리아노 파니에리(Emiliano Panieri)에게 감사한다.

인스 트루먼 트와 일 솔루션 1. 준비 <ol><li> 물고기 물 솔루션을 준비합니다. 증류수 50ml에 바다 염 인스턴트 오션 &#39;2g을 용해시켜 스톡 용액을 만든다. 물고기 물 (60 ㎍ / ㎖의 바다 소금 최종 농도)를 사용할 준비가 준비하는 1 L의 증류수에 주식 물고기 물 1.5 ML을 추가합니다. 사용하기 전에 물고기의 물을 사용할 준비를 압력솥. 이 용액을 제브라 피쉬 배아 매체로서 사용된다. </li><li> 배아 설치에 대한 메틸 셀룰로오스를 준비합니다. 멸균 물고기 물 50 ㎖에 메틸 1.5 g을 녹여. 저어 접시에 자석을 사용하여 용해를 촉진한다. 분말의 완전 용해 몇 시간이 필요할 수 있습니다. 작은 튜브에 선명도와 나누어지는에 대한 솔루션을 확인합니다. 개월 -20 ° C에서 보관 및 사용에 분주을 해동. 사용하기 전에 5 분 950 XG에 메틸 셀룰로오스를 원심 분리기. 분취 량의 동결 - 해동 사이클을 피하십시오. </li><li> tricaine / 에틸 3 - 아미노 벤조 에이트 (M)의 50 ㎖를 준비100 ml의 물에 tricaine 200mg을 용해 및 트리스 - 염산 1 M (pH가 15)를 사용하여 7.0의 pH를 조정 순서 ethanesulphonate 염 (원액). 더 이상 30 일 이상 4 ° C에서 콘텐츠를 저장합니다. 주의 : tricaine는 독성이다. 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다. </li><li> 제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스를 유도 <ol><li> 일반적인 산화 스트레스 유도를위한 산화제 용액을 제조 : H 2 O 2 원액 (과산화수소, 100 ㎜)에 추가하여 산화성 용액 50 ㎖를 확인 물고기의 물을. 2 ㎜, 100 μM 사이의 최종 농도의 H 2 O 2를 사용합니다. 곧 사용하기 전에이 솔루션을 준비합니다. 산화제 용액 전체 마운트 ROS 검출 및 단일 셀 ROS 검출 방법을 모두 적용 할 수있다. 이 솔루션을 저장하지 마십시오. 주의 : H 2 O 2는 위험 및 흡입 유해 삼키면. 가연성 물질과 접촉하면 화재를 일으킬 수 있습니다. 흄 후드를 처리하고 적절한 그럴를 착용ONAL 보호 장비. </li><li> 미토콘드리아 유래 산화 스트레스 유도위한 산화제 용액을 준비한다 : 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 중에서 2 ㎖에 로테 논 3.9 밀리그램을 용해한 산화제 스톡 용액 (5 mm)를 확인. 어두운 용액을 실온에서 보관. <ol><li> 솔루션을 사용하기 준비하기 위해 물고기의 물 10 ㎖에 로테 논 원액을 녹인다. 5-50 μM 사이의 농도에서 로테 논을 사용합니다. 100 μM보다 더 높은 농도에서 로테 논을 사용하지 마십시오. 적절한 농도에서,이 산화제 용액 전체 마운트 ROS 검출 및 단일 셀 ROS 검출 방법을 모두 적용 할 수있다. 주의 : 로테 논은 독성 및 위험합니다. 적절한 예방 조치 문구에 따라 처리합니다. </li></ol></li><li> 유전자에 의해 산화 스트레스를 유도 노크 다운 : 노크 다운 nrf2a 유전자 발현을 제브라 피쉬 배아의 모르 폴리 노의 미세 주입에 의해 이전에 TIMME-Laragy A. 등 2012 년 (38)에 의해보고.. </li><li> OXID를 유도조직 손상 후 스트레스는 ative :. 이전 Niethammer 등 2009 년 (39)에 의해 설명 된대로 72 HPF에서 제브라 피쉬 배아의 꼬리 지느러미에 상처 마진을 생성합니다. </li></ol></li><li> 단일 셀 ROS-검출 방법에 대한 ROS 감지 솔루션의 5 ML을 준비 <ol><li> 작업 솔루션 (: 2.5-10 μM 농도 범위)를 준비하기 위해 HBSS (행크의 균형 소금 솔루션)에서 일반 ROS에 민감한 분자 프로브를 용해 : 일반 ROS의 탐지를위한 솔루션을 제공합니다. 이 솔루션은 바로 사용하기 전에 준비를해야합니다. </li><li> 미토콘드리아에 의해 유도 된 특정 감지 ROS의 해결 방법 : 사용 직전에, DMSO는 5 mM의 원액을 만들고있는 미토콘드리아 ROS 민감한 프로브를 녹입니다. 작동 용액 (: 2.5-10 μM 농도 범위)을 제조하기 위해 HBSS에 원액을 용해. 