Name: 색도계 탐지의 종이 기반의 대장균 살모넬라 SPP., 그리고 리스테리아 농업 다량의 물에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: 배우세요 농업용 대용량 물에서 식품 매개 병원균을 검출하는 색도계 탐지 방법을. Modified Moore Swab(MMS)을 이용한 농축과 종이 기반 분석 장치를 활용하여 E. coli, Salmonella, Listeria를 신속하게 식별할 수 있습니다.

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USDA National Institute of Food and Agriculture 보조금 2009-01208 및 2009-01984에서 이 프로젝트에 자금을 지원해 주셔서 감사합니다.

MMS를 사용하여 농업 다량의 물에서 박테리아의 1. 집중 <ol><li> MMS 준비 <ol><li> 40 × 12 센티미터 크기의 4 겹의 무명천의 사각형 부분을 잘라냅니다. </li><li> 20 × 6 cm의 사각형을 얻기 위해 두 축을 따라 투박한을 접습니다. </li><li> 높이 약 6cm, 지름 3cm의 원통형 면봉을 형성하기 위해 단단히 긴 축을 따라 투박한을 굴립니다. </li><li> 알루미늄 호일의 투박한 면봉을 압력솥, 카세트를 압력솥하지 않습니다. 10 %의 가정용 표백제에 30 분 정도 담가 카세트의 오염을 제거하고, 티오 황산나트륨 오수화물 (나 2 S 2 O 3 · 5H 2 O) 용액 (50 ㎎ / L에서 15 분 동안 카세트를 담가 잔류 염소를 비활성화 ) 멸균 제조. </li><li> MMS 카세트에 면봉을 삽입합니다. NOTE : MMS 카세트의 일회용이 아닌 버전을 사용하는 경우, 무명천의 4 겹의 시트를 시작하는 날80 X 22cm를 asuring, 40 X 11cm로 접어 직경 약 11 ㎝ 높이와 6cm 실린더를 형성하기를 굴립니다. </li><li> MMS를 조립합니다. </li><li> 튜브가 완전히 스피을 준수 보장, MMS의 양쪽에 스피에 비닐 튜브를 연결하고 연동 펌프로 튜브를 고정합니다. 연동 펌프의 튜브 상류 샘플링을위한 충분한 길이가 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 박테리아의 농도 <ol><li> 고속 연동 펌프를 실행하여 농업용 수의 샘플 적어도 10 L. </li><li> 샘플링이 완료되면, 물 샘플에서 연동 펌프 유입구를 철회하고 제공된 배출수는 MMS를 종료 관찰되지 않을 때까지 펌프를 계속 실행. </li><li> 매니 폴드가 동시에 여러 샘플을 실행하는 데 사용되는 경우, 각 MMS의 유출 물을 수집하고, 10 L은 단일 MMS를 통해 여과 될 때 해당 특정 MMS위한 밸브를 닫고 펌프를 계속 실행. <ol><li> 나는 샘플링 할 때완료들, 농업 물에서 연동 펌프의 입구를 철회 매니 폴드의 모든 밸브를 열고 아무 유출 물이 MMSS을 종료 관찰 될 때까지 펌프를 계속 실행. </li></ol></li></ol></li><li> 농도는 모두 MMSS 대해 완료되면, 정중 MMS의 스피에서 비닐 호스를 분리하고 MMS 양쪽 스피 캡. 단단히 캡핑 MMS는 농축 미디어를 추가하기 전에 최대 12 시간 동안 저장 될 수있다. </li></ol> 2. MMS 농축 및 시료 전처리 <ol><li> 심화 <ol><li> MMS의 뚜껑을 나사를 풀고, 무균 적절한 멸균 농축 국물 20 ㎖를 추가합니다. 각각의 선택적 농축에 대해 하나의 MMS를 사용합니다. 또한, 동일한 샘플에 세 대상 박테리아를 전파하는 비 선택적 농축을 수행합니다. NOTE : MMS 카세트의 일회용이 아닌 버전이 사용되는 경우, 무균 카세트에서 무명천 필터를 제거하고 광고 전에 멸균 봉지에 배치적절한 농축 미디어의 딩 225 ML. <ol><li> E.의 농축을위한 대장균, 반코마이신 염산염 8 ㎎ / L로 보충 완충 펩톤 수 (BPW) 20 ㎖를 추가합니다. </li><li> 살모넬라 종의 농축을 위해., BPW 20 ㎖ 살모넬라 균의 보충 (4 ㎖ / L)로 보충을 추가합니다. </li><li> L.