Name: 정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 배우세요 정량적 RT-PCR을 이용한 개별 인간 배아 줄기 세포의 유전자 발현 프로파일링 방법을. FACS로 세포를 분리하고 역전사 및 증폭 후 정량 분석을 수행하여 줄기 세포 집단 내 이질성을 연구할 수 있습니다.

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우리는 원고에 대한 가치있는 토론을위한 이명박 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이명박 실험실에서 작업 세포 연구 기금 (TEDCO를) 줄기 뉴욕 줄기 세포 재단의 로버트슨 조사자 포상에서 메릴랜드에서 교부금에 의해 지원되었다.

96 - 웰 플레이트의 1. 준비 <ol><li> 9 μL 하나의 세포 용해 용액에 하나의 세포 DNase1 1 μl를 섞는다. </li><li> 96 - 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 10 ㎕를 혼합 용액을 넣어. </li></ol> FACS 정화 2. 분리 및 인간 배아 줄기 세포 <ol><li> 인간 ES 매체와 중화 된 37 ° C에서 20 분간 1 ㎖ Accutase와 60mm 접시,에서 OCT4 :: EGFP ES 세포주를 분리합니다. </li><li> FACS는 버퍼 1 ML에 세포 인구를 준비하고 1 X 10 6 세포 / ml로 셀을 조정합니다. </li><li> 35 μm의 셀 스트레이너 캡 튜브를 통해 세포 샘플을 전달합니다. </li><li> 셀 정렬하기 전에 얼음에 튜브를 저장합니다. </li></ol> 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 FACS 정제 된 단일 셀의 3. 용해 <ol><li> 숙련 된 운전자와 셀 분류기에 EGFP 양성 세포의 샘플을 정렬합니다. 96 - 웰 PCR 플레이트에 하나의 세포 Lysis/DNase1 솔루션으로 단일 셀을 넣습니다. 필요한 경우, 구샘플 6 - 웰 플레이트 한 달 미만 -80 ° C 냉동고에 저장 될 수 있습니다. </li><li> 세포 용해 실온에서 시료에게 5 분을 품어. </li><li> 용해 반응을 중지하려면 중지 솔루션 1 μl를 추가합니다. </li><li> RT에서 2 분을 품어. </li></ol> 4. 역전사 <ol><li> 20 μM SMA-T15, SMA-A의 각각 0.5 ㎕의 분취 량을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 물론 각 4 μL 배 버퍼, 2 μL DTT, 1 μL 역전사, 1 μL의의 dNTP를 추가합니다. </li><li> 열 자전거 타는 사람에 역전사를 수행합니다. <ol><li> 90 분 × 42 ° C에서 열 프로그램을 설정하고 85 ° C × 5 분에 역전사을 비활성화. </li></ol></li></ol> 5. 증폭 <ol><li> 각 역 전사 샘플 ExoSAP-IT 시약의 4 μl를 추가합니다. <ol><li> ExoSAP-IT 시약을 비활성화하는 15 분 15 분 80 ° C, 37 ° C에서 샘플을 품어. </li></ol></li><li> PCR 반응 혼합물을 제조 wi 번째 SMA-P2 (2 NM) </li><li> 각 역 전사 샘플 PCR 반응 혼합물의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 변성의 20주기 (30 초 94 ° C), 어닐링 (30 초 57 ° C) 및 확장 (68 ° C 10 분)로 구성된 증폭을 수행합니다. </li></ol> 6. QRT-PCR 성능 <ol><li> 물론 각 2X SYBR 녹색 PCR 마스터 믹스, 1 μL 증폭 된 cDNA, 2 nm의 프라이머, 7 μL의 물 10 μl를 추가합니다. <ol><li> 3 초 동안 95 ° C 다음에 프로그램을 설정, 30 초 × 40주기 동안 60 ° C에서. </li></ol></li><li> 기술적 인 오류에 대한 중복 수행합니다. </li></ol>

<ol><li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+from+mice+and+rats+exhibit+properties+consistent+with+a+generic+pluripotent+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state.</a> Development. 137, 2279-2287 (2010).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).</li>
<li>Stewart, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+hESCs+reveals+heterogeneity+within+the+pluripotent+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment.</a> Nat Methods. 3, 807-815 (2006).</li>
<li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. 499, 88-91 (2013).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
<li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li>
<li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+template+switching%3A+A+SMART+%28TM%29+approach+for+full-length+cDNA+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30, 892-897 (2001).</li>
<li>Pan, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li>
<li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