참고 : ROS 탐지 작업 솔루션의 빛과 산소에 노출과 각각의 원액을 피하십시오. 사용하여 빛으로부터 튜브를 보호알루미늄 호일. 저장 또는 HBSS에 용해 재사용 프로브하지 마십시오. 한 달 동안 -20 ° C에서 주식 솔루션을 저장합니다. 주의 : 적절한 지침에 따라 흄 후드 분자 프로브 및 DMSO를 처리합니다. </li></ol></li><li> 전체 마운트 ROS-검출 방법에 대한 ROS 검출 용액 5 ㎖를 준비 작업 솔루션 (: 2.5-5 μM 농도 범위)를 준비하기 위해 HBSS에 (DMSO에서 안정화) 일반 ROS 민감한 프로브 원액을 녹인다. 빛과 산소에 노출을 피하십시오. 빛으로부터 튜브를 보호합니다. 사용하기 전에이 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션을 저장하거나 다시 사용하지 마십시오. 주의 : 적절한 지침에 따라 흄 후드 분자 프로브를 처리합니다. </li><li> PBS 1X 15 ㎖에 소 태아 혈청 10 ㎖를 추가하여 정지 용액 25 ㎖를 확인합니다. 멸균 솔루션을 유지합니다. 4 ° C에서이 솔루션을 저장 ROS 검출 방법 -이 솔루션은 하나의 세포가 필요합니다. </li><li> 28 &amp;에 제브라 피쉬 공기 배양기를 설정# 176; C. </li><li> 단일 세포 ROS-검출 방법에 대해 4 ° C에서 원심 분리기를 설정합니다. </li></ol> 2. 성인 물고기의 결합 및 제브라 피쉬 배아의 선택 <ol><li> 셋업 성인 zebrafish의 쌍은 표준 프로토콜 (40)에 따라 교차합니다. 특정 실험의 요구에 따라 해당 유전자 변형 라인을 선택합니다. </li><li> 계란을 수집하고 물 물고기 / 배아 매체와 90 mm 접시에 배치합니다. 태아가 개발하고 원하는 발달 단계에 성장할 때까지 28 ° C에서 알을 유지 (예를 들어, 48 HPF, 72 HPF, HPF : 시간 게시물 수정). </li><li> 배아를 개발하기위한 화면입니다. 모든 미 수정 알이나 낙후 된 배아를 제외합니다. </li><li> 50 ㎖ 물고기 물에 tricaine (원액) 1 ㎖를 추가하여 태아를 마취. </li><li> 실체 현미경의 Tg 형광 배아를 선택합니다. </li></ol> 산화제 에이전트와 태아의 3. 치료 <ol><li> 48 시간 사이에 최소 30 배아를 사용PF (72)가 다른 조건 당 HPF. tricaine을 제거하기 위해 신선한 생선의 물로 2 회 배아를 씻으십시오. </li><li> 세 가지 요리에 형광 배아를 분할합니다. 더 이상 30 이상의 태아 / 접시를 넣어. </li><li> 세척 용액을 제거하고, 산화제 용액 10 ㎖ 또는 제어 솔루션으로 물고기의 물 10 ㎖를 추가합니다. </li><li> 28 ℃에서 1 시간 10 분 동안 태아를 품어 잠복기는 특정 조직에 유도되는 산화 스트레스의 수준에 따라 달라집니다. 산화 스트레스에 의해 영향을받는 세포가 점진적으로 세포의 죽음을 받다 짧은 기간은 최고입니다. </li><li> 소용돌이 치는 HBSS 및 세척 배아를 포함하는 새 접시에 배아를 전송. 28 ° C에서 사전 따뜻한 HBSS </li></ol> 4. 전체 마운트 ROS 감지 방법 <ol><li> 산화 처리 후 배아를 수집하고 작은 관에 10 개 이상 배아를 넣어. HBSS에 가능한 한 많이 씻어. 알루미늄 호일을 사용하여 빛을에서 튜브를 보호합니다. </li><li> 에 대한 ROS 감지 솔루션 1 ML을 추가합니다각 관. </li><li> 빛의 노출을 피하기 위해 28 ° C에서 15 분 동안 어둠 속에서 배아를 품어. </li><li> 배양 시간 동안 완전히 배아 분석을 위해 유리 슬라이드를 준비한다. &quot;우울증&quot;유리 슬라이드에 메틸 셀룰로오스의 300 μl를 넣고 피펫 팁으로 유리 표면에 확산. 메틸 셀룰로오스를 해제하는 동안 거품을 피하십시오. </li><li> 배양 시간의 끝에서, 즉 ROS 검출 용액을 제거하고 HBSS 2 ㎖로 두 번 세척 하였다. 튜브를 여러 번 반전 배아를 씻으십시오. 피펫 또는 소용돌이하지 마십시오. </li><li> 최대 유리 파스퇴르 피펫으로 기음 배아. 피펫의 개통 근처 부드럽게 위치 배아는 메틸로를 꺼냅니다. 좋은 나일론 줄을 적절하게 배아를 동쪽을 향하게. </li><li> 처리 된 배아와 제어 배아의 형광을 비교. 