Name: 항 바이러스 패턴 인식 수용체 RIG-I와 PKR에 의해 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지의 모니터링 활성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 배우세요 RIG-I와 PKR의 활성화를 제한 프로테아제 소화 및 네이티브 PAGE로 분석하는 방법. A549 세포를 이용한 바이러스 감염 실험에서 패턴 인식 수용체의 구조 변화와 올리고머화를 모니터링할 수 있습니다.

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우리는 안티 리프트 밸리 열병 바이러스의 혈청을 제공하는 CISA-INIA에서 알레한드로 브룬 감사합니다. 우리의 실험실에서 작업 Forschungsförderung 보석에 의해 지원됩니다. 2 상승률 §. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum 기센 운트 마르부르크, 신흥 바이러스 성 질병에 대한 라이프니츠 대학원 (EIDIS), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021 및 DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

감염 A549 세포의 1. 시드 <ol><li> 37 ° C에서 A549 세포의 T75 플라스크를 육성하고 5 %는 세포 배양 배지에서 CO 2 (DMEM 10 % FCS, 526.6 ㎎ / ℓ의 L-글루타민, 50.000 U / L 페니실린, 50 ㎎ / ℓ의 스트렙토 마이신과 보충). </li><li> 세포를 수확을 시작하기 전에 37 ℃로 가열 수조에 세포 배양 배지, PBS 0.05 % 트립신-EDTA를 따뜻하게 </li><li> 매체를 제거하고 10 ㎖의 PBS로 세포를 씻어. 다시 PBS를 제거합니다. </li><li> 트립신-EDTA의 3 mL를 넣고 플라스크에 동일하게 배포 할 수 있습니다. 37 ° C로 인큐베이터에서 플라스크를 전송하고 5 % CO 2. </li><li> 모든 세포가 분리되면, 세포 배양 배지 12 mL를 넣고 세포를 재현 탁하고, 15 ㎖의 팔콘 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> RT에서 5 분 동안 800 XG에서 세포를 원심 분리하고 상등액을 10 ㎖의 신선한 세포 배양 배지에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 카운팅 챔버와 함께 세포를 카운트. </li><li> 두 T25 플라스크 각 세포 배양 배지 5 ㎖에 2.5 × 10 6 세포를 추가합니다. 37 ° C에서 16 시간 동안 배양하고 5 % CO 2. 한 플라스크 모의 제어 및 망할 CIA 13 감염에 대한 하나 제공합니다. </li></ol> 리프트 밸리 열병 바이러스의 복제 13 2. 감염 된 (C1 13) <ol><li> 참고 : 망할 CIA (13)가 독일에서 BSL-2 조건에서 처리 할 수​​있는 약독 화 바이러스의 돌연변이이다. 해당 국가의 지침을 참조하십시오. 다른 일반적인 IFN 유도제 센다이 바이러스 (변형 Cantell) 뉴캐슬 질병 바이러스 일 것입니다. </li><li> 5 % FCS를 함유하는 사전 따뜻한 PBS, 무 혈청 배지 및 세포 배양 배지. </li><li> 5 감염 다중도 (MOI)로 2.5 × 106 A549 세포를 감염 혈청 배지에서 망할 CIA 13 1.25 × 10 7 PFU / ㎖를 준비한다.을 고려하는 데 필요한 것보다 약간 (약 10 %)보다 많은 양을 준비 피펫 오류. </li><li> 1.3에 설명 된대로 PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 1 망할 CIA 13 ml의 희석 또는 추가무 혈청 배지의 세포 (감염되지 않은 제어, 모의), 37 ° C에서 1 시간 5 % CO 2 알을 품다. 각각 망할 CIA 13 희석 혈청 배지의 동등한 분배를 보장하기 위해 매 15 분 조심스럽게 플라스크를 이동합니다. </li><li> 감염의 1 시간 후, 접종을 제거 5 % FCS로 예열 된 세포 배양 배지 5 ㎖를 추가하고, 37 ° C에서 5 시간 5 % CO 2 알을 품다. </li></ol> 세포 용 해물의 3. 준비 <ol><li> 4 ℃에서 PBS / 0.5 % 트리톤 X-100을 준비 세린 프로테아제 억제제를 추가하지 마십시오. </li><li> 차가운 PBS로 세포를 세척하고 신선한 PBS의 10 ML을 추가합니다. </li><li> RT에서 5 분 800 XG에서 세포 팔콘 튜브 서스펜션, 원심 분리기를 전송하고, 세포를 긁어. </li><li> 상층 액을 제거하고 30 ㎕의 PBS / 0.5 % 트리톤 X-100에있는 세포 펠렛을 resuspend. 새로운 1.5 ML 튜브에 해물을 전송하고 4 ℃에서 적어도 10 분 동안 품어 </li><li> 10.00 해물을 원심 분리기0 ~ 4 ° C에서 10 분 동안 XG와 신선한 튜브에 명확히 세포 용 해물 (상층 액)을 전송합니다. </li><li> 다른 33 설명한대로 브래드 포드 분석에 의해 단백질 농도를 결정합니다. </li><li> -20 ° C에서 보관 또는 트립신 소화 (4.1) 또는 기본 페이지 (5.1)로 진행합니다. </li></ol> 패턴 인식 수용체의 구조적인 변경 4. 결정 <ol><li> 세포 용 해물의 TPCK - 트립신 처리 <ol><li> 2 ㎍ / μL의 최종 작업 농도로 PBS에 L-1-tosylamido-2 - 페닐 에틸 클로로 메틸 케톤 처리 (TPCK) 트립신을 희석. </li><li> 두 개의 새로운 튜브 PBS 9 μL의 최종 볼륨 (모의 또는 망할 CIA 13) 각 단백질의 용해 액의 25 μg의 최종 단백질 농도를 조정합니다. 따라서, 그것은 두 번 모의 두 번 망할 CIA 13 감염 25 μg의 해물을 각각 네 개의 튜브해야합니다. 하나는 입력 제어 (치료) 및 TPCK - 트립신 처리를위한 하나의 세트로 설정합니다. </li><li> PBS의 1 μl를 추가합니다 (치료)또는 1 ㎍ / ㎕의 TPCK-트립신 (최종 농도 0.2 ㎍ / μL) ㎕의 세포 용 해물을하고 피펫으로 반응을 섞는다. 그것은 소화의 효율성을 손상하기 때문에, 동결 TPCK-트립신 분주을 해동하지 마십시오. </li><li> 25 분 동안 37 ° C에서 해물을 품어. 배는 (250 MM 트리스 - 염산의 pH 6.8, 10 % SDS, 50 % 글리세롤, 25 %의 β-머 캅토 에탄올, 파랑 0.5 % 브로 모 페놀) 샘플 버퍼를 변성 추가하여 95 ℃에서 5 분간 끓여 반응을 중지 그것은 트립신 보육 시간을 연장하지하는 것이 중요합니다. 더 프로테아제 저항하는 조각이 검출없는 경우, 트립신 소화의 시간을 단축 할 수 있어야합니다. </li><li> 끓는 후, 샘플은 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol></li><li> SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)과 웨스턴 블로 팅 <ol><li> 황산 도데 실 나트륨 12 % 해결 젤에 5 %의 스택을 포함하는 (SDS) 폴리 아크릴 아마이드 겔에서 샘플을로드합니다. 까지 젤 당 25mA에서 단백질을 분리브로 모 페놀 블루 밖으로 실행됩니다. </li><li> 메탄올로 30 초 동안 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인을 활성화하고 전송 버퍼 (48 mM 트리스, 39 mM의 글리신, 1.3 mM의 SDS, 20 % 메탄올)에 넣어. </li><li> 반 건조 블로 팅 시스템과 블로 팅을 준비하고 1 시간 동안 10 V에서 단백질의 전송을 할 수 있습니다. 멤브레인을 꺼내 물로 간단히 씻어서 말리면. </li><li> 곧 메탄올로 전송하여 막 활성화하십시오. TBS로 5 분 씻으십시오. 실온에서 4 ° CO / N.에서 1 시간 동안 TBS에서 10 % 탈지 우유로 차단 5 분 TBS 각각의 막 배를 씻으십시오. </li><li> 표 1에 권장 항체 희석을 준비하고 실온에서 4 ° CO / N.에서 1 시간 동안 막 부화 </li><li> 10 분 TBS-T와 각 막 배를 씻으십시오. TBS의 1 % 탈지 우유 1:20,000 희석에 고추 냉이 퍼 옥시 다제과 함께 적절한 보조 항체를 추가합니다. 