Name: 인간 호중구 유량 용기 접착 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 배우세요 인간 호중구 유량 용기 접착 분석법으로 전단 응력 조건에서 호중구의 견고한 접착을 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 자가면역 질환 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 루퍼스 연구소 (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 및 NIH UL1-TR00165 후원됩니다. 우리는 자신의 지속적인 지원을 위해 로버트 P. 킴벌리 감사합니다.

이 연구를 위해 모집 모든 기증자가 서면 동의를 준 연구는 버밍엄 기관 평가위원회에서 알라바마의 대학에 의해 승인되었습니다. 1. HUVEC 초기 문화와 서브 컬쳐 <ol><li> 내피 세포의 기초 배지 구성되어 완전한 성장 배지에서 체외 배양 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 내피 세포 성장 인자로 보충 (자재 목록 참조). 참고 :이 연구에 사용 된 성장 요인은 다음을 포함한다 : 5 NG / ML 인간 재조합 표피 성장 인자 (hEGF), 1.0 ㎎ / ㎖의 하이드로 코티손, 50 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신 및 50 NG / ML 암포 테리 신-B (GA-1000), 2 % 태아 소 혈청 (FBS), 0.5 NG / ML 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 10 NG / ML 인간 섬유 아세포 성장 헤파린 (hFGF-B)와 인자 - 기본, 20 NG / ML 인간 재조합 인슐린과 같은 성장 인자 ( R 3-IGF-1) / ㎖ 아스코르브 산 1 μg 및 22.5 ㎍ / ml의 헤파린. 완전 배지37 ° C에서 처음에 준비하고 준비 1 개월 이내에 사용하기 위해 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 세포의 플라스크를 준비하려면, 전체 성장 매체는 75 ㎠의 조직 배양 플라스크 (1 ㎖ / 5cm 2)에 다음 플라스크의 배양기에서 37 ° C / 5 % CO 2 평형을 허용 추가 적어도 30 분. 인간은 HUVEC / cm 2 2,500-5,000 세포의 밀도로 평형화이 배양 플라스크에 직접 파종한다. </li><li> 미디어가 평형을하는 동안 신속하게 37 ° C의 물을 욕조에 주식 HUVEC의 cryovial을 해동. 볼 텍싱에 의해 일본어 저장 바이알 세포를 분산하고 / cm 2 2,500-5,000 세포 밀도를 달성하기 위해 미리 평형화 HUVEC 완전 성장 배지를 함유하는 배양 플라스크에 직접 추가. 부드럽게 골고루 세포를 배포 한 후 인큐베이터에 플라스크를 반환하는 플라스크 바위. 이 세포는 현재 1 차 통과를 나타냅니다. </li> &lt;세포를 70 ~ 80 % 년 합류 할 때까지 리&gt; 보통은 이틀마다 변경해야합니다. </li><li> HUVEC를 지금 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 문화 플라스크에서 수확 할 수있다. 배양 배지는 세포에서 남아있는 단백질과 칼슘을 제거하는 PBS 린스 다음에 배양 플라스크에서 흡입됩니다. 0.25 % 트립신-EDTA 용액을 첨가하고, 광학 현미경에 의해 평가로 2-6 분의 세포 분리에서 분명해야한다. </li><li> 세포의 90 %가 플레이트 오프 반올림되는 경우, 2X 트립신 억제제의 동량을 첨가함으로써 트립신을 멈춘다. 세포 수확을 용이하게하기 위해, 완전 성장 배지의 다른 동등한 양을 추가한다. 멸균 15 ML의 원심 분리기 튜브에 분리 된 세포를 전송합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 225 XG에서 분리 된 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음하고 완전한 성장 매체의 2 ~ 3 ㎖의 세포를 재현 탁. hemacytometer와 트리 판 블루를 사용하여 세포 농도 및 생존 능력을 결정합니다. </li><li> 일을 사용하려면전자 연구를위한 세포, 다시 씨앗 추가 75cm / ㎠ 10,000 세포의 밀도로 세포 2 플라스크를 수확하고 2.2 단계로 진행합니다. 또한, 세포는 미래의 연구를 위해이 시점에서 고정 할 수 있습니다. 냉동 세포를 들어, 실온에서 5 분 동안 225 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 상등액 대기음하고 1 × 106 세포 / ml의 농도에서 10 %의 DMSO를 함유 FBS에서 세포 펠렛을 재현 탁. 세포 현탁액을 세포 냉동 컨테이너에 세포를 고정한 후 cryovials에 옮기고 -80 ° C에 저장된다. </li></ol> 2. HUVEC 계층 준비 <ol><li> 냉동 2 차 통과 된 HUVEC의 사용 : 부흥과 문화. 적극적으로 성장하는 세포를 사용하는 경우, 2.2 단계로 진행합니다. <ol><li> 37 ° C의 물을 욕조에 신속하게 단계를 1.8에서 2 차 통과 된 HUVEC을 포함하는 cryovial을 해동. 15 ㎖의 멸균 원심 분리 관에 cryovial 세포를 전송하고 10 ㎖ 성장 메디 추가음. </li><li> 상온에서 5 분 200 XG에서 세포를 원심 분리기 및 잔류 DMSO를 제거 뜨는을 대기음. </li><li> 완전 성장 배지로 세포 펠렛을 재현 탁하고 75cm 2 플라스크에 세포를 옮긴다. 전체 볼륨에 대한 20 ~ 25 ml로 성장 매체를 추가하고 37 ° C / 5 % CO 2에서 품어. </li></ol></li><li> 시각 매체의 변화 이틀에 하루에 합류하기위한 세포 배양을 검사합니다. 보통 2 ~ 4 일 이내에, 세포들은 흐름 챔버 분석에 사용하기위한 준비가 될 것입니다 어떤 시간에 80~90% 합류에 도달 할 것입니다. </li><li> 유량 용기에 사용되는 배양 접시를 준비하려면 (5 장 참조), 수 있도록 10 ㎍ / ml의 피브로넥틴 1 ㎖와 0.05 % 35mm 조직 문화 요리와 피펫 (w / v)의 젤라틴을 여러 번 추가 확인 전체 플레이트 표면은 코팅되어있다. 단백질 매트릭스 형성을 최적화하기 위해 최소 30 분 동안 접시를 건조 과도한 피브로넥틴과 젤라틴 용액과 공기를 제거합니다. Fibronectin 젤라틴 용액을 10 배까지 재사용 할 수있다. </li><li> 단계 1.5-1.7의 설명에 따라 트립신-EDTA를 이용하여 단계 2.2에서 HUVEC 세포를 수확. 