Name: 센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 배우세요 센다이 바이러스를 이용하여 인간 체세포를 유전자 침입 없는 유도만능줄기세포로 재프로그래밍하는 효율적인 방법을. 이 기술은 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 원고에 대한 가치있는 토론을위한 이명박 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이명박 실험실에서 작업 세포 연구 기금 (TEDCO를) 줄기 뉴욕 줄기 세포 재단의 로버트슨 조사자 포상에서 메릴랜드에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. 셀의 제조 및 미디어 (주 1) <ol><li> 문화 DMEM 매체는 10 % FBS가 포함 된 인간의 섬유 아세포를 확장합니다. </li><li> 플레이트 인간의 섬유 아 세포 전달 전날에 잘 당 적절한 밀도로 24 웰 플레이트 상에 (그림 1). 참고 : 다른 종류의 세포가 다른 첨부 파일 기능을 가지고 있기 때문에 다음과 같은 일련의 희석액 (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K 및 6.25K)을 권장합니다. </li><li> 세포가 완전히 준수 및 확장이 보장, 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 하루 더의 세포를 품어. </li></ol> 2. 형질을 수행합니다 (2 일) <ol><li> 형질 도입의 날에, 세포 밀도를 확인하고 가장 효율적인 밀도 웰 (도 2)을 선택했다. 높은 (80 ~ 90 %), 중 (50 ~ 70 %)과 낮은 (20 ~ 40 %)의 세 가지 다른 밀도를 선택하는 것이 좋습니다. </li><li> 1 시간 이상 전달하기 전에, fibrobl를 대기음AST의 세포에서 미디어와 섬유 아세포 매체의 새로운 300 μl를 변경합니다. </li><li> -80 ° C 저장에서 4 개의 다른 센다이 바이러스 튜브의 한 세트를 제거합니다. 몇 초 동안 37 ° C의 물 배스 동시에 각 튜브를 해동하고 수욕으로부터 튜브를 가지고. 그 후, 실온까지 이들을 해동; 원심 분리기 10 초 동안 6,000 XG에 튜브 및 사용까지 얼음에 배치합니다. 동결을 다시 및 역가가 유지되지 않으므로 바이러스를 해동하지 마십시오. </li><li> 마이크로 원심 분리기 튜브에 네 센다이 바이러스 튜브 (10 월 - 4, KLF-4, C-Myc와와 삭스-2)의 각각의 지정된 볼륨을 추가합니다. 용액을 부드럽게 피펫 팅하여 잘 혼합되어 있는지 확인합니다. 예를 들어, 전달 24 - 웰 플레이트 lookwell의 50K 세포 / 잘 하나 : (생활 기술에서 분석의 인증서를 기반으로 역가가 배치에서 배치에 차이가있을 수 있습니다) 튜브 hOct-4 = 6.0 × 10 7 CIU, 3 MOI 5 μl를 = 튜브 hSox-2 = 6.5 × 10 7 CIU, 3 MOI는 = 4.6 μ; L 튜브 hKlf-4 = 6.3 × 10 7 CIU, 3 MOI = 4.8 μL 튜브 HC-Myc와 = 7.8 × 10 7 CIU, 3 MOI = 3.8 μL 총 = 24 - 웰 플레이트의 네 가지 바이러스 요인 혼합물 / 잘 하나 (50K 세포)의 18.2 μL </li><li> 세포 밀도에 따라; 2X, 1X, 그리고 잘에 바이러스 혼합물의 0.5X 볼륨을 추가합니다. 부드럽게, 플레이트 앞뒤 흔들어 좌우 (2X : 바이러스 혼합물, 1X의 36.4 μL : 18.2 μL와 0.5X : 9.1 μL). </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 세포를 놓고 밤새 품어. </li></ol> 3. 문화 매체의 교체 (3 일 · 5 일) <ol><li> 24 시간 전달 후, 500 ㎕의 신선한 섬유 아세포 매체와 매체를 교체하십시오. </li><li> 5 일에, 신선한 섬유 아세포 미디어와 중간 변경합니다. </li></ol> 4. 공동 문화 MEF 요리를 준비 (8 일) <ol><li> 10 % 60mm 배양 접시에 MEF 세포를 준비 FBS는 DMEM 매체 하나 다 포함MEF 피더 세포에 형질 도입 된 섬유 아 세포를 계대 전에 Y. 참고 : 우리는 각 60mm 접시에 MEF의 5 × 5를 사용하고 있습니다. </li></ol> 5. 시작 공동 문화 MEF 피더 세포 (9 일)으로 세포를 형질 도입 <ol><li> 형질 세포를 도금하기 전에 대기음 10 % FBS는 MEF 피더 요리에서 DMEM 매체를 포함하고 FBS는 DMEM 매체를 포함 신선한 10 %를 추가합니다. </li><li> 24 - 웰 플레이트에 있고 D-PBS로 한 번 세포를 씻어 형질 섬유 아 세포에서 매체를 제거합니다. 24 - 웰 플레이트 기계가 섬유 아세포의 세포에 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 200 μl를 추가합니다. 세포가 플레이트에서 분리하기 시작할 때 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 미만 5 분 배양 후, 15 ML 원뿔 튜브에 성장 매체와 세포를 수집합니다. 그런 다음 4 분 6,000 XG에서 그들을 원심 분리기. 참고 : 2X, 1X, 0.5X 및 바이러스를 풀링은 형질 섬유 아세포를 권장합니다. </li><li> 뜨는 매체를 제거하고 다시 중단에 씻어트립신의 중화를위한 신선한 섬유 아세포 배지 중에서 4-5 ㎖를 가진 세포 펠렛. 그런 다음 4 분 동안 135 XG에이를 원심 분리. </li><li> 예 : 1 / 2, 1 / 4, 1 / 8, 1 / 16, 1 / 32, 1 / 64, 및 백이십팔분의 일 60 당 : 시리얼 희석 밀도 및 MEF 상에 섬유 아세포 미디어와 공동 문화에 시작 플레이트 세포 mm 접시. 