실온에서 45 분 알을 품다. </li><li> 10 분 TBS-T와 각 막 배를 세척하고, 오TBS와 네브라스카 추가 시간. </li><li> 신호 검출을위한 상용 chemiluminescense 키트 및 디지털 겔 이미징 시스템을 사용한다. </li></ol></li><li> 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250 염색법 <ol><li> 4.2.1에 설명 된대로 SDS-PAGE를 수행합니다. 브로 모 페놀 블루가 소진 될 때까지로드 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔에 샘플 및 젤 당 25mA에서 젤을 실행합니다. </li><li> RT에서 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250 염색을 수행합니다. 일정한 진탕 모든 배양을한다. </li><li> 40 % 메탄올, 30 분 동안 10 % 아세트산을 함유하는 고정액으로 겔을 전송. </li><li> destaining 용액 (25 % 에탄올과 8 % 아세트산)에 버퍼를 교환하고 5 분 동안 품어. </li><li> 40 % 메탄올로 1 시간 동안 10 % 아세트산 0.2 % 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250으로 겔을 염색. </li><li> destaining 용액 겔을 Destain하고 10 분, 30 분 및 60 분 후에 버퍼를 교환한다. </li><li> 4 ° C에서 25 % 에탄올, 8 % 초산, 4 % 글리세롤에 젤을 저장 </lI&gt; <li> 4.2.8에 설명 된대로 이미징 및 분석을 수행합니다. </li></ol></li></ol> 패턴 인식 수용체의 올리고머 미국의 5. 분석 <ol><li> 기본 페이지 <ol><li> PBS 10 μL의 최종 부피로 세포 용 해물 50 μg를 준비의 최종 농도 5 × 네이티브 샘플 완충액 (250 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 50 % 글리세롤, 블루 0.5 % 브로 모 페놀)를 추가 1X. </li><li> 스태킹 5 % 젤을 해결하는 등의 8 %와 기본 폴리 아크릴 아마이드 젤에 즉시 샘플을로드합니다. 지연은 네이티브 단지 (34)의 손실이 발생할 것입니다. </li><li> 양극과 50 mM 트리스 산도 8.3, 384 MM의 글리신, 음극 버퍼로 1 %의 나트륨 데 옥시 콜레이트 등으로 50 mM 트리스 - 수산화 나트륨의 pH 9.0, 384 mM의 글리신과 4 ° C에서 젤 당 20mA에서 젤을 실행합니다. 1.5 시간 후 전기가 완료 (브로 모 페놀 블루 밴드는 약 45 분 이전에 젤 남아있다). </li></ol></li><li> 웨스턴 블로 팅 <ol><li> polyv 활성화메탄올 30 초 동안 플루오 라이드 (PVDF) 막을 inylidene 및 Towbin 버퍼 (25 MM 트리스, 192 mM의 글리신, 0.1 % SDS, 20 % 메탄올)에 넣어. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 젖은 얼룩 챔버를 조립하고 Towin 버퍼 탱크를 채우십시오. </li><li> 4 ℃에서 1.5 시간 동안 250mA로 블로 팅을 수행합니다 </li><li> 모래 바닥 경우는 4.2.3에서 설명 된대로 진행으로 완성되고 있습니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gurtler, C., Bowie, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+detection+of+microbial+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate immune detection of microbial nucleic acids.</a> Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).</li>
<li>Jensen, S., Thomsen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+RNA+viruses%3A+a+review+of+innate+immune+receptors+involved+in+recognizing+RNA+virus+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion.</a> Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).</li>
<li>Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIG-I-like+receptors%3A+cytoplasmic+sensors+for+non-self+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA.</a> Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).</li>
<li>Yoneyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RIG-I+has+an+essential+function+in+double-stranded+RNA-induced+innate+antiviral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses.</a> Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).</li>
<li>Andrejeva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V+proteins+of+paramyxoviruses+bind+the+IFN-inducible+RNA+helicase%2C+mda-5%2C+and+inhibit+its+activation+of+the+IFN-beta+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+innate+antiviral+defenses+through+a+shared+repressor+domain%5BTitle%5D)+AND+%22in+RIG-I+and+LGP2+Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain.</a> in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).</li>
<li>Ferrage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+the+second+CARD+of+human+RIG-I+provide+mechanistic+insights+into+regulation+of+RIG-I+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England+%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation.</a> Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).</li>
<li>Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKolakofsky%2C+D+%22A+structure-based+model+of+RIG-I+activation%22">A structure-based model of RIG-I activation</a>. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).</li>
<li>Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+determinants+of+viral+RNA+recognition+by+innate+immune+sensor+RIG-I%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England+%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I.</a> Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).</li>