각 코팅 조직 배양 접시에 50 만 셀을 시드. 각 접시에 2 ㎖ 성장 매체를 추가하고 37 ° C / 5 % CO 2에서 품어. </li><li> 세포 단계 2.2에서와 같이 합류로 성장할 수 있습니다. 세포는 시각 매체의 변화 이틀 매일 점검해야한다. 이전 유량 용기의 분석에, 접착 분자 발현을 상향 조절하고 자극하는 4 ~ 6 시​​간 동안 20 NG / ML 인간 TNF-α와 HUVEC 총리. </li></ol> 3. 정화 리간드 코팅 <ol><li> 35mm 조직 배양 접시의 중앙에 마커 또는 펜으로 0.5 cm 직경의 원을 그립니다. </li><li> 표시된 지역에서 20 ㎍ / ㎖의 단백질의 판 (20) μL. 단백질에게 0.5 cm 직경의 원 안에 전체 영역을 커버하는 솔루션을 확산 피펫 팁을 사용합니다. 그것은 D의 표면을 만지거나 긁지하는 것이 중요하다ISH. 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 1 ㎖의 PBS (산도 8.0)와 단백질 코팅 된 플레이트의 3 배를 씻으십시오. </li><li> 비 특정 판에 바인딩을 차단하기 위해 표시된 부분의 판 (50) ㎕의 1 % BSA. 4 ℃에서 2 시간 동안 배양 </li><li> 단계 3.3에서와 같이 1 ㎖의 PBS 차단 판의 3 배를 씻으십시오. </li><li> 코팅 구단 유착 수용체 리간드 키메라 단백질 솔루션을 준비합니다. 이 실험에서, 25 ㎍ / ml로 ICAM-1/Fc 키메라 PBS 용액 및 0.5 ㎍ / ml로 P-Selectin/Fc 키메라는 (산도 8.0)을 사용 하였다. </li><li> 코트 기판의 50 μL로 표시된 부분. 4 ℃에서 하룻밤 배양한다 접시 2 일 이내에 사용되어야하며, 코팅 된 지역은 건조하도록 허용 할 수 없습니다. 접시에 50 μL 솔루션을 유지하기 위해 필요한 경우 PBS를 추가합니다. </li></ol> 4. 호중구 분리 (실내 온도에서 수행되는 모든 단계) <ol><li> 동의를 얻은 후, 정맥 절개에 의해 참가자의 혈액을 수집N 항 응고 혈관 또는 vacutainer (EDTA 또는 헤파린). 채혈 후 분리하기 전에 PBS와 혈액 1:1 희석. </li><li> 50 ㎖ 원심 분리기 튜브에 PBMC 및 호중구를 분리하는 2 개의 층 피콜를 준비합니다. 처음 15 ㎖의 헤비 피콜 (재료의 목록, ρ = 1.118-1.120 참조)에 추가 한 다음 조심스럽게 10 ㎖ 무거운 피콜 위에 (재료의 목록, ρ = 1.077-1.080 참조) 피콜 빛 층. 빛 피콜 무거운 피콜 층 사이에 날카로운 경계가 있어야합니다. 마지막으로,주의 깊게 피콜 층을 방해하지 않고 빛 피콜 위에 희석 된 혈액 샘플 25 ㎖ 레이어. </li><li> 실온에서 30 분 동안 250 XG에서 튜브를 원심 분리기. 주의 : 이러한 스핀은 원심의 끝에서 로터 감속시의 세포 분리의 잠재적 인 방해를 최소화하기 위해 원심 로터 브레이크가 해제되어야한다. 원심 분리 후, (위에서 아래로) 다음의 층 존재 : 상부 층은 플라즈마 FOLLO이며광 피콜 층 위에 PBMC 층에 의해 물, 약간의 적혈구 (RBC)와 호중구 층은 튜브의 바닥에서 무거운 피콜 층과 적혈구이어서 가볍고 무거운 피콜 사이​​이다. </li><li> 수확하고, 전송 피펫으로 새로운 50 ㎖ 튜브에 호중구 계층 전송을 실온에서 10 분 동안 225 XG에 50 ㎖ 원심 분리기의 최종 부피 PBS를 추가. <ol><li> 원심 분리 후, 여전히 호중구와 혼합 적혈구가있을 수 있습니다. 아래로 10 ㎖ 마크 뜨는을 대기음. 튜브 (또는 간단한 저속 소용돌이로 교반)의 부드러운 교반 호중구 RBC 펠렛을 재현 탁하고 PBS 50 ㎖로 다시 세척한다. </li></ol></li><li> 두 번째 세척 후, 뜨는을 대기음. , 오염 적혈구를 제거 교반 (또는 짧은 소용돌이로 교반)에 의해 잔류 PBS의 펠렛 세포를 재현 탁하려면 25 ML의 H 2 O 및 RBC를 용해하는 10 초 동안 부드럽게 소용돌이를 추가합니다. <ol><li> 1.8 % 염화나트륨 25 mL를 넣고 즉시 혼합실온에서 10 분 동안 225 XG에서 원심 분리함에 따라. 오염 RBC는 이제 흰색 호중구 세포 펠렛을 떠나 용해되어야한다. </li></ol></li><li> PBS와 호중구 세포 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 10 % FBS와 RPMI 배지에서 격리 된 호중구를 재현 탁하고 혈구와 광학 현미경으로 세포 농도를 결정한다. </li><li> 완전 RPMI-10 % FBS 배지로 500,000 세포 / ml의 세포 밀도를 조정한다. </li></ol> 5. 유량 용기 접착 분석 <ol><li> 유량 용기를 조립합니다. 현미경 테이블에 합류 HUVEC를 또는 정제 부착 수용체 리간드를 포함하는 35mm 접시를 놓습니다. 주사기 펌프, 진공 시스템과 병렬 플레이트 흐름 챔버를 연결하고 호중구 입력 오픈 한 줄을 둡니다. 접시 위에 유량 용기를 삽입하고 유량 용기 조립체 (13)를 고정합니다. (그림 1 참조) </li><li> 컴퓨터 연결된 t에 녹화 프로그램을 시작현미경 오. 완전히 성장 HUVEC 세포와 명확한 필드 또는 리간드 코팅 영역을 볼 수 있습니다 내에서 필드까지 현미경의 필드와 초점을 조절합니다. </li><li> 주사기 펌프를 사용하여, RPMI 배지로 유동 챔버를 헹군다. 챔버 내의 기포 또는 호중구 입력 라인이 없는지 확인합니다. </li><li> 원하는 경우, 호중구는 10 분 동안 낮은 복용량 (10 -8 M) fMLP으로 뇌관을 할 수있다. 이것은 다른 기증자 (14) 사이의 호중구 활성화의 기초 수준의 일치를 허용합니다. </li><li> 정의 속도 유량 용기에 (이 연구에서 사용되는 / ㎠ 1.5 다인의 전단 응력과 동일 350 μL / 분의 속도) 호중구를 주입하는 주사기 펌프를 사용합니다. 영상을 기록합니다. 호중구 밀착성이 빠르게 일어날 수 있으므로, 4-5 분의 길이는 비디오 분석을 위해 점착 이벤트를 정량하는 것이 충분하다. </li><li> 부착 성 세포는 이하 기포 직경을 이동 셀로서 정의된다HUVEC 또는 리간드 코팅 된 표면 (15, 16)에 5 초 이내. 이 규칙을 사용하여 기록 된 영상 내에 존재하는 필드에 부착 세포의 총 수를 센다. 다른 기증자 호중구와 비슷한 길이의 동영상을 기록하여, 하나는 다른 기증자 사이의 접착 특성을 비교하기 위해 부착 세포 / 분을 계산할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

