인간 호중구 유량 용기 접착 분석

호중구의 부착을 정량하는 방법이보고되어있다. 이 방법은 혈관에서 발생 된 것과 유사한 동적 흐름 환경을 생성한다. 그것은 허용 정제 부착 분자 (리간드) 또는 투명 스트레스 생체 환경 유사한 맥락에서 내피 세포 기질 (HUVEC) 중 하나에 호중구 부착 조사.

이 절차의 전반적인 목표는 전단 응력이 있는 상태에서 인간 호중구 접착을 허용하는 유동 챔버 분석을 사용하여 호중구 견고성 접착력을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 정제된 접착 분자의 기질 또는 인간 제대 정맥, 내피 세포 또는 ve와 같은 내피 세포 표면을 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 2층 PHI 원심분리 방법을 사용하여 인간 말초 혈액에서 호중구를 분리

다음으로, 플로우 챔버는 전단 응력 하에서 분리된 인간 호중구를 접착, 리간드 또는 ve의 기질에 주입할 수 있도록 조립됩니다. 마지막 단계는 유동 챔버에서 호중구 접착 이벤트를 기록한 다음 단단한 접착력을 신중하게 정량화하는 것입니다. 궁극적으로, 플로우 챔버 분석은 정제된 접착 분자와 HX 표면에 대한 호중구의 확실한 접착력을 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법은 자가면역 발달과 관련이 있는 것으로 알려진 조직 분자의 유전적 변이의 기능적 중요성과 같은 자가면역 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전신성 홍반성 루푸스 안검하수 환자를 대상으로 한 유전자 연구는 변이 및 호중구 확고한 접착에 관여하는 단백질인 Abeta two integrin과 강한 연관성을 보여주었습니다. 우리는 이 베타 2 내분비계의 유전적 변이의 기능적 결과를 평가하기 위해 이 분석 시스템을 개발했으며, 맥 원(Mac one)이라고 불리는 내분비계는 유동 챔버에서 사용할 배양 접시를 준비하기 위해 단단히 접착되었습니다.

각 35mm 조직 배양 접시와 피펫에 1ml의 피브린 및 젤라틴 용액을 여러 번 추가하여 전체 플레이트 표면이 코팅되었는지 확인합니다. 과도한 피브로넥틴과 젤라틴 용액을 제거하고 플레이트를 최소 30분 동안 자연 건조시킵니다. 단백질 기질 대형을 낙관하기 위하여는, trypsin EDTA 씨 500, 각 입히는 조직 배양 접시로 000의 세포를 사용하여 80에서 90%confluence에 배양된 인간적인 제대 정맥 내피 세포 또는 qve를 가을걷

각 접시에 2ml의 성장 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 배양합니다.5%CO2 세포는 매일 육안으로 검사해야 하며 이틀에 한 번씩 배지를 교체해야 합니다. 세포가 80-90% 합류점으로 성장하도록 합니다.

이 절차를 시작하려면 마커 또는 펜을 사용하여 35mm 조직 배양 접시 플레이트의 중앙에 직경 0.5cm의 원을 그립니다. 밀리리터당 20마이크로그램 단백질 20마이크로리터, 표시된 영역에 용액. 피펫 팁을 사용하여 단백질을 펴 바르고, 0.5cm 직경의 원 내에서 전체 영역을 덮는 용액을 사용합니다.

접시 표면을 만지거나 긁지 않는 것이 중요합니다. 조직 배양 접시를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 각 단백질을 코팅된 플레이트로 1ml의 PBS로 세 번 세척합니다.

세 번째 세척 플레이트에서 PBS를 제거한 후 표시된 영역에 1% BSA 50마이크로리터를 주입하여 플레이트의 비특이적 결합을 차단합니다. 섭씨 4도에서 2시간 동안 배양합니다. 두 시간 후.

막힌 플레이트를 PBS 1ml로 세 번 씻습니다. 코팅을 위한 FC 접착 수용체 리간드 키메라 단백질 용액을 준비하고 이 실험과 밀리리터당 25마이크로그램의 ICAM 1 FC Kyra와 밀리리터당 0.5마이크로그램의 P 셀렉틴 FC Kyra를 사용합니다. 표시된 영역을 50 마이크로 리터의 기질로 코팅하고 조직 배양 접시를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

접시는 이틀 이내에 사용해야 하며 코팅된 부분이 건조되지 않도록 해야 합니다. 필요한 경우. 플레이트에 50마이크로리터의 용액을 유지하려면 PBS를 추가합니다.

이 연구를 위한 호중구는 서면 동의서를 제공한 참가자의 혈액에서 분리됩니다. 정맥 절개술로 혈액을 채취하여 항응고제 채혈 튜브 또는 액포 용액에 넣은 후 PBS로 혈액을 일대일로 희석하여 이 절차의 모든 단계를 수행합니다. 실온에서 50ml 원심분리 튜브에서 말초 혈액 단핵 세포 또는 p BMC와 호중구를 분리하기 위한 2층 phy call을 준비합니다.

먼저 15밀리리터의 무거운 PHI 호출을 추가한 다음 무거운 FI 호출 위에 10ml의 가벼운 FI 호출을 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 가벼운 fi 호출과 무거운 fi 호출 레이어 사이에 날카로운 경계가 있어야 합니다. 마지막으로, PHI를 방해하지 않고 가벼운 fi 호출 위에 희석된 혈액 샘플 25ml를 조심스럽게 겹쳐 놓습니다.