전달의 첫 주 동안 세포 사멸 속도에 따라, 하나는 1 / 2 또는 128분의 1 밀도에 희석 할 필요가 있습니다. 형질 전환 유전자 RT-PCR에 대한 긍정적 인 제어로 총 RNA를 추출하기 위해 옆에 남아있는 세포를 넣어. </li><li> 5 % CO 2 배양기 하룻밤, 37 ° C에서 60mm 요리를 놓습니다. </li></ol> 6. 인간 배아 줄기 세포의 중간 피드와 셀 (주 10) 모니터 <ol><li> 다음 날, 10 μM Y-27632 인간의 ES 미디어에 섬유 아세포 미디어를 변경합니다. 그 후, 인간 ES 매체 매일 매체 변경 : 800 ml의 DMEM/F12 + 200 ㎖의 녹아웃 혈청 교체 + 10 ml의 L-글루타민 + 10 10 mM의 MEM 최소 비 필수 아미노산의 ML기본적인 섬유 아세포 성장 인자의 2 - 머 캅토 에탄올 + 10 겨 / ㎖의 + 1 ㎖. </li><li> 신선한 인간의 ES의 미디어와 매일 미디어 변경 작업을 수행합니다. 일주일 후, ES 식민지와 같은 세포 덩어리의 형성을 현미경으로 한 번에 2 ~ 3 일이다 요리를 확인합니다. 콜로니가 발견되기 전에 세포의 종류에 따라, 배양은 더 많거나 적은 시간이 걸릴 것이다. </li></ol> 7. 유도 다 능성이 세포 식민지 줄기 및 셀 확장 따기 (일 20 ~) <ol><li> 3 주 전달 후, 식민지 따기 제대로 성장 나타납니다. </li><li> 식민지를 따기 전날 24 - 웰 플레이트에 MEF 공급 장치를 준비합니다. 참고 : 우리는 하나 24 - 웰 플레이트에 MEF 12.5 × 10 5를 사용하고 있습니다. </li><li> 다음 날, 10 μM Y-27632 인간의 ES의 미디어에 섬유 아세포 미디어에서 MEF 요리의 매체를 변경합니다. 수동 따기 후드에서 현미경으로 각각 한 번에 하나의 식민지를 선택하고 피펫으로 작은 덩어​​리를 만들어 전송할새로 개의 클론을 선택하는 MEF dishes.Try 준비에. </li><li> 통로 처음 6 웰 플레이트에 24 웰 플레이트에서 각 웰 확장합니다. 그런 다음 6 잘 플레이트에서 더 전파하기 전에 60mm 요리에. </li></ol> (10 구절 후) 인간 유도 만능의 8. 특성 <ol><li> 면역 형광 <ol><li> 매일 미디어 변화 4-5 일 도중 24 웰 플레이트와 문화 플레이트 인간 유도 만능. </li><li> 면역 형광 분석을 시작, 한 번 D-PBS로 접시를 씻으십시오. 그런 다음 30 분 동안 0.4 % 파라 포름 알데히드 즉시 세포를 고정합니다. 그 후 5 분 동안 D-PBS로 세 번 씻어. </li><li> 실온에서 15 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 용액으로 고정 된 세포를 치료. </li><li> permeablization 용액 (0.1 % 트리톤 X-100 용액) 대기음 다음, 상온에서 1 시간 동안 0.5 % BSA 블로킹 용액을 추가한다. </li><li> Nanog를, 10 월 - 4, SSEA (무대 특정 배아 antig의 검출을 수행EN) 및 TRA-1-81 0.5 % BSA 용액에 항 인간 항체를 사용하여 (종양 제거 항원) (항체의 희석 비율에 대한 자료 표를 확인하시기 바랍니다.) 실온에서 2 시간 동안 차 항체를 품어. 그런 다음 5 분마다 D-PBS로 세 번 씻어. </li><li> 실온에서 0.5 % BSA 용액에 1:2,000 희석하는 2 차 항체와 같은 알렉사 플 루어 488 염소 항 - 마우스 IgG 항체와 배양 1 시간 후 형광 현미경을 사용하여 확인합니다. DAPI 각 MEF 피더 세포와 hiPSCs의 모든 핵을 얼룩. </li></ol></li><li> 형질 전환 유전자 확인의 RT-PCR <ol><li> RNA 추출 시약을 사용하여 세포 펠렛에서 총 mRNA의 압축을 풉니 다. </li><li> 역전사하여 PCR 증폭을위한 총 RNA와 그 결과의 cDNA의 분취에 역전사 (1 μg)을 수행합니다. </li><li> cDNA를 템플릿의 2 μL, 2X PCR 마스터 믹스 10 μL, 프라이머 2 pmol의 2 μl를 포함하는 PCR 혼합물을 준비합니다(앞으로 1 μL 및 역방향 : 1 μl를) 및 DW 6 μL. 표 1에 기재된 프라이머로 RT-PCR을 수행하여 유전자 발현을 검출한다. </li><li> 증폭 반응의 효율을위한 제어로 GAPDH 유전자와 RT-PCR을 수행합니다. 시각화하고 1 % 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 생성물을 분석한다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
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<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
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<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Fluri, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation%2C+expansion+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+continuous+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures.</a> Nature Methods. 9, 509-516 (2012).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22P+Jpn+Acad+B-Phys%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.</li>
<li>Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