모든 배아이를 이용한 영상화되도록 대안 적으로, 형광 실체 현미경 또는 공 초점 현미경의 파라미터를 정돈영상 설정. </li></ol> 5. 하나의 세포 ROS 감지 방법 <ol><li> 3.5 단계에서 시작합니다. 각 조건에 대해 적어도 35 배아를 가지고 있는지 확인합니다. </li><li> 새 접시에 배아를 전송합니다. 물고기 물에게 가능한 한 많이 제거합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 1X 10 ㎖ 및 프로테아제 억제제 칵테일의 400 μl를 추가합니다. 수동 집게와 배아를 d​​echorionate 및 미세 바늘 노른자 자루를 제거합니다. 참고 : 노른자의 자루를 제거하면 다음 FACS 분석을위한 깨끗한 샘플을 보장합니다. 이 단계는 FACS 악기에있어서 피할 수있다. </li><li> 전송 드 노른자위 24 웰 멀티 웰 플레이트에 배아 (15 배아 / 웰)과 모든 물고기의 물을 제거합니다. </li><li> HBSS 300 μL, 30 μL의 콜라게나 제 P, 각 웰에 50 ㎕의 트립신-EDTA를 추가합니다. </li><li> 꽉 피펫 팁 (1,000 μL)으로 부드럽게 피펫 팅에 의해 아래로 배아를 균질화. </li><li> 20 분 동안 28 ° C에서 품어 5 분마다 피펫으로 시료를 균질화. </li><li> 조직 DISR 확인복합 현미경에서 균질의 분취 량을 관찰하여 uption. 피펫 팅하여 단일 세포 현탁액을 용이하게한다. 30 분 동안 배아를 배양하지 마십시오. </li><li> 정지 솔루션 200 μl를 추가하여 반응을 중지합니다. 부드럽게 피펫으로 섞는다. </li><li> 단단한 바닥에 미리 냉각 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지하고 빛의 노출을 피하십시오. </li><li> 4 ° C에서 250 XG에 5 분 동안 원심 분리 </li><li> 부드럽게 피펫 팅에 의해 얼음 차가운 HBSS와 상부 상하고 다시 중단 세포를 제거합니다. </li><li> 세포를 계산하고 당신의 모든 샘플에 동일한 수의 셀이 있는지 확인하십시오. 이하 2 × 10 6 세포를 사용하지 마십시오. </li><li> 4 ° C에서 250 XG에서 5 분 원심 분리기 세포 </li><li> 상층 액을 제거하고 활성 산소에 민감한 프로브를 포함하는 얼음 냉각 HBSS 1 ㎖로 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> 어둠 속에서 3 분간 실온에서 튜브를 배양한다. 산화 스트레스의 레벨에 따라 배양 시간이 다를 t하도록프로브의 고 감도. </li><li> FACS 튜브에 세포를 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지하고 FACS 분석하기 전에 빛의 노출을 피하십시오. </li><li> 형광 활성 세포 분류기 (FACS)으로 세포를 정렬합니다. Tg는 조직의 형광 (예를 들면, GFP) 및 ROS 감지 (예를 들어, 특정 미토콘드리아 ROS 민감한 프로브, 일반 ROS 민감한 프로브)에 사용되는 분자 프로브의 여기 / 발광 스펙트럼에 따라 설정 파장. </li><li> 각 조건을 위해, 동일한 FACS 설정을 적용하여 동일한 실험 세션 내에서 모든 샘플을 측정한다. 다른 생물은 복제의 수단으로 형광 세포의 비율을 계산합니다. 각 조건에 대해 적어도 두 개의 반복을 분석합니다. </li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

중요한 단계 본원에 기재된 제브라 피쉬 배아 산화 스트레스 탐지하는 절차는 두 가지 다른 방법을 포함한다. 단일 셀 ROS 검출 방법 (도 1)보다 구체적인 정량적 측정을 허용하는 동안 전체 마운트 ROS 검출 방법은 주로 ROS 검출을위한 정성 분석이다. 두 가지 방법은 제브라 피쉬 배아에 생체 활성 산소 검출을 평가하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다. 그러나, 그들은 모두 몇 가지 중요한 단계를 제시한다. 방법 I에 관련된 중요한 단계 전체 마운트 ROS-검출을위한 첫 번째 방법은 쉽게 생활 배아 (그림 2)의 모든 조직에 산화 스트레스를 감지하는 큰 장점이 있습니다. 배아 조직에 프로브 1) 투과성 2) 프로브 독성 및 3) 번째 : 그러나 고려되어야하고 상기 분석의 결과에 영향을 줄 수있는 중요한 세...

