Name: BEST : Tetrads의 바코드 사용 시퀀싱 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 배우세요 효모 테트라드를 형광 활성화 세포 분류와 바코드 기술을 이용하여 고효율로 분리하고 분석하는 방법을. 이 기술은 수천 개의 재조합 자손을 몇 시간 내에 생성하며 유전적 계보 정보를 보존합니다.

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이 작품은 AMD에 대한 NIH / NHGRI 게놈 학술 / 학부 전환 수상 (K22 HG002908) 및 시스템 생물학 연구소와 룩셈부르크의 대학 간의 전략적 제휴에 의해 지원되었다. 변종 또는 플라스미드에 대한 요청은 아미 더들리 (aimee.dudley @ gmail.com)로 지정해야합니다.

1. 변형 건설 및 특성 <ol><li> 반수체 균주 짝짓기와 diploids 2를 선택 또는 자연적으로 발생하는 이형 균주를 사용하여 크로스에 사용되는 이형 이배체 균주를 구축. 변종 GFP 항구는 안된다. </li><li> 변형이 YPD 2 + 200 ㎍ / ㎖의의 G418에 성장 할 수 없음을 확인합니다. </li><li> 변형이 포자를 형성 할 수 있는지 확인합니다. BEST 낮은 포자 효율 십자가와 호환되지만 낮은 포자 주파수 증가의 FACS 정렬 시간이 필요합니다. <ol><li> 5 ㎖ YPD에 긴장의 O / N 문화를 설정하고 30 ℃에서 교반과 함께 성장 </li><li> PBS (산도 7.4)와 O / N 문화 0.5 ㎖를 세 번 씻으십시오. </li><li> 세척 세포 펠렛, 2 ㎖ 포자 매체 7의 상층 액과에 resuspend를 제거합니다. </li><li> RT에서 세포를 교반 및 40X의 목적으로 위상차 광학 현미경을 사용하여 테트라 형성을 위해 매일 확인합니다. </li> &lt;/ OL&gt; </li><li> tetrads 적은 수의 (~ 20) 종래의 해부 2,3에 의해 십자가의 포자 가능성을 예상하고있다. 다른 변형 배경 사이의 십자가의 포자 가능성은 넓게 예측할 다릅니다. 그러나, 포자 생존을 선험적 기대 전에 균주를 저장 및 유전형의 노동력 및 비용 집약적 단계에 BEST 실험의 효율성을 평가하는 데 사용될 수있다. 따라서이 단계는 것이 좋습니다. </li></ol> 바코드 플라스미드의 도서관과 Diploids 2. 변환 <ol><li> 다음 수정을 Gietz 우즈 8에 설명 된 변환 프로토콜을 사용하여 이형 이배체 변형에 pCL2_BC 바코드 플라스미드를 삽입합니다. <ol><li> 세포는 20 분 동안 30 ° C에서 변형 혼합물을 배양 한 후, 변형 믹스의 볼륨의 8 %에 DMSO를 추가합니다. DMSO를 첨가 변환 효율을 향상 제가 밝혀졌다N 일부 변형 배경 9. </li><li> 열 충격 단계 후, 간단한 원심 분리로 세포 펠렛 변환 혼합물을 가만히 따르다 및 YPD 부드럽게 세포를 씻어. 이어서, 1 ml의 YPD에서 세포를 재현 탁하고이를 교반없이 3 시간 동안 RT에서 회수 할 수있다. </li></ol></li><li> 판 한천 YPD + G418 (200 ㎍ / ㎖)에 도금에 의해 형질 전환을 선택합니다. 플라스미드 바코드의 복잡한 수영장을 보장하기 위해, 식민지의 많은 수의, 플레이트 당 ~ 2,500 식민지와 예를 들어, 5 판을 수확. </li><li> 식민지 (30 ° C에서 성장 2 ~ 3 일간) 볼 수 있습니다되면, 조심스럽게 액체 YPD + G418 (200 ㎍ / ㎖) + 15 % 글리세롤로 판을들을 긁어하여 형질 전환 체를 풀. 와동이 세포 현탁액은, 냉동 보존 유리 병에 전송하고, C. 각 플레이트에 대해 별도의 냉동 재고를 확인 -80 ° 동결. 이러한 냉동 재고품 단계 3.1 출발 균주로서 역할을하고 또한 원하는 경우, 나중에 더 tetrads를 생성하는데 사용될 수있다. </리&gt; </ol> 3. 바코드 Tetrads을 구하는 형질 전환 세포의 라이브러리 포자 형성된 <ol><li> 교반하면서 30 ° C에서 5 ㎖ YPD + G418 (200 ㎍ / ml)에 O / N의 성장에 2.3에서 만든 냉동 주식 세포를 부활. </li><li> O에서 세포를 세척 / N 배양 PBS (산도 7.4)의 3 배 후 포자 형성 매체 7 플러스 200 ㎍ / ㎖의의 G418에있는 세포를 재현 탁. </li><li> RT에서 포자의 문화를 선동하고 새로운 tetrads 형성 중지 할 때까지 매일 포자의 진행 상황을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 문화가 잘 형성 tetrads과 상대적으로 적은 산모와 아기를 포함하면, 교반에서 문화를 제거하고 최소 7 일 동안 실온에서 둡니다. 일부 십자가가 (7.3에 설명 된대로 평가) 즉시 tetrads가 형성로 판 소화 장애에 대한 의무가있을 수 있지만, 추가 배양 (실험 7-10 일) 다른 십자가에 필수적입니다. 따라서이 단계는 것이 좋습니다. </li></ol> 4. 설립테트라 정렬을위한 FACS 게이츠 meiotically는 pCL2_BC 플라스미드에 SPS2-GFP 융합은 포자 문화 tetrads가 감지 형광하여 문화로부터 격리 될 수 있도록 표현했다. 다음 프로토콜 FACSAria II 개발되었다. <img alt="그림 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> 네 순차적 게이트의 그림 2. FACS 게이트. 시리즈는 tetrads을 분리하는 데 사용됩니다. (A)에 도시 게이트와 (B)는 대단히 짧은 시간의 수를 줄일 수 있습니다. 형광 이벤트는 (C)의 게이트에 선정된다. (D)의 막대 그래프는 두 개의 봉우리가 있습니다. 왼쪽 피크의 이벤트는 주로 tetrads (왼쪽 삽입 된 이미지), 그리고 오른쪽 피크 이벤트는 일반적으로 연결된 새싹 (오른쪽 삽입 된 이미지)와 tetrads 있습니다. 마지막 문은대부분 tetrads (빨간색 막대) 이벤트를 선택하려면이 막대 그래프에 적용. 이 수치는 등 1, 러들로에서 수정되었습니다. <ol><li> FACS 분류기에 포자 문화를 넣고 파편, 응집 세포 및 방울 당 여러 개의 세포를 제외 할 두 앞으로 산란 및 측면 산란 게이트를 설정 (그림 2A와 2B). </li><li> SPS2-GFP 기자 구문을 사용하는 경우 댓구 및 tetrads (10)를 포함 형광 세포의 인구가 있어야합니다. 