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이 프로토콜은 깎아 지른듯한 스트레스 조건에서 호중구의 부착주의 정량화를위한​​ 최소한의 활성화 된 호중구의 분리 및 격리를 안내합니다. 호중구 부착 염증에서 중요한 과정이다. 이 과정에서 여러 분자의 유전자 변종은자가 면역 질환 1,2의 발전에 걸리기 입증 되었기 때문에, 정량적으로 인간 호중구 회사의 접착력을 평가 할 수있는 분석 시스템이 필요합니다. 이 프로토콜에서 설명하는 방법은 깎아 지른듯한 스트레스 조절 체외 환경에서 호중구의 회사 접착제 전위의 신중하고 정량 할 수 있습니다. 이 방법은 따라서 유전자형 개인 간의 양적 호중구 부착 직접 비교가 부착 분자 (14)의 유전 적 변이의 중요도를 결정한다. 이 방법의 몇 가지 단계에 achiev을 충분히 고려 공로전자 고도의 양적 및 재현 가능한 결과. HUVEC 제제에서, 유동 챔버 내에 사용하기 전에 100 % 세포의 합류를 달성하는 것이 중요하다. 정제 리간드로 코팅 된 표면을 사용하기 위해, 기판 코팅 영역은 리간드 변성 방지하기 위해 건조하도록 허용해서는 안됩니다. 또, 인간의 호중구의 제제는 실험의 성공에 중요하다. 혈액에서 호중구를 분리의 주요 이슈 조심스럽게 분리하고 실험을, 활성화를 피하기 위해 소용돌이로 교반을 최소화 (혈액은 실온에서 수행되어야 얼음과 원심 분리 단계에 저장할 수 없습니다 즉) 실온에서 세포를 유지하고 완료하여 처리 포함 가능한 한 최소의 시간에. 또한 이러한 분석법 17,18 위해 세포를 준비하는 데에 이용 될 수있는 추가 호중구의 분리 방법이있다. 갓 고립 된 인간의 호중구를 사용하여 실용적인 관점, 접착 분석에서<html> 참가자 정맥 절개 후 3-6 시간 이내에 시작되어야한다. 호중구 처리에 매우 민감으로, 채혈 및 사용 사이의 오랜 시간 분석 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 종래 유동 챔버 분석에 호중구 세포 농도의 신중한 판단이 정확하고 재현성있는 결과를 달성하기 위해 필요하다. 흐름 챔버 분석 동안, 흐름 속도가 일치하고 실험의 길이에 걸쳐 제공된 난류이 없도록 신중 비디오 기록을 감시하는 것이 중요하다. 유동 속도 변화 나 난류의 존재는 실험을 반복 할 것을 필요로한다. 실험 한 결과, 호중구가 응집되지 않도록 미세 잔존 호중구를 평가하는 것이 중요하다. 이 시점에서 응집하면 호중구가 크게 실험 기간 동안 호중구 밀도를 변경할 수있는 활성화 될 것을 나타냅니다. 내용 &quot;&gt; 흐름 챔버는 Q가 = 유량 챔버 내 주변의 균일 한 얇은 응력 (τ = 6Qμ / (WH 2), μ = 동점도 및 유량 용기의 W = 폭의 H = 높이를 생성 ) 챔버 (15)를 흐른다. 우리의 연구에서, 우리는 / cm 2 1.5 다인의 깎아 지른 스트레스를 생성 호중구 접착에 350 μL / 분의 유속을 사용 (= w 0.25 cm, H = 인치 0.01, 물의 점성 37 ° C에서 (0.007 포이즈가)) RMPI 매체의 점도의 근사치로 사용 하였다. 특정 유동 챔버를 들어, 하나의 다른 생리적 조건을 모방하도록 투명 응력의 상이한 레벨을 달성하기 위해 유량을 변경할 수있다. 일반적인 생리적 전단 응력보기 인간 혈관 0.5-5.0 다인 / cm 13,16 사이의 범위. 다른 혈관에서 전단 응력 수 및 다른 동물은 표 1 113,16,19 20에 열거 하였다. 우리의 방법은 인간의 neutrophi의 접착의 연구에 초점을 맞추고있는 동안LS,이 방법은 호중구에 한정되지 않고, 용이하게 부착 또는 간단한 변형을 가진 다른 세포 유형의 압연 연구에 적용될 수있다. 또한,이 방법에서는 기판은 다른 목적을 위해 변경 될 수있다. 이 프로토콜은 서로 다른 연구에 쉽게 적응할 수 있지만, 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 여기에 구현 된 프로토콜 분석을 위해 일차 전지의 많은 수를 필요로한다. 이 작은 동물에서 일차 전지의 분석을 방해 할 수 있습니다. 또한, 가능 / 활성 형태로 정제 된 점착 리간드를 고정화 할 필요가 리간드의 범위를 제한 할 수있다. 된 Fc 융합 단백질의 용도는 크게 플레이트 표면에 적절한 리간드의 입체 구조를 달성 할 가능성을 향상시킨다. 그럼에도 불구하고, 우리의 방법은 접착 이벤트의 정량 분석​​을 허용하기 위해 상당한 유연성을 가지고 있습니다. 이러한 연구는 매우 우리의 유착 수용체 리간드 쌍의 이해, 유전자 변종의 잠재적 기능의 중요성을 향상시킬 것입니다이러한 단백질, 인간의 질병의 병인에.