산화 스트레스는 특별히 불평형 세포 산화 환원 상태로부터 발생 조건으로 정의된다. 일상적으로 세포 내부에서 발생하는 복잡한 산화 환원 반응은 세포의 산화 환원 상태를 결정합니다. 산화 환원 반응 감소와 분자 (즉, 산화 환원 반응)의 산화를 생산하는 생체 분자의 원자 사이의 전자의 이동에 구성되어있는 모든 화학 반응으로 구성되어 있습니다. 이러한 반응은 극단적 인 구조 불안정과 이웃 생체 분자와 교환 불균형 전자의 자발적인 활성화를 특징으로 전자 활성 종 (즉, 프로 산화 종)에 의해 촉매된다. 이러한 불규칙한 반응은 DNA 손상, 단백질의 카르 복 실화, 지질의 산화로 발생, 결국 세포의 죽음 1로 이어집니다. 산화 스트레스의 증가 수준은 노화와 다른 병적 인 상태 2의 진행과 관련이있다. 산화 스트레스가당뇨병과 심혈관 질환 3,4 혈관 변경에 대한 책임을 져야하는 것으로보고되었습니다. 또한 알츠하이머 병에서 신경 변성에 중요한 역할을하고 파킨슨 병 5. 또한, 산화 스트레스는 암 진행 및 전이성 이벤트 6,7 지배하는 중요한 인자로 입증되었다. 또한, 염증과 면역 반응이 유도 및 추가 지원의 산화 스트레스 8있다. 또는 질소 (RNS, 반응성 질소 종), 살아있는 세포에서 프로 산화 종은 산소 (활성 산소 종 ROS)에서 파생됩니다. (H 2 O 2), 및 과산화수소 - (O 2) ROS는 수퍼 옥사이드 음이온, (. OH) 히드 록실 라디칼을 포함한다. 기본 RNS는 아산화 질소 (NO.)입니다. 이차 반응 종의 일련 betwee 자발적인 상호 작용에 의해 발생 될 수있다N ROS와 RNS 또는 무료 금속은 9 이온. H 2 O 2가 철 2 + 하이드 록실 라디칼을 발생과 반응하면서, - 예를 들면, 수퍼 옥사이드 음이온 peroxynitrate (ONOO)을 형성하는 질소 산화물과 반응한다. ROS와 RNS 인해 여러 가지 생체 분자와 반응 할 수있는 능력으로, 생리적 인 산화 환원 상태 (10)의 유지 보수를 위해 위험한 위협으로 간주됩니다. 유지하기 위해 산화 환원 상태의 세포는 산화를 억제하는 분자와 효소를 해독하는 일련의를 갖추고 있습니다. . 11 - 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 (SOD)는, 카탈라제, 글루타티온 과산화 효소 및 Peroxiredoxins는 기본적으로 H 2 O 2, OH와 오노 등의 프로 산화 종의 세포 보호 기능을 제공하는 항산화 효소 - 아스날을 구성한다. 또한 비타민 C와 E, 폴리 페놀 및 보효소 Q10 (코큐텐)과 같은 항산화 분자는 ROS와 그 위험한 데를 해소하기 위해 매우 중요합니다12, 13 rivatives. 그러나, ROS 및 RNS 또는 항산화 제 시스템 장애의 과잉 생산은 산화 적 스트레스 (14)를 향해 세포 산화 환원 상태를 시프트. 부정적인 의미 외에, ROS는 서로 다른 기원의 세포에서 다양한 생리 학적 역할을 할 수있다. 세포는 일반적으로 같은 숙주 방어와 상처 수리 15-17 정상적인 생물학적 이벤트를 중재하는 분자 신호로 ROS를 생산하고 있습니다. 반응 종은 일반적으로 신호 인자, 성장 인자, 칼슘 레벨 (18, 19)의 세포 내 변동에 대한 응답 등의 NOX (NADPH 산화 효소)와 XO (Xantine 산화 효소)와 같은 세포 내 효소에 의해 세포에서 생성된다. 이것은 ROS가 p53의 그러한 차별적 또는 ATM-키나아제, DNA 손상 반응 (20)의 마스터 레귤레이터 같은 세포 성분으로서 중요한 핵 인자의 활성을 조절 할 수 있다고보고되었다. 유사하게 ROS는 강력하게 일을 매개로 세포 신호 전달에 영향을 미치는전자의 산화 및 신호 전달 (21)의 중요 규제로 설립되는 단백질 티로신 포스파타제 (PTPS)의 불 활성화. 또한, 단백질 체학 기반 방법론은 RNS는 특정 단백질의 수정 및 분자 신호의 변경에 대한 책임이 있음을 보여줍니다. RNS는 S-nitrothiols (SNO)에이를 수정하고 염증 및자가 면역 질환 (22, 23) 등의 병적 상태와 수반하는 분자 경로를 트리거 시스테인 티올 그룹과 반응한다. 세포 배양 실험은 단지 부분적으로 생체 내에서 작용하는 요인 중 다수를 재현하기 때문에, 동물 모델 (24, 25)에 산화 환원 연구를 수행하기 위해 큰 관심이다. 이를 위해 제브라 피쉬는 산화 스트레스 역학 26 공부 적합한 척추 동물 모델로 간주되었다. 제브라 피쉬는 여러 가지 장점이 척추 데브 동안 세포 및 유전 이벤트를 연구하기 위해 부여하는 새 모델 시스템입니다elopment과 질병. 배아의 큰 클러스터는 실험의 요구에 매주 생성 및 사용할 수 있습니다. 