<li>Kowalinski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+activation+of+innate+immune+pattern-recognition+receptor+RIG-I+by+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA.</a> Cell. 147, 423-435 (2011).</li>
<li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+RNA+recognition+by+RIG-I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural insights into RNA recognition by RIG-I.</a> Cell. 147, 409-422 (2011).</li>
<li>Habjan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+genome+5%26%2334%3B+termini+as+a+strategy+of+negative-strand+RNA+viruses+to+avoid+RIG-I-dependent+interferon+induction%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Processing of genome 5&#34; termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction.</a> PloS One. 3, e2032(2008).</li>
<li>Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+viral+Achilles%27+recognition+of+5%27-triphosphate+RNA+in+innate+anti-viral+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence.</a> Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).</li>
<li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPichlmair%2C+A+%22RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5%27-phosphates%22">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates</a>. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).</li>
<li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornung%2C+V+%225%27-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I%22">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I</a>. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).</li>
<li>Saito, T., Gale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+double-stranded+RNA+by+RIG-I-like+receptors+in+antiviral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).</li>
<li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonself+RNA-sensing+mechanism+of+RIG-I+helicase+and+activation+of+antiviral+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses.</a> Mol Cell. 29, 428-440 (2008).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+signal+perception+and+integration+by+the+innate+immune+sensor+retinoic+acid-inducible+gene-I+%28RIG-I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I).</a> J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-induced+oligomerization+of+the+RNA+sensors+RIG-I+and+MDA5+activates+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response.</a> Immunity. 36, 959-973 (2012).</li>
<li>Civril, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIG-I+ATPase+domain+structure+reveals+insights+into+ATP-dependent+antiviral+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling.</a> EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).</li>
<li>Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+the+innate+antiviral+response+through+IRF-3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).</li>
<li>Hertzog, P. J., Williams, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+type+I+interferon+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokin.%2C+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fine tuning type I interferon responses.</a> Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).</li>
<li>Pindel, A., Sadler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+kinase+R+in+the+interferon+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interfero.%2C+%26+Cytokine+Research+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">The role of protein kinase R in the interferon response.</a> Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).</li>
<li>Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eIF2alpha+kinases%3A+their+structures+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+CMLS%22%5BJournal%5D)">The eIF2alpha kinases: their structures and functions.</a> Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).</li>
<li>Cole, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PKR+an+open+and+shut+case%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Activation of PKR an open and shut case.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).</li>