hiPSCs에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 것은 기본 생물학, 개인 의학 및 이식 12 전례없는 약속을 보유하고 있습니다. 이전에, 인간의 IPSC 세대는 의약품 개발과 이식 치료 13으로 추가 임상 응용 프로그램을 제한하는 바람직하지 않은 유전자 변이를 만들 수 있습니다 호스트 게놈으로 통합 위험이 DNA 바이러스를 요구했다. 이러한 이유로, 많은 연구는 여러 다른 방법으로 벡터 및 유전자없는 시스템 인간 유도 만능를 생성하는 것으로보고되었지만, 동시에, &#39;무료 풋 프린트&#39;분리의 효율은 인간 유도 만능은 고려되어야한다. 아직 센다이 바이러스 매개 IPSC 세대의 &#39;게놈 안전&#39;을 보여주기 위해 전체 게놈 시퀀싱에 대한 게시는 없지만 예를 들어, RNA 바이러스는 다른 방법 (14)에 비교 유전자 수차의 최소 수준이 있어야합니다. 여기서, 우리는와 hiPSCs를 생성하기위한 방법을 제시비용 효율적인 방식으로 높은 프로그래밍 효율이 센다이 ...

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 약물 검사에 대한 질병 모델링을위한 잠재적으로 유용 할 수 있고, 질병 및 조직 손상을 치료하는 세포 기반 치료법을 개발하기 위해 자기 갱신 시험 관내 및가 능성에 대한 능력을 보유하고 있습니다. 그러나 인간 배아 줄기 세포 때문에, 면역 학적 종양학과 윤리적 장벽의 세포 대체 요법에 대한 제한이 있고, 질병 관련 유전자를 연구, 질병 특정 인간 배아 줄기 세포는 착상 전 유전자 진단 (PGD) 방식을 통해 분리 할 수​​ 있지만, 여전히 기술적으로 도전 및 배아 기증은 매우 드물다. 이러한 문제는 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 개발을 주도하고있다 줄기 세포 생물학의 진행과 관련이 있습니다. 인간 유도 만능은 유 전적으로 인간의 성인 체세포에서 프로그램이 다시 그들에게 예 : D 재생 의학을위한 유용한 소스를 만드는 인간 배아 줄기 세포와 유사한 만능 줄기 세포와 같은 기능을 품고있다양탄자 발견, 질병 모델링 및 환자 특정 방식으로 1,2의 세포 치료. 지금까지 바이러스 매개 (레트로 바이러스 및 아데노 바이러스)를 포함하여 인간 유도 만능를 생성하는 여러 가지 방법, 3, 비 바이러스 매개 (BAC 시스템과 벡터의 형질) 4 유전자 transductions 및 단백질 전달 시스템 5-7이 있습니다. 바이러스 매개 유전자 전달 효율의 특정 수준을 보장 할 수 있지만 그들이 통제 할 수없는 방식으로 프로그램을 다시 만들 유전자를 표현하는 호스트의 염색체에 통합하기 때문에, 바이러스 성 벡터는 유전자 발자국을 떠날 수 있습니다. 전사 인자의 바이러스 통합을 활성화하거나 호스트 8 유전자를 불 활성화 할 수 있더라도, 이는 예기치 유전 수차 및 종양의 5,9의 위험을 일으킬 수있다. 한편, 체성 세포로 단백질 또는 RNA의 직접적인 도입은보고 있지만, 이러한 노동 집약적 반복 TRANSF 등의 몇 가지 단점을 가지고 있었다ection 및 7,10 재 프로그램의 낮은 수준입니다. 심지어 에피 솜 및 비 통합 아데노 바이러스, 아데노 - 관련 바이러스, 플라스미드 벡터는 여전히 11 비교적 덜 효율적이다. 이러한 이유로, 그것은 IPSC 세대의 높은 효능과 적은 유전자 이상과 비 통합 프로그램을 다시 만들 방법을 선택하는 그럴듯​​. 이 연구에서, 우리는 센다이 바이러스 기반 프로그래밍을 사용합니다. 이 방법은 호스트 게놈에 비 통합과 지속적으로 유전자 통합하지 않고 인간 유도 만능를 생산하는 것으로 알려져있다.

