센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포
2014년 4월 23일
여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.
이 절차의 전반적인 목표는 센다이 바이러스로 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 형질전환될 섬유아세포 세포를 준비하고 도금함으로써 달성됩니다. 절차의 다음 단계는 세포를 센다이 바이러스에 감염시키는 것입니다.
그런 다음 감염된 섬유아세포 세포는 새로운 마우스 배아 섬유아세포 공급 세포로 이식됩니다. 마지막 단계는 재프로그래밍된 것을 수동으로 선택하는 것입니다. 이제 만능 줄기 세포, 궁극적으로 트랜스 유전자를 사용하지 않고 섬유아세포 세포를 I PSC로 재프로그래밍하는 것을 면역 표지 및 R-T-P-C-R을 통해 보여줄 수 있습니다.
기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 트랜스를 유지하지 않고 비용 효율적인 방식으로 재프로그래밍 효율성을 향상시킨다는 것입니다.이 프로토콜의 경우 DMEM에서 배양된 인간 섬유아세포를 준비해야 합니다. FBS를 사용하면 실험 플레이트를 위해 이러한 세포를 24개의 웰 플레이트로 옮기고 세포를 6개의 연속 희석하여 세포 부착을 위한 최상의 밀도를 결정합니다. 24웰 플레이트의 각 행은 하나의 희석 계열의 세포를 수용할 수 있습니다.
따라서 하나의 플레이트에서 4가지 세포 유형을 테스트하고 24시간 동안 희석액을 배양할 수 있습니다. 다음 날, transduction을 위해 3개의 합류 지점에서 well을 선택합니다. 하나는 80-90%의 높은 수준에서confluence, 다른 하나는 약 60%confluence에서, 세 번째는 약 30%Confluence에서 transduction 한 시간 이상 전에 이루어집니다.
형질 도입 해동을 위해 배지를 300마이크로리터의 새 섬유아세포 배지로 교체합니다. 센다이 바이러스 튜브 한 세트를 섭씨 37도에서 몇 초 동안 사용한 다음 끝냅니다. 실온에서 해동합니다.
해동된 바이러스를 6, 000G에서 10초 동안 원심분리하고 하나의 마이크로 원심분리기 튜브에 얼음 위에 보관합니다. 형질도입할 세포의 수에 따라 계산된 바이러스의 혼합물을 만듭니다. 계산 세부 정보는 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있습니다.
부드러운 피펫팅으로 바이러스를 잘 섞습니다. 이제 가장 밀도가 높은 세포에 두 부피의 바이러스를 추가합니다. 중간 밀도 세포에 한 부피의 바이러스를 추가하고 밀도가 가장 낮은 셀렉션에 절반 부피의 바이러스를 추가합니다.
접시를 휘젓고 다음날 반응이 일어날 수 있도록 밤새 배양하십시오. 매체를 500마이크로리터의 새 섬유아세포 매체로 교체합니다. 2일 후, 형질도입된 세포에서 두 번째 배지 변화가 이루어진 후 3일 후에 이 작업을 다시 수행합니다.
10%FBS 플레이트를 포함하는 DMEM으로 60mm 접시에 필로폰 세포를 준비하고 접시당 500, 000개의 세포를 준비하고 밤새 배양합니다. 다음 날, 필로폰 세포의 배지를 새로운 배지로 교체한 다음 공동 배양 설정을 진행합니다. 먼저, 형질도입된 섬유아세포에서 배지를 제거하고 DPBS로 한 번 세척합니다.
다음으로, 5분 이내에 0.25%트립신 EDTA 200마이크로리터를 각 형질도입된 각 세포에 첨가합니다. 분리되는 모든 세포를 하나의 15ml 원뿔형 튜브에 모읍니다. 1, 350G에서 4분 동안 세포를 회전시킵니다.
그런 다음 상층액을 제거하고 펠릿화된 세포를 약 5ml의 신선한 배지로 세척하여 트리핀을 중화합니다. 이제 1, 350 G.Next 플레이트에서 또 다른 4분 회전으로 세포를 수집합니다. 대부분의 세포는 필로폰에서 6 개의 연속 희석액입니다.