의 농축을위한 모노 사이토는 VIDAS UP 리스테리아 (LPT) 국물 20 ㎖를 추가합니다. </li><li> 하나의 MMS를 사용하여 세 가지 미생물을 동시에 비 선택적 농축을 위해, 보편적 preenrichment 국물 (UPB)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 다시 단단히에 MMS의 덮개를 고정합니다. 스피 단단히 농축 동안 유출 및 오염 가능성을 방지하기 위해 덮인되어 있는지 확인합니다. </li><li> 200 rpm에서 진탕 배양기에서 최대 18 ~ 24 시간 동안 MMS를 품어. E. 42 °의 C를 사용 대장균과 살모넬라 종. 선택적 enrichments. L. 30 °의 C를 사용 모노 사이토 선택적 농축, 사용 37 &amp; #176, 비 선택적 농축을위한 C. </li></ol></li><li> 샘플 준비 <ol><li> 배양이 완료되면, 인큐베이터에서 MMS를 제거 스피 중 하나를 덮개를 벗기다, 부드럽게 1.5 ML microcentrifuge 관에 약 0.5 ml의 분배. 또한, 중 MMS 피펫 0.5 밤새 농축 ML을 풉니 다. NOTE : MMS 카세트의 일회용없는 버전이 사용되는 경우, 백에서 농축 0.5 ㎖를 피펫. </li><li> E.의 비색 분석 콜라이 선택적 농축하거나 비 선택적 enrichments의 분석을 위해, 5 W, 프로브 초음파기를 사용하여 20 초 동안 22 kHz에서 농축 0.5 ㎖ 초음파 처리. </li></ol></li></ol> μPADs 3. 준비 및 발색 기질의 임베딩 <ol><li> 각 시험 샘플 및 대상에 대한 충분한 μPADs를 준비합니다. E.를 검출 대장균 살모넬라 종에 대해, CPRG 및 X-Gluc μPADs를 준비합니다. 탐지는 MC의 μPADs을 준비하고, L.에 대한 monocytogenes 검출은 X-의 InP μPADs를 준비합니다. <ol><li> HEPES 버퍼를 준비 비색 기판에 대한 [0.1 M 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 HEPES]를 사용하는 것입니다 기판에 따라 버퍼의 pH를 조정한다 : CPRG 또는 X-Gluc의 준비를위한 pH가 7.5, MC에 대한 pH가 9 및 X-InP를위한 pH가 7. </li><li> pH의 기판의 주식 솔루션을 준비 3 MM (CPRG), 62.5 밀리미터 (X-Gluc), 15 MM (MC), 100 ㎜ (X-의 InP)의 농도 HEPES 버퍼를 조정. 빛에서 주식 솔루션을 보호합니다. </li><li> 각 기판 원액 24 μL로 μPAD의 microspot를 끼워 넣다, 멸균 페트리 접시 안에 μPADs를 놓습니다. </li></ol></li></ol> 4. 검색 및 데이터 분석 <ol><li> 검출 <ol><li> 페트리 접시에 포함 된 각 해당 μPAD의 microspot에 풍부한 샘플의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 페트리 접시의 뚜껑을 다시 놓고 파라 필름으로 밀봉. </li><li> 샘플을 품어microspots의 발색과 건조를 허용 할 최대 3 시간 동안 37 ° C에서 μPAD와. </li></ol></li><li> 결과의 육안 검사 <ol><li> μPADs의 색깔 변화의 간단한 육안 검사로 검출을 수행합니다. 참고 : 일반적으로, 최종 색상의 변화를 생성 강한 반응은 추가 설명의 필요성을 사전에 제거해야하며, 긍정적 인 고려되어야한다 농축의 18 ~ 24 시간, 다음 예상된다. </li><li> E.의 존재를 결정 붉은 보라색과 파란색 - 녹색 무색에서 X-Gluc 변화에 박혀있는 걸 microspots 노란색에서 CPRG 변화에 박혀있는 걸 microspots을 관찰하여 대장균 양성 샘플. </li><li> L.