정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

이 절차의 전반적인 목표는 단일 세포 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(R-T-P-C-R)을 사용하여 개별 인간 배아 줄기 세포의 유전자 발현 수준을 프로파일링하는 것입니다. 이는 먼저 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 세포 용해 완충액을 포함하는 96웰 플레이트의 각 웰로 개별 세포를 분류함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 RNA를 역전사하여 단일 세포 용해물에서 CDNA를 생성하는 것입니다.

다음으로, CDNA는 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭됩니다. 마지막 단계는 증폭된 cDNA에 대해 정량적 R-T-P-C-R을 수행하는 것입니다. 궁극적으로 이 분석은 인간 배아 줄기 세포와 같은 이질적인 집단에서 유전자 발현을 연구하는 데 유용합니다.

기존 단세포 정량 인공 용기에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법, EEG 및 팩스 정제 전에 더 강력하다는 것입니다. OCT 4개의 EGFP 인간 배아 줄기 세포 또는 Hess가 60mm 접시에서 분리됩니다. 모든 배지를 제거하고 1ml의 Accutane을 첨가한 다음 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.

상등액을 버리고 세포를 펠렛화하기 위해 1 밀리리터의 인간 ES 매체 원심 분리기로 Accutane을 중화하고, 팩스 버퍼에 세포를 재현 탁탁 하 고 농도를 1 배 10 밀리리터 당 6 개의 세포로 조정하십시오. 다음으로, 세포 샘플을 35마이크로미터 셀 스트레이너 캡 튜브에 통과시킵니다. 세포 분류 전에 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.

1마이크로리터의 단일 세포 D Ns 1 및 9마이크로리터의 단일 세포 용해 용액을 포함하는 마스터 믹스를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 각각에 대해 10 마이크로 리터의 혼합 용액을 팩스 분석 프로그램을위한 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰로 잘 옮기고, 세포 분류기는 세포 분류 후 단일 EGFP 양성 세포를 96 웰 PCR 플레이트의 웰로 분류하고 세포 용해를 위해 실온에서 5 분 동안 샘플을 배양합니다. 용해 반응을 중지하려면 1마이크로리터의 정지 용액을 추가하고 실온에서 2분 동안 배양합니다.

이 절차를 시작하려면 먼저 96웰 플레이트의 각 웰에 0.5마이크로리터, 20마이크로몰, SMAT 15 및 SMAA 프라이머의 Eloqua를 추가합니다. 샘플을 섭씨 80도에서 5분 동안 가열합니다. 그런 다음 5 x 완충액 4마이크로리터, DTT 2마이크로리터, 역전사효소 1마이크로리터, D 및 tps 1마이크로리터를 추가합니다.

각 웰에 대해 열 순환기에서 역전사를 수행합니다. 열 프로그램을 섭씨 42도에서 90분 동안 설정한 다음 섭씨 85도에서 5분 동안 설정합니다. 역전사가 완료되었을 때 역전사효소를 비활성화하려면 각 CDNA 샘플에 4마이크로리터의 엑소 시약을 첨가하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하여 과도한 올리고뉴클레오티드 글라이드를 소화한 다음 섭씨 80도에서 15분 동안

엑소 시약을 비활성화하려면 SMAP 2개의 프라이머의 2개의 나노 몰로 PCR 반응 혼합물을 준비합니다. PCR 반응 혼합물 10마이크로리터를 추가합니다. 각 역 전사 샘플에.

20 사이클의 변성으로 구성된 증폭을 수행하고, 샘플을 증폭 한 후 무릎을 꿇고 확장 한 후 2 개의 96 웰 플레이트의 각 웰에 R-T-P-C-R 결과를 확인하기 위해 별도의 플레이트에서 두 세트의 정량적 R-T-P-C-R 반응을 수행하고, 2 개의 x 사이버 그린의 10 마이크로 리터를 추가합니다. PCR 마스터는 1마이크로리터의 증폭된 CDNA, 2개의 프라이머 및 7마이크로리터의 물을 혼합합니다. 프로그램을 섭씨 95도로 3초 동안 설정한 다음 섭씨 60도로 30초 동안 설정합니다.

40 사이클의 경우, 프라이머의 오류를 줄이기 위해 무릎 꿇는 단계가 제거됩니다. 본 연구에서는 무릎을 꿇고 Hess의 총 RNA를 마이크로그램 단위로 희석하여 기술적 변동성을 평가하고 G-A-P-D-H 유전자의 소량의 총 RNA에 대한 차이 검출을 MR을 사용하여 수행했습니다. 마이크로리터당 10나노그램에서 마이크로리터당 0.1피코그램으로 연속적으로 희석된 풀링된 껍질의 NA. 각 점은 팩스로 정렬된 연속적으로 희석된 mRNA와 단세포 mRNA의 CT 값을 보여줍니다.

각 샘플과 QR TPCR 결과 간에 상관관계가 관찰되었으며, 여러 개의 단일 세포가 유사한 CT 값을 보였습니다. 팩스는 OCT four EGFP reporter HESC 라인에서 강력한 EEG FP 양성 세포를 분류하고 선택하는 데 사용되었습니다. 결과는 음성 모집단에 비해 약 60%의 EGFP 양성 모집단을 보여주어 역전사 및 증폭 반응의 서로 다른 배치 간의 일관성을 검증합니다.

Fax purified single cell lysates를 반으로 나누고 배치 비교를 위해 프로토콜을 각 반에 적용했습니다. 단일 세포 용해물의 각 절반에 대한 OCT 4 CT 값 사이의 유의미한 상관관계가 관찰되었습니다. 단일 껍질 유전자 발현에 대한 히트맵 프레젠테이션은 일관되고 강력한 수준의 OCT 4 발현을 보여주지만, 다른 줄기 세포 마커 유전자의 다양한 수준인 NAN og를 종합하여 본 결과를 종합하면 이 단일 세포 유전자 발현 분석이 만능 줄기 세포의 집단 이질성을 연구하는 데 유용하다는 것을 보여줍니다.

이 동영상을 시청한 후에는 단일 세포 전사체에 대한 QITP를 올바르게 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.