BEST : Tetrads의 바코드 사용 시퀀싱

이 절차의 전반적인 목적은 동일한 원래의 4분포자(tetrad)에서 유래한 자손이 무엇인지에 대한 정보를 유지하는 방식으로 효모 교배를 통해 다수의 재조합 자손을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 교배에 사용할 이형접합 이배체 균주에 4분포자 특이적 바코드와 포자 형성 특이적 형광 리포터를 포함하는 플라스미드 라이브러리를 형질전환함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 바코드가 표시된 세포를 포자 형성 배지로 옮기는 것입니다.

이를 통해 테트라(tetras)가 형성되고, 포자 형성(sporulate)에 실패한 세포에서는 발현되지 않는 Tetras 내 GFP 형광 리포터의 발현이 유도됩니다. 다음으로, FACS 소터가 형광 표지된 테트라를 다른 세포들로부터 분리하여 한천 배지 플레이트에 직접 배치하며, 여기서 테트라의 외피가 효소로 소화됩니다. 마지막 단계는 유리 구슬을 사용하여 소화된 테트라의 포자들을 분리하고 한천 배지 표면에 펼쳐, 각 포자가 단일 콜로니를 형성하도록 하는 것입니다.

최종적으로, 이 방법을 통해 얻은 균주들은 각 균주의 4가지 특이적 바코드를 판독하는 고처리량 멀티플렉스 DNA 시퀀싱 프로토콜을 사용하여 유전형 분석을 수행하게 됩니다. 이후 바코드를 이용하여 단일 감수 분열 사건으로 인해 생성된 4가지 균주를 각각 식별합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 이용한 수동 테트라드 해리법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 연구자 한 명이 단 몇 시간 만에 수천 개의 재조합 자손을 분리할 수 있다는 점입니다.

본 연구에 사용된 이배체 효모 세포는 동반 원고에 기술된 바와 같이 바코드가 지정된 플라스미드 라이브러리로 미리 형질전환되었으며, 냉동 스톡에서 세포를 회복시키기 위해 -80 °C에 보관되었습니다. 다음 날, 30 °C에서 진탕하며 200 µg/mL의 G418이 첨가된 5 mL의 YPD 배지에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양한 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 200 µg/mL가 첨가된 포자 형성 배지를 사용하여 최종 부피 2 mL가 되도록 세포를 재부유합니다.

실온에서 포자 형성 배양액을 교반합니다. 새로운 4분포자(tetrad) 형성이 중단될 때까지 매일 포자 형성 진행 상황을 모니터링합니다. 일반적으로 배양액에 잘 형성된 4분포자가 포함되어 있고 2분포자(dyad)가 상대적으로 적어지면, 그 후 2~4일 정도가 소요됩니다.

배양액을 교반에서 분리하여 사분자 분리(tetrad sorting) 전까지 최소 7일 동안 실온에 둡니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 포자를 효과적으로 분리하는 것입니다. 경험적으로 포자 형성 배양액을 사분자 분리 전 최소 일주일 동안 실온에서 교반 없이 그대로 두었을 때 포자 분리 효율이 크게 향상됨을 확인하였습니다.

이배체 세포 내의 바코드 플라스미드가 포자 형성 특이적 GFP 융합 단백질 또한 발현하므로, 포자 형성 배양액으로부터 사분포자를 형광 활성 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting) 또는 FACS를 통해 검출하고 분리할 수 있습니다. 본 프로토콜은 FACS Aria II를 위해 개발되었습니다. 이 절차를 시작하려면, 포자 형성된 배양액을 FACS 분류기에 로드하고, 잔해물, 응집된 세포 및 드롭렛당 다수 세포를 제외하기 위해 두 개의 전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 게이트를 설정하십시오.

형광 세포군이 존재해야 하며, PS 두 가지 GFP 리포터 구조체를 사용하는 경우 다이아드(dyads)와 테트라드(tetrads)가 포함되므로, 이러한 형광 이벤트를 포함하도록 GFP 대 FSC 게이트를 설정합니다. 균주 배경에 따라, 테트라드 및 다른 세포들이 포함된 응집물을 제거하기 위해 추가 게이트를 설정해야 할 수도 있습니다. 형광 이벤트의 FSC 히스토그램을 확인하십시오.