원심분리 후 실온에서 30분 동안 튜브를 원심분리기로 호출하고 여러 층이 있어야 합니다. 적혈구가 거의 없는 호중구층은 가벼운 파이와 무거운 파이 사이에 있습니다. 이송 피펫 수확을 사용하여 호출하고 호중구층을 새로운 50 millil 튜브로 옮기고 PBS를 최종 부피 50 ml에 추가합니다.

225배 G에서 10분 동안 원심분리기. 원심분리 후 실온에서는 여전히 호중구와 적혈구가 혼합되어 있을 수 있습니다. 상등액을 10ml까지 흡입합니다.

마크 레수스. 호중구 적혈구 펠릿을 저속으로 간단히 와류로 현탁시킨 다음 50ml의 PBS로 다시 세척하여 상층액을 흡인하여 오염된 적혈구를 제거합니다. 잔류 PBS에서 펠릿화된 세포를 짧은 저속 와류로 재현탁시킵니다.

물 25ml를 넣고 10초 동안 부드럽게 소용돌이칩니다. 이가 있다. 적혈구는 25 밀리리터의 1.8% 염화나트륨을 첨가하고 즉시 225배 G에서 10분 동안 원심분리하여 혼합합니다.

오염된 적혈구는 이제 백색 호중구 세포 알갱이를 남기고 누워야 합니다. 호중구 세포 펠릿을 PBS로 세척하고 상등액을 버리고 분리된 호중구를 10% FBS로 RPMI 배지에 재현탁합니다. 혈구 분석기로 광학 현미경으로 세포 농도를 결정한 후 완전한 RPMI 10%FBS 배지를 사용하여 세포 밀도를 500, 밀리리터당 000개의 세포로 조정합니다.

플로우 챔버 접착 분석을 시작하기 전에 VE를 밀리리터당 20나노그램의 인간 TNF 알파로 4-6시간 동안 프라임하여 접착 분자 발현을 상향 조절하고 자극합니다. VE가 준비되면 플로우 챔버를 조립합니다. confluent VE가 들어 있는 35mm 접시를 현미경 테이블에 놓습니다.

이 비디오의 목적을 위해 VE에 대한 호중구 접착만 검사하지만, 정제된 접착 분자에 대한 호중구 접착을 연구하는 데에도 동일한 절차가 적용됩니다: 평행판 유동 챔버를 주사기 펌프 및 진공 시스템과 연결하고 호중구 입력을 위해 한 줄을 열어 둡니다. 플레이트 상단에 플로우 챔버를 삽입하고 플로우 챔버 어셈블리를 고정합니다. 현미경에 연결된 컴퓨터에서 비디오 녹화 프로그램을 시작합니다.

완전히 성장한 VE가 있는 명확한 필드가 보일 때까지 현미경의 시야와 초점을 조정합니다. 주사기 펌프를 사용하여 RPMI 매체로 플로우 챔버를 헹굽니다. 챔버 또는 호중구 입력 라인 내부에 기포가 없는지 확인하십시오.

주사기 펌프를 사용하여 정의된 속도로 호중구를 유동 챔버에 주입합니다. 호중구 유착은 빠르게 발생할 수 있으므로 일반적으로 4-5분 분량의 비디오는 분석을 위해 유착 이벤트를 정량화하기에 충분합니다. 이 비디오 클립은 HU E 코팅된 유동 챔버에 결합하는 호중구의 예를 보여줍니다.

부착 세포(adherent cell)는 5초 이내에 1 세포 지름 미만으로 이동하는 세포로 정의됩니다. HU e 코팅 표면에. 여기에 표시된 것은 ICAM one P selectin 코팅 표면 또는 uve 코팅 표면에 부착된 호중구의 샘플 비디오와 다른 시점의 스크린샷입니다.

두 실험 모두에서 호중구 유속은 분당 350마이크로리터이며 호중구 밀도는 밀리리터당 500, 000세포입니다. 일반적인 조건하에서, 50 내지 70개의 인간 호중구가 4분의 기록 기간 동안 리간드 또는 VE 코팅된 표면에 단단히 부착되는 것이 관찰되었다. 그러나 호중구 접착 분자의 대립유전자 변이체 또는 기질의 대립형질 변이체는 다른 공여자와 유사한 길이의 비디오를 녹화하여 정량적 호중구 접착을 실질적으로 변경할 수 있습니다.

호중구, 분당 부착 세포의 수를 계산하여 서로 다른 공여체 간의 접착 특성을 비교할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 격리 유도 세포 활성화로 인한 세포 클램핑에 대해 호중구를 육안으로 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 세포 활성화에 대한 병렬 유세포 분석을 수행하여 세포의 활성화 상태가 donor 간 및 실험 간에 일치하는지 확인할 수 있습니다.

이 기술은 자가면역 분야의 연구자들이 베타 2 인테그린, MAC 1의 CD 11 B 사슬의 다른 코딩 영역 대립유전자를 가진 유전자형 공여자로부터 일차 인간 세포의 세포 부착을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이러한 연구를 통해 인간 시스템에서 이러한 대립유전자 변이의 기능적 영향에 대한 신중하고 정량적인 평가가 가능해졌습니다.