인간 호중구 유량 용기 접착 분석

이 절차의 전반적인 목표는 전단 응력이 존재하는 환경에서 인간 호중구의 부착을 가능하게 하는 유동 챔버 분석법(flow chamber assay)을 사용하여 호중구의 강한 부착(firm adhesion)을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 정제된 부착 분자의 기질 또는 인간 제대정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)와 같은 내피세포 표면을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 이층 원심분리법(two layer PHI call centrifugation method)을 사용하여 인간 말초혈액에서 호중구를 분리하는 것입니다.

다음으로, 분리된 인간 호중구를 전단 응력 하에 접착 분자, 리간드 또는 ve 기판 위로 주입할 수 있도록 유동 챔버를 조립합니다. 마지막 단계는 유동 챔버 내에서 호중구의 접착 이벤트를 기록한 후, 강한 접착(firm adhesion) 정도를 정밀하게 정량화하는 것입니다. 궁극적으로 유동 챔버 분석법은 정제된 접착 분자 및 HX 표면에 대한 호중구의 강한 접착을 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법은 자가면역 질환의 발생과 관련이 있는 것으로 알려진 조직 분자의 유전적 변이의 기능적 중요성과 같은 자가면역 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전신성 홍반성 루푸스 환자를 대상으로 한 유전적 연구에서는 중성구의 강한 부착(firm adhesion)에 관여하는 단백질인 beta two integrin 변이와의 강력한 연관성이 입증되었습니다. 우리는 Mac one이라 불리는 이 beta two integrin의 유전적 변이가 강한 부착에 미치는 기능적 영향을 평가하기 위해 이 분석 시스템을 개발했습니다. 유동 챔버(flow chamber)에서 사용할 배양 접시를 준비합니다.

35 mm 조직 배양 접시 각각에 피브린 및 젤라틴 용액 1 mL를 첨가하고, 플레이트 표면 전체가 코팅되도록 여러 번 피펫팅합니다. 과잉의 피브로넥틴 및 젤라틴 용액을 제거하고 플레이트를 최소 30분 동안 자연 건조합니다. 단백질 매트릭스 형성을 최적화하기 위해, 80~90% 합류도(confluence)까지 배양된 인간 제대 정맥 내피 세포 또는 qve를 trypsin EDTA를 사용하여 회수하고, 코팅된 각 조직 배양 접시에 500,000개의 세포를 접종합니다.

각 디쉬에 2 mL의 성장 배지를 추가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 세포 상태를 매일 육안으로 확인하고 2일마다 배지를 교체해야 합니다. 세포가 80~90% confluence에 도달할 때까지 배양합니다.

이 절차를 시작하려면, 마커나 펜을 사용하여 35 millimeter 조직 배양 접시 중앙에 직경 0.5 centimeters의 원을 그립니다. 표시된 영역에 20 microgram per milliliter 농도의 단백질 A 용액 20 microliters를 넣습니다. 피펫 팁을 사용하여 단백질 A 용액이 직경 0.5 centimeter 원 내부의 전체 영역을 덮도록 펼쳐 줍니다.

디쉬의 표면을 만지거나 긁지 않는 것이 중요합니다. 조직 배양 디쉬를 37°C에서 1시간 동안 배양하십시오. 그다음, 단백질이 코팅된 각 플레이트를 1 mL의 PBS로 3회 세척하십시오.

세 번째 세척 플레이트에서 PBS를 제거한 후, 플레이트의 비특이적 결합을 차단하기 위해 표시된 영역에 1% BSA 50 µL를 넣습니다. 4 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후에.

블로킹된 플레이트를 1 mL의 PBS로 3회 세척하십시오. 코팅 및 본 실험을 위한 FC 접착 수용체 리간드 키메라 단백질 용액을 준비하며, 25 µg/mL의 ICAM-1 FC Kyra와 0.5 µg/mL의 P-selectin FC Kyra가 사용됩니다. 표시된 영역에 기질 50 µL를 코팅하고, 조직 배양 접시를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.

디시는 2일 이내에 사용해야 하며 코팅된 부위가 마르지 않도록 해야 합니다. 필요한 경우, 플레이트 위에 50 µL의 용액이 유지되도록 PBS를 추가하십시오.

본 연구에 사용되는 호중구는 서면 동의서를 작성한 참여자의 혈액에서 분리합니다. 항응고제가 포함된 혈액 수집 튜브 또는 vacutainer를 통해 채혈한 후, 혈액을 PBS와 1:1 비율로 희석하여 본 절차의 모든 단계를 수행합니다. 상온에서 50 mL 원심분리 튜브에 말초혈액 단핵구(pBMCs)와 호중구를 분리하기 위한 2층 밀도 구배 용액을 준비합니다.

먼저, 15 milliliters의 heavy PHI call을 넣은 다음, heavy fi call 위에 10 milliliters의 light fi call을 조심스럽게 층이 지도록 쌓습니다. 이때 light fi call 층과 heavy fi call 층 사이에 뚜렷한 경계가 형성되어야 합니다. 마지막으로, PHI를 흐트러뜨리지 않으면서 light fi call 위에 25 milliliters의 희석된 혈액 샘플을 조심스럽게 층이 지도록 쌓습니다.