<li>Dauber, B., Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Antiviral+Kinase+PKR+and+Viral+Countermeasures%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures.</a> Viruses. 1, 523-544 (2009).</li>
<li>Dey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+link+between+PKR+dimerization%2C+autophosphorylation%2C+and+eIF2alpha+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition.</a> Cell. 122, 901-913 (2005).</li>
<li>Gack, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM25+RING-finger+E3+ubiquitin+ligase+is+essential+for+RIG-I-mediated+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity.</a> Nature. 446, 916-920 (2007).</li>
<li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+RIG-I+pathway+reveals+a+signaling+role+of+unanchored+polyubiquitin+chains+in+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity.</a> Cell. 141, 315-330 (2010).</li>
<li>Anderson, E., Cole, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+stabilities+in+protein+kinase+R+%28PKR%29%3A+evidence+for+weak+interdomain+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions.</a> Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).</li>
<li>Habjan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incoming+RNA+virus+nucleocapsids+containing+a+5%27-triphosphorylated+genome+activate+RIG-I+and+antiviral+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Hos.%2C+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling.</a> Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+clear-native%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of clear-native.</a> 5, 4338-4346 (2005).</li>
<li>Muller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Bouloy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Ikegami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathogens. 5, e1000287(2009).</li>
<li>Iwamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IRF-3%2F-7+kinase+and+NF-kappaB+in+response+to+double-stranded+RNA+and+virus+infection%3A+common+and+unique+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells+%3A+Devoted+to+Molecula.%2C+%26+Cellular+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways.</a> Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).</li>
<li>Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+IRF-3+activation+by+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interfero.%2C+%26+Cytokine+Research+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Control of IRF-3 activation by phosphorylation.</a> Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).</li>
<li>Bamming, D., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+signal+transduction+by+enzymatically+inactive+antiviral+RNA+helicase+proteins+MDA5+RIG-I+and+LGP2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+dsRNA+recognition%2C+filament+formation%2C+and+antiviral+signal+activation+by+MDA5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5.</a> Cell. 152, 276-289 (2013).</li>
<li>Berke, I. C., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDA5+cooperatively+forms+dimers+and+ATP-sensitive+filaments+upon+binding+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA.</a> The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).</li>
<li>Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+evasion+of+type+I+interferon+responses+by+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses.</a> Virus Research. 162, 12-18 (2011).</li>
<li>Taylor, K. E., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+viral+evasion+of+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon.</a> Immunology. 138, 190-197 (2013).</li>
<li>Goodbourn, S., Randall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+type+I+interferon+production+by+paramyxoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interfero.%2C+%26+Cytokine+Research+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses.</a> Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).</li>
<li>Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+tricks+to+grid-lock+the+type+I+interferon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral tricks to grid-lock the type I interferon system.</a> Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