의 존재를 결정 무색에서 인디고에 X-InP의 변화에 박혀있는 걸 microspots을 관찰하여 긍정적 인 샘플 모노 사이토 겐. </li><li> 살모넬라 종의 존재를 확인합니다. COL에서 MC 변화에 박혀있는 걸 관찰 microspots으로 긍정적 인 샘플자주색 자주 빛에 orless. </li></ol></li><li> 소프트웨어를 돕는 데이터 분석 참고 : 분명히 약한 반응이 양 또는 음의 여부를 확인하고 그 결과의 반 정량 분석​​을 가능하게 하였다. <ol><li> μPADs가 완전히 건조 할 수 있습니다. </li><li> 플랫 베드 스캐너를 사용하여 μPAD를 스캔합니다. </li><li> 이미지를 처리​​하기 위해 ImageJ에 소프트웨어를 사용합니다. <ol><li> 메인 메뉴 (누르거나 &quot;CLT + O&quot;)에서 &quot;파일&quot;탭 아래에있는 ImageJ에 분석 할 수있는 스캔 한 이미지를 &quot;열기&quot;. </li><li> ( &quot;CLT는 + + I 시프트&quot;를 누르거나) 주 메뉴에서 &#39;편집&#39;탭 아래에있는 &quot;반전&quot;을 선택하여 이미지를 반전. </li><li> 주 메뉴에서 &quot;분석&quot;탭을 사용하여 분석보고 된 측정을 선택하려면 &quot;설정 측정 ...&quot;를 선택합니다. </li><li> 반드시 &quot;평균 회색 강도&quot;, &quot;임계 값 제한 확인하십시오&quot;와 &quot;표시 레이블&quot;상자는확인하고 Enter 키를 눌러 &quot;OK.&quot;이 소프트웨어가 선택한 각 영역을 분석하는 방법을 설정하는 방법과 그것을보고합니다. </li><li> 당신이 내 측정 할 영역을 설명 원을 그리려면 &quot;타원형&quot;도구를 사용합니다. </li><li> &quot;분석&quot;탭에서 &quot;측정&quot;(누르거나 &quot;CLT + M&quot;)를 선택합니다. 이 소프트웨어는 정의 된 영역 내에서의 평균 회색 강도를 측정 및 복사 및 추가 분석을 위해 엑셀에 붙여 넣을 수있는 팝업 화면을보고합니다. 참고 :보다 정확한 분석을 위해, 각각의 샘플의 적어도 두 기술은 복제가 수행되어야한다. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidance+for+industry%3A+Guide+to+minimize+microbial+food+safety+hazards+for+fresh+fruits+and+vegetables%22">Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables</a>. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).</li>
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<li>Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+paper-based+microfluidics+with+wax+for+low-cost%2C+portable+bioassay%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay.</a> Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).</li>
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</ol>

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이 프로토콜은 E.를 검출하기위한 통합 방법을 개시 대장균, 살모넬라 균의 종., 그리고 L. 농업 물에 리스테리아 모노 사이토 겐. 여기에, 농업용 수의 큰 볼륨에서 박테리아의 MMS 농도 (10 L)을, 세균 농축과 결합하고, 세균성 나타내는 색채 감지 μPADs을 사용하고 있습니다. 세균 10 배 집중하는 동안 MMS 절차는 물 시료에서 높은 미립자 내용에 대응할 수있는 강력하고 최소한의 훈련을받은 사람이 현장 응용 프로그램을위한 충분한 간단하고, 최소한의 비용으로 수행 할 수 있습니다. 세균 농축 단계를 통합하여 실시간 박테리아가 검출되고, 방법의 감도가 크게 향상된다. 농축은 정량 할 대상을 증폭하고, 선택 성장 미디어와 결합 될 때, 거짓 긍정적 인 결과에 기여할 수있는 샘플에서 원하지 않는 미생물 성장을 감소시킨다. 최종 검출 간단한을 제공 μPADs, 수행된다,중요한 인성 병원균에 대한 화면으로 솔루션을 해석하는 데 효과적이고, 쉽고, 가격이 저렴....