<table><tbody><tr><td>CytoTune-iPS 재프로그래밍 키트</td><td>Invitrogen</td><td>A1378002</td><td></td></tr><tr><td>CF-6,MEFs, 네오마이신 저항성, 미토마이신 C 처리&nbsp;</td><td>글로벌 스템</td><td>GSC-6105M</td><td>5 x 105/6 cm 또는 12.5 x 105/24웰 플레이트</td></tr><tr><td>트립신 EDTA 0.25% 트립신(EDTA 포함) 4Na 1X</td><td>Invitrogen</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 배지</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑이 있는 평평한 바닥</td><td>BD</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td>10 &#956; M (재고: 10 mM)</td></tr><tr><td>기본 섬유아세포 성장 인자</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>PHG0263</td><td>10 ng (재고 : 100 ug)</td></tr><tr><td>녹아웃 세럼 교체</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), 액상 (고포도당)</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine-200 mM (100X), 액상</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td>1/100</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td></td><td>11140050 1/100</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (1,000X), 액체</td><td>GIBCO</td><td>21985023</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Hausser 위상차 혈</td>농도계 <td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1% 젤라틴 용액</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>DSHB</td><td>MC-813-70</td><td>1/200</td></tr><tr><td>anti-Tra-1-81</td><td>Cell Signaling</td><td>4745S</td><td>1/200</td></tr><tr><td>마우스 단클론 Oct4 항체</td><td>산타</td>크루즈 <td>SC-5279</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>나노</td><td>R& D</td><td>AF1997</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Alexa Flouor 488 염소 안티-마우스</td><td>Invitrogen</td><td>948492</td><td>1/2,000</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039; s 인산염 완충 식염수), 칼슘 및 칼슘 없이 1X 마그네슘</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect 역전사 키트</td><td>QIAGEN</td><td>205313</td><td></td></tr><tr><td>PCR 마스터 믹스 [2X]</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>따기 후드</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td></td></tr><tr><td>해부 스코프&nbsp;</td><td>니콘</td><td>SMZ745</td><td></td></tr></tbody></table>