문이 형광 이벤트 (그림 2C)를 포함하는 FSC 대 GFP. </li><li> 스트레인 배경에 따라서는 tetrads 및 다른 셀을 포함 덩어리를 제거하기 위해 추가 게이트를 포함 할 필요가있다. 이 필요한 경우, 형광 이벤트 FSC 히스토그램을 검사하고 낮은 FSC (그림 2D, 게이트 이벤트가 빨간색입니다) 이벤트를 포함하는 게이트를 지정합니다. </li><li> t의 효율성을 점검<html> 그는 현미경 슬라이드 상 ~ 1500 tetrads 정렬 및 400X 배율에서 위상차 현미경을 사용하여 비 tetrads에 tetrads의 비율을 계산하여 정권 게이팅. tetrads의 %가 정확하게 만 ~ 200 정렬 이벤트를 계산하여 추정 만 ~ 1,500 시간의 양을 줄일 수 정렬하면 현미경 슬라이드에 세포를 찾고 소비 할 수 있습니다. 대안 적으로, 비 tetrads 행 tetrads의 비율은 4.5 단계 동안 평가 될 수있다. </li><li> 주기적 분류기 정확하게 현미경 슬라이드 상 25 tetrads 정렬 및 400X 배율에서 위상차 현미경을 이용하여 액체 방울에 포함 된 세포를 검사함으로써 이벤트의 수를보고하는 것을 확인하세요. 물방울의 25 tetrads이 있어야합니다. FACS 악기의 분산을 평가하기 위해 3 배를 반복합니다. </li></ol> 한천 판에 5. 정렬 Tetrads p_upload/51401/51401fig3highres.jpg &quot;폭 =&quot;500 &quot;/&gt; FACS 분류기에 한천 플레이트의 그림 3. 배치. 표준 (원형) 한천 플레이트, 표준 (100mm 직사각형)의 중간에 배치 zymolyase 솔루션의 작은 방울로 tetrads를 정렬하는 96 - 웰 플레이트는 처음이다 셀 분류기의 스테이지에 배치하고 분류기는 (이 경우 D5에) 특정 우물에 tetrads을 입금하도록 프로그램되어있다. 그리고, 원형 한천 플레이트를 96 - 웰 플레이트 위에 놓이며 zymolyase의 저하가 지정된 잘 위에 중심되도록 정렬된다. <ol><li> FACS 분류기 근처에 위치 37 ° C 배양기에서 적어도 1.5 시간 동안 YPD + G418 (200 ㎍ / ㎖) 판의 원하는 번호를 따뜻하게. </li><li> 정렬 프로토콜의 주요 기능은 정확하게 FACS는 zymolyase 솔루션의 풀을 포함하는 한천 플레이트의 특정 위치에 tetrads 정렬 대상으로하는 기능입니다. t에이 작업을 수행하려면, &quot;랜드 마크&quot;를 배치 96 웰 플레이트그는 분류기의 셀 증착 장치 (ACDU)를 자동화. 96 - 웰 형식 잘 하나에 25 tetrads을 정렬하는 정렬 레이아웃을 준비합니다. 선택 잘 플레이트의 중앙 근처에, 예를 들면 잘 D5. 그림 3은 셀 분류기에로드 페트리 접시 96 - 웰 플레이트를 보여줍니다. 접시 당 25 tetrads를 정렬하면 잘 분리 된 콜로니를 얻을​​ 수 있습니다. </li><li> 분류기에 37 ° C 배양기에서 10 한천 플레이트의 스택을 가지고. </li><li> 접시의 중앙 부근에 한천에 zymolyase 솔루션 중 하나 한천 플레이트와 피펫 25 μL (0.7 M 소르비톨 1 ㎎ / ㎖)을 가져 가라. 그런 다음, 단계 5.2, 예를 들면 잘 D5에서 잘 대상에 zymolyase 방울을 정렬, 랜드 마크 96 - 웰 플레이트에 플레이트를 배치합니다. </li><li> 정렬을 시작하고 한천 플레이트에 zymolyase 방울의 중간에 25 tetrads을 입금. 그런 다음, 제거하고 플레이트를 커버한다. </li><li> 반복 5.4 단계 5.5 25까지 tetrads는 스택의 각 접시에 zymolyase 방울로 분류되었다. </li&gt; <li> 37 ° C의 배양기에 테트라 함유 플레이트의 스택을 반환합니다. </li><li> 모든 플레이트 tetrads가 될 때까지 5.7을 통해 5.3 단계를 반복합니다. </li></ol> 6.을 분리 포자 <ol><li> 1.5 시간 동안 37 ° C에서 테트라 함유 한천 플레이트의 각 스택을 품어. </li><li> , 인큐베이터에서 접시를 제거 접시 당 15-25 멸균 3mm 유리 구슬을 추가하고, 3 ~ 5 분 동안 스택 (또는 5 판의 두 스택 등)로 판을 흔들. 가장 포자 분리는 뒷면에 측면 또는 전면 좌우로 견고하게 판을 이동함으로써 달성된다. 이러한 판의 바깥 쪽 가장자리 주위에 구슬 &quot;소용돌이&quot;가 판을 이동하지 마십시오. 완료되면 접시에 구슬을 남겨주세요. </li><li> 구슬이 30 ° C 배양기에서 얼굴 플레이트의 스택을 놓습니다. 37 ° C 배양기에서 다음 스택 플레이트를 검색하고, 6.2 단계를 반복합니다. </li><li> 30 ° C에서 접시 O / N을 품어 </li></ol> 7. 수확 식민지 <ol><li> 후30 ° C에서 O / N 배양, 작은 식민지가 판을 형성해야합니다. 조심스럽게 유리 구슬을 방해하지 않고 인큐베이터에서 접시를 제거합니다. </li><li> 정중하게 유리 구슬을 제거하고 신속하게 깊은 용기에 번호판을 반전. 컨테이너는 그들을 위로 반사하여 한천 판을 칠 허용하지 않고 구슬을 잡을 수있을만큼 깊이해야한다. 이 반전되는 동안 접시의 바닥을 두드리는 것은 플레이트에 붙어있는 구슬을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 구슬은 탈 물로 잘 세척 및 고압 증기 멸균에 의해 살균 비누로 철저히 세척하여 재사용 할 수 있습니다. </li><li> 각 접시에 콜로니의 수를 계산하고 포자 분리 및 복구의 효율성을 추정하기 위해 식민지의 번호를 사용합니다. 예를 들어, 근처에 100 % 생존과 크로스 플레이트 당 25 tetrads 접시 당 100 콜로니의 총을 얻을 수 있습니다. </li><li> 각 콜로에서 충분한 식민지의 숫자 (높은 생존 능력의 십자가에 대한&gt; 65), 전송 세포와 플레이트에서+ G418 YPD 액체를 함유하는 96 - 웰 플레이트의 분리에 잘 NY. 또한, 우물이 같은 한천 플레이트에서 식민지를 포함하는 주목을; 이 정보는 테트라 할당 소프트웨어를 돕기 위해 사용될 것이다. </li><li> 유전자형과 냉동 글리세롤 주식 등의 변종을 절약 문화를 배정하는 96 - 웰 액체 접시를 사용합니다. RAD 태그 서열 및 서열 분석에 대한 세부 사항은 러들로 등의 알 1에서 찾을 수 있습니다. </li></ol>

