제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 살아있는 제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스를 정성적 및 정량적으로 측정하는 것입니다. 이는 산화 스트레스 유도를 위해 준비된 배아에 산화 용액을 첨가하거나 배아의 꼬리 지느러미에 상처 가장자리를 생성함으로써 달성됩니다. 그런 다음 배아는 단일 세포 방법 또는 전체 마운트 방법에 의해 산화 스트레스 감지를 위해 처리됩니다.

다음으로, 제제는 Ross 검출 프로브로 배양됩니다. 결과는 홀 마운트의 컨포칼 현미경 검사 또는 단일 세포의 사이토 형광 측정 분석을 기반으로 산화 스트레스의 양과 Ross 수준을 보여줄 수 있습니다. 산소 스트레스 마커를 위한 immuno Fluor와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 살아있는 유기체의 맥락에서 원시 검출과 단일 조직 수준에서 정량화가 가능하다는 것입니다.

이 방법은 병리학적 상태의 맥락에서 산화 스트레스 조건을 탐색하는 것과 같은 기초 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 처음 입원한 개인은 원시적으로 민감한 분자 프로브가 계획되지 않은 산성의 원인이 될 수 있기 때문에 우발적인 조직 손상으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 그리고 높은 수준의 산화 스트레스는 세포 사멸을 초래해야 하기 때문에 너무 적으면 연습과 실험으로 감지하기 어려울 수 있지만 이러한 문제는 DMSO로 알려진 부패로 구성된 미토콘드리아에 산화 스트레스를 유발하기 위한 용액을 준비할 때 5에서 50 마이크로몰 사이의 농도로 부패로 알려진 스톡으로 만들어야 하며 100 마이크로몰 이상의 부패로 알려진 부패는 독성 및 위험으로 알려져 있습니다.

표시된 주의 사항에 주의하십시오. 홀 마운트 로스 감지를 위한 프로브 용액은 준비하는 동안 빛이나 산소에 노출되어서는 안 되며 단일 세포 로스 감지 방법을 위해 새로 준비해야 합니다. PBS에서 FBS의 정지 용액은 준비해야 하며 섭씨 4도에서 유지해야 합니다.

다른 준비로는 제브라피시 공기 인큐베이터를 섭씨 28도로 설정하고 단일 세포 방법의 경우 원심분리기를 섭씨 4도로 냉각하는 것이 있습니다. 제브라피시 십자가, 배아 채취 및 마취가 모두 수행됩니다. 표준 방법론을 사용하여 수정 후 48시간에서 72시간 사이에 관심 배아를 수집합니다.

배아를 마취한 후 마취제를 두 번 씻어낸 다음 배아를 접시당 30개 이하의 접시에 넣어 단세포 원시 검출을 합니다. 여러 접시에서 조건별로 최소 35개의 배아를 수집합니다. 다음으로, 10ml의 산화제 용액을 바르거나 음성 대조군으로 바릅니다.

물 10ml를 바르고 배아가 섭씨 28도에서 부화하는 동안 10-60분 정도 기다립니다. 또한 세탁을 위해 HBSS를 섭씨 28도로 예열하십시오. 배양 후 배아를 따뜻한 HBSS의 새 접시에 옮기고 소용돌이칩니다.

그런 다음 전체 마운트 또는 단일 셀 Ross 감지를 진행합니다. 보다 생리학적인 옵션은 NI Tomer와 회사가 설명한 꼬리지느러미 상처 기법을 사용하여 조직 손상 후 스트레스를 생성하는 것입니다. 산화제 처리 후 최대 10개의 배아 그룹을 작은 튜브로 이식합니다.

HBSS로 심하게 헹구고 호일로 빛으로부터 보호하십시오. 다음으로, 각 튜브에 1ml의 원시 검출 용액을 추가하고 튜브가 배양하는 동안 섭씨 28도에서 15분 동안 튜브를 배양합니다. 대조 조건과 실험 조건을 모두 포함하는 유리 슬라이드를 준비합니다.

우울증 슬라이드를 300마이크로리터의 메틸셀룰로오스로 덮습니다. 메틸셀룰로오스를 배출할 때 거품을 만들지 마십시오. 배아 배양 후 튜브의 용액을 2ml의 HBSS로 빠르게 교체하고 튜브를 여러 번 뒤집어 배아를 세척합니다.