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

몇 년 전, 인간 유도 만능 줄기 세포 (유도 만능)의 설립은 생물 의학의 새로운 시대를 열었다. 인간 유도 만능의 잠재적 인 사용은 인간의 유전 질환의 모델링 발병 유전자 보정 후자가 세포 치료, 환자 별 증상과 관련된 세포의 소스를 제공함으로써 맞춤 약물 검사를 포함한다. 그러나, 이러한 인간 유도 만능 생산 후 남은 프로그래밍 인자 유전자의 발현을 제거하는 등의 극복하는 여러 장애물이있다. 더 중요한 것은, 미분화 된 인간 유도 만능 잔류 유전자 발현 적절한 분화를 방해하고 질병 관련 체외 표현형에서의 해석을 잘못지도 할 수 있습니다. 이러한 이유와 함께, 통합 - 무료 및 / 또는 유전자가없는 인간 유도 만능는 아데노 바이러스, 피기 백 (PiggyBac) 시스템, minicircle 벡터, 에피 솜 벡터, 직접 단백질 전달과 같은 몇 가지 방법을 사용하여 개발 및 mRNA의 합성되었다. 그러나 reprogra의 효율성통합없는 방법을 사용하여 mming하는 것은 대부분의 경우 매우 낮습니다. 여기서, 우리는 센다이 바이러스 (RNA 바이러스) 기반 프로그래밍 시스템을 사용하여 인간 유도 만능을 분리하는 방법을 제시한다. 이 프로그래밍 방법은 일관된 결과 및 비용 효율적인 방식으로 고성능을 나타낸다.

보통 감염 섬유 아 세포는 센다이 바이러스 전달 후 몇 일에 한 어떤 형태의 변화를 보여주지 않지만, 5 일 후, 그들은 다른 모양 (그림 1)를 가지고 시작합니다. 도 1의 오른쪽 패널에서 설명한 바와 같이, 세포는 전형적인 섬유 아세포의 형태를 가지고 있지 않는다. 그들은 세포질보다 둥근 모양과 더 큰 핵이있다. 전달이 80 %의 세포 포화 상태에서 수행되는 경우에도 그들이 다시 프로그램 시작 후가 아니라 덜 합류처럼, 그것은 보인다. 형태 이러한 종류의 변경이 아니라 가장에서 볼 수 시작하면, 형질 섬유 아세포 MEF 피더 배양 접시에 도금 할 준비가 된 것입니다. 우리의 프로토콜에서는, 세포 배양 규모를 최소화하고 또한 hiPSCs 발전 효율을 증가 같은 다른 섬유 아세포 세포 밀도 및 바이러스 역가를 이용한 다양한 프로그래밍 가능성, 및 후속 몇개 재 도금 비율 MEF를 (준 <strong&gt; 그림 2)...