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<li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+gene+conversion%3A+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

복잡한 특성 매핑 (11)로부터 DNA 재조합 (12)를 기본 메커니즘의 연구에 이르기까지 유전학 연구의 많은 지역은 자손의 매우 큰 숫자와 DNA 염기 서열의 높은 볼륨을 필요로합니다. 높은 처리량의 DNA 시퀀싱의 용량을 기존의 접근 방식의 힘 결혼 기술 이전에 다루기 힘든이었다 연구를 가능하게 할 가능성이있다. 여러 높은 처리량 효모 유전학 방법은 특정 문제에 효과적으로 적용되어 있지만, 각각의 기존 테트라 분석의 광범위한 응용에 미치지 제한 사항이 있습니다. 테트라 해부를 결합 높은 처리량 접근 방식을 채택하고 효모 십자가의 자손 유전형에 의한 BEST 주소 이러한 과제. 멀티 플렉스 RAD 태그의 순서와 함께, BEST 고유 테트라 바코드에 의해 테트라 관계를 유지하면서 각각의 자손 균주의 유전자형 정보를 수집합니다하는 저렴한 방법을 제공합니다.0; 모든 현재 높은 처리 방법을 사용 BEST 가장 가깝게 수동 해부 효모 교차에 의해 제공된 정보가 되풀이되었습니다. BEST는 두 가지 주요 기능을 가지고 있습니다. 첫 번째는 빠르게 (프로토콜 5-6 단계) 거리 문화 unsporulated 세포 tetrads을 분리하는 FACS를 사용하는 것입니다. 형광 이벤트 (tetrads)의 수천을 분리 할 수​​있는 능력은 BEST에게 처리량이 가장 큰 이득을 제공합니다. 이 자동화로 인해 시각적으로 희귀 한 이벤트를 식별하는 데 필요한 시간이 증가로, 낮은 포자 효율 십자가 수동 해부를 통해 더 큰 이점을 제공한다. 두 번째 중요한 특징은 테트라 각각 자매 포자로 송신된다 고도로 복잡한 분자 바코드 (프로토콜 단계 2)의 사용이다. 이러한 바코드는 무작위 필요성 수동 정렬 격자의 배열 셀이 완화되는, 한천 플레이트에 분산 된 테트라 드 포자 간의 관계를 재구성 계산하는데 사용될 수 있기 때문이다. 마지막으로,분자 바코드와 포자 특정 GFP 리포터 유전자가 물리적으로 (같은 플라스미드에) 연결되어 있기 때문에, 분자 바코드를 유지 만 tetrads는 FACS 정렬에 의해 선택된다. 문화 포자 매체에 배양해야하는 시간을 제어하는​​ 두 가지 고려 사항이 있습니다. 포자 특정 기자 (SPS2-GFP)이 초기의 감수 분열로 표현되기 때문에 첫째, 혼자 GFP는 감수 분열 (즉, 산모와 아기를) 완료하지 않은 세포에서 완전한 4 - 포자 tetrads를 구분하지 않습니다. 추가 FACS 게이팅 형광, 불완전 tetrads의 수를 줄일 수 있지만, 원치 않는 사건을 줄일 수있는 가장 쉬운 방법은 단순히 포자 문화를 모니터링 (3.3 단계) 한 번 새로운 tetrads 형성 중지 진행되고있다. 우리의 실험에서는, 우선 댓구의 빈도는 1 % 미만이다. 둘째, 동요하지 않고 실온에서 포자 형성 매체에서 보낸 일부 십자가 추가 시간에 시그 (3.4 단계)촉진 시켜서 사실,이 단계는 약간의 십자가의 중단을 위해 절대적으로 필요하다 도금 동안 유리 구슬로 tetrads의 분리 ((프로토콜 6 단계). 향상시킵니다. 모두 높은 처리량 방법과 마찬가지로, BEST는 대응하는 기존의 방법보다 &quot;시끄럽다&quot;입니다. 기존 테트라 절제술에 비해 최고 효율의 겸손한 감소는 여러 가지 요인의 조합에서 발생할 수 있습니다. 한 가지 요인으로 인해 공정의 기계적 스트레스에 포자 사멸을 확산하거나 증가하는 동안 유리 비드의 접착에서 발생할 수있는, 달리 실행 가능한 포자의 증가 된 손실이다. 두 번째 요인은 세포의 감수 분열시 간단한 플라스미드 손실 될 수 있습니다. 세 번째 요인은 혼합 유전자형을 가진 식민지에서 발생 가능한 식민지에서 효과적인 감소 될 수있다, 우리의 파일럿 식민지의 추정 ~ 5 % 1을 교차. 이들 식민지 자매 포자 분리의 실패를 나타내는 것으로 보인다. 때문에 빠른 불소escence 정렬 및 포자 분리 tetrads 엄청난 숫자의 컬렉션을 허용, BEST는 잘 규모의 효율 감소를 극복하기 위해 장착되어 있습니다. BEST 미래의 반복 수동 절개의 접근 효율성을 증가시킬 수 있지만, 그것은 DNA 시퀀싱 용량의 현재 지수 궤적이 빠르게 사용할 변형 손실이 수준을 보상 할 것을 아마 가능성이 높습니다. 어쨌든, BEST는 적용 할 수있는 규모가 원소 분석을 수행 할 수있는 능력은 현재 설명서의 방법에 의해 실행할 수 없게되어 연구를 가능하게 할 것이다.