또한 제브라 피쉬 배아의 특별한 광학 선명도뿐만 아니라 작은 크기는 전체 생물 27 단일 세포 이미징 및 동적 추적을 할 수 있습니다. 지난 10 년, 제브라 피쉬 돌연변이의 상당수는 암과 유전 질환 28 ~ 31으로 인간의 병적 인 조건을 모델로 생성 된. 가장 중요한 것은, 유전자 변형 라인의 다수는 유전과 생물학적 조작 (32)의 폭 넓은 기회를 제공 할 수 있도록 제작되었습니다. 예를 들어, 유전자 조직 특정 제브라 피쉬 라인은 정기적으로 생체 내 연구에 이용된다. 이 라인은 생체 내에서 단일 세포를 식별 할 수있는 능력뿐만 아니라, 그들이 포함 해부 구조를 제공 선택된 프로모터의 제어하에 형광 단백질을 발현. 여러 독성 연구는 이미 T를 사용했습니다그는 약물 발견 및 산화 스트레스 33-35의 분야에 대한 동물 모델 등이 척추의 적합성을 제안, 산화 환원 항상성에 화학 물질의 생체 내 효과를 평가하기 위해 제브라 피쉬. 약간의 형광 프로브는 제브라 피쉬의 유충 (36, 37)에 산화 스트레스를 모니터링하기 위해 테스트되었습니다 경우에도, 제브라 피쉬의 조직에서 산화 스트레스의 수준과 살아있는 세포를 감지하고 측정 할 수있는 확립 된 시험 법이 없습니다. 여기에서 우리는 제브라 피쉬 배아의 살아있는 세포에 산화 스트레스의 생체 정량화하기위한 절차를 설명합니다. 이미징 도구, FACS 정렬, 형광 프로브 및 프로 산화 조건은 모든 제브라 피쉬 배아 조직에서 검출 및 산화 종의 정량화에 대한 간단한 분석을 생성하기 위해 결합됩니다.

<table><tbody><tr><td>과산화수소 용액</td><td>SIGMA</td><td>516813</td><td>희석액을 보관하지 마십시오</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution 1x</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>메틸 셀룰로오스</td><td>SIGMA</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean 수족관 바다 소금 혼합물</td><td>INSTANT OCEAN</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>SIGMA</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent</td><td>INVITROGEN</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondria 특정 ROS-sensitive probe: MitoSOX&nbsp;</td><td>INVITROGEN</td><td>M36008</td>은 <td>13 &mu; DMSO</td></tr><tr><td>Hydroethidine</td><td>INVITROGEN</td><td>D23107</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td>의 l은 <td>DMSO에서 5mM 재고 용액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VAS2870; 3-벤질-7-(2-벤조옥사졸릴)티오-1,2,3-트리아졸로(4,5-d)피리미딘</td><td>EnzoLifeScience</td><td>BML-EI395</td><td>는 DMSO에 분말을 용해시킵니다; 물고기 물에 희석석</td></tr><tr><td>Propidium 요오드&nbsp;</td><td>분자 프로브 (Life Technologies)</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)&nbsp;</td><td>분자 프로브 (Life Technologies)</td><td>A1310</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2a Morpholino</td><td>GeneTools</td><td>5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'Ref</td><td>: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); 고바야시 et al.; 2002 (PMID:12167159)</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 P</td><td>ROCHE</td><td>11213857001</td><td>분말을 100mg/ml로 멸균 HBSS에 용해시킵니다. 