여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

이 절차의 전반적인 목표는 센다이 바이러스로 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 형질전환될 섬유아세포 세포를 준비하고 도금함으로써 달성됩니다. 절차의 다음 단계는 세포를 센다이 바이러스에 감염시키는 것입니다.그런 다음 감염된 섬유아세포 세포는 새로운 마우스 배아 섬유아세포 공급 세포로 이식됩니다. 마지막 단계는 재프로그래밍된 것을 수동으로 선택하는 것입니다. 이제 만능 줄기 세포, 궁극적으로 트랜스 유전자를 사용하지 않고 섬유아세포 세포를 I PSC로 재프로그래밍하는 것을 면역 표지 및 R-T-P-C-R을 통해 보여줄 수 있습니다.기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 트랜스를 유지하지 않고 비용 효율적인 방식으로 재프로그래밍 효율성을 향상시킨다는 것입니다.이 프로토콜의 경우 DMEM에서 배양된 인간 섬유아세포를 준비해야 합니다. FBS를 사용하면 실험 플레이트를 위해 이러한 세포를 24개의 웰 플레이트로 옮기고 세포를 6개의 연속 희석하여 세포 부착을 위한 최상의 밀도를 결정합니다. 24웰 플레이트의 각 행은 하나의 희석 계열의 세포를 수용할 수 있습니다.따라서 하나의 플레이트에서 4가지 세포 유형을 테스트하고 24시간 동안 희석액을 배양할 수 있습니다. 다음 날, transduction을 위해 3개의 합류 지점에서 well을 선택합니다. 하나는 80-90%의 높은 수준에서confluence, 다른 하나는 약 60%confluence에서, 세 번째는 약 30%Confluence에서 transduction 한 시간 이상 전에 이루어집니다.형질 도입 해동을 위해 배지를 300마이크로리터의 새 섬유아세포 배지로 교체합니다. 센다이 바이러스 튜브 한 세트를 섭씨 37도에서 몇 초 동안 사용한 다음 끝냅니다. 실온에서 해동합니다.해동된 바이러스를 6, 000G에서 10초 동안 원심분리하고 하나의 마이크로 원심분리기 튜브에 얼음 위에 보관합니다. 형질도입할 세포의 수에 따라 계산된 바이러스의 혼합물을 만듭니다. 계산 세부 정보는 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있습니다.부드러운 피펫팅으로 바이러스를 잘 섞습니다. 이제 가장 밀도가 높은 세포에 두 부피의 바이러스를 추가합니다. 중간 밀도 세포에 한 부피의 바이러스를 추가하고 밀도가 가장 낮은 셀렉션에 절반 부피의 바이러스를 추가합니다.접시를 휘젓고 다음날 반응이 일어날 수 있도록 밤새 배양하십시오. 매체를 500마이크로리터의 새 섬유아세포 매체로 교체합니다. 2일 후, 형질도입된 세포에서 두 번째 배지 변화가 이루어진 후 3일 후에 이 작업을 다시 수행합니다.10%FBS 플레이트를 포함하는 DMEM으로 60mm 접시에 필로폰 세포를 준비하고 접시당 500, 000개의 세포를 준비하고 밤새 배양합니다. 다음 날, 필로폰 세포의 배지를 새로운 배지로 교체한 다음 공동 배양 설정을 진행합니다. 먼저, 형질도입된 섬유아세포에서 배지를 제거하고 DPBS로 한 번 세척합니다.다음으로, 5분 이내에 0.25%트립신 EDTA 200마이크로리터를 각 형질도입된 각 세포에 첨가합니다. 분리되는 모든 세포를 하나의 15ml 원뿔형 튜브에 모읍니다. 1, 350G에서 4분 동안 세포를 회전시킵니다.그런 다음 상층액을 제거하고 펠릿화된 세포를 약 5ml의 신선한 배지로 세척하여 트리핀을 중화합니다. 이제 1, 350 G.Next 플레이트에서 또 다른 4분 회전으로 세포를 수집합니다. 대부분의 세포는 필로폰에서 6 개의 연속 희석액입니다.첫 번째 희석과 마지막 희석은 세포의 사멸률에 따라 필요하지 않을 수 있습니다. RNA 추출을 위해 일부 세포를 저장하고 플레이트를 밤새 배양합니다. 다음날, 배지를 10 마이크로몰의 RO 키나아제 억제제 Y 2 7 6 3 2가 보충된 인간 ES 배지로 교체합니다.다음 며칠 동안 세포 생존을 개선하려면 배지를 일반 unsu 보충 인간 ES 배지로 변경합니다. 일주일 동안 배양한 후 며칠에 한 번씩 접시를 확인하여 세포 덩어리와 같은 ES 군집이 형성되었는지 확인하십시오. 그들이 나타나면 성장을 모니터링하십시오.형질도입 3주 후, ES 세포 덩어리의 군집은 증식할 준비가 되어야 합니다. 60mm 플레이트를 위해 준비된 것과 마찬가지로 24개의 웰 플레이트에 필로폰 공급기 세포를 준비했습니다. 콜로니를 선택하기 전에 필로폰 세포의 배지를 Y 2 7, 6, 3, 2 10마이크로리터의 ES 배지로 변경합니다.접시에서 한 번에 하나의 식민지를 선택하십시오. 용액이 있는 15ml 튜브로 콜로니를 옮깁니다. 피펫터를 사용하여 군체를 분해합니다.그런 다음 나를 덮으십시오. 음, 분열된 식민지와 함께. 궁극적으로 각 우물에 하나의 분해된 군체를 로드하고 가능한 한 많은 웰을 로드합니다.매일 배지를 교체하여 세포를 유지하고 6개의 웰 플레이트와 60mm 접시로 확장합니다. 일반적으로 센다이 바이러스에 감염된 섬유아세포는 5일이 지나기 전까지는 형태학적 변화를 보이지 않습니다. 그런 다음 세포는 더 큰 핵과 더 작은 세포질을 가진 둥근 모양을 취합니다.이 소규모 프로토콜에는 섬유아세포 밀도, 바이러스 역가 및 mes에 대한 도금 밀도와 같이 최적화할 수 있는 여러 매개변수가 포함되어 있습니다. 서로 다른 색상으로 표시되는 서로 다른 cofluency에서 세포의 transduction도 최적화할 수 있습니다. 일주일 동안 필로폰 공급세포와 공동 배양한 후, 부분적으로 재프로그래밍된 섬유아세포는 느슨한 모양을 가지며 트립신을 사용하여 수집하는 것과는 대조적으로 쉽게 채취할 수 있습니다.완전히 재프로그래밍된 I PSC는 부분적으로 재프로그래밍된 세포에서 명확하게 식별할 수 있습니다. 완전히 재프로그래밍된 세포는 단단히 채워져 있으며 군집은 명확한 경계를 가질 수 있습니다. 부분적으로 재프로그래밍된 세포는 쉽게 분리될 수 있는 느슨한 클러스터를 만듭니다.몇 주 동안 IPSC 클론을 확장한 후, H 9 세포에 비해 줄기 세포 마커에 대한 염색이 보장됩니다. IPC는 만능 품질을 지원하는 SSEA 4, OCT 4, TRA 81 및 nano G를 포함하여 여러 예상 항체에 양성입니다. R-T-P-C-R 전이유전자 발현을 사용하는 것은 인간 IPSC 클론에서 언급되지 않았다.외인성 OCT four에 대한 10개의 프라이머 후, SOX 2, klf four 및 Cmic을 강력한 전이유전자 발현 수준을 보여주는 양성 대조군 샘플과 함께 사용했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 poly potent 줄기 세포를 유도하기 위해 체세포를 재프로그래밍하는 방법과 이를 선택하여 다른 세포에서 세포를 완전히 다시 프로그래밍하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 인간의 요인 Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 Lin28의 lentivirus - 중재 전송을 사용하여 인간의 체세포에서 유도된 pluripotent 줄기 세포의 생성에 대한 프로토콜을 보여줍니다. Pluripotency는 형태학 및 배아 줄기 (ES) 세포 특정 마커의 존재에 의해 확인되었다.

Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

OCT4의 레트로 바이러스 - 매개 자궁외 표현을 통해 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs) 생성하는 방법은, SOX2, KLF4 및 MYC가 설명되어 있습니다. GFP 발현을 바탕으로 인간 iPSC 식민지를 식별하기위한 실용적인 방법도 설명되어 있습니다.

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

우리는 렌티바이러스 기반의 재프로그래밍 및 특성화된 무인자 인간 유도 만능 줄기세포를 유도하고 추정되는 임상 등급 조건으로 전환하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

의 유도 및 특성 형질 전환 유전자가없는 인간 유도 다 능성 정의 임상 수준의 조건으로 세포주 및 변환 줄기

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 재프로그래밍 인자를 포함하는 마트리겔 및 센다이 바이러스 벡터의 조합을 사용하여 공급자가 없는 조건에서 인간 말초 T 세포에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하는 방법을 설명합니다.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

이 프로토콜의 목표는 흑색종 종양 침투 림프구를 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는 프로토콜을 보여주는 것입니다.

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

우리는 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제안합니다. 원심분리를 통해 형질도입된 혈액 세포를 매트릭스 코팅된 플레이트에 도금함으로써 부유 세포에서 iPSC를 성공적으로 유도할 수 있습니다. 이 기술은 PBMC 및 CBMC와 같은 셀에 대한 간단하고 효과적인 재프로그래밍 프로토콜을 제안합니다.

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 센다이 바이러스 감염에 의해 신경 줄기 세포를 유도하는 말초 혈액 단핵 세포의 재프로그래밍을 제시, 도파민성 뉴런으로 iNC의 분화, 일방적으로 병변에 DA 전구체의 이식 파킨슨병 마우스 모델, PD 치료를 위한 iNSC 유래 DA 전구체의 안전성 및 효능에 대한 평가.

말초 단핵 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구에 대 한 도파민성 신경 전구체로 분화

배우세요 센다이 바이러스를 이용하여 인간 체세포를 유전자 침입 없는 유도만능줄기세포로 재프로그래밍하는 효율적인 방법을. 이 기술은 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

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