일반적으로가 원소 분석으로 알려진 감수 유전자 매핑, 효모 유전학의 중심이다. 간단히, 각 각 염색체의 단일 복사본을 포함하는 두 개의 반수체 균주, 각 염색체의 두 개의 사본, 각 부모로부터 하나 이형 이배체 긴장을 형성하기 위해 결합됩니다. 질소 이배체 세포를 굶주리는 것은 염색체 복제, 재 배열을 받아야하고, 각각의 부모로부터 대립 유전자의 새로운 조합으로 네 개의 반수체 세포 (포자 또는 segregants)로 나누어 (포자)하는 감수 분열을 유도한다. 단일 감수 분열로 인한 사 포자 테트라 박리라는 수동 프로세스에 의해 단리 될 수있다. 1937 4에 해당 출판물 때문에 상대적으로 조금 변경되었습니다 기존 테트라 해부 2,3 세 가지 목표를 가지고 있습니다. 첫째, 감수 분열 (tetrads)을받은 세포는 식물 세포의 배경에서 멀리 격리해야합니다. 기존의 분석에서, 이것은 사용하는 사람의 연구원에 의해 수행된다현미경은 시각적으로 agar 접시에 tetrads을 식별하고 미세 조작기 장치는 시각적으로 agar 접시에 tetrads을 식별하고 플레이트의 세포가없는 지역에 테트라를 이동하는 미세 조작기를 이용하여 사용합니다. 다음으로, 테트라에서 4 개의 포자는 물리적으로 interspore 연결을 방지하기 위해 구분해야합니다. 테트라 내에서 포자는 자낭, 원래 배체 세포의 세포벽의 남은 및 interspore 교량 5 세트 모두 함께 개최된다. 기존 테트라 분석에서 자낭은 소화 효소에 의해 제거하고, 연구원은 interspore 교량을 파괴하고 포자를 떨어져 애타게 미세 조작기를 사용합니다. 마지막으로, 개개의 포자는 포자의 관계를 유지 그리드 화 패턴으로 배열되어, 네 개의 행 즉, 모든 자손은 동일한 일본어 테트라 여동생 포자이다. 경험이 풍부한 효모 연구원은 10 tetrads (일반적으로 허용되는 최소 수를 해부하는 과정을 완료 할 수 있습니다약 15 분에) 간 당. 우리는 우리가 1 (BEST) T의 etrads의 nabled S의 equencing B의 arcode의 E 전화를 새로운 높은 처리량가 원소의 유전자형 방법을 개발했습니다. BEST는 절연되어 자손 많은 수의 유전자형, 그리고 네 감수 제품의 자매 포자의 관계를 복구 할 수 있도록하는 방식으로 개인과 유지의 생성 및 유전자형을 가능하게하여 높은 처리량 유전학 현재의 방법에 따라 확장합니다. 이 세 가지 주요 전략 (그림 1)를 사용하여 수행됩니다. 첫 번째는 GFP와 세포의 감수 분열을받은 셀 라벨과 그들이 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 분리 할 수​​ 기자 구문의 소개입니다. 제가 원소의 네 포자에 송신하고 Progen는 재조합 DNA의 염기 서열에 의해 판독 될 수있는 형태로 매우 복잡한 DNA 바코드의 내장 (15 무작위 뉴클레오티드 문자열)이며따라서 Y와 같은 테트라에서 자매 포자를 식별합니다. 세 번째는 유전자형 단계이며, BEST 포착하는 게놈 마커 세트뿐만 아니라 테트라 특정 바코드를 모두 다수의 유전자형 플랫폼과 호환됩니다. 우리는 이에 일관된 2-3 자손 균주의 게놈의 %뿐만 아니라 캡처, 제한 사이트 관련 DNA 태그 시퀀싱 (RAD-서열) 특정 제한 사이트 1 게놈 시퀀싱을 지시 6 방법을 사용 플라스미드 매개 바코드 . 십자가에서 경험적으로 파생 된 유전자형 데이터와 함께 테트라 관계의 회복은 낮은 순서의 범위와 마커의 상태와 inviable (따라서 복구 할 수없는) 개인의 전체 유전자형을 포함하여 누락 된 정보의 정확한 추론을 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 감수 매핑을 위해 가장 일반적으로 사용되는 미생물, 효모 S.보기에서 방법의 응용을 설명 사카로 마이 세스 세레 비시 애. 그러나 유기체 특정 정말이에요의 사소한 대체와신사는, GFP 융합 예를 들어, 다른 포자 특정 단백질이 방법은 감수 매핑이 집중 또는 현재 어려운 훨씬 더 노동하는 생물 등 다른 미생물에 쉽게 양도해야한다. <img alt="그림 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> 그림 1. 가장 좋은 방법. (A) pCL2_BC 플라스미드는 포자 특정 GFP 융합, G418에 대한 저항, 그리고 15 메르 임의의 바코드와 함께 2 마이크론 플라스미드이다. 플라스미드 라이브러리의 건설은 러들로 등의 알 1에 설명되어 있습니다. (B) 바코드 플라스미드의 풀은 십자가에서 이배체 균주로 변환됩니다. (C) 형질 전환 한 다음 선택에서 재배되고 ~ 10,000 변형 식민지 풀링 및 포자됩니다. 감수 분열시가 원소의 각 포자가 공동 상속바코드 플라스미드의 평. (D) Tetrads는 FACS로 unsporulated 세포를 분리하고 소화 각 포자가 식민지를 형성 할 수 있도록 중단되는 한천 플레이트에 수집됩니다. (E) 콜로니는 그 다음 96 웰 플레이트에 고른 phenotyped 및 유전자형된다. 유전형 동안 플라스미드 바코드 판독하고 각각의 테트라 개의 멤버를 식별하기 위해 사용된다. 이 그림은 러들 외 여러분 1에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>FACSAria II (Special order unit)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>다른 세포 분류기가 이 절차를 위해 작동해야 합니다. 핵심 요소는 다음과 같습니다: (1) 사용 중인 형광 리포터를 위한 레이저/검출 시스템(이 경우 EGFP를 자극하기 위한 488nm 레이저), (2) 단일 이벤트를 정렬할 수 있는 기능, (3) 정렬 품질을 평가하기 위해 현미경 슬라이드에 정렬할 수 있는 기능, (4) 페트리 접시에 정렬할 수 있는 기능</td></tr><tr><td>Automated Cell Deposition Unit (FACSAria II용)</td><td>BD Biosciences</td><td>643155(FACSAria 기기와 별도로 구매한 경우)</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>세이카가쿠 바이오비즈니스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>A.G. 사이언티픽</td><td></td><td>http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html</td></tr></tbody></table>