단일 세포 유전자 프로파일은 단일 세포의 기능이나 전체 인구를 예측할 수있는 중요한 도구가 될 수 있습니다. 기술적 인 제한으로 전체 유전자 프로파일 분석은 인구의 평균으로 제한하고있다. 유전자 발현 패턴 및 개별 세포 모집단 사이 수준의 변화는 잘못된 해석을 일으키는 것으로 제안되어왔다. 이러한 다양한 셀룰러 양태는 인간 배아 줄기 세포에서 발견 될 수 있고, 그들의 이질성 능성 운명 특정 처리를 유지하기위한 미묘한 차이를 유발 능력. 우리가 개발 한 개별 세포의 유전자 발현 연구를 위해 간단하지만 강력한 방법을 제공한다 단세포 정량적 RT-PCR에 대해 검증. 우리의 프로토콜의 유효성을 검사하려면, FACS 정제 된 단일 세포의 용해 액은 절반으로 나누어 정확도를 확인하기 위해이 방법을 적용 하였다. 하나의 세포와 우리의 결과는 희석 한 총 RNA 샘플을 뒷받침하고, 우리는 일관된 결과 B 발견etween 세포 용 해물의 각 반 (그림 4)....

가장 높은 진핵 생물의 인구가 풀링 인구의 분석에 따라서 이기종 있으며, 그것은 자신의 휴대 전화 기능을 해석하는 것이 어렵습니다. 인구 내의 개별 세포가 미묘하게 다를 수 있습니다, 그리고 이러한 차이는 전체 인구의 1, 2의 속성과 기능에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다. 특히, 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 섬세 독특한 방법으로 3, 4의 혈통 사양을 능성의 서로 다른 수준의 다양한 잠재력을 일으키는 이기종 것으로 알려져있다. 예를 들어, 다른 세포 표면 항원이 미분화 다 능성 줄기 세포를 분류하기 위해 사용될 수있다, (5) 및 오스틴 스미스 그룹은 그들의 형태, 감별 성향 및 통로 6 시그널링 종속성에 기초하여, 마우스 배아 줄기 세포의 다 능성의 상이한 레벨을 제안 하였다. 이러한 현상은 인간의 배아에 가설 된NIC 줄기 세포 12. 전체적인 연구는 다른 줄기 세포가 아닌 개별 단일 줄기 세포 사이에 수행 된 반면, 잠재적으로 모든 체세포 계통쪽으로 분화 능력에 영향을 단일 세포 수준에서 다 능성의 상이한 레벨을 분석하는 것은 매우 흥미로운 일 수 있었다. 세포 및 분자 이질성은 &#39;단일 세포의 사체&#39;라고하는 전사 프로파일에 의해 결정 및 유전자 발현 수준 8-10 정량화에 대한 새로운 접근 방식을 강조 할 수있다. 각각의 세포에서 유전자 발현 수준의 분석을 위해, 우리는 하나의 셀 정량적 RT-PCR의 간단하지만 강력한 프로토콜을 개발했다. 우리는 최소한의 기술적 변화와 차이의 결과로, 각각의 단일 세포 용 해물의 절반뿐만 아니라 인간 배아 줄기 세포의 희석 한 총 RNA를 비교하여 우리의 프로토콜의 효과와 가능성을 확인했다. 또한, 우리는 동질적인 (P)를 분리하는 유전자 기자 라인을 사용유전자 타겟팅 시스템을 이용하여 인간 배아 줄기 세포의 opulation. OCT4 궤적 (OCT4-2A-EGFP-PGK - 푸로가 구성) 및 TALEN 플라스미드의 한 쌍을 대상으로 대한 기증자 벡터 (11)를 사용 하였다. 기증자 벡터와 TALEN 플라스미드 한 쌍의 우리의 nucleofection 및 클론 선택 프로토콜과 인간 배아 줄기 세포는 우리의 일상적인 프로토콜 12을 기준으로 수행 된 유지 보수를 이용하여 인간 배아 줄기 세포 (H9, WA09)에 소개되었다. 우리는이 유전자 기자 라인 OCT4에 OCT4의 표현 EGFP을 표현 :: EGFP 인간 배아 줄기 세포를 확인했다. 우리의 결과는 (OCT4으로 분류 :: EGFP 강하게 양성 세포) 각각의 인간 배아 줄기 세포는 OCT4 표현의 높은 수준,하지만, NANOG 식의 다른 수준을 유지 것을 보여줍니다. 따라서, 우리의 단일 세포 유전자 발현 분석은 다 능성 줄기 세포의 인구 이질성을 연구하는 것이 유용 할 것이다.