부분 표본을 -20 &deg에 저장하십시오. C</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>완전한 프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>ROCHE</td><td></td><td>1ml의 물에 한 정제를 녹여라</td></tr><tr><td>0.5% 트립신-EDTA (10배), 페놀 레드 없음</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>사용 전에 1x 작업 용액을 준비하십시오</td></tr><tr><td>. 복합 현미경&nbsp;</td><td></td> 형광 조명이 있는 ZEISS <td></td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Nikon</td><td>AZ100</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>ZEISS</td><td>AxioCamMRm</td><td></td></tr><tr><td>형광 이미지 획득을 위한</td> 소프트웨어 <td>ZEISS</td><td>ZEN 2011</td><td></td></tr><tr><td>형광 활성화 세포 분류기</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브&nbsp;</td><td>BD</td><td>342065</td><td></td></tr><tr><td>멀티웰 플레이트&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>멸균, 비 처리 페트리 접시 90 mm</td><td>VWR</td><td>391-1915</td><td></td></tr><tr><td>컨 포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>Leica SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

반응성 산소 종 (ROS)의 높은 수준은 산화 적 스트레스 조건을 향한 세포의 산화 환원 상태의 변화를 유발할 수있다. 이 상황은 분자 (지질, DNA, 단백질)의 산화를 일으키는 원인이되고 세포 죽음에 이르게한다. 산화 스트레스도 영향 당뇨병, 망막 병증, 신경 변성, 암 등 여러 가지 병적 인 상태의 진행. 따라서, 단일 세포 수준에서뿐만 아니라 전체 유기체의 맥락에서뿐만 아니라, 산화 적 스트레스 조건을 조사 할 수있는 도구를 정의하는 것이 중요하다. 여기에서, 우리는 연구를 수행하고 생체 내 산화 스트레스를 측정 할 수있는 프로토콜을 제공하는 생체 시스템의 유용한 제브라 피쉬 배아를 고려합니다. &quot;나는) 산화 스트레스의 질적 측정을 위해&quot;전체 배아 ROS-검출 방법 &quot;및 II) : 형광 ROS 프로브 및 제브라 피쉬의 형질 전환 형광 라인을 활용, 우리는 생체 내에서 산화 스트레스를 측정하는 두 가지 방법을 개발산화 스트레스의 정량적 측정을위한 단일 셀 ROS 검출 방법 &quot;. 여기서, 우리는 산화제 에이전트 및 생리 학적 또는 유전 적 방법으로 조직의 산화 스트레스를 증가시켜 이러한 절차의 효과를 보여줍니다. 이 프로토콜은 앞으로 유전자 스크린에 대한 의무이며 이러한 신경 장애 및 암과 같은 산화 스트레스 관련 병리의 동물 모델에서 ROS의 주소 원인 - 결과 관계를하는 데 도움이됩니다.

여기에 기재된 방법을 적용하여, 우리는 쉽게 측정 할 수 있고, 제브라 피쉬 배아 조직에서 산화 스트레스 (ROS 및 레벨)을 검출한다. 성인 제브라 피쉬를 횡단 한 후, 달걀을 수집하고 72 시간 게시물 수정 (HPF)로 28 ° C에서 개발하기 위해 사용할 수 있습니다. 강한 친 산화제 시약 배아 1) 치료 또는 조직 상해 후에 2) 촉진 ROS 형성 : 산화 스트레스를 유도하기 위해, 우리는 두 가지 방법을 제안한다. 과산화수소 (H 2 O 2), 일반 휴대 ROS 형성 제로서, 그리고 로테 논, 특정 미토콘드리아 ROS 드라이버로 : 첫 번째 방법은 특정 필요에 따라 서로 다른 두 가지 시약을 사용. 로테 논은 규제 완화는 산화 스트레스 (41)의 원인이되는 등, 복잡한 I의 억제제이다. 두 번째 방법에서, 우리는 제브라 피쉬 배아의 꼬리 지느러미에 상처를 작...

여기에서 우리는 살아있는 제브라피시 배아의 산화 스트레스를 측정하는 프로토콜을 보고합니다. 이 절차를 통해 전체 배아 조직과 단일 세포 집단 모두에서 활성 산소 종(ROS)을 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 정성적 분석과 정량적 분석을 모두 수행합니다.