best : tetrads의 바코드 사용 시퀀싱

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

테트라 분석은 효모 유전학을위한 유용한 도구입니다,하지만 프로세스의 힘든 수동 성격은 큰 규모에 해당 응용 프로그램을 방해하고있다. 바코드 Tetrads의 시퀀싱 (BEST) 1, 분리 방해 및 tetrads 간격의 수동 프로세스를 대체 할 수있었습니다. BEST 직접 자낭이 효소 소화하고 포자가 중단되고, 무작위로 유리 구슬 도금에 의해 배열 한천 플레이트에 tetrads의 형광 활성화 된 셀 정렬을 허용하는 포자 특정 GFP 융합 단백질의 미덕으로 tetrads을 분리합니다. 포자 유전자형 동안 읽을 분자 바코드를 사용하여 동일한 테트라에서 유래, 즉 정보를하는지에 대한 반수체 식민지 다음, 자매 포자 관계가 할당됩니다. 수동 해부의 병목 현상을 제거함으로써, tetrads의 수백 또는 수천 분에 격리 할 수​​ 있습니다. 여기에서 우리는 효모에 최선을 수행하는 데 필요한 실험 절차에 대한 자세한 설명을 제공사카로 마이 세스 세레 비시 애, 반수체 감수 자손에서 파생 된 식민지의 분리를 통해 이형 이배체 변형으로 시작.

BEST 크게 tetrads 포자로부터 절연 될 수있는 속도를 향상시킬 수있다. 이 방법은 제공 할 수있는 처리량의 예를 들어, 한 연구원은 3 시간 1 149 한천 플레이트로 정렬 FACS 및 포자 분리 (단계 5.1 6.3을 통해) 한. 동등한 수익률 (약 3,725 tetrads)는 수동 해부의 90 시간을 필요로한다. 그러나, 많은 높은 처리량 방법과 마찬가지로, 방법의 현재 반복 수동 절개에 비해 효율의 일부 손실이있다. 콜로니 수가 감소 수동 해부 (단계 1.4)에 의해 결정 크로스 포자 생존 능력에 기초하여 계산 된 기대에 비해 회수로 이는 손실이 나타난다. 포자 손실 (토의)의 원인이 랜덤 포자에 영향을 가정하면, 추정 회수 콜로니가 1, 2, 3 또는 4 포자가 복구되고있는 tetrads의 부재 (도 4)이 얼마나 많이 만들어 질 수있다. 테트라 수준 성공적으로 (식민지로) 포자를 복구 할 수 있습니다. 실패의 방법 효율의 그림 4. 시뮬레이션 이항 분포가 사용 된 등 포자 inviability, 유리 구슬에 포자 부착, 서로 포자를 분리 실패가 원인 일 수 있습니다 성공적으로 회수 된 모든 포자의 비율에 기초하여 4, 3, 2 또는 1 콜로니를 생산하는 (적어도 하나의 성공적으로 회수 된 포자) tetrads의 예상 비율은 계산. 또는 - 4 - 포자 tetrads이 그래프는 궁극적으로 (3)에 조립합니다 균주의 수에 거친 가이드 역할을 할 수 있습니다. 플레이트 증가 당 콜로니 수가 있으므로 회수 완료 tetrads의 수는 않는다. 실험은 위의 설명에서 100 %로 포자 생존 가까이 함께 십자가에서 25 tetrads은 (DET로) 설명서를 해부하여 ermined 1 149 한천 플레이트에 도금했다. 이 실험에서 관찰 된 접시 당 콜로니의 최대 수는 20 포자 개별 콜로니를 형성하지 못했음을 나타내는, 80이었다. 접시 당 콜로니의 평균 수는 65 식민지 이상을 포함하는 61 판 수확 순서가되었다에서 62. 식민지였다. 또는 4 - - 시퀀싱 품질 관리를 통과 3700 균주, 72 %가 3 계산적으로 지정 될 수있는 포자를 tetrads.