바이러스의 존재와 I 시스템을 IFN 항 바이러스 유형의 활성화를 감지 성공적으로 타고난 면역 반응 22 중요하다. 바이러스 탐지함으로써 신속한 대응 및 항 바이러스 방어 메커니즘의 활성화를 가능하게 RIG-I와 PKR 같은 병원체 인식 수용체 (PRRS)에 의해 매개된다. 여기, 우리가 직접 RIG-I와 PKR의 활성화 상태를 평가하기 위해 두 가지 방법을 설명합니다. RIG-I과 PKR의 구조적 변화 첫 각각 M. 게일 주니어와 T. 후지타 6,17 및 JL 콜 (30)의 그룹에 의해 기술 된 모니터링하는 도구로, 제한되는 단백질 분해 효소의 소화. 그것은 구조적인 변화에 따른 트립신 처리에 감도 변경을 평가하는 중요한 방법을 나타냅니다. 바이러스에 감염된 세포 용 해물의 트립신 처리 저항 RIG-I의 조각을 트립신을 주도하는 반면 트립신 소화를 적용, 우리는 모의 감염된 샘플 RIG-I과 PKR의 급격한 저하를 ...

항 바이러스 숙주 방어에서 중요한 이벤트는 소위 패턴 인식 수용체 (PRRS) 1,2에 의해 병원균의 신속한 검출입니다. RNA 바이러스 감염 세포 내 검출은 두 가지 세포 내 RNA의 헬리, RIG-I (레티노 산 유도 유전자 I) 및 MDA5 (흑색 종 분화 관련 단백질 5) 3-5에 따라 달라집니다. RIG-I은 두 개의 N-말단 카스파 모집 도메인 (카드), 중앙 DECH 박스 타입 RNA 헬리 케이즈 도메인과 C-말단 도메인 (CTD) 4,6로 구성되어있다. CTD 및 헬리 케이즈 도메인이 아닌 자기 (바이러스) RNA를 인식에 필요한 반면, 카드는 항 바이러스 호스트 상태의 설립에 이르는 다운 스트림 신호를 중재. RIG-I가 특정 RNA 리간드의 부재 즉 무음 상태에있는 경우, 제 CARD는 중앙 헬리 케이즈 도메인과 상호 작용하고 자동 억제 입체 7-11 RIG-I를 유지한다. RIG-I는 짧은에 바인딩 더블5&#39;-트리 포스페이트 (5&#39;PPP), 긴 dsRNA에, 그리고 polyU / UC 풍부한 RNA, 많은 RNA 바이러스 12-16의 게놈에 존재하는 고전적인 서명 구조 베어링 가닥 (DS) RNA. RIG-I 활성화의 두 가지 주요 특성은 닫힌 형태 6,17 및 호모 올리고머 6,18,19로 전환합니다. 구조적 스위치, RNA 바인딩 향상 다운 스트림 신호의 카드를 노출하고 활성 ATP 아제 사이트 8,9,11,20을 재구성한다. 올리고머 RIG-I 복합체의 형성은 항 바이러스 신호 전달 (11)를위한 플랫폼을 형성하도록 하류 시그널링 어댑터 분자의 향상된 모집에 이르게한다. RIG-I-조절 신호 체인은 결국 전사 인자를 활성화 IRF-3 위로 규칙 전체 바이러스 반응 (21, 22)에 대한 인터페론 (IFN-alpha/beta) 유전자와 인터페론 자극 유전자의 따라서 유전자 발현 (ISGs)의 . 최고의 특성화 ISGs 중 하나는 RNA 활성화 PROTEI입니다N 키나제 (PKR) 23. PKR은 진핵 번역 개시 인자 2 알파 (eIF2α) 키나아제의 가족에 속하는 N-말단 이중 가닥 RNA 결합 도메인과 C-말단 키나제 도메인으로 구성되어 있습니다. 키나아제는 PKR 활성화를위한 이량 인터페이스 중요한 구성하고 단백질의 촉매 기능을 수행한다. 바이러스를 dsRNA에 PKR의 바인딩의 구조적 변화가 다른 잔류 물 사이의 Thr 446에 이합체 및 자동 인산화를 허용로 연결됩니다. PKR는 따라서 바이러스의 mRNA 23-27의 번역을 차단 eIF2α의 인산화를 중재. RIG-I와 PKR 모두 주요 구조 재 배열을 받아야 올리고머 단지를 형성하고 포스트 병진 인산화 / 탈 인산화와 유비퀴틴 10,11,19,23,24,26-29에 의해 수정됩니다. 바이러스 성 RNA의 구조는 RIG-I과 PKR 활성화 (그리고 어떤 단계에서 바이러스 성 길항제 ㄴ 수있는의 더 나은 이해를위한E) 간섭, 그것은 정확하게 활성화 상태를 결정하는 것이 중요하다. 모두 PRRS를 위해 이전에 활성화가 트립신 내성 단백질 조각 6,17,30 및 고차 올리고머 6,18,19의 출현에 이르게 설명했다. 그러나, 항 바이러스 호스트 응답 1,2,24 이러한 핵심 요소에 대한 문학의 재산을 주어, 직접 방법의 응용 프로그램은 비교적 드문 것 같다. 광범위한 사용을 촉진의 희망, 우리는 견고 RIG-I와 PKR의 활성화 상태를 분석 할 수있는 편리하고 민감한 프로토콜을 제공합니다. IFN 유능한 인간 세포주 A549은 RIG-I과 PKR, 감쇠 리프트 밸리 열병 바이러스 돌연변이 클론 13 (망할 CIA 13) (31, 32)의 설립 활성화에 감염된다. 간단한 용해하는 과정을 거친 후, 감염된 세포의 추출물 구조적 전환을 평가하기 위해 제한된 트립신 소화 / 웨스턴 블롯 분석에 의해 테스트되고 파란색 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE) / 웨스턴 블롯 분석가로올리고머의 형성을 측정하는 것이다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">세포 배양</td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985-47</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>PAA</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>PAA</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>PAA</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Chemicals</td></tr><tr><td>L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">항체</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-804-849-C100</td><td>WB: TBS Mouse의 1% 탈지유에 1:500</td></tr><tr><td> monoclonal anti-PKR (B10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6282</td><td>WB: TBS</td></tr><tr><td>Rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td><td>Epitomics</td><td>1120-1</td><td>WB: 1:1,000 in 5% BSA in TBS</td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-IRF-3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9082</td><td>WB: 1:500 in 1% 탈지유 in TBS</td></tr><tr><td>Rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td><td>IBL</td><td>og-413</td><td>WB: 1:100 in 1% 탈지유 TBS</td></tr><tr><td>토끼 항 RVFV 과면역 혈청 "C2"(MP-12)</td> <td>친절 제공 Alejandro Brun CISA-INIA</td><td></td><td>WB : TBS의 1 % 탈지유에 1 : 2,000</td></tr><tr><td>마우스 단클론 항 베타 액틴 (8H10D10)</td> <td>세포 신호</td><td>3700</td><td>WB : TBS의 1 % 탈지유에 1 : 1,000</td></tr><tr><td>Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031460 1892914</td><td>WB : TBS</td></tr><tr><td>의 1 % 탈지유에 1 : 20,000폴리클로날 과산화효소 접합 염소 안티 마우스</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031430 1892913</td><td>WB: TBS의 1% 탈지유에서 1:20,000</td></tr></tbody></table>