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

다음 실험의 전반적인 목표는 살아있는 제브라피쉬 배아의 산화적 스트레스를 정성적 및 정량적으로 측정하는 것입니다. 이는 준비된 배아에 산화 용액을 첨가하여 산화적 스트레스를 유도하거나, 배아의 꼬리 지느러미에 상처 경계를 형성함으로써 수행됩니다. 이후 배아는 단일 세포 방법 또는 홀마운트 방법을 통해 산화적 스트레스 검출 과정을 거치게 됩니다.다음으로, 준비물을 ROS 검출 프로브와 함께 배양합니다. 결과는 전체 마운트의 공초점 현미경 관찰 또는 단일 세포의 사이토플로로메트릭(cyto fluor metric) 분석을 통해 산화 스트레스의 양과 ROS 수준으로 나타낼 수 있습니다. 산화 스트레스 마커에 대한 immuno Fluor와 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 살아있는 생물체 내에서 ROS를 직접 검출하고 단일 조직 수준에서 정량화할 수 있다는 점입니다.이 방법은 병리학적 상태에서의 산화적 스트레스 조건 탐구와 같은 기초 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 숙련되지 않은 사용자의 경우, 가공되지 않은 민감한 분자 프로브가 예상치 못한 산성 원인이 되어 우발적인 조직 손상을 일으키는 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한, 높은 수준의 산화 스트레스는 세포 사멸을 초래하고, 너무 낮은 수준은 실습 및 실험에서 검출하기 어려울 수 있으므로 이러한 문제는 직접 수행할 때에만 나타날 것입니다. DMSO에 용해된 rot known을 사용하여 미토콘드리아에 산화적 스트레스를 유도하기 위한 용액을 준비할 때, rot known 스톡을 5~50 µM 농도로 제조해야 하며, rot known은 독성 및 위험성이 있으므로 절대 100 µM을 초과해서는 안 됩니다.표시된 주의 사항을 준수하십시오. hole Mount Ross 검출을 위한 프로브 용액은 조제 과정 동안 빛이나 산소에 노출되지 않아야 하며, 단일 세포 Ross 검출 방법을 위해 새로 조제해야 합니다. PBS에 포함된 FBS 정지 용액을 조제하여 4°C에서 보관해야 합니다.기타 준비 사항으로는 제브라피쉬 공기 배양기를 28 °C로 설정하고, 단일 세포법의 경우 원심분리기를 4 °C로 냉각하는 것이 포함됩니다. 제브라피쉬 교배, 배아 수집 및 마취를 모두 수행합니다. 표준 방법론을 사용하여 수정 후 48시간에서 72시간 사이의 대상 배아를 수집합니다.배아를 마취시킨 후 마취제를 두 번 세척하고, 단일 세포 원시 검출을 위해 배아를 디시당 30개 이하로 하여 3개의 디시에 나누어 담습니다. 조건당 최소 35개의 배아를 여러 디시에 걸쳐 수집합니다. 다음으로, 10 milliliters의 산화제 용액 또는 음성 대조군을 처리합니다.물 10 milliliters를 가한 후, 배아가 28 degrees Celsius에서 배양되는 동안 10~60분 동안 기다립니다. 또한 세척을 위해 HBSS를 28 degrees Celsius로 미리 데워둡니다. 배양이 끝나면 배아를 따뜻한 HBSS가 담긴 새 접시로 옮기고 가볍게 흔들어 섞어줍니다.그런 다음 전체 마운트(whole mount) 또는 단일 세포 ROS 검출을 진행합니다. 더 생리적인 옵션은 NI Tomer 등이 설명한 꼬리 지느러미 상처 유발 기술을 사용하여 조직 손상 후 스트레스를 유발하는 것입니다. 산화제 처리 후, 최대 10개의 배아 그룹을 소형 튜브로 옮깁니다.HBSS로 충분히 헹구고 호일로 감싸 빛으로부터 보호합니다. 다음으로, 각 튜브에 raw detection solution 1 mL를 넣고 28 °C에서 15분 동안 배양합니다. 대조군과 실험군을 모두 담을 유리 슬라이드를 준비합니다.오목 슬라이드를 300 µL의 메틸셀룰로스로 덮습니다. 메틸셀룰로스를 분주할 때 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 배아 배양 후, 튜브 안의 용액을 2 mL의 HBSS로 빠르게 교체하고 튜브를 여러 번 뒤집어 배아를 세척합니다.그런 다음 마이크로 피펫 팁으로 배아를 흡입한 후, 처리된 슬라이드 위에 조심스럽게 배출합니다. 미세 나일론 라인을 사용하여 배아의 방향을 잡고, 형광 현미경 또는 공초점 주사 현미경을 사용하여 분석을 진행합니다. 반드시 모든 배아를 동일한 설정 하에 분석하십시오.배아를 HBSS 세척액에서 새 디쉬로 옮기고, 용액을 가능한 한 많이 제거합니다. 이제 배아의 투명대를 수동으로 제거합니다. 이는 배아를 단일 세포로 해리시키기 위해 반드시 필요한 과정입니다.다음으로, 배아를 24-웰 플레이트로 옮겨 각 웰에 15개의 배아를 넣습니다. 각 조건당 최적의 결과를 위해 3개의 웰을 채웁니다. 