이 예시에서 왼쪽 피크의 이벤트는 주로 4분포자(tetras)이며, 오른쪽 피크의 이벤트는 일반적으로 출아 세포가 부착된 4분포자입니다. 빨간색 막대로 표시된, 주로 4분포자로 구성된 낮은 FSC 이벤트들을 포함하도록 최종 게이트를 적용하십시오. 약 1,500개의 4분포자를 현미경 슬라이드에 분리하여 4분포자와 비 4분포자의 비율을 계산함으로써 게이팅 체계의 효율성을 확인하십시오. 400배 배율의 위상차 현미경을 사용하면 분리된 이벤트 중 약 200개만 세어도 4분포자의 백분율을 정확하게 추정할 수 있지만, 약 1,500개를 분리하면 현미경 슬라이드에서 세포를 찾는 데 소요되는 시간을 줄일 수 있습니다.

이 명시야 이미지들은 600배 배율로 촬영되었습니다. 팩트 소팅(facts sorting) 후 왼쪽에 tetrad의 예시를, 오른쪽에 non tetrad의 예시를 보여줍니다. 25개의 tetrad를 현미경 슬라이드에 소팅한 후 위상차 현미경의 400배 배율로 드롭렛 내의 세포를 검사하여, 소터가 이벤트 수를 정확하게 보고하고 있는지 주기적으로 확인하십시오.

드롭렛 내에 25개의 사분포자(tetrad)가 있어야 합니다. 해당 실행에서 fax 장비의 분산을 평가하기 위해 이 과정을 3~4회 반복하십시오. fax 소터 근처에 위치한 37 °C 인큐베이터에서 필요한 수량의 YPD plus G four 18 플레이트를 최소 1.5시간 동안 가온하여 본 절차를 위한 아가 플레이트를 준비하십시오.

분류 프로토콜의 핵심 특징은 FACS로 분류된 4분포자(tetrads)를 X 용액 풀이 포함된 한천 배지의 특정 위치로 정확하게 타겟팅하는 능력입니다. 이를 위해 먼저 소터의 자동 세포 증착 장치에 랜드마크 96웰 플레이트를 배치하십시오. 그다음, 96웰 플레이트의 한 웰에 25개의 4분포자를 분류하도록 분류 레이아웃을 준비하십시오.

플레이트당 25개의 테트라를 정렬하는 웰 포맷팅 방식을 사용하면 콜로니가 잘 분리됩니다. 플레이트 중앙 근처의 웰을 선택하십시오. 예를 들어, D5 웰을 선택합니다.

37 °C 인큐베이터에서 agar 플레이트 10개를 묶음으로 가져와 소터로 옮깁니다. agar 플레이트 하나를 꺼내 플레이트 중앙 근처의 agar 위에 zy 용액 25 µL를 피펫으로 분주합니다. 그런 다음 플레이트를 랜드마크 96 웰 플레이트 위에 놓고, X droplet이 표적 위에 오도록 정렬합니다.

해당 샘플은 이전에 선택되었습니다. D5 샘플입니다. 분류를 시작하고 25마리의 테트라(tetras)를 아가 플레이트 위 zy 드롭렛 중앙에 배치하십시오.

플레이트를 꺼내고 덮개를 씌웁니다. 스택 내의 각 플레이트에 25개의 4분포자가 zamo 액적에 분류될 때까지 각 플레이트에 대해 분류 과정을 반복합니다. 4분포자가 포함된 플레이트 스택을 37 °C 인큐베이터로 다시 옮깁니다.

다음 10개의 플레이트 묶음을 분류기로 가져와 분류 절차를 반복합니다. tetrad 함유 한천 플레이트를 37 °C에서 1.5시간 동안 배양한 후 포자를 분리할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 각 플레이트에 멸균된 3 mm 유리 구슬 15~25개를 넣고, 5개씩 두 묶음으로 나누어 플레이트를 3~5분 동안 흔들어 줍니다.