그것은 인성 질병 에이전트가 식품 매개 질환의 부담을 줄이기 위해 필드 기반의 설정에서 신속하고 바람직하게 감지하는 것이 중요합니다. 인성 세균 병원균을 감지하는 일반적인 전략은 생화학 적 프로파일, 선택 및 차등 배양, 면역 분리 및 검출 및 분자 검출이 (가) 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 산발적 인 오염에 의해 방해되고, 테스트 작은 샘플 크기는 인성 병원성 세균의 종종 낮은 농도는, 긴 처리 시간을 필요로, 및 / 또는 필드 설​​정을 적용 할 수 없습니다. 또한, 많은 음식 행렬의 화합물은 검출 및 진단 응용 프로그램을 억제합니다. 미생물 검출 가능성을 향상시키기 위해, 미국 식품 의약청 (예 세척수 관개 물 등) 농업용 수를 테스트하는 농산물의 큰 표면적과 접촉하거나 차량 역할도하는 것을 제안했다 P에 대한roduce 오염 식품 1 직접 테스트에 대한 실행 가능한 대안이다. 그럼에도 불구하고, 대표 농업용 샘플의 희석 효과와 결합 종종 낮은 자연 병원균 부담 병원균 농도의 샘플 준비 방법이 중요합니다. 이러한 방법은 물 (≥ 10 L), 적절한 병원균 농도 및 다운 스트림 탐지 전략과의 호환성 많은 양의 샘플이 필요합니다. 수정 무어 면봉 (MMS)는 물 2-4의 큰 볼륨 (≥ 10 L)에서 박테리아를 집중 사용, 저렴, 간단하고 견고한 장치입니다. MMS는 연동 펌프를 사용하여 카세트를 통해 펌핑 다량의 물에 대한 거친 필터 역할을 거즈로 채워진 플라스틱 카세트로 구성되어 있습니다. MMS 처리 리 미생물 등의 유기 및 무기 미립자 물질을 포착 세균 농도 (≥ 10 배 농도)의 비 차별적 방법pond 지폐 샘플. 그것은 MMS 기준 대상 미생물 농도의 우수한 효능 미생물 실트 점토 분획 또는 부유 물질 (3)의 유기 미세 골재에 부착 될 것으로 예상된다는 사실에 의해 설명 될 수 있다는 가능성이있다. MMS의 견고한 설계는 필터의 막힘, 많은 양을 처리 할 수​​없는, 높은 탁도 필터 샘플 및 높은 비용 등의 물에서 세균의 캡처 및 농도에 대한 다른 여과 방법과 관련된 대부분의 단점을 극복 할 수 있습니다. 이러한 이유로, FDA는 MMS의 이용은 환경 및 생산 관련 샘플 수집 절차 5 공식 절차에 혼입되는 것이 추천된다. 여기서, 방법은 농도, 농축하고, 대장균의 검출, 살모넬라 종. 및 농업 워터스 리스테리아 대해 설명한다. MMS는 BACT의 농도에 사용되는eria, 또한 선택 또는 비 선택 세균 농축을위한 용기로 사용됩니다. 세균 검출은 종이 기반의 분석 장치 (μPADs) 6를 사용하여 생화학 적으로 얻을 수있다. μPADs는 유체 네트워크 또는 포토 리소그래피, 잉크젯 인쇄, 스탬핑, 왁스가 7-11 인쇄 등의 다양한 방법을 사용하여 현장 시험으로 제조 할 수있다. 유체 디자인의 예는 시료 중심에 증착 된 이후에 샘플 또는 기판은 중심 (12)으로 모세관 작용에 의해 채널의 외측 저수지에서 뽑은되는 원위 저수지 또는 단일 채널 패턴으로 흐른다 수지상 채널 패턴 일 수있다. 이 프로토콜에 대한, 우리는 여기에서 테스트 한 미생물을 나타내는 효소에 의해 처리 할 수​​있는 발색 기판에 새겨 져 7 mm 직경의 왁스 종이 자리 배열에 사용하도록 선택했습니다 : 클로로 페놀 레드 β-D-갈 락토 (CPRG) 및 5 -에게 브로 모 -4 - 클로로 -3 - 인돌 릴의 β-D-글루 쿠로 니드 (X-Gluc)E.에 의해 생성 된 β-갈 락토시다 아제 및 β-글루 쿠로의 검출 대장균; 살모넬라 종에 의해 생성 된 C8-에스 테라 제의 발견을위한 5 - 브로 모 -6 - 클로로 -3 - 인돌 릴 카 프릴 (진홍색 카 프릴),. 포스파티딜 이노시톨 특이 적 포스 포 리파제 C의 검출 및 5 - 브로 모 -4 - 클로로 -3 - 인돌 릴-미오 - 이노시톨 포스페이트 (X-의 InP) (PI-PLC)에 의해 생성 L. 6 모노 사이토 겐. 따라서, 특정 세균의 존재는 복잡한 장비 또는 데이터 해석을위한 필요없이 시각적으로 관찰 할 수있다. 이러한 특정 대상 세균의 효소 기반의 비색 μPAD 검출의 민감도와 특이도는 이전에 6을 탐구하고있다. 또한, 이들 목표 세균 집적 농도 검출 방법의 민감도는 미생물 (미발표 데이터 및 비샤 외. 13)의 소정 레벨로 다량의 물 중에서 스파이 킹함으로써 평가 하였다.