그다음, 모든 용액을 제거하고 300 µL의 HBSS, 30 µL의 collagenase p 및 50 µL의 trypsin EDTA로 교체합니다.1 mL 피펫 팁을 사용하여 트리터(trier)로 배아를 균질화합니다. 모든 웰의 준비가 완료되면, 플레이트를 28 °C에서 최소 20분 동안 보관하며 5분마다 샘플을 트리트레이션(tritrate)하여 충분히 균질화되었는지 확인합니다. 또한, 조직 준비가 완료되었을 때 수집할 수 있도록 마이크로 원심분리 튜브를 얼음 위에 준비해 둡니다.20분이 되었을 때 샘플을 채취하여 조직이 단일 세포 현탁액으로 분해되었는지 현미경으로 확인합니다. 분해되지 않았다면 총 30분까지 배양을 계속합니다. 조직이 준비되면 200 µL의 정지 용액을 추가하여 반응을 중단시킵니다.1 mL 피펫 팁을 사용하여 이를 TRI와 혼합합니다. 다음으로, 각 웰의 내용물을 미리 냉각시킨 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 이 튜브들을 빛이 차단된 얼음 위에 보관합니다. 그런 다음, 샘플을 4 °C에서 250 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.그 다음 흡입법으로 상층액을 제거합니다. 얼음처럼 차가운 HBSS를 넣고 가볍게 트리톤 처리하여 세포 펠렛을 재부유시키고, 부유액 내 세포 수가 최소 200만 개인지 확인합니다. 다음으로, 세포를 1 mL의 raw sensitive probe 용액에 재부유시킵니다.실온의 암소에서 약 3분 동안 배양합니다. 이 배양 시간은 실험적으로 조정하십시오. 다음으로, 빛이 차단된 팩스 튜브(fax tubes)로 세포를 옮깁니다.형질전환 마커를 검출하기 위해 팩스 분석을 진행하십시오. 분석하는 동안 형광 및 Ross 프로브 형광을 확인하십시오. 배경 형광을 정규화하기 위해 항상 대조군 샘플과 비교한 배수 증가량으로 손실 수준을 계산하십시오.상처 부위의 과산화수소 축적을 조사하기 위해 모든 Mount Ross 검출법을 사용하였습니다. 산화제 처리 20분 후, 손상되지 않은 꼬리와 손상된 꼬리를 비교하였습니다. 두 조건 모두에서 비특이적 신호가 검출되었습니다.과산화수소 수준을 낮추기 위해 배아를 전처리하여 동일한 실험을 수행하였습니다. OX 억제제 VAs 28 70을 사용한 결과, 검출된 신호가 실제로 ROS 축적에 의존한다는 것이 밝혀졌습니다. 처리된 배아들에 대해서도 전체 마운트(whole mount) 검사를 실시하였습니다.고배율에서 해부학적 부위를 식별할 수 있었습니다. 팩스(fax)를 통한 Ross 양성 세포의 형광 계수를 통해 Ross가 생성되었음을 확인하였으며, 단일 세포 Ross 검출을 위해 분석을 수행하였습니다. 이 분석은 사멸 세포를 제외하고 진행되었습니다. 대조군.처리를 하지 않은 세포 또한 분석되었습니다. 이 결과들을 비교함으로써 Ross 축적의 정량화를 매우 쉽게 수행할 수 있었습니다. 이 분석법은 다양한 실험적 조작을 테스트하는 데 매우 탁월한 것으로 입증되었습니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 90분 이내에 완료할 수 있습니다. 분자 프로브를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로 주의 사항을 잊지 마십시오. 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑을 착용해야 합니다.

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높은 처리량<em&gt; 다니오 레 리오 (rerio)</em&gt; 에너지 지출 분석

기형에 노출되면 기형아 출산의 원인이 될 수 있습니다. 제브라 피쉬는 화학 물질의 기형 가능성을 결정하는 데 유용합니다. 우리는 노출의 서로 다른 시간에 또한 아질산염의 다양한 수준에 배아를 노출에 의해 제브라 피쉬의 유틸리티를 보여줍니다. 우리는 아질산염은 독성이 심한 발달 결함을 야기 할 수 있음을 보여준다.

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면역 형광을 사용하여 제브라피시 배아 심장에서 PM2.5-유도 된 DNA 손상을 감지합니다.

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배우세요 산화 스트레스 정량 분석 방법을 Danio rerio 배아에서 활성산소종을 측정합니다. 공초점 현미경과 세포형광측정법을 활용하여 생체 내 산화 스트레스를 정성적·정량적으로 평가할 수 있습니다.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

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