Tetrads의 바코드 사용 시퀀싱 (BEST)를 분리 방해 및 tetrads 간격의 수동 프로세스를 대체합니다. BEST는 한천 플레이트에 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 tetrads를 격리 유리 구슬로 교반하여 포자를 분리하고, 무작위로 배열 된 식민지는 분자 바코드를 사용하여 동일한 원본 테트라에서 파생 된 결정합니다.

BEST : Tetrads의 바코드 사용 시퀀싱

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

이 절차의 전반적인 목적은 동일한 원래의 4분포자(tetrad)에서 유래한 자손이 무엇인지에 대한 정보를 유지하는 방식으로 효모 교배를 통해 다수의 재조합 자손을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 교배에 사용할 이형접합 이배체 균주에 4분포자 특이적 바코드와 포자 형성 특이적 형광 리포터를 포함하는 플라스미드 라이브러리를 형질전환함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 바코드가 표시된 세포를 포자 형성 배지로 옮기는 것입니다.이를 통해 테트라(tetras)가 형성되고, 포자 형성(sporulate)에 실패한 세포에서는 발현되지 않는 Tetras 내 GFP 형광 리포터의 발현이 유도됩니다. 다음으로, FACS 소터가 형광 표지된 테트라를 다른 세포들로부터 분리하여 한천 배지 플레이트에 직접 배치하며, 여기서 테트라의 외피가 효소로 소화됩니다. 마지막 단계는 유리 구슬을 사용하여 소화된 테트라의 포자들을 분리하고 한천 배지 표면에 펼쳐, 각 포자가 단일 콜로니를 형성하도록 하는 것입니다.최종적으로, 이 방법을 통해 얻은 균주들은 각 균주의 4가지 특이적 바코드를 판독하는 고처리량 멀티플렉스 DNA 시퀀싱 프로토콜을 사용하여 유전형 분석을 수행하게 됩니다. 이후 바코드를 이용하여 단일 감수 분열 사건으로 인해 생성된 4가지 균주를 각각 식별합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 이용한 수동 테트라드 해리법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 연구자 한 명이 단 몇 시간 만에 수천 개의 재조합 자손을 분리할 수 있다는 점입니다.본 연구에 사용된 이배체 효모 세포는 동반 원고에 기술된 바와 같이 바코드가 지정된 플라스미드 라이브러리로 미리 형질전환되었으며, 냉동 스톡에서 세포를 회복시키기 위해 -80 °C에 보관되었습니다. 다음 날, 30 °C에서 진탕하며 200 µg/mL의 G418이 첨가된 5 mL의 YPD 배지에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양한 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 200 µg/mL가 첨가된 포자 형성 배지를 사용하여 최종 부피 2 mL가 되도록 세포를 재부유합니다.실온에서 포자 형성 배양액을 교반합니다. 새로운 4분포자(tetrad) 형성이 중단될 때까지 매일 포자 형성 진행 상황을 모니터링합니다. 일반적으로 배양액에 잘 형성된 4분포자가 포함되어 있고 2분포자(dyad)가 상대적으로 적어지면, 그 후 2~4일 정도가 소요됩니다.배양액을 교반에서 분리하여 사분자 분리(tetrad sorting) 전까지 최소 7일 동안 실온에 둡니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 포자를 효과적으로 분리하는 것입니다. 경험적으로 포자 형성 배양액을 사분자 분리 전 최소 일주일 동안 실온에서 교반 없이 그대로 두었을 때 포자 분리 효율이 크게 향상됨을 확인하였습니다.이배체 세포 내의 바코드 플라스미드가 포자 형성 특이적 GFP 융합 단백질 또한 발현하므로, 포자 형성 배양액으로부터 사분포자를 형광 활성 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting) 또는 FACS를 통해 검출하고 분리할 수 있습니다. 본 프로토콜은 FACS Aria II를 위해 개발되었습니다. 이 절차를 시작하려면, 포자 형성된 배양액을 FACS 분류기에 로드하고, 잔해물, 응집된 세포 및 드롭렛당 다수 세포를 제외하기 위해 두 개의 전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 게이트를 설정하십시오.형광 세포군이 존재해야 하며, PS 두 가지 GFP 리포터 구조체를 사용하는 경우 다이아드(dyads)와 테트라드(tetrads)가 포함되므로, 이러한 형광 이벤트를 포함하도록 GFP 대 FSC 게이트를 설정합니다. 균주 배경에 따라, 테트라드 및 다른 세포들이 포함된 응집물을 제거하기 위해 추가 게이트를 설정해야 할 수도 있습니다. 형광 이벤트의 FSC 히스토그램을 확인하십시오.이 예시에서 왼쪽 피크의 이벤트는 주로 4분포자(tetras)이며, 오른쪽 피크의 이벤트는 일반적으로 출아 세포가 부착된 4분포자입니다. 빨간색 막대로 표시된, 주로 4분포자로 구성된 낮은 FSC 이벤트들을 포함하도록 최종 게이트를 적용하십시오. 약 1,500개의 4분포자를 현미경 슬라이드에 분리하여 4분포자와 비 4분포자의 비율을 계산함으로써 게이팅 체계의 효율성을 확인하십시오. 400배 배율의 위상차 현미경을 사용하면 분리된 이벤트 중 약 200개만 세어도 4분포자의 백분율을 정확하게 추정할 수 있지만, 약 1,500개를 분리하면 현미경 슬라이드에서 세포를 찾는 데 소요되는 시간을 줄일 수 있습니다.이 명시야 이미지들은 600배 배율로 촬영되었습니다. 팩트 소팅(facts sorting) 후 왼쪽에 tetrad의 예시를, 오른쪽에 non tetrad의 예시를 보여줍니다. 