실온에서 30분 동안 층 분리 원심분리를 수행합니다. 원심분리 후에는 여러 개의 층이 형성되어야 합니다. 적혈구가 소량 포함된 호중구 층은 가벼운 층과 무거운 층 사이에 위치합니다. 전이 피펫을 사용하여 호중구 층을 수확하여 새로운 50 milliliter 튜브로 옮기고, PBS를 추가하여 최종 부피를 50 milliliters로 맞춥니다.

225 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 실온 상태에서 호중구에 적혈구가 여전히 혼합되어 있을 수 있습니다. 상층액을 10 mL 지점까지 흡입하여 제거합니다.

재현탁합니다. 호중구 적혈구 펠렛을 낮은 속도로 짧게 볼텍싱하여 부유시킨 후, 50 milliliters의 PBS로 다시 세척하고 상층액을 흡입하여 오염된 적혈구를 제거합니다. 낮은 속도로 짧게 볼텍싱하여 잔류 PBS에 펠렛팅된 세포를 재현탁합니다.

물 25 milliliters를 첨가하고 10초 동안 부드럽게 vortex 합니다. 적혈구를 용해하기 위해 1.8% sodium chloride 25 milliliters를 첨가하고 즉시 225 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 혼합합니다.

이제 오염된 적혈구가 용해되어 흰색의 호중구 세포 펠렛만 남아야 합니다. PBS로 호중구 세포 펠렛을 세척하고, 상층액을 제거한 뒤 분리된 호중구를 10% FBS가 포함된 RPMI 배지에 재현탁합니다. 혈구계수기를 이용해 광학 현미경으로 세포 농도를 측정한 후, 10% FBS가 포함된 완전 RPMI 배지를 사용하여 세포 밀도를 mL당 500,000 cells로 조정합니다.

유동 챔버 부착 분석을 시작하기 전, 접착 분자 발현을 상향 조절하고 자극하기 위해 VE를 20 ng/mL의 human TNF alpha로 4~6시간 동안 프라이밍합니다. VE 준비가 완료되면 유동 챔버를 조립합니다. 합류(confluent)된 VE가 들어 있는 35 mm 디쉬를 현미경 스테이지 위에 놓습니다.

본 영상에서는 VE에 대한 호중구 접착만을 살펴볼 예정이나, 동일한 절차를 정제된 접착 분자에 대한 호중구 접착 연구에도 적용할 수 있습니다. 평행 플레이트 흐름 챔버(parallel plate flow chamber)를 시린지 펌프 및 진공 시스템과 연결하고, 호중구 투입을 위한 라인 하나는 열어 둡니다. 플레이트 위에 흐름 챔버를 장착하고 흐름 챔버 어셈블리를 고정합니다. 현미경과 연결된 컴퓨터에서 영상 녹화 프로그램을 시작합니다.

완전히 성장한 VE가 보이는 선명한 시야가 나타날 때까지 현미경의 시야와 초점을 조정하십시오. 시린지 펌프를 사용하여 유동 챔버를 RPMI 배지로 헹굽니다. 챔버 내부나 호중구 주입 라인에 기포가 없는지 확인하십시오.

시린지 펌프를 사용하여 정해진 속도로 호중구를 유동 챔버(flow chamber)에 주입하십시오. 호중구 부착은 빠르게 일어날 수 있으므로 영상을 기록하십시오. 일반적으로 분석을 위한 부착 이벤트의 정량화를 위해 4~5분 분량의 영상이면 충분합니다. 이 영상 클립은 HU E가 코팅된 유동 챔버에 호중구가 결합하는 예시를 보여줍니다.

부착 세포는 HU e 코팅 표면에서 5초 이내에 세포 직경의 1배 미만으로 이동하는 세포로 정의됩니다. 여기에는 ICAM 1 P-셀렉틴 코팅 표면 또는 uve 코팅 표면에 부착되는 호중구 샘플 비디오의 서로 다른 시점별 스크린샷이 표시되어 있습니다.

두 실험 모두에서 호중구 유속은 350 µL/min이며, 호중구 밀도는 500,000 cells/mL입니다. 일반적인 조건 하에서, 4분간의 기록 시간 동안 50~70개의 인간 호중구가 리간드 또는 VE 코팅 표면에 단단히 부착되는 것이 관찰되었습니다. 하지만, 서로 다른 공여자를 대상으로 비슷한 길이의 영상을 기록했을 때, 호중구 부착 분자의 대립 형질 변이 또는 기질 내의 대립 형질 변이가 호중구 부착의 정량적 수치를 상당히 변화시킬 수 있었습니다.

호중구의 경우, 분당 부착 세포 수를 계산하여 서로 다른 기증자 간의 부착 특성을 비교할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 분리 과정에서 유도된 세포 활성화로 인해 발생하는 세포 응집(cell clamping) 현상이 있는지 호중구를 시각적으로 확인하는 것이 중요합니다. 또한, 기증자 간 및 실험 간에 세포의 활성 상태가 일치하는지 확인하기 위해 세포 활성화에 대한 유세포 분석 평가를 병행하여 수행할 수 있습니다.

이 기술은 자가면역 분야의 연구자들이 $\beta_2$ 인테그린인 MAC-1의 CD11b 체인에 대해 서로 다른 코딩 영역 대립유전자를 가진 유전자형 공여자의 일차 인간 세포에서 세포 부착을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이러한 연구들을 통해 인간 시스템 내에서 이러한 대립유전자 변이체의 기능적 영향에 대한 세밀하고 정량적인 평가가 가능해졌습니다.