모두 β 2 인테그린 및 ICAM 리간드의 유전자 변종은 현재자가 면역 질환의 1,2의 개발과 관련된 것으로 인식하고 있습니다. 이러한 변이를 가진 사람에서 파생 된 세포에서 이러한 변종의 기능적 결과의 결정은 이러한 변형은자가 면역 질환의 발병에 기여하는 방법에 대한 우리의 이해가 필요합니다. 이러한 기능적 연구는 자연적으로 발생하는 유전자 변종은 건강과 질병 모두에서 면역 반응을 형성하는기구의 판정을 허용. SLE의 구체적인 예에서, 우리는 지금 그 ITGAM (CD11b를) 변종 알고 리간드는, ICAM-1, 1,2 강하게 질환의 개발에 연결합니다. 호중구는 염증 반응에 중요하기 ​​때문에, 호중구 부착의 양적 연구는 ITGAM / ICAM의 유전자 변종이 염증을 변경하는 방법으로 기계적인 통찰력을 제공 할 수 있습니다. Neutrop세포 (EC)를 내피 밀착성을 HIL은 매우 규제 과정 및 염증 반응 3,4에 필수적인 역할을한다. 호중구의 밀착성은 EC에 초기 호중구 압연 및 캡처를 다음과 궁극적으로 생체 내에서 윤회가 발생할 수 있습니다. 이러한 프로세스는 ICAM-1을 포함한 부착 분자의 많은 종류, ICAM-2, P-셀렉틴, E-셀렉틴 내피 세포 및 호중구 5-9이 인테그린을 β를 포함한다. 따라서, 접착 분자의 서로 다른 대립 유전자 변형을 가진 기증자로부터 호중구 부착주의 정량화이 유전자 변종의 기능 및 병리학 적 결과를 이해하는 것이 중요 할 것입니다. 유동 챔버의 사용은 생체 내 실험 10-12에서 혈관 환경에서 관찰 된 것과 유사한 유체 전단 응력으로 체외 환경을 만들 수있다. 실제로, 유량 용기의 분석은 인간의 umbili과 함께CAL 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 혈관의 생체 내 환경을 모방 할 수있다. 이 방법을 사용하여, 하나는 내피 세포를 향해 전체 세포 접착 특성을 연구 할 수 있습니다. 또, 유동 챔버의 고도로 통제 된 환경은 또한 셀의 평가는 ICAM-1의 특정 수용체​​ - 리간드 상호 작용의 연구를 용이하게 정제 된 점착 리간드에 결합한다. 우리는 여기에서 HUVEC로 정제하여 리간드 기재에 인간 말초 혈액 호중구의 접착 특성을 연구하는 유동 챔버 접착 분석 시스템을 이용하는 방법을 제시한다. 다른 접착 분자의 대립 유전자의 변형을 표현하는 기증자의 세포로이 방법을 사용하면 우리가이 유전자 변종 인간 호중구 회사의 접착 성을 변경할 수있는 방법을 평가할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신/EDTA</td><td>Life technologies</td><td>25200-056</td><td>페놀 레드</td></tr><tr><td>2x 트립신 억제제</td><td>Life technologies</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>35mm 조직 배양 접시</td><td>Corning Inc.</td><td>430165</td><td>표준 조직 배양 처리 표면</td></tr><tr><td>75cm2 조직 배양 플라스크</td><td>Corning Inc.</td><td>430641</td><td>표준 조직 배양 처리된 표면</td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Dage-MTI</td><td>모델 300T-RC</td><td></td></tr><tr><td>세포 동결 컨테이너&nbsp;</td><td>살생물제</td><td>BCS-045</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC 성장 기초 매체</td></tr><tr><td>EGM-2 Bulletkit</td><td>Lonza Inc</td><td>CC-4176</td><td>HUVEC 기초 매체용</td></tr><tr><td>성장 인자 FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td>인증,</td></tr><tr><td>소 가죽에서</td>열 비활성화<td>젤라틴</td><td>시그마</td><td>G9391</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>인간 플라즈마</td></tr><tr><td>플로우 챔버</td><td>Glyco Tech</td><td>31-001</td><td>35mm 접시용 원형 플로우 챔버</td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma</td><td>47729</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-11191</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Heavy Ficoll</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2517A</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R& 시리즈 D Systems</td><td>720-IC</td><td>Fc 키메라</td></tr><tr><td>림프구 분리 매체</td><td>Mediatech Inc.</td><td>25072CV</td><td>광 Ficoll</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td>L-글루타민 및 페놀 레드</td></tr><tr><td>단백질 A</td><td>Sigma</td><td>P6031</td><td>PBS</td></tr><tr><td>P-Selectin</td><td>R&에서 재현탁; D Systems</td><td>137-PS</td><td>Fc 키메라</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>KD Scientific</td><td>KDS270</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&#945;</td><td>생명 과학</td><td>PHC3015</td><td>재조합 인간 단백질</td></tr><tr><td>트리판 블루 솔루션, 0.4%</td><td>생명 과학 기술</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