<table><tbody><tr><td>농업용수</td><td></td><td></td>, <td>관개용수, 농산물, 세척수, 우물물 등</td></tr><tr><td>비닐 튜빙</td><td>Wilmar</td><td>BN-CVT1005</td><td>&nbsp; 1/4" 내경,&nbsp; 3/8" 외경, 다음에서 사용 가능:&nbsp; http://www.wilmar.com</td></tr><tr><td>수정된 Moore 면봉 카트리지&nbsp;</td><td>Lumiere Diagnostics</td><td></td><td>11 & frac12; 길이 cm 및 4 &frac12; 너비 cm, 다음에서 사용 가능&nbsp; http://www.lumierediagnostics.com.&nbsp; 또는 일회용이 아닌 버전의 카트리지를 사용할 수 있습니다(텍스트 참조)Cheesecloth</td></tr> <tr><td></td><td>Chesapeake Wiper & 공급, Inc.</td><td>CC90</td><td>등급 #90, 44 x 36 직조, 다음에서 사용 가능:&nbsp; www.raglady.com</td></tr><tr><td>가정용 표백제</td><td>다양한</td><td></td><td>나트륨 차아염소산염 농도 약. 6%</td></tr><tr><td>나트륨 티오황산염 5-수화물</td><td>Mallinckrodt Baker Inc</td><td>8100-04</td><td></td></tr><tr><td>매니폴드</td><td>자체</td><td></td> 제작 <td>선택 사항, 장치는 PVC 파이프와 적절한 피팅으로 구성 가능</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Micron Meters</td><td>RPP1300</td><td>사용 가능한 위치:&nbsp; http://www.micronmeters.com</td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>다양한</td><td></td><td>일회용, 10 ml</td></tr><tr><td>범용 사전 농축 수프</td><td>Difco</td><td>223510</td><td></td></tr><tr><td>완충 펩톤 물</td><td>Difco</td><td>218105</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella 보충제</td><td>Biom&eacute; rieux Industry</td><td>42650</td><td></td></tr><tr><td>http://www.biomerieux-usa.com VIDAS UP Listeria (LPT) Broth</td><td>Biom&eacute; rieux Industry</td><td>410848</td><td></td></tr><tr><td>http://www.biomerieux-usa.com Vancomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861987</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>여기에 사용된 다양한</td><td></td><td>Drummond DP-110</td></tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터</td><td>다양한</td><td></td><td>Excella E25, New Brunswick Scientific 여기에</td></tr><tr><td>사용된 Micropipette&nbsp;</td><td>다양한</td><td></td><td>10 &mu; l, 1 ml</td></tr><tr><td>마이크로 피펫 팁</td><td>다양한</td><td></td><td>장벽, 10 &mu; l, 1 ml</td></tr><tr><td>1.5 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>다양한</td><td></td><td>RNase- 및 DNase-free</td></tr><tr><td>프로브 초음파 발생기</td><td>Q Sonica LLC</td><td>XL-2000 series</td><td></td></tr><tr><td>&micro; PAD</td><td>아방가르드&nbsp;</td><td></td><td>왁스는 직경 7mm의 원을 4pt 선 두께로 인쇄했습니다. 추가 정보는 Charles Henry 박사에게 문의하십시오</td></tr><tr><td>. HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&prime; -2-ethanesulfonic acid]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>클로로페놀 레드-갈락토피라노사이드(CPRG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59767</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-glucuronide (X-Gluc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8174</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (마젠타 카프릴레이트)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53451</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38896</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 폴리스티렌 100mm by 15mm</td><td>다양한</td><td></td><td>멸균</td></tr><tr><td>플랫 베드 스캐너</td><td>다양한</td><td></td><td>Xerox USB 스캐너</td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>국립 보건</td><td></td>원 <td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

색도계 탐지의 종이 기반의<em&gt; 대장균</em&gt;<em&gt; 살모넬라</em&gt; spp., 그리고<em&gt; 리스테리아</em&gt; 농업 다량의 물에서

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

이 프로토콜은 농업 바다의 큰 볼륨에서 대장균, 살모넬라 종., 리스테리아 모노 사이토의 빠른 비색 검출 (10 L)에 대해 설명합니다. 여기에, 물은 박테리아를 집중, 플라스틱 카트리지로 둘러싸인 간단한 거즈 필터로 구성 멸균 수정 무어 면봉 (MMS)를 통해 필터링됩니다. 여과 후, 대상 박테리아에 대한 비 선택 또는 선택 enrichments는 MMS에서 수행됩니다. 대상 박테리아의 비색 검출을 위해, enrichments은 다음 박테리아 나타내는 기판에 내장 된 종이 기반의 분석 장치 (μPADs)를 사용하여 정량된다. 각각의 기판은 μPAD에 시각 (성적 검출)를 검출 할 수있다 착색 제품을 생성하는 목표 표시된 박테리아 효소와 반응한다. 대안 적으로, 반응 μPADs의 디지털 이미지는 일반적인 스캐닝 또는 사진 장치 생성 ImageJ에 소프트웨어, 알을 사용하여 분석 할 수있다결과를보다 객관적이고 표준화 된 해석 lowing. 생화학 검사 절차는 상기 세균 병원체를 확인하도록 설계되어 있지만, 효소 배경 미생물 또는 색채 기질의 분해에 의해 생성 된 경우에 가양가 발생할 수 있습니다. 따라서, 더 차별적 진단을 사용 확인이 필요하다. 그럼에도 불구하고,이 세균 농도 및 검출 플랫폼은 초기 검사 방법으로 사용을 정당화 (농도, 농축, 검출이 약 24 시간 내에서 수행된다), 저렴 (0.1 CFU / ㎖의 검출 한계)를 구분하기 쉬운, 그리고 급속 농업용 수의 미생물 학적 품질.