첫 번째 희석과 마지막 희석은 세포의 사멸률에 따라 필요하지 않을 수 있습니다. RNA 추출을 위해 일부 세포를 저장하고 플레이트를 밤새 배양합니다. 다음날, 배지를 10 마이크로몰의 RO 키나아제 억제제 Y 2 7 6 3 2가 보충된 인간 ES 배지로 교체합니다.
다음 며칠 동안 세포 생존을 개선하려면 배지를 일반 unsu 보충 인간 ES 배지로 변경합니다. 일주일 동안 배양한 후 며칠에 한 번씩 접시를 확인하여 세포 덩어리와 같은 ES 군집이 형성되었는지 확인하십시오. 그들이 나타나면 성장을 모니터링하십시오.
형질도입 3주 후, ES 세포 덩어리의 군집은 증식할 준비가 되어야 합니다. 60mm 플레이트를 위해 준비된 것과 마찬가지로 24개의 웰 플레이트에 필로폰 공급기 세포를 준비했습니다. 콜로니를 선택하기 전에 필로폰 세포의 배지를 Y 2 7, 6, 3, 2 10마이크로리터의 ES 배지로 변경합니다.
접시에서 한 번에 하나의 식민지를 선택하십시오. 용액이 있는 15ml 튜브로 콜로니를 옮깁니다. 피펫터를 사용하여 군체를 분해합니다.
그런 다음 나를 덮으십시오. 음, 분열된 식민지와 함께. 궁극적으로 각 우물에 하나의 분해된 군체를 로드하고 가능한 한 많은 웰을 로드합니다.
매일 배지를 교체하여 세포를 유지하고 6개의 웰 플레이트와 60mm 접시로 확장합니다. 일반적으로 센다이 바이러스에 감염된 섬유아세포는 5일이 지나기 전까지는 형태학적 변화를 보이지 않습니다. 그런 다음 세포는 더 큰 핵과 더 작은 세포질을 가진 둥근 모양을 취합니다.
이 소규모 프로토콜에는 섬유아세포 밀도, 바이러스 역가 및 mes에 대한 도금 밀도와 같이 최적화할 수 있는 여러 매개변수가 포함되어 있습니다. 서로 다른 색상으로 표시되는 서로 다른 cofluency에서 세포의 transduction도 최적화할 수 있습니다. 일주일 동안 필로폰 공급세포와 공동 배양한 후, 부분적으로 재프로그래밍된 섬유아세포는 느슨한 모양을 가지며 트립신을 사용하여 수집하는 것과는 대조적으로 쉽게 채취할 수 있습니다.
완전히 재프로그래밍된 I PSC는 부분적으로 재프로그래밍된 세포에서 명확하게 식별할 수 있습니다. 완전히 재프로그래밍된 세포는 단단히 채워져 있으며 군집은 명확한 경계를 가질 수 있습니다. 부분적으로 재프로그래밍된 세포는 쉽게 분리될 수 있는 느슨한 클러스터를 만듭니다.
몇 주 동안 IPSC 클론을 확장한 후, H 9 세포에 비해 줄기 세포 마커에 대한 염색이 보장됩니다. IPC는 만능 품질을 지원하는 SSEA 4, OCT 4, TRA 81 및 nano G를 포함하여 여러 예상 항체에 양성입니다. R-T-P-C-R 전이유전자 발현을 사용하는 것은 인간 IPSC 클론에서 언급되지 않았다.
외인성 OCT four에 대한 10개의 프라이머 후, SOX 2, klf four 및 Cmic을 강력한 전이유전자 발현 수준을 보여주는 양성 대조군 샘플과 함께 사용했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 poly potent 줄기 세포를 유도하기 위해 체세포를 재프로그래밍하는 방법과 이를 선택하여 다른 세포에서 세포를 완전히 다시 프로그래밍하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 기사는 센다이 바이러스를 사용하여 인간 체세포를 형질전환 유전자가 없는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSCs)로 재프로그래밍하는 방법을 소개합니다. 이 절차는 iPSCs를 생성하는 데 있어서 일관된 결과와 향상된 효율성을 보여줍니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 줄기 세포 생물학
- 세포 재프로그래밍
- 바이러스학
배경
- 유도 만능 줄기 세포(iPSCs)는 재생 의학에 가치가 있습니다.