내피 세포 호중구 회사 접착은 건강과 질병 모두 염증에 중요한 역할을합니다. 호중구 회사 접착 과정은 β 2 인테그린의 회원들과 ICAM 가족들의 반대 수용체 등 다양한 접착 분자를 포함한다. 최근에, 모두에서 자연적으로 발생하는 유전자 변종은 2 인테그린을 β 및 ICAMs은자가 면역 질환과 연관된 것으로보고있다. 따라서, 이러한 접착 분자의 다양한 대립 유전자 형태를 가진 사람에서 호중구의 양적 접착 능력은자가 면역의 개발을 기본 메커니즘과 관련하여 공부하는 것이 중요합니다. 흐름 챔버 시스템에서의 접착 연구는 생체 내에서 혈관 환경에서 관찰 된 것과 유사한 유체 전단 응력과 환경을 만들 수있다. 여기서, 우리는 인간 말초 혈액 호중구의 정량적 접착 특성을 연구하기 위해 유동 챔버 분석 시스템을 이용한 방법을 제시의 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)로 정제 리간드 기판에. 이 방법으로 접착 수용체 다른 대립 유전자 변형을 가진 기증자의 호중구 접착 능력을 평가하고 비교할 수 있습니다. 이 방법은 또한 다른 주 세포 유형 또는 세포주의 밀착성을 평가하기 위해 수정 될 수있다.