이 프로토콜에 설명 된 바와 같이, MMS를 사용하여 세균의 농도 (도 1)은 약 15 ~ 20 분 내에 수행 될 수있다. 두 개의 분리 된 구성 요소에 아크릴로 니트릴 부타디엔 스티렌 (ABS)로부터 구성에서 MMS; 원통형 무명천 면봉가 삽입되는 집적 마개 조립체 (도 1a)와 양쪽 덮개와 카트리지. 두 구성 요소는 다음 함께 MMS (그림 1B)를 형성 망했다. MMS 기반 처리는 필드 설​​정에 집중 될 샘플을 허용하는 배터리 전원 연동 펌프에 의해 구동된다. MMS 농도, 선택적 enrichments (18-24 시간), 및 μPADs 결합함으로써; 농업용 쉽게 (약 24 시간) 신속하게, 그리고 싸게 E. 등의 중요한 인성 병원균 및 표시 미생물에 대한 검사를 할 수 있습니다 대장균, 살모넬라 균의 종., 그리고 L. 모노 사이토.이 프로토콜,이 표적 균 검출 될 수있다0.1 C...

많은 양의 농업용수에서 식품 매개 병원체의 통합 농도, 농축 및 종말점 비색 검출과 관련된 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 물은 선택적 또는 비선택성 매체로 농축된 MMS(Modified Moore Swabs)를 통해 여과되며, 검출은 박테리아 표시 비색 기판이 내장된 종이 기반 분석 장치(μPAD)를 사용하여 수행됩니다.

색도계 탐지의 종이 기반의<em&gt; 대장균</em&gt;<em&gt; 살모넬라</em&gt; SPP., 그리고<em&gt; 리스테리아</em&gt; 농업 다량의 물에서

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

이 절차의 전반적인 목표는 대량의 농업용수에서 식중독균을 검출하는 것입니다. 이를 위해, 접은 거즈나 치즈클로스 조각을 MMS 카세트 안에 넣어 이후 MMS라고 칭하는 수정된 모어 스왑(modified more swab)을 조립합니다. 다음으로, 샘플링 현장에서 연동 펌프를 사용하여 대량의 물을 MMS에 통과시킴으로써 표적 박테리아를 농축합니다.그 후 MMS의 양 끝을 단단히 밀봉하여 실험실로 운반합니다. 선택 또는 비선택 증균 배지를 MMS에 첨가하고 18~24시간 동안 배양합니다. 증균된 배양액을 수집한 후, E. coli 검출을 위한 용해물을 준비합니다.이들을 비색 효소 검출용 기질이 함침된 마이크로 패드 마이크로 스폿에 추가하고 최대 3시간 동안 배양합니다. 그 후 마이크로 패드를 검사하고 스캔합니다. 최종적으로, 마이크로 스폿의 시각적 및 정량적 분석을 통해 0.1 CFU/mL만큼 낮은 수준의 E. coli, Salmonella 종 및 L. monocytogenes의 존재를 확인할 수 있습니다.막 여과 및 고체 배지 배양 방식에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 더 많은 양의 수질 시료를 사용할 수 있다는 점입니다. 이는 분석의 민감도를 높일 뿐만 아니라 농축 시간을 단축시킵니다. 또한 검출 시간 역시 막 여과법의 24~48시간과 비교하여 24시간 이내로 단축됩니다.또한, 마이크로 패드는 기존의 고체 세균 배지에서는 불가능한 세 가지 서로 다른 식중독성 병원균의 동시 검출에 사용할 수 있습니다. 이 기술의 활용 범위는 농업용수 분석뿐만 아니라, 작물 관개에 사용되는 지표수의 미생물 오염을 증가시킬 수 있는 산불이나 극한 강우와 같은 극단적인 사건 이후의 분석까지 확장됩니다. 저희는 2012년과 2013년 여름 콜로라도 산불 이후 대량의 물에서 병원균 존재 여부를 빠르게 스크리닝해야 했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 샘플링 지역이 외진 곳에 있어 분석을 위해 대량의 물을 수집하여 실험실로 운송하는 것이 어려웠기 때문에, 이 방법은 현장에서 사용할 수 있도록 적응 가능해야 했습니다.변형된 면 스왑(modified more swab, MMS)을 준비함으로써 이 프로토콜을 시작하십시오. 40 by 12 cm 크기의 직사각형으로 4겹 거즈를 자릅니다. 거즈의 양쪽 축을 따라 접어 20 by 6 cm 크기의 직사각형을 만듭니다. 다음으로, 거즈를 긴 축을 따라 단단하게 말아 높이 약 6 cm, 지름 3 cm의 원통형 스왑을 형성합니다.면봉을 알루미늄 호일 팩에 넣고 15분 동안 오토클레이브 멸균합니다. 