항 바이러스 패턴 인식 수용체 rig-i와 pkr에 의해 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지의 모니터링 활성화

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

바이러스 감염에 대한 숙주 방어는 타고난 면역 시스템의 패턴 인식 수용체 (PRRS)에 의한 신속한 검출에 따라 달라집니다. 세포질에서, PRRS RIG-I 및 특정 바이러스 성 RNA의 리간드 PKR 바인딩. 이것은 첫 번째 구조적 전환 및 올리고머를 중재하고 항 바이러스 인터페론 반응의 활성화를 가능하게한다. 바이러스 숙주 유전자 발현을 측정하는 방법은 잘 확립되어 있지만, 직접 RIG-I 및 PKR의 활성 상태를 모니터링하는 방법은 부분적으로 만 이하이며 잘 확립. 여기, 우리는 설립 인터페론 유도, 리프트 밸리 열병 바이러스 돌연변이 클론 13 (망할 CIA 13) 감염시 RIG-I과 PKR 자극을 모니터링하는 두 가지 방법을 설명합니다. 제한 트립신 소화 PRRS의 구조적 변화를 나타내는 단백질 분해 효소의 감도 변화를 분석 할 수 있습니다. RIG-I과 PKR, wherea의 급속한 저하의 모의 감염된 세포 결과에서 해물의 트립신 소화망할 CIA의 13 감염은 단백질 분해 효소 내성 RIG-I 조각의 출현에 이르게한다. 또한 PKR은의 Thr 446에 그것의 특징 인산화와 일치 트립신 소화에 바이러스에 의한 부분적인 저항을 보여줍니다. RIG-I과 PKR 올리고머 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해 확인 된의 형성. 이 단백질은 모의 감염된 샘플 단량체로 남아있는 반면 감염되면, RIG-I과 PKR 올리고머 단지의 강한 축적이있다. 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지는 RIG-I과 PKR 활성화의 두 다양한 단계의 민감하고 직접 측정을 허용, 웨스턴 블롯 분석을 결합 둘. 이 기술은 상대적으로 쉽게 수행 할 수 신속하고 고가의 장비를 필요로하지 않습니다.