호중구의 예는 정제 리간드 (ICAM-1/P-Selectin) 코팅 유량 용기 (그림 2) 또는 HUVEC 코팅 흐름 챔버 분석 (그림 3)에 결합하는 호중구의에 바인딩이 표시됩니다. 도면에 도시 된 바와 같이, 호중구는 연속적인 흐름의 조건 하에서 피복면 또는 HUVEC에 밀착 / 축적하는 것을 계속한다. 우리의 일반적인 실험 조건에서, 우리는 확고하게 네 분의 기록 기간 동안 코팅 표면 또는 HUVEC에 부착 50-70 인간 호중구를 관찰 할 수 있습니다. 그러나, 호중구 부착 분자, 또는 기판 (정제 리간드 또는 HUVEC)에있는 대립 유전자 변형 대립 유전자 변형이 실질적으로 양적 호중구 부착 (14)를 변경할 수 있습니다. 우리는 우리의 연구에서 관찰 된 호중구 부착 이벤트의 시간 의존성을 평가했다. 우리가 일정한 유량 조건을 유지하고 있지만, 그것은 세포의 접착 성이 시간에 따라 변경하는 것이 가능하다. However, 우리의 연구에서 비교적 짧은 시간의 과정을 통해, 우리는 시간이 지남에 따라 접착력의 비율에 어떤 일관성있는 차이를 관찰하지 않습니다. 예를 들어, 3-4 분 시간 지점 사이에서 관찰 접착력에 비해 1-2 분 시점에서의 밀착성을 평가 일관 다르지 않다. 세포 부착 실험 동안 자극되는 경우 물론, 다음 시간에 따른 접착 특성의 변화가 예상 될 수있다. 우리의 연구에서, 우리는 의도적으로 공부를하기 전에 10 분 동안 낮은 복용량 fMLP (10-8 M)와 함께 세포를 프라이밍하여 격리 유도 호중구의 활성화를 위해 제어. 내피 세포 (우리의 연구에서 HUVEC)도 최적의 백혈구 회사의 접착 접착 분자의 발현을 상향 조절하기 전에 정품 인증이 필요합니다. 전처리의 부재에서, 내피 세포 (HUVEC를)는 매우 적은 호중구 부착을 지원할 것이다. 우리의 연구에서, 우리는 10 NG / ML 사용하기 전에 4-6 시간 동안 TNFα 처리를 사용했다. IL-1β (10 NG / ㎖)<html> LPS (0.5 ㎍ / ㎖)을 또한 내피 세포를 미리 활성화하는 데 사용할 수있다. 중요한 치료는 HUVEC 세포 부착이 특정 (수용체 - 매개) 중성구 - 내피 세포 상호 작용에 의해 발생되도록하여 음성 대조군으로 사용할 수있다. 또는, 항 - 수용체 항체는 접착 특이성을 평가하는 특정 수용체​​를 차단하기 위해 사용될 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> 현미경 단계의 그림 1. 흐름 챔버 구성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; 0 시점, B : 1 분 시점, C : 2 분의 시점, 그리고 D. 다른 시간 지점 (A로 코팅 된 표면을 ICAM-1/P-Selectin에 부착 된 호중구의 샘플 비디오에서 그림 2 스크린 샷 : 4 분 시점). ICAM-1의 농도가 25 ㎍ / ㎖를이고 P-셀렉틴은 0.5 ㎍ / ㎖의이다. 호중구의 흐름 속도가 500,000 세포 / ml로 호중구 밀도 350 μL / 분이다. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> . 서로 다른 시간의 점 (0 시점, B : 1 분 시점, C : 2 분의 시점, 그리고 D : 4 분의 시점)에서 HUVEC 코팅 표면에 부착 호중구의 샘플 비디오에서 그림 3의 스크린 샷.호중구의 흐름 속도가 500,000 세포 / ml로 호중구 밀도 ML 350 μL /이다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td> 종 </td><td > 위치 </td><td > 전단 응력 (다인 / cm 2) </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 일반 caroid 동맥 </td><td> 11.6 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 아가미 동맥 </td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 대퇴 동맥 </td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 부신 대동맥 </td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> Supraceliac 대동맥 </td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 표면 fermoral 동맥 </td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 세정맥 </td><td> 0.5 ~ 5.0 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 망막 처음 소동맥 </td><td> 40.2 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 두 번째 망막 세동맥 </td><td> 0.001 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 망막 처음 세정맥 </td><td> 23.2 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 망막 번째 세정맥 </td><td> 0.43 </td></tr><tr ><td> 개 </td><td> 일반 caroid 동맥 </td><td> 15.8 </td></tr><tr ><td> 토끼 </td><td> 일반 caroid 동맥 </td><td> 23.3 </td></tr><tr ><td> 쥐 </td><td> 일반 caroid 동맥 </td><td> 46.​​6 </td></tr><tr ><td> 마우스 </td><td> 일반 caroid 동맥 </td><td> 64.8 </td></tr><tr ><td> 개 </td><td> 대퇴 동맥 </td><td> 9.8 </td></tr><tr ><td> 토끼 </td><td> 대퇴 동맥 </td><td> 156.8 </td></tr><tr ><td> 쥐 </td><td> 대퇴 동맥 </td><td> 65.9 </td></tr></tbody></table> 다른 기관과 다른 종의 표 1. 샘플 전단 응력. * 참고 문헌 13, 16, 19, 20에서 요약.

호중구의 부착을 정량하는 방법이보고되어있다. 이 방법은 혈관에서 발생 된 것과 유사한 동적 흐름 환경을 생성한다. 그것은 허용 정제 부착 분자 (리간드) 또는 투명 스트레스 생체 환경 유사한 맥락에서 내피 세포 기질 (HUVEC) 중 하나에 호중구 부착 조사.