15 PSI의 건조 사이클(dry cycle)로 멸균을 마친 후, 장치를 현장으로 가져갈 준비가 완료됩니다. 현장에 도착하면 MMS 양측의 스피곳(spigot)에 비닐 튜브를 연결하고, 튜브가 스피곳에 완전히 밀착되었는지 확인합니다.그 다음 튜브를 연동 펌프에 고정합니다. 연동 펌프 상류의 튜브 길이가 박테리아를 농축하기 위한 샘플링에 충분한지 확인하십시오. 연동 펌프의 입구를 샘플링할 농업용수에 배치합니다.연동 펌프를 분당 300 milliliters의 유량으로 작동시켜 최소 10 liters를 채취하십시오. 샘플링이 완료되면 연동 펌프의 입구 튜브를 수질 샘플에서 꺼내고, 유출수가 더 이상 보이지 않을 때까지 펌프를 계속 작동시키십시오. 농축 과정이 완료되면 MMS를 종료합니다.수정된 모든 면봉에 대해, MMS 콕(spigot)에서 비닐 튜브를 조심스럽게 제거하고 MMS 양쪽의 콕을 캡으로 막았습니다. 캡을 단단히 닫은 MMS를 농축 배지를 추가하기 전까지 냉장 온도에서 최대 12시간 동안 보관했습니다. 여기서는 E. coli, 살모넬라(Salmonella) 종, 그리고 L. monocytogenes의 농축 과정이 시연될 것입니다. 각 선택적 농축에는 하나의 MMS가 사용됩니다.MMS의 뚜껑을 돌려서 열고, e coli 농축을 위해 8 mg/L의 vancomycin hydrochloride가 첨가된 멸균 완충 펩타이드수 또는 BPW 20 mL를 추가합니다. MMS의 뚜껑을 다시 단단히 돌려 닫습니다.Salmonella 종의 증식을 위해, 리터당 4 mL의 Salmonella 보충제가 첨가된 멸균 BPW 20 mL를 넣습니다. L. monocytogenes의 증식을 위해서는 멸균된 urea broth 20 mL를 넣습니다. MMS를 150 RPM의 진탕 배양기에서 18~24시간 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 다음 단계를 진행합니다.인큐베이터에서 MMS를 꺼냅니다. 뚜껑을 엽니다. 배지를 Falcon 튜브에 조심스럽게 붓고, 피펫을 사용하여 0.5 milliliters를 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.E. coli 선택적 농축의 비색 분석 또는 비선택적 농축의 분석을 준비하기 위해, 농축액 0.5 milliliters를 5 watts, 22 kilohertz에서 20초 동안 초음파 처리합니다. 프로브 소니케이터를 사용하여 pH가 조정된 HEPES 완충액에 기질 C-P-R-G-X glue, magenta cap relate 및 XINP의 스톡 솔루션을 준비합니다. 스톡 솔루션을 빛으로부터 보호하십시오 five promo six.CHLORO three in allele, capite, 또는 magenta capite는 빛에 민감하며 자동 분해를 통해 위양성 결과를 생성할 가능성이 있습니다. 테스트하는 각 샘플 및 표적에 대해, 멸균 페트리 접시 안에 마이크로 패드 하나를 배치하십시오. E. coli 검출을 위해, CPRG 및 xgl 마이크로 패드를 준비하십시오.살모넬라(salmonella) 종 검출을 위해 magenta capite 마이크로 패드를 준비하고, l monocytogenes 검출을 위해 XINP 마이크로 패드를 준비하십시오. 피펫을 사용하여 각 기질 스톡 용액 24 µL를 마이크로 패드의 마이크로 스팟에 도포하십시오. 검출 준비를 위해, 농축된 시료 6 µL를 각각의 해당 마이크로 패드에 첨가하십시오.페트리 접시에 덮개를 다시 덮고 파라필름으로 밀봉합니다. 마이크로 패드가 부착된 샘플을 37 °C에서 최대 3시간 동안 배양하여 색상이 발색되고 마이크로 스폿이 건조되도록 합니다. 배양 후, 마이크로 패드의 색상 변화를 육안으로 간단히 검사하여 검출을 수행합니다.뚜렷한 색 변화를 일으키는 강한 반응은 일반적으로 18~24시간의 증식 배양 후에 나타납니다. 이러한 반응은 양성으로 간주하며 추가적인 확인이 필요하지 않습니다. E. coli가 존재할 경우, CPRG가 포함된 마이크로 스폿의 색상이 노란색에서 빨간색으로 변합니다.보라색 및 마이크로 스팟입니다. xlu가 포함된 곳은 여기에서 보이는 것처럼 무색에서 청록색으로 변합니다. L. monocytogenes가 존재하면 XINP가 포함된 마이크로 스팟이 무색에서 남색으로 변합니다.salmonella 종이 존재하는 경우, magenta capite가 포함된 마이크로 스팟이 무색에서 보라색으로 변합니다. 