그런 다음 배아를 마이크로 피펫 끝으로 흡인하고 처리된 슬라이드로 부드럽게 배출합니다. 가는 나일론 선을 사용하여 배아의 방향을 정하고 분석을 위해 형광 또는 컨포칼 스캐닝 현미경을 사용하여 진행하십시오. 동일한 설정에서 모든 배아를 분석해야 합니다.

HBSS 세척의 배아를 새 접시로 옮기고 가능한 한 많은 용액을 제거합니다. 이제 배아를 수동으로 코팅합니다. 이것은 배아를 단일 세포로 해리하는 데 정말 필요합니다.

다음으로, 배아를 24웰 플레이트로 옮기고 각각 15개의 배아를 로드합니다. 각 조건에 대해 3개의 웰을 최적으로 채웁니다. 다음으로, 모든 용액을 제거하고 300 마이크로 리터의 HBSS, 30 마이크로 리터의 콜라겐 분해 효소 p 및 50 마이크로 리터의 트립신 EDTA로 교체하십시오.

1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 배아를 트리어로 균질화합니다. 모든 웰이 준비되면 5분마다 최소 20분 동안 플레이트를 섭씨 28도로 옮기고 샘플을 삼중처리하여 우수한 균질화를 보장합니다. 또한 얼음 위에 마이크로 퍼지 튜브를 올려 준비가 되었을 때 조직을 수집합니다.

20분에 샘플을 채취하여 현미경으로 조직이 단일 세포 현탁액으로 파괴되었는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 총 30분 동안 배양을 계속하십시오. 조직이 준비되면 추가로 200마이크로리터의 정지 용액으로 반응을 중단합니다.

1ml 피펫 팁을 사용하여 TRI와 혼합합니다. 다음으로, 각 웰의 내용물을 미리 냉각된 마이크로 퍼지 튜브로 옮기고 이 튜브를 얼음 위에 올려 빛을 피하십시오. 그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 250GS에서 샘플을 원심분리합니다.

그런 다음 흡인에 의해 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 HBSS에 부드러운 트라이로 재현탁하고 현탁액에 최소 200만 개의 세포가 있는지 확인합니다. 다음으로, 1밀리리터의 원시 민감 프로브 용액에 세포를 재현탁합니다.

실온과 어두운 곳에서 약 3분 동안 배양합니다. 이 배양 시간을 경험적으로 조정합니다. 그런 다음 셀을 빛으로부터 차폐된 팩스 튜브로 옮깁니다.

팩스 분석을 진행하여 형질전환 마커를 검출합니다. Fluorescence 및 Ross 프로브 형광분석 중. 배경 형광을 정규화하기 위해 항상 대조군 샘플과 비교하여 폴드가 증가함에 따라 손실 수준을 계산하십시오.

모든 Mount Ross 검출은 상처 부위의 과산화수소 축적을 검사하는 데 사용되었습니다. 산화제 처리 20분 후 손상되지 않은 꼬리와 손상된 꼬리를 비교했습니다. 두 조건 모두에서 비특이적 신호가 감지되었습니다.

과산화수소 수치를 낮추기 위해 배아를 전처리하는 것과 동일한 실험. OX 억제제를 사용하여 VA 28,70은 감지된 신호가 실제로 Ross 축적 부패에 의존한다는 것을 밝혔습니다. 알려진 처리된 배아도 전체 마운트에 의해 검사되었습니다.

고배율에서 해부학적 영역을 식별할 수 있습니다. 그것은 단일 세포 Ross 검출을 위해 팩스에 의한 Ross 양성 세포의 형광 계수에 의해 표시된 Ross를 생성했습니다. 이 분석은 죽은 세포를 포함하지 않고 수행되었습니다. 제어.

처리되지 않은 세포도 분석했습니다. 이러한 결과를 비교하면 Ross 축적을 매우 쉽게 정량화할 수 있습니다. 이 분석은 여러 가지 실험적 조작을 테스트하는 데 탁월한 것으로 입증되었습니다.

이것을 마스터하면 제대로 수행되면 90분 안에 기술을 수행할 수 있습니다. 분자 프로브로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 재주가 발생할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑을 사용해야 합니다.