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

이 절차의 전반적인 목표는 전단 응력이 존재하는 환경에서 인간 호중구의 부착을 가능하게 하는 유동 챔버 분석법(flow chamber assay)을 사용하여 호중구의 강한 부착(firm adhesion)을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 정제된 부착 분자의 기질 또는 인간 제대정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)와 같은 내피세포 표면을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 이층 원심분리법(two layer PHI call centrifugation method)을 사용하여 인간 말초혈액에서 호중구를 분리하는 것입니다.다음으로, 분리된 인간 호중구를 전단 응력 하에 접착 분자, 리간드 또는 ve 기판 위로 주입할 수 있도록 유동 챔버를 조립합니다. 마지막 단계는 유동 챔버 내에서 호중구의 접착 이벤트를 기록한 후, 강한 접착(firm adhesion) 정도를 정밀하게 정량화하는 것입니다. 궁극적으로 유동 챔버 분석법은 정제된 접착 분자 및 HX 표면에 대한 호중구의 강한 접착을 보여주는 데 사용됩니다.이 방법은 자가면역 질환의 발생과 관련이 있는 것으로 알려진 조직 분자의 유전적 변이의 기능적 중요성과 같은 자가면역 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전신성 홍반성 루푸스 환자를 대상으로 한 유전적 연구에서는 중성구의 강한 부착(firm adhesion)에 관여하는 단백질인 beta two integrin 변이와의 강력한 연관성이 입증되었습니다. 우리는 Mac one이라 불리는 이 beta two integrin의 유전적 변이가 강한 부착에 미치는 기능적 영향을 평가하기 위해 이 분석 시스템을 개발했습니다. 유동 챔버(flow chamber)에서 사용할 배양 접시를 준비합니다.35 mm 조직 배양 접시 각각에 피브린 및 젤라틴 용액 1 mL를 첨가하고, 플레이트 표면 전체가 코팅되도록 여러 번 피펫팅합니다. 과잉의 피브로넥틴 및 젤라틴 용액을 제거하고 플레이트를 최소 30분 동안 자연 건조합니다. 단백질 매트릭스 형성을 최적화하기 위해, 80~90% 합류도(confluence)까지 배양된 인간 제대 정맥 내피 세포 또는 qve를 trypsin EDTA를 사용하여 회수하고, 코팅된 각 조직 배양 접시에 500,000개의 세포를 접종합니다.각 디쉬에 2 mL의 성장 배지를 추가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 세포 상태를 매일 육안으로 확인하고 2일마다 배지를 교체해야 합니다. 세포가 80~90% confluence에 도달할 때까지 배양합니다.이 절차를 시작하려면, 마커나 펜을 사용하여 35 millimeter 조직 배양 접시 중앙에 직경 0.5 centimeters의 원을 그립니다. 표시된 영역에 20 microgram per milliliter 농도의 단백질 A 용액 20 microliters를 넣습니다. 피펫 팁을 사용하여 단백질 A 용액이 직경 0.5 centimeter 원 내부의 전체 영역을 덮도록 펼쳐 줍니다.디쉬의 표면을 만지거나 긁지 않는 것이 중요합니다. 조직 배양 디쉬를 37°C에서 1시간 동안 배양하십시오. 그다음, 단백질이 코팅된 각 플레이트를 1 mL의 PBS로 3회 세척하십시오.세 번째 세척 플레이트에서 PBS를 제거한 후, 플레이트의 비특이적 결합을 차단하기 위해 표시된 영역에 1% BSA 50 µL를 넣습니다. 4 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후에.블로킹된 플레이트를 1 mL의 PBS로 3회 세척하십시오. 코팅 및 본 실험을 위한 FC 접착 수용체 리간드 키메라 단백질 용액을 준비하며, 25 µg/mL의 ICAM-1 FC Kyra와 0.5 µg/mL의 P-selectin FC Kyra가 사용됩니다. 표시된 영역에 기질 50 µL를 코팅하고, 조직 배양 접시를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.디시는 2일 이내에 사용해야 하며 코팅된 부위가 마르지 않도록 해야 합니다. 필요한 경우, 플레이트 위에 50 µL의 용액이 유지되도록 PBS를 추가하십시오.본 연구에 사용되는 호중구는 서면 동의서를 작성한 참여자의 혈액에서 분리합니다. 항응고제가 포함된 혈액 수집 튜브 또는 vacutainer를 통해 채혈한 후, 혈액을 PBS와 1:1 비율로 희석하여 본 절차의 모든 단계를 수행합니다. 상온에서 50 mL 원심분리 튜브에 말초혈액 단핵구(pBMCs)와 호중구를 분리하기 위한 2층 밀도 구배 용액을 준비합니다.먼저, 15 milliliters의 heavy PHI call을 넣은 다음, heavy fi call 위에 10 milliliters의 light fi call을 조심스럽게 층이 지도록 쌓습니다. 이때 light fi call 층과 heavy fi call 층 사이에 뚜렷한 경계가 형성되어야 합니다. 마지막으로, PHI를 흐트러뜨리지 않으면서 light fi call 위에 25 milliliters의 희석된 혈액 샘플을 조심스럽게 층이 지도록 쌓습니다.실온에서 30분 동안 층 분리 원심분리를 수행합니다. 원심분리 후에는 여러 개의 층이 형성되어야 합니다. 적혈구가 소량 포함된 호중구 층은 가벼운 층과 무거운 층 사이에 위치합니다. 전이 피펫을 사용하여 호중구 층을 수확하여 새로운 50 milliliter 튜브로 옮기고, PBS를 추가하여 최종 부피를 50 milliliters로 맞춥니다.225 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 실온 상태에서 호중구에 적혈구가 여전히 혼합되어 있을 수 있습니다. 상층액을 10 mL 지점까지 흡입하여 제거합니다.재현탁합니다. 호중구 적혈구 펠렛을 낮은 속도로 짧게 볼텍싱하여 부유시킨 후, 50 milliliters의 PBS로 다시 세척하고 상층액을 흡입하여 오염된 적혈구를 제거합니다. 낮은 속도로 짧게 볼텍싱하여 잔류 PBS에 펠렛팅된 세포를 재현탁합니다.물 25 milliliters를 첨가하고 10초 동안 부드럽게 vortex 합니다. 적혈구를 용해하기 위해 1.8% sodium chloride 25 milliliters를 첨가하고 즉시 225 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 혼합합니다.이제 오염된 적혈구가 용해되어 흰색의 호중구 세포 펠렛만 남아야 합니다. PBS로 호중구 세포 펠렛을 세척하고, 상층액을 제거한 뒤 분리된 호중구를 10% FBS가 포함된 RPMI 배지에 재현탁합니다. 혈구계수기를 이용해 광학 현미경으로 세포 농도를 측정한 후, 10% FBS가 포함된 완전 RPMI 배지를 사용하여 세포 밀도를 mL당 500,000 cells로 조정합니다.유동 챔버 부착 분석을 시작하기 전, 접착 분자 발현을 상향 조절하고 자극하기 위해 VE를 20 ng/mL의 human TNF alpha로 4~6시간 동안 프라이밍합니다. VE 준비가 완료되면 유동 챔버를 조립합니다. 합류(confluent)된 VE가 들어 있는 35 mm 디쉬를 현미경 스테이지 위에 놓습니다.본 영상에서는 VE에 대한 호중구 접착만을 살펴볼 예정이나, 동일한 절차를 정제된 접착 분자에 대한 호중구 접착 연구에도 적용할 수 있습니다. 평행 플레이트 흐름 챔버(parallel plate flow chamber)를 시린지 펌프 및 진공 시스템과 연결하고, 호중구 투입을 위한 라인 하나는 열어 둡니다. 플레이트 위에 흐름 챔버를 장착하고 흐름 챔버 어셈블리를 고정합니다. 현미경과 연결된 컴퓨터에서 영상 녹화 프로그램을 시작합니다.완전히 성장한 VE가 보이는 선명한 시야가 나타날 때까지 현미경의 시야와 초점을 조정하십시오. 시린지 펌프를 사용하여 유동 챔버를 RPMI 배지로 헹굽니다. 챔버 내부나 호중구 주입 라인에 기포가 없는지 확인하십시오.시린지 펌프를 사용하여 정해진 속도로 호중구를 유동 챔버(flow chamber)에 주입하십시오. 호중구 부착은 빠르게 일어날 수 있으므로 영상을 기록하십시오. 일반적으로 분석을 위한 부착 이벤트의 정량화를 위해 4~5분 분량의 영상이면 충분합니다. 이 영상 클립은 HU E가 코팅된 유동 챔버에 호중구가 결합하는 예시를 보여줍니다.부착 세포는 HU e 코팅 표면에서 5초 이내에 세포 직경의 1배 미만으로 이동하는 세포로 정의됩니다. 여기에는 ICAM 1 P-셀렉틴 코팅 표면 또는 uve 코팅 표면에 부착되는 호중구 샘플 비디오의 서로 다른 시점별 스크린샷이 표시되어 있습니다.두 실험 모두에서 호중구 유속은 350 µL/min이며, 호중구 밀도는 500,000 cells/mL입니다. 일반적인 조건 하에서, 4분간의 기록 시간 동안 50~70개의 인간 호중구가 리간드 또는 VE 코팅 표면에 단단히 부착되는 것이 관찰되었습니다. 하지만, 서로 다른 공여자를 대상으로 비슷한 길이의 영상을 기록했을 때, 호중구 부착 분자의 대립 형질 변이 또는 기질 내의 대립 형질 변이가 호중구 부착의 정량적 수치를 상당히 변화시킬 수 있었습니다.호중구의 경우, 분당 부착 세포 수를 계산하여 서로 다른 기증자 간의 부착 특성을 비교할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 분리 과정에서 유도된 세포 활성화로 인해 발생하는 세포 응집(cell clamping) 현상이 있는지 호중구를 시각적으로 확인하는 것이 중요합니다. 또한, 기증자 간 및 실험 간에 세포의 활성 상태가 일치하는지 확인하기 위해 세포 활성화에 대한 유세포 분석 평가를 병행하여 수행할 수 있습니다.이 기술은 자가면역 분야의 연구자들이 $\beta_2$ 인테그린인 MAC-1의 CD11b 체인에 대해 서로 다른 코딩 영역 대립유전자를 가진 유전자형 공여자의 일차 인간 세포에서 세포 부착을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이러한 연구들을 통해 인간 시스템 내에서 이러한 대립유전자 변이체의 기능적 영향에 대한 세밀하고 정량적인 평가가 가능해졌습니다.