25개의 tetrad를 현미경 슬라이드에 소팅한 후 위상차 현미경의 400배 배율로 드롭렛 내의 세포를 검사하여, 소터가 이벤트 수를 정확하게 보고하고 있는지 주기적으로 확인하십시오.드롭렛 내에 25개의 사분포자(tetrad)가 있어야 합니다. 해당 실행에서 fax 장비의 분산을 평가하기 위해 이 과정을 3~4회 반복하십시오. fax 소터 근처에 위치한 37 °C 인큐베이터에서 필요한 수량의 YPD plus G four 18 플레이트를 최소 1.5시간 동안 가온하여 본 절차를 위한 아가 플레이트를 준비하십시오.분류 프로토콜의 핵심 특징은 FACS로 분류된 4분포자(tetrads)를 X 용액 풀이 포함된 한천 배지의 특정 위치로 정확하게 타겟팅하는 능력입니다. 이를 위해 먼저 소터의 자동 세포 증착 장치에 랜드마크 96웰 플레이트를 배치하십시오. 그다음, 96웰 플레이트의 한 웰에 25개의 4분포자를 분류하도록 분류 레이아웃을 준비하십시오.플레이트당 25개의 테트라를 정렬하는 웰 포맷팅 방식을 사용하면 콜로니가 잘 분리됩니다. 플레이트 중앙 근처의 웰을 선택하십시오. 예를 들어, D5 웰을 선택합니다.37 °C 인큐베이터에서 agar 플레이트 10개를 묶음으로 가져와 소터로 옮깁니다. agar 플레이트 하나를 꺼내 플레이트 중앙 근처의 agar 위에 zy 용액 25 µL를 피펫으로 분주합니다. 그런 다음 플레이트를 랜드마크 96 웰 플레이트 위에 놓고, X droplet이 표적 위에 오도록 정렬합니다.해당 샘플은 이전에 선택되었습니다. D5 샘플입니다. 분류를 시작하고 25마리의 테트라(tetras)를 아가 플레이트 위 zy 드롭렛 중앙에 배치하십시오.플레이트를 꺼내고 덮개를 씌웁니다. 스택 내의 각 플레이트에 25개의 4분포자가 zamo 액적에 분류될 때까지 각 플레이트에 대해 분류 과정을 반복합니다. 4분포자가 포함된 플레이트 스택을 37 °C 인큐베이터로 다시 옮깁니다.다음 10개의 플레이트 묶음을 분류기로 가져와 분류 절차를 반복합니다. tetrad 함유 한천 플레이트를 37 °C에서 1.5시간 동안 배양한 후 포자를 분리할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 각 플레이트에 멸균된 3 mm 유리 구슬 15~25개를 넣고, 5개씩 두 묶음으로 나누어 플레이트를 3~5분 동안 흔들어 줍니다.플레이트를 좌우 또는 앞뒤로 단단하게 움직여 포자를 가장 효과적으로 분리할 수 있습니다. 비드가 플레이트의 바깥쪽 가장자리를 따라 소용돌이치며 움직이지 않도록 주의하십시오. 작업이 완료되면 비드는 플레이트에 그대로 둡니다.비드가 위를 향하게 놓인 플레이트 더미를 30 °C 인큐베이터에 넣습니다. 37 °C 인큐베이터에서 다음 플레이트 더미를 꺼내 비드를 이용한 포자 분리 절차를 반복합니다. 포자를 분리한 다음 날, 모든 플레이트를 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.유리 구슬이 흐트러지지 않도록 주의하며 30 °C 배양기에서 플레이트를 꺼냅니다. 플레이트에 작은 콜로니들이 형성되어 있어야 합니다. 플레이트를 깊은 용기 위에서 조심스럽고 빠르게 뒤집어 유리 구슬을 제거합니다.플레이트를 뒤집은 상태에서 바닥면을 가볍게 두드리면 플레이트에 달라붙어 있는 비즈를 떼어내는 데 도움이 됩니다. 용기는 비즈가 튀어 올라 다시 한천 플레이트에 닿지 않으면서 비즈를 충분히 받을 수 있을 만큼 깊어야 합니다. 각 플레이트의 콜로니 수를 측정하고, 이 콜로니 수를 이용하여 포자 분리 및 회수 효율을 추정하십시오.예를 들어, 생존율이 거의 100%인 교배의 경우 플레이트당 25개의 4분포자(tetrad)가 있다면, 높은 생존율을 보이는 65개 이상의 충분한 군락 수가 있는 플레이트에서 플레이트당 총 100개의 군락을 얻을 수 있습니다. 각 군락의 교배 전이 세포를 YPD 액체 배지와 G four 18이 포함된 96-웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 또한 어떤 웰들이 동일한 한천 플레이트의 군락을 포함하고 있는지 기록하십시오.이 정보는 나중에 사분자 할당을 돕는 데 사용됩니다. 소프트웨어를 활용하면 사분자로부터 포자를 분리하는 속도를 크게 향상시킬 수 있습니다. 현재의 방법론 버전은 수동 해부와 비교하여 효율성이 일부 저하되었으나, 모든 포자의 성공적인 회수 비율을 기반으로 하여 1, 2, 3 또는 4개의 콜로니를 생성하는 성공적으로 회수된 포자가 적어도 하나 이상 포함된 사분자의 예상 분율을 계산하기 위해 이항 분포가 사용되었습니다.이 그래프는 여기서 관찰된 바와 같이 최종적으로 3개 또는 4개의 포자 사분체(spore tetras)로 조립될 균주 수에 대한 대략적인 지침으로 활용될 수 있습니다. 본 연구에서 플레이트당 콜로니 수가 증가함에 따라 회수된 완전한 사분체의 수도 증가합니다. 수동 해부를 통해 결정된 포자 생존율이 100%에 가까운 25 rads를 149개의 한천 플레이트에 도말하였습니다.플레이트당 관찰된 최대 콜로니 수는 80개였으며, 이는 20개의 포자가 개별 콜로니를 형성하지 못했음을 나타냅니다. 플레이트당 평균 콜로니 수는 62개였습니다. 65개 이상의 콜로니가 포함된 61개의 플레이트에서 총 4,354개의 콜로니를 수확하여 시퀀싱했습니다. 시퀀싱 품질 관리를 통과한 3,700개의 균주 중 2,665개(72%)가 분석 후 3개 또는 4개의 포자 사분체(tetrads)로 전산 할당될 수 있었습니다.이 기술을 사용하면 시간당 1,000개 이상의 tetrad를 처리할 수 있습니다. 다만, 3시간 이상의 정밀 작업이 필요한 경우에는 도움이 필요할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