RIG-I 또는 PKR에 의한 바이러스 성 작용제의 인식은 구조적 전환 6,17,30 및 올리고머 6,18,27를 트리거합니다. 우리는 각각 제한된 단백질 분해 효소의 소화와 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해이 두 활성화 마커를 정량. 인간의 A549 세포는 IFN 길항제 NSS (35, 36)의 돌연변이에 의해 특징 리프트 밸리 열병 바이러스의 복제 13 (망할 CIA 13)에 감염되었다. 때문에 기능 NSS의 부재로, 클론 (13)은 강하게 세포 12,31,32,37에서 강력한 항 바이러스 상태의 설립에 이르는, RIG-I과 PKR을 유도한다. RIG-I의 급속한 저하의 모의 감염된 세포 용 해물 결과 트립신 소화, 망할 CIA 13 감염이 30 kDa의 저항 RIG-I 조각 그림 1A의</stron...

바이러스 감염에 타고난 방어는 패턴 인식 수용체 (PRRS)에 의해 실행됩니다. 두 세포질 PRRS RIG-I과 바이러스 서명 RNA를 변경 형태, 올리고머, 항 바이러스 신호를 활성화하기 위해 PKR 바인딩. 방법은 편리한 구조적인 스위칭 및 이러한 세포질 PRRS의 올리고머를 모니터링 할 수있는 기술되어있다.

항 바이러스 패턴 인식 수용체 RIG-I와 PKR에 의해 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지의 모니터링 활성화

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

바이러스 감염에 대한 선천적 방어 기전은 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptors, PRRs)에 의해 유발됩니다. PRRs는 감염 중 선천 면역계 세포 내에 존재합니다. 세포질 PRRs인 RIG-I 및 PKR은 바이러스 특이적 RNA에 결합하여 구조적 변화를 일으키며, 모든 리간드와 결합하여 항바이러스 신호 전달을 활성화합니다. RIG-I 및 PKR의 구조적 변화와 리간드 결합을 in vitro에서 모니터링하기 위해, 인간 A549 세포에 Rift Valley 열병 바이러스를 감염시킵니다.PRR 활성화를 자극하기 위해 클론 13을 사용합니다. 그 후 대조군 세포와 감염된 세포의 세포 용해물을 준비하여 RIG-I 및 PKR의 구조적 변화를 분석합니다. 제한적 트립신 소화 과정을 수행합니다.단백질 구조에 형태 변화가 일어난 경우, 해당 단백질은 소화에 더 강한 저항성을 가지며, 모든 가스 네이티브 PAGE(allgas native page) 수행 후 웨스턴 블로팅 분석(Western blotting Analysis)을 통해 형성 여부를 분석하면 밴드가 관찰됩니다. 모든 리가먼트화(ligamentization)가 일어난 경우, 더 높은 분자량의 all liga rig eye 및 PKR 복합체가 관찰됩니다. 제한적 프로테아제 소화(limited protease digestion)와 네이티브 PAGE의 주요 장점은 이러한 기술들이 rega 및 PKR 활성화를 직접적으로 측정할 수 있게 한다는 점입니다.이러한 방법들은 RIG-I 및 PKR 활성화와 관련된 RNA 종의 정확한 성질과 기원은 무엇인지와 같이 선천 면역 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 방법들은 RIG-I 및 PKR 작용제에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 아울러 MDA5와 같은 다른 세포질 센서 단백질에도 적용될 수 있으며, 본 절차의 시연은 저희 실험실의 박사 과정 학생인 Mila Viva가 수행하겠습니다. 절차를 시작하기에 앞서.이후 CL 13으로 지칭되는 Rift Valley Fever virus clone 13은 약독화된 바이러스 변이체이며, 독일에서는 BSL 2 조건 하에서 취급해야 함에 유의하십시오. PBS 무혈청 배지와 5% FCS가 포함된 세포 배양 배지를 예열합니다. 이를 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브에 넣어 항온 수조에 둡니다. 2.5 × 10⁶ 개의 세포를 감염시키

monitoring-activation-antiviral-pattern-recognition-receptors-rig-i

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 모델 herpesvirus, 감마 herpesvirus 68 (γHV68)의 lytic 복제에 호스트 신호 분자의 핵심 역할을 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 유전자 변형 마우스 긴장과 γHV68 lytic 복제 배아 섬유 아세포를 활용, 프로토콜 phenotypic 특성화 및 바이러스 lytic 복제에서 바이러스 호스트 상호 작용의 분자 심문을 모두 할 수 있습니다.