플레이트를 좌우 또는 앞뒤로 단단하게 움직여 포자를 가장 효과적으로 분리할 수 있습니다. 비드가 플레이트의 바깥쪽 가장자리를 따라 소용돌이치며 움직이지 않도록 주의하십시오. 작업이 완료되면 비드는 플레이트에 그대로 둡니다.

비드가 위를 향하게 놓인 플레이트 더미를 30 °C 인큐베이터에 넣습니다. 37 °C 인큐베이터에서 다음 플레이트 더미를 꺼내 비드를 이용한 포자 분리 절차를 반복합니다. 포자를 분리한 다음 날, 모든 플레이트를 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

유리 구슬이 흐트러지지 않도록 주의하며 30 °C 배양기에서 플레이트를 꺼냅니다. 플레이트에 작은 콜로니들이 형성되어 있어야 합니다. 플레이트를 깊은 용기 위에서 조심스럽고 빠르게 뒤집어 유리 구슬을 제거합니다.

플레이트를 뒤집은 상태에서 바닥면을 가볍게 두드리면 플레이트에 달라붙어 있는 비즈를 떼어내는 데 도움이 됩니다. 용기는 비즈가 튀어 올라 다시 한천 플레이트에 닿지 않으면서 비즈를 충분히 받을 수 있을 만큼 깊어야 합니다. 각 플레이트의 콜로니 수를 측정하고, 이 콜로니 수를 이용하여 포자 분리 및 회수 효율을 추정하십시오.

예를 들어, 생존율이 거의 100%인 교배의 경우 플레이트당 25개의 4분포자(tetrad)가 있다면, 높은 생존율을 보이는 65개 이상의 충분한 군락 수가 있는 플레이트에서 플레이트당 총 100개의 군락을 얻을 수 있습니다. 각 군락의 교배 전이 세포를 YPD 액체 배지와 G four 18이 포함된 96-웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 또한 어떤 웰들이 동일한 한천 플레이트의 군락을 포함하고 있는지 기록하십시오.

이 정보는 나중에 사분자 할당을 돕는 데 사용됩니다. 소프트웨어를 활용하면 사분자로부터 포자를 분리하는 속도를 크게 향상시킬 수 있습니다. 현재의 방법론 버전은 수동 해부와 비교하여 효율성이 일부 저하되었으나, 모든 포자의 성공적인 회수 비율을 기반으로 하여 1, 2, 3 또는 4개의 콜로니를 생성하는 성공적으로 회수된 포자가 적어도 하나 이상 포함된 사분자의 예상 분율을 계산하기 위해 이항 분포가 사용되었습니다.

이 그래프는 여기서 관찰된 바와 같이 최종적으로 3개 또는 4개의 포자 사분체(spore tetras)로 조립될 균주 수에 대한 대략적인 지침으로 활용될 수 있습니다. 본 연구에서 플레이트당 콜로니 수가 증가함에 따라 회수된 완전한 사분체의 수도 증가합니다. 수동 해부를 통해 결정된 포자 생존율이 100%에 가까운 25 rads를 149개의 한천 플레이트에 도말하였습니다.

플레이트당 관찰된 최대 콜로니 수는 80개였으며, 이는 20개의 포자가 개별 콜로니를 형성하지 못했음을 나타냅니다. 플레이트당 평균 콜로니 수는 62개였습니다. 65개 이상의 콜로니가 포함된 61개의 플레이트에서 총 4,354개의 콜로니를 수확하여 시퀀싱했습니다. 시퀀싱 품질 관리를 통과한 3,700개의 균주 중 2,665개(72%)가 분석 후 3개 또는 4개의 포자 사분체(tetrads)로 전산 할당될 수 있었습니다.

이 기술을 사용하면 시간당 1,000개 이상의 tetrad를 처리할 수 있습니다. 다만, 3시간 이상의 정밀 작업이 필요한 경우에는 도움이 필요할 것입니다.