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

이 동영상은 all-on-chip 방법을 사용한 호중구 화학주성 분석을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 면역자기 음성 선택에 의해 전혈에서 호중구를 직접 분리한 후 미세유체 칩에서 화학주성 분석을 수행할 수 있습니다.

전혈을 이용한 신속한 호중구 화학요법 분석을 위한 미세유체 칩 기반 방법

이 비디오는 백혈구와 내피 세포와 같은 세포 파트너의 상호 작용을 특성화하기 위한 층류 기반 분석을 보여줍니다. 이 방법은 혈관 세포의 손상되지 않고 합류하는 층에 관류될 때 백혈구의 접착, 데데젼 및 전이에 대한 동적 통찰력을 제공합니다.

백혈구와 내피 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위한 층류 기반 분석

이 비디오는 백혈구 동원에 대한 기질 세포의 영향을 조사하는 방법을 보여줍니다. 평행 플레이트 유동 챔버 모델에서, 전염증성 사이토카인은 내피 세포에 의한 접착 수용체의 발현을 유도하여 호중구 모집 및 이동을 촉진합니다. 기질 세포와 내피 세포 사이의 누화는 내피 세포로의 호중구 모집을 감소시킵니다.

백혈구 모집에 대한 기질 세포의 효과에 대한 체외 흐름 조사

감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에...

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

이 프로토콜은 강력한 재현성 전체 혈액 한 방울에서 인간 호중구의 화학 주성을 측정하기위한 분석을 자세히 설명합니다. 이 접근법은 호중구의 분리의 필요성을 우회하고 분석 준비 시간의 몇 분을 필요로한다. 마이크로 유체 칩은 유아 또는 샘플의 양이 제한되어 작은 포유 동물에 시간이 지남에 따라 호중구의 화학 주성의 반복 측정을 가능하게합니다.

처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

간장에 백혈구 모집은 고유 간 사인 내피 세포에 의해 줄 지어있다 간 사인 곡선의 전문 채널 내에서 발생합니다. 생리 전단 응력의 조건에서 인간의 간 사인 내피 세포에서 백혈구 모집의 위상차 현미경은이 과정을 기초가되는 분자 메커니즘의 해명을 용이하게 할 수있다.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

이 기사에서는 전혈에서 온 칩 호중구 분리와 단일 마이크로 유체 칩의 화학 주성 테스트를 통합하여 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을 수행하는 자세한 방법을 제공합니다.

혈액 방울로부터의 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을위한 올 온칩 (all-on-chip) 방법

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

배우세요 인간 호중구 유량 용기 접착 분석법으로 전단 응력 조건에서 호중구의 견고한 접착을 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 자가면역 질환 연구에 필수적인 도구입니다.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

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