모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

우리는 인간 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV)와 엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 밀접하게 관련되는 모델 헤르페스 바이러스, 뮤린 감마 허피스 바이러스 68 (γ HV68)로 감염된 마우스에서 항 바이러스 사이토 카인 생성을 측정하기 위해 프로토콜을 설명한다. 유전자 변형 마우스 종자와 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)를 활용하여, 우리는 항 바이러스 사이토 카인 생산 생체 내 및 생체 모두를 평가. 렌티 바이러스 전달하여 녹아웃 배아 섬유 아세포에서 선천성 면역 구성 요소의 표현을 "재구성", 우리는 더 특정 선천성 면역 분자를 정확하게 지적하고 차등 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 조절하는 중요한 신호 이벤트를 해부하다.

사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

여기에서는 IRF3 전사 인자의 인산화 의존적 활성화에 대한 자세한 분석을 허용하는 절차를 설명합니다. 이는 여러 인특이성 항체를 사용하여 면역블롯에 결합된 고분해능 SDS-PAGE와 native-PAGE의 조합을 통해 달성됩니다.

고해상도 방법 IRF3의 인산화에 의존 활성화를 모니터링하려면

RNA 바이러스 복제 생산 하는 이중 가닥 RNA는 타고 난 면역 반응 유도 하 패턴 인식 수용 체에 의해 인식할 수 있습니다. 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 낮은 수준의 dsRNA와 호흡기 간의 상호 작용 불분명 남아 있습니다. Arenavirus dsRNA와 개별 셀에서 PRR를 시각화 하는 confocal 현미경 검사 법 방법을 개발 했습니다.

이중 가닥 RNA와 패턴 인식 수용 체 부정적인 감 RNA 바이러스 감염에의 confocal 영상

우리는 HeLa 세포를 사용 하 여 포유류 세포 주기 동안 이중 가닥 RNA 바인딩 단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR)의 공부 RNA-인터에 대 한 실험적인 접근을 제시. 이 방법은 포름알데히드 crosslink RNA PKR 단지 및 PKR 바인딩된 RNAs를 풍부 하 게 하는 immunoprecipitation를 사용 합니다. 이러한 RNAs는 더 높은 처리량 시퀀싱 또는 qRT-PCR을 통해 분석할 수 있습니다.

공부 하는 단백질 키 니 아 제 RNA 포유류 세포 주기 동안 활성의 RNA 인터

CAL-1 혈장세포세포주에서 내인성 인터페론 조절 인자 5 이량화를 분석하기 위한 네이티브 웨스턴 블롯 방법이 기재되어 있다. 이 프로토콜은 다른 세포주에도 적용될 수 있습니다.

내인성 IRF5 이분화의 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기동동면역블롯 분석

우리는 바이러스성 다단백질에 내장된 상동 호스트 병원체 단백질 서열(SSHHPS)의 짧은 스트레칭을 확인하기 위한 일반적인 프로토콜을 제시한다. SSHHPS는 바이러스 성 프로테아제에 의해 인식되고 여러 그룹 IV 바이러스에 의해 특정 숙주 단백질의 표적 파괴를 지시한다.

시험관 내 및 실리코 방법을 사용한 그룹 IV 바이러스 성 SSHHPS 분석

이 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내 (마우스내) 감염, 무균 손상 및 암 모델 모두에 대한 반응으로 카스파제 활성화(카스파제-1, 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-11)를 평가하여 파이롭토시스, 세포자멸사, 괴사 및 PANoptosis와 같은 세포 사멸 경로의 개시를 결정합니다.

선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

면역형광 염색 중 티라마이드 신호 증폭은 HSV-1 감염 후 ZBP1 유발 괴사 동안 인산화된 RIPK3 및 MLKL의 민감한 검출을 가능하게 합니다.

인간 세포에서 HSV-1 감염 후 RIPK3 및 MLKL의 ZBP1 의존성 인산화의 면역형광염색을 위한 티라마이드 신호 증폭

배우세요 RIG-I와 PKR의 활성화를 제한 프로테아제 소화 및 네이티브 PAGE로 분석하는 방법. A549 세포를 이용한 바이러스 감염 실험에서 패턴 인식 수용체의 구조 변화와 올리고머화를 모니터링할 수 있습니다.

항 바이러스 패턴 인식 수용체 RIG-I와 PKR에 의해 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지의 모니터링 활성화

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