<table><tbody><tr><td>96웰 PCR 플레이트</td><td>USA Scientific</td><td>1402-8900</td><td></td></tr><tr><td>Ambion 세포 용해 키트</td><td>Life Technologies</td><td>4458235</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe 역전사 효소</td><td>Clonetech</td><td>639536</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>USB</td><td>78200</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA 중합효소 고충실</td>도 <td>Invitrogen</td><td>11304</td><td></td></tr><tr><td>10mM dNTP 믹스, PCR 등급</td><td>Invitrogen</td><td>18427</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Universal 2X Master Mix</td><td>Kapa biosystem</td><td>KR0389</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>S-1100-1</td><td></td></tr><tr><td>FACS 버퍼</td><td></td><td></td><td>45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 &mu; l DNase, 필터 살균</td></tr><tr><td>35 &mu; m 세포 스트레이너 캡 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

정량적 rt-pcr에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

줄기 세포 인구의 이질성은 다른 계통쪽으로 분화 성향으로, 줄기 세포 생물학에 대한 자세한 이해를 방해한다. 단일 세포 사체 분석은 개인차를 해부하기위한 새로운 접근 방식이 될 수 있습니다. 우리는 하나의 셀 QRT-PCR 방법을 개발하고,이 방법은 여러 유전자 발현 프로파일에서 잘 작동하는지 확인했다. 단일 세포 수준에서 OCT4으로 분류되어 각각의 인간 배아 줄기 세포, :: EGFP 양성 세포는 OCT4 높은 표현하지만, NANOG 표현의 다른 수준이 있습니다. 우리의 단일 세포 유전자 발현 분석은 인구의 이질성을 심문하는 것이 유용 할 것이다.

효율적이고 강력한 단일 세포의 RNA 증폭 인간 배아 줄기 세포 사이의 전사 변화를 최소화하기 위해, 우리는 OCT4을 사용 :: FACS 정화용 EGFP hESC의 클론. 96 - 웰 플레이트에 OCT4 :: EGFP 양성 세포를 선별 한 후, 각 세포는 용해 버퍼에 용해하고 SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) 프라이머를 사용하고 SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG로 고정 된 전체 길이의 cDNA에 폴리 (A) + RNA를 변환 ) SMART 템플릿 스위칭 기술을 사용함으로써. 과량의 올리고 뉴클레오티드는 다음 SMA-P2 (GACATGTATCCGGATGT) 13의 cDNA의 PCR 증폭의 18-20 회 반복, ExoSAP-IT 시약으로 분해 하였다. 우리는 QRT-PCR에 대한 템플릿 (그림 1)</stro...

단일 세포 유전자 발현 분석은 줄기 세포 이질성을 이해하는데 필요하다.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 단일 세포 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(single cell quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 이용하여 개별 인간 배아 줄기 세포의 유전자 발현 수준을 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 형광 활성 세포 분류법(fluorescent activated cell sorting)을 사용하여 세포 용해 버퍼가 들어 있는 96-웰 플레이트의 각 웰에 개별 세포를 분류합니다. 두 번째 단계는 단일 세포 용해물로부터 cDNA를 생성하기 위해 RNA를 역전사하는 것입니다.다음으로, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 cDNA를 증폭합니다. 마지막 단계는 증폭된 cDNA에 대해 정량적 RT-PCR을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 이 분석법은 인간 배아 줄기 세포와 같은 이질적인 집단 내의 유전자 발현을 연구하는 데 유용합니다.기존의 단일 세포 정량 인공 혈관 제작법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 EEG 및 더 견고한 사전 정제 단계가 적용된다는 점입니다. EGFP 인간 배아 줄기 세포(hESCs)를 60 mm 디쉬에서 분리합니다. 배지를 모두 제거하고 Accutane 1 mL를 첨가한 후 37 °C에서 20분 동안 배양합니다.1 mL의 인간 ES 배지로 Accutane을 중화시킨 후, 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 형성합니다. FACS 완충액으로 세포를 재현탁하고 농도를 1 × 10⁶ cells/mL로 조정합니다. 다음으로, 세포 샘플을 35 µm 세포 스트레이너 캡 튜브에 통과시킵니다. 세포 분리 전까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.1 µL의 single cell D Ns one과 9 µL의 single cell lysis solution을 포함하는 마스터 믹스를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 96-well PCR 플레이트의 각 웰에 믹스 용액 10 µL를 분주합니다. FACS 분석을 위해, 세포 분류기를 프로그래밍하여 EGFP 양성 단일 세포를 96-well PCR 플레이트의 각 웰로 분류합니다. 세포 분류 후, 세포 용해를 위해 시료를 상온에서 5분 동안 배양합니다. 용해 반응을 중단하려면 stop solution 1 µL를 첨가하고 상온에서 2분 동안 배양합니다.이 절차를 시작하려면 먼저 96-웰 플레이트의 각 웰에 20 µM SMAT 15 및 SMAA 프라이머 0.5