반응이 약하게 양성인 경우에는 소프트웨어를 사용하여 결과의 반정량 분석을 수행하십시오. 이를 위해 마이크로 패드를 완전히 건조시킨 후, 플랫베드 스캐너를 사용하여 마이크로 패드를 스캔하십시오.Image J 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다. 다음으로, Image J에서 분석할 스캔 이미지를 엽니다. 그다음 이미지를 반전시키려면 메인 메뉴의 Edit 탭을 클릭하고 Invert를 선택합니다.메인 메뉴의 분석(analyze) 탭을 사용하고 측정값 설정(set measurements)을 선택하여 분석할 보고 측정값을 선택하십시오. 평균 회색 강도 임계값(mean gray intensity limit to threshold)과 표시 라벨 상자(display label boxes)가 체크되어 있는지 확인한 후 확인(okay)을 누르십시오. 이를 통해 소프트웨어가 선택된 각 영역을 분석하고 보고하는 방식이 설정됩니다.다음으로, 분석(analyze) 탭에서 타원형 도구를 사용하여 분석할 영역을 지정한 후, 측정(measure)을 선택합니다. 소프트웨어가 정의된 영역 내의 평균 회색 강도를 측정하며, 그 결과는 팝업 화면에 표시되어 추가 분석을 위해 엑셀로 복사하여 붙여넣을 수 있습니다. 마이크로 패드 분석법은 색도 측정 기질과 반응하는 박테리아 지표 효소의 검출을 기반으로 합니다.E. coli를 검출하는 분석법은 청록색 생성물과 적자색 생성물을 형성합니다. Salmonella 종 및 L. monocytogenes를 검출하는 분석법은 각각 보라색과 남색을 나타냅니다. 대안적으로, Image J 소프트웨어를 사용하여 디지털 이미지를 처리함으로써 더욱 객관적이고 표준화된 데이터 해석이 가능합니다.여기에 음성 및 양성 테스트가 모두 포함된 각 분석의 디지털화된 컬러 및 메트릭 이미지가 표시되어 있습니다. 음성 테스트는 표적 효소를 인코딩하지 않는 박테리아 종을 사용하여 수행되었으며, 양성 테스트는 표적 박테리아를 사용하여 수행되었습니다. 첫 번째 행은 두 번째 행에 있는 수정되지 않은 스캔 이미지를 보여줍니다.스캔된 이미지는 Image J 소프트웨어를 사용하여 그레이스케일로 변환되었습니다. 그리고 세 번째 행의 색상은 이후의 그레이 강도 해석을 위해 반전되었습니다.네 번째 행은 마이크로 패드의 각 마이크로 스폿 내에서 Image J를 사용하여 측정한 평균 회색조 강도를 보여줍니다. 노란색 화살표와 원으로 예시 마이크로 스폿을 표시하였습니다. 이 그래프는 Image J로 결정한 4회 반복 실험의 평균 회색조 강도를 나타냅니다. 각 색상은 I metric 마이크로 패드의 양성 및 음성 테스트를 의미합니다.이 데이터는 대용량 농업용수에서 농축된 세 가지 표적 미생물의 모호한 검출이 본 절차를 통해 수행될 수 있음을 입증합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 수정된 Moore 스왑을 조립하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한 대용량 농업용수에서 관심 미생물을 농축하고, 종이 기반 분석 장치에서 비색 효소 검출 및 분석을 수행하는 방법도 익히게 될 것입니다.본 절차를 수행할 때, E. coli 검출을 위한 초음파 처리 단계를 포함하는 것이 중요합니다. 또한 Magenta capite 기질을 가능한 한 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다. 추가 배양을 통해 절차를 완료하려면 배양 전 MMS의 적절한 밀봉 및 조립이 중요합니다.이 기술은 식품 안전 분야를 넘어 미생물 병원균 및 지표 미생물을 현장에서 진단할 수 있는 간단하고 저렴하며 신속한 방법으로서 매우 유용할 것으로 기대됩니다. 또한, 이 기술은 환경 및 임상 미생물학 분야에서도 잠재적인 활용 가능성이 있습니다. 병원성 미생물을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 박테리아 농축액을 쏟거나 바이오 에어로졸이 형성되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.이 절차를 수행할 때는 항상 병원성 미생물 취급을 위한 표준 예방 조치를 준수해야 합니다.

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