- 전통적인 방법은 종종 안전성 문제를 일으킬 수 있는 형질전환 유전자의 사용을 포함합니다.
- 센다이 바이러스는 형질전환 유전자 삽입 없이 안전한 재프로그래밍을 가능하게 하는 비통합 벡터입니다.
- 이 방법은 체세포로부터 iPSCs를 생성하는 효율성을 향상시키는 것을 목표로 합니다.
연구 목적
- 형질전환 유전자 없이 iPSCs를 생성하는 신뢰할 수 있는 방법을 확립합니다.
- 재프로그래밍 과정의 효율성을 향상시킵니다.
- 연구 환경에서 쉽게 복제할 수 있는 프로토콜을 제공합니다.
사용된 방법
- 섬유아세포의 준비 및 배양.
- 섬유아세포의 센다이 바이러스를 이용한 형질전환.
- 감염된 세포를 마우스 배아 섬유아세포 피더 세포로 이전합니다.
- 면역 라벨링 및 RT-PCR을 통해 확인된 재프로그래밍된 세포의 수동 선택.
주요 결과
- 섬유아세포로부터 형질전환 유전자가 없는 iPSCs를 성공적으로 생성했습니다.
- 여러 시도를 통해 일관된 재프로그래밍 결과를 보였습니다.
- 기존 방법에 비해 향상된 효율성을 보였습니다.
- 확립된 검정을 통해 만능성을 검증했습니다.
결론
- 센다이 바이러스 방법은 iPSCs 생성을 위한 안전하고 효과적인 접근 방식입니다.
- 이 기술은 재생 의학의 추가 연구를 촉진할 수 있습니다.
- 향후 연구는 이러한 iPSCs의 다양한 치료 맥락에서의 응용을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Efficient generation of transgene-free human iPSCs using Sendai virus addresses a critical bottleneck in early discovery and disease modeling pipelines. This method enhances predictive confidence by eliminating residual transgene expression, supporting more reliable downstream differentiation and phenotypic screening. Its reproducibility and scalability position it as a foundational capability for translational research and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust generation of patient-specific iPSCs for hypothesis-driven disease modeling.
- Reduces mechanistic ambiguity by removing confounding transgene effects in functional assays.
- Supports target validation through reproducible reprogramming and marker-based confirmation.
- Facilitates portfolio triage by providing high-quality, integration-free cellular models.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, transgene-free iPSC lines for assay development and compound screening.
- Improves assay reproducibility by minimizing genetic and epigenetic artifacts.
- Enables quantitative readouts via immunolabeling and RT-PCR for pluripotency markers.
- Supports scalable workflows for high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular systems for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by maintaining genomic integrity.
- Reduces risk of misinterpreting disease phenotypes due to residual transgene expression.
- Aligns with requirements for preclinical model standardization and reproducibility.
Pipeline & Workflow Integration
This Sendai virus-based reprogramming method integrates at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by generating high-fidelity iPSC models.
- Screening: Provides reproducible, transgene-free cell lines for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative assessment of pluripotency via immunolabeling and RT-PCR outputs.
- Translational Research: Maintains disease relevance and biomarker alignment for downstream studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for generating iPSCs across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic risk in disease modeling.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of iPSC generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling reliable model systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, viral transduction, and stem cell characterization.
- Needs access to Sendai virus reagents, feeder cell infrastructure, and molecular analysis tools.
- Demands cross-team standardization of cell density, virus titer, and marker validation protocols.
- Adaptable to various human somatic cell sources with optimization of key parameters.
- Dependent on rigorous immunolabeling and RT-PCR to confirm transgene-free status and pluripotency.