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생물학

우리는 사전 microRNA의 설정 및 분석 서비스를 선보일 예정 써모 과학 매트릭스 멀티채널 피펫과 수작업으로뿐만 아니라 로봇을 사용하여 QPCR위한 96 잘 배열.

정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

여기 샘플 제한된 양의 작업 특히, microRNA (miRNA) 표현 수준에 대해 비용과 시간 효율 높은 처리량 검사 도구로 microfluidic 플랫폼와 함께 최적화된 멀티 플렉스 반전 transcriptase 정량 PCR (qRT - PCR) 프로토콜을 설명합니다.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

이 문서는 인간의 배아 줄기 세포 집단에서 인간 간장 endoderm의 생성에 초점을 맞출 것이다.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

단세포 표현 프로 파일링 개별 세포의 자세한 유전자 발현 분석을 수 있습니다. 우리는 cardiomyocytes의 격리를 위해 방법을 설명하고, 구체적인 목표의 전체 transcriptome의 microarray 또는 qPCR 중 하나에 대한 결과 lysates를 준비.

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

단일 망막 세포와 그 cDNAs의 후속 증폭의 절연을위한 방법을 설명합니다. 단일 세포 transcriptomics는 조직의 세포 이질 선물의 정도를 보여 희귀 세포 집단에 대한 새로운 마커 유전자를 알게되어. 동반 프로토콜은 다양한 세포 유형에 맞게 조정할 수 있습니다.

개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링

뇌 종양 세포 시작 (BTICs), 이기종 종양이 가진 줄기 세포의 속성 내에있는 희귀 한 세포의 식별은 인간의 뇌 종양의 pathogenesis에 새로운 통찰력을 제공합니다. 우리는 BTICs에 풍부하게 특정 문화 조건을 정제 한, 우리는 정기적으로 더 이러한 인구 풍부 유동 세포 계측법을 사용합니다. 단일 셀 RT-PCR에 의한 자기 갱신 assays 및 성적표 분석은 이후 이러한 절연 셀에 수행 할 수 있습니다.

정렬 줄기 세포 Assays 및 흐름에 대한 기본 뇌 종양 조직의 처리

분화된 인간 신경 줄기세포(hNSCs)에서 miRNA의 변화를 특성화하기 위한 목적으로 3차원 시스템에서의 hNSC 분화, miRNA PCR 어레이에 의한 microRNA 발현 변화 평가, miRNA 표적 예측을 위한 컴퓨터 분석 및 이중 루시페라제 분석에 의한 검증에 대해 설명합니다.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

이 프로토콜은 추가적인 외인성 보충 또는 hPSC 특이적 합성 하층(hPSC) 없이 젤라틴으로 코팅된 접시에 담긴 인간 태반에서 유래한 조건화된 배지만을 사용하여 인간 만능 줄기세포(hPSC)를 증식시키는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다.

소설 문화 모델은 인간 다 능성에 대한 태반 에어컨 미디어에서 젤라틴에 세포 전파 줄기

우리는 단일 포유류 세포를 분류하고 각 세포에서 최대 96개의 관심 대상 유전자의 발현을 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 방법에는 절대 전사체 수를 추정할 수 있도록 내부 qPCR 표준을 사용하는 것이 포함됩니다.

내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

대량 유전자 식 측정 클라우드 개별 셀 차이 이종 세포 인구에서. 여기, 우리는 프로토콜 설명 어떻게 단일 셀 유전자 표정 분석 및 인덱스에 대 한 분류로 개화 활성화 셀 정렬 (FACS)이 윤곽을 그리 다 결합 될 수 있다 및 immunophenotypically 특성 분자로 뚜렷한 세포 인구.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

배우세요 정량적 RT-PCR을 이용한 개별 인간 배아 줄기 세포의 유전자 발현 프로파일링 방법을. FACS로 세포를 분리하고 역전사 및 증폭 후 정량 분석을 수행하여 줄기 세포 집단 내 이질성을 연구할 수 있습니다.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

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