표면 형광을 가진 조직 매트릭스 구성 요소 및 두 개의 광자 현미경의 장기의 intravital 면역 형광 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 종양 조직의 기질 구성 요소의 역학을 연구하기 위해 흑색종이 있는 마우스의 귀에 대한 생체 내 면역형광 이미징을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 B, 16, F, 10 흑색종 세포를 발현하는 GFP를 마우스 귀에 접종함으로써 달성됩니다. 다음으로 배쪽과 등쪽 귀 피부를 분리하고 종양 조직을 노출시키기 위해 쥐의 귀에 수술을 수행합니다.

그런 다음 등귀의 노출된 조직에 면역 염색을 수행합니다. 마지막으로, 동물은 생체 내 이미징을 위해 준비됩니다. 궁극적으로 형광 입체 현미경 또는 다광자 현미경은 종양 세포와 그 매트릭스 구성 요소의 위치 파악 및 동적 거동을 보여주는 데 사용됩니다.

다른 실시간 이미징 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 종양 세포와 면역 세포와 같은 기질 관련 세포의 동적 상호 작용을 이미지화할 수 있다는 것이지만, 이는 세포외 기질과 같은 섬유소 및 메쉬의 맥락에서 이루어집니다. 따라서 이 방법은 종양 세포가 물리적 미세환경과 어떻게 상호 작용하는지와 같은 종양 생물학 분야의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 종양이 어떻게 진행되는지에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 절차의 일부는 우리 실험실의 선임 과학자인 Vita Kki에 의해 시연될 것입니다: 주입을 위한 종양 세포를 준비하려면 B, 16, F, 10, GFP, 흑색종 세포를 배양하는 것으로 시작하십시오.

세포를 원심 분리한 후 1.5 밀리리터 einor 튜브로 옮기고 다시 회전시키고, 펠릿 바로 위에 있는 얇은 매체 층을 제외한 모든 상등액을 제거하고, 세포를 두꺼운 세포 슬러리에 재현탁시킨 다음 세포 슬러리를 10 마이크로 리터 부피로 로드합니다. 해밀턴 주사기. 부착된 33게이지 바늘에서 팁 캡을 제거하고 팁 챔버 위에 20마이크로리터의 슬러리를 로드합니다.

그런 다음 주사기 내부에 5마이크로리터의 슬러리가 적재될 때까지 플런저를 다시 당깁니다. C 57 black six 마우스를 주사 마취로 마취한 후 마우스 머리를 면도하고 머리와 귀 주위의 털을 제거하고 물로 헹굽니다. 접착 테이프를 사용하여 귀의 근위 가장자리를 검지 손가락 끝에 고정합니다.

해밀턴 주사기 바늘을 C 57 블랙 식스 마우스의 등 진피와 귀 연골 사이에 삽입하고 약 2-3mm 동안 원위부에서 원위부까지 귀를 관통합니다. 세포 슬러리를 주입하고 피부에서 바늘을 천천히 집어넣습니다. 종양 세포가 7-9일 동안 형광 현미경을 사용하여 종양 성장을 추적하여 고형 종양을 형성하도록 합니다.

가습 산소와 iso 불소의 혼합물을 사용하여 마우스를 마취한 후 마우스를 섭씨 37도의 가열 패드에 놓고 부드러운 발가락 꼬집기를 수행합니다. 동물이 충분히 마취되었는지 확인하기 위해. 눈에 안과 연고를 바르고 전체 절차 동안 직장 서미스터 제어 가열 패드에 마우스를 유지합니다.

다음으로, 종양이 있는 귀를 유리 슬라이드 더미에 부드럽게 놓습니다. 그런 다음 작은 접착 테이프 스트립을 사용하여 메스를 사용하여 귀의 앞쪽과 뒤쪽 가장자리를 스택에 고정하고 마우스 귓바퀴의 반나선을 따라 귀의 복부 피부를 자릅니다. 구부러진 핀셋을 사용하여 귀에서 테이프를 제거합니다.