미생물 군집을 특성화하는 것은 환경 미생물학의 오랜 목표였습니다. 차세대 염기서열분석 방법을 통해 이제 최소한의 비용과 노동력으로 전례 없는 깊이로 미생물 군집의 특성을 분석할 수 있습니다. 여기에서는 벤치탑 염기서열분석기를 사용하여 박테리아 16S 리보솜 RNA 유전자를 염기서열분석하는 접근 방식에 대해 자세히 설명합니다.

16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

녹색 형광 단백질 유전자가 발견된 이래로 형광 단백질은 분자 세포 생물학에 영향을 미쳤습니다. 이 프로토콜은 유전 공학을 통한 뚜렷한 형광 단백질의 발현이 개별 세포를 바코드로 만드는 데 어떻게 사용되는지 설명합니다. 이 절차를 통해 세포 혼합물에서 고유한 집단을 추적할 수 있으며, 이는 다중화 응용 분야에 이상적입니다.

멀티 플렉스 애플리케이션을위한 형광 단백질 유전자 바코드

이 프로토콜은 세포 신호 전달 연구와 바이오 마커 검출 잠재적 인 응용 프로그램과 대규모의 제조, 다중화 된 두 차원의 DNA 또는 항체 배열을 설명합니다.

고밀도 바코드 항체 마이크로 어레이의 흐름 패턴 가이드 제작

Cytometry 및 높은 처리량 연속 게놈 늦게 복제 영역을 식별 하는 기술을 설명 합니다.

G2-seq: 높은 처리량 시퀀싱 기반 기술을 늦게 게놈의 복제 확인

단일 셀 시퀀싱 생물 학적 시스템, genotypic이 보여 하지만 현재 기술 커뮤니티 구성 및 기능의 깊은 프로 파일링에 필요한 처리량 부족. 여기, 우리는 미세 워크플로 시퀀싱에 대 한 설명 &gt; 다양 한에서 50000 단일 셀 게놈 세포 인구.

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

세균 적합성을 결정하기 위한 이 분자 기반 접근법은 디지털 PCR을 통해 정량화되는 독특한 게놈 DNA 바코드를 사용하여 미생물을 정확하고 정확하게 검출할 수 있도록 합니다. 프로토콜은 살모넬라 균주에 대한 경쟁 지수를 계산하는 것을 설명합니다. 그러나 이 기술은 유전적으로 가단성 유기체의 절대 정량화를 요구하는 프로토콜에 쉽게 적응할 수 있습니다.

살모넬라에서 피트니스의 높은 처리량 분석을 위한 디지털 PCR 기반 경쟁 지수

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

당사는 그람 음성 박테리아에 있는 포화 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하고 고처리량 시퀀싱을 위한 DNA 증폭기 라이브러리의 후속 준비를 생성하는 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 ESKAPE 병원체, 아신토박터 baumannii에초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜은 그람 음성 유기체의 넓은 범위에 순종.

고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성

여기에서, 저자들은 망막에서 전사체 및 크로마틴 접근성 프로파일을 특성화하는데 있어서 표현형 및 후속 쌍을 이룬 scRNA-seq 및 scATAC-seq 에 대한 MULTI-seq 의 유용성을 보여준다.

scRNA-Seq 및 scATAC-Seq 를 이용한 망막 유전자 발현 및 크로마틴 접근성의 다중화 분석

이 기사에서는 조직 구조를 보존하면서 다양한 전사체의 고해상도 매핑을 가능하게 하는 Stereo-seq를 사용하여 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 절편에서 숙주, 바이러스, 진균 및 마이크로바이옴 RNA의 포괄적인 공간 전사체 프로파일링을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

Stereo-seq 를 통한 종에 구애받지 않는 전사체의 포괄적인 공간 프로파일링

배우세요 효모 테트라드를 형광 활성화 세포 분류와 바코드 기술을 이용하여 고효율로 분리하고 분석하는 방법을. 이 기술은 수천 개의 재조합 자손을 몇 시간 내에 생성하며 유전적 계보 정보를 보존합니다.

BEST : Tetrads의 바코드 사용 시퀀싱

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