배쪽 진피와 등쪽 진피의 연골을 부드럽게 벗겨냅니다. 면역형광 염색을 수행하기 위해 링거 버퍼를 사용하여 귀를 씻습니다. 차단막의 세포외 기질 분자를 표적으로 하는 1차 항체를 노출된 귀에 적용하고 그 위에 커버 슬립을 놓습니다.

15분 동안 배양한 후 약 5ml의 링거 버퍼를 사용하여 귀를 두 번 씻으십시오. 적절한 2차 항체 또는 연쇄상구균 Aden을 차단 buffer에 적용합니다. 커버 슬립을 바르고 15분 동안 배양한 후 두 번 씻습니다 이전과 마찬가지로 열린 피부 부위를 EM mencia conki에 접고 멸균 물티슈를 사용하여 열리지 않은 바깥쪽 귀 진피를 건조시킵니다.

유리 슬라이드 더미 위에 귀를 놓고 0.5마이크로리터의 수술용 접착제를 앞쪽과 뒤쪽 등 가장자리에 바르고 2시간 이하의 단기 이미징을 위해 귀를 움직이지 못하게 합니다. 갓 준비한 멸균 제품을 소르베이트 링거로 고정되지 않은 귀 위에 완충하고 커버 슬립을 적용합니다. 그런 다음 두 개의 렌즈가 있는 형광 실체 현미경을 사용하여 귀를 이미지화합니다.

장기 이미징용. 소르베이트 링거가 들어 있는 저장통에 부착된 바늘 배출구를 귀에서 약 0.5cm 떨어진 덮개 슬립 아래에 놓습니다. 분당 1마이크로리터의 속도로 연동 펌프를 사용하여 버퍼를 챔버에 지속적으로 전달합니다.

획득 소프트웨어를 엽니다. 게인 형광 강도, 배율 및 노출 시간 이미지, 종양 세포를 포함하는 여러 필드, 염색된 세포 외 기질 단백질을 조정하여 실리콘 그리스를 사용한 다중 광자 현미경을 사용하여 생체 내 이미징을 수행합니다. 귀 밑에서 시작합니다.

귀 주위에 지름이 약 2cm, 높이가 2-3mm인 원형 벽을 만듭니다. 소르베이트 링거로 원을 채웁니다. s에 마우스를 놓습니다.tage 섭씨 37도로 설정된 가열 패드에 놓고 텍스트 프로토콜에 따라 현미경 설정을 구성합니다.

이 그림에서 볼 수 있듯이 많은 구조는 면역 염색 후 형태에 따라 구별할 수 있습니다. 콜라겐 4 또는 프롤린과 같은 기저막 구성 요소의 경우 가장 중요한 것은 일반적으로 SHG에서 감지할 수 없는 구조 단백질입니다. 고전적인 매트릭스 감지 방법을 시각화할 수 있습니다.

예를 들어, 종양 미세환경 내에서 발생하는 힘은 종양 기질의 확장 또는 수축으로 이어질 수 있으며, 결과적으로 상처 치유와 유사한 종양 혈관 구조의 리모델링으로 인해 종양 기질의 서로 다른 위치에 Tens와 C가 침착되는 것을 발견했습니다. 여기에서 우리는 광자 현미경 검사에 대한 높은 광자 밀도에서도 Fluor four의 최소한의 광 표백으로 면역 표지된 테나 및 C 매트릭스를 동시에 이미징하는 동시에 두 개의 광자 타임 랩스 현미경 검사를 수행할 수 있음을 보여줍니다. 이 비디오에서는 콜라겐 4가 염색된 노출된 진피에 겹쳐진 종양 세포가 조직에 부착되어 그룹으로 혈관의 기저막과 지방 부위를 따라 집단적으로 이동하기 시작했습니다.

일단 숙달되면 귀를 열고 면역 염색을 하는 전체 절차는 2시간이 걸립니다. 이 동영상을 시청한 후에는 에피 형광 또는 이중 광자 현미경을 사용하여 종양의 세포 기질 상호 작용을 연구하기 위해 생체 내 면역 염색을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.