항 바이러스 패턴 인식 수용체 RIG-I와 PKR에 의해 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지의 모니터링 활성화

바이러스 감염에 대한 선천적 방어 기전은 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptors, PRRs)에 의해 유발됩니다. PRRs는 감염 중 선천 면역계 세포 내에 존재합니다. 세포질 PRRs인 RIG-I 및 PKR은 바이러스 특이적 RNA에 결합하여 구조적 변화를 일으키며, 모든 리간드와 결합하여 항바이러스 신호 전달을 활성화합니다. RIG-I 및 PKR의 구조적 변화와 리간드 결합을 in vitro에서 모니터링하기 위해, 인간 A549 세포에 Rift Valley 열병 바이러스를 감염시킵니다.

PRR 활성화를 자극하기 위해 클론 13을 사용합니다. 그 후 대조군 세포와 감염된 세포의 세포 용해물을 준비하여 RIG-I 및 PKR의 구조적 변화를 분석합니다. 제한적 트립신 소화 과정을 수행합니다.

단백질 구조에 형태 변화가 일어난 경우, 해당 단백질은 소화에 더 강한 저항성을 가지며, 모든 가스 네이티브 PAGE(allgas native page) 수행 후 웨스턴 블로팅 분석(Western blotting Analysis)을 통해 형성 여부를 분석하면 밴드가 관찰됩니다. 모든 리가먼트화(ligamentization)가 일어난 경우, 더 높은 분자량의 all liga rig eye 및 PKR 복합체가 관찰됩니다. 제한적 프로테아제 소화(limited protease digestion)와 네이티브 PAGE의 주요 장점은 이러한 기술들이 rega 및 PKR 활성화를 직접적으로 측정할 수 있게 한다는 점입니다.

이러한 방법들은 RIG-I 및 PKR 활성화와 관련된 RNA 종의 정확한 성질과 기원은 무엇인지와 같이 선천 면역 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 방법들은 RIG-I 및 PKR 작용제에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 아울러 MDA5와 같은 다른 세포질 센서 단백질에도 적용될 수 있으며, 본 절차의 시연은 저희 실험실의 박사 과정 학생인 Mila Viva가 수행하겠습니다. 절차를 시작하기에 앞서.

이후 CL 13으로 지칭되는 Rift Valley Fever virus clone 13은 약독화된 바이러스 변이체이며, 독일에서는 BSL 2 조건 하에서 취급해야 함에 유의하십시오. PBS 무혈청 배지와 5% FCS가 포함된 세포 배양 배지를 예열합니다. 이를 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브에 넣어 항온 수조에 둡니다. 2.5 × 10⁶ 개의 세포를 감염시키기 위해 무혈청 배지에 CL 13을 1.25 × 10⁷ PFU/mL 농도로 준비합니다.

감염 다중도(MOI)가 5인 A 5 49 세포를 준비하며, 피펫팅 오차를 고려하여 필요한 양보다 약 10% 더 많이 준비합니다. 배양기에서 A 5 49 세포를 꺼내 배지를 흡입해 제거하고, 10 milliliters의 PBS를 첨가한 후 배양 플라스크를 흔들거나 기울여 세포를 세척한 다음 PBS를 제거합니다. 다음으로, 희석된 CL 13 1 milliliter를 첨가하거나, 비감염 대조군 또는 모의 감염(mock infection)의 경우 해당 시료를 첨가합니다.

무혈청 배지 1 mL를 첨가하고 15분 간격으로 1시간 동안 배양합니다. 배지가 균일하게 분배되도록 플라스크를 조심스럽게 기울입니다. 감염 후 1시간이 지나면 접종물을 제거합니다.

5% FCS가 포함된预열된 세포 배양 배지 5 mL를 추가하고 5시간 동안 배양합니다. 0.5% Triton X 100이 포함된 PBS를 준비하여 4 °C에 보관합니다. Syrian protease 억제제는 추가하지 마십시오.

다음으로, 차가운 PBS로 세포를 세척하고 신선한 PBS 10 milliliters를 첨가합니다. 그런 다음 세포 스크래퍼를 사용하여 디쉬에서 세포를 떼어냅니다. 세포 현탁액을 15 milliliter 원심분리관으로 옮기고 실온에서 800 times G로 5분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후, 상층액을 제거하고 0.5% Triton X 100이 포함된 PBS 30 µL로 세포 펠릿을 재부유합니다. 용해물을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고 얼음 위에서 최소 10분 동안 배양합니다. 용해물을 4 °C에서 10,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후, 맑은 세포 용해물을 새 튜브로 옮깁니다. Bradford 분석을 수행하여 맑은 세포 용해물의 단백질 농도를 측정합니다. -20 °C에서 보관하거나, 패턴 인식 수용체의 구조적 변화를 분석하기 위해 즉시 trypsin 소화 또는 native PAGE 단계를 진행합니다. 먼저 PBS에 녹인 chloro, methyl ketone 처리 trypsin 또는 TPCK trypsin을 최종 작동 농도 2 µg/mL가 되도록 희석합니다. 각 조건에 대해 두 개의 새 튜브에 CL 13 및 비감염 대조군 단백질 용해물의 최종 단백질 농도가 25 µg이 되도록 PBS로 최종 부피 9 µL까지 맞춥니다. 용해물 한 세트는 입력 대조군으로 사용하고, 다른 세트는 TPCK trypsin으로 처리하며, 처리하지 않은 대조군 튜브에는 나머지 두 튜브에 1 µL의 PBS를 추가합니다.

최종 농도가 0.2 µg/µL가 되도록 2 µg/µL TPCK trypsin 1 µL를 첨가합니다. 피펫팅을 통해 반응물을 혼합합니다. 용해물을 37 °C에서 25분 동안 배양합니다.

5x 변성 시료 버퍼를 첨가하고 95 °C에서 5분간 가열하여 반응을 중단시키십시오. 트립신 배양 시간을 연장하지 않는 것이 중요합니다. 내성 단백질이 검출되지 않거나 너무 많이 검출되는 경우, 배경 신호 없이 내성 단편을 검출하기 위해서는 트립신 소화 시간을 정확하게 조절하는 것이 매우 중요하므로 이에 따라 소화 시간을 조정하십시오.

가열 후 샘플을 -20 °C에서 보관하거나, 5% stacking gel과 12% resolving gel로 구성된 두 개의 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel에 샘플을 로딩하십시오. bromo phenol blue가 모두 내려갈 때까지 젤당 25 mA의 전류로 단백질을 분리하십시오.

겔 전기영동을 마친 후, 단백질을 하나의 겔에서 poly vine fluoride membrane으로 전이시키고 RIG-I 및 PKR 항체를 이용한 western blotting으로 분석합니다. 다른 겔은 kumasi brilliant blue G two 50으로 염색합니다. 그 다음 겔을 25% ethanol, 8% acetic acid, 4% glycerol 혼합액에 넣고 4 °C에서 보관하거나, 즉시 이미징 및 분석을 수행합니다. 패턴 인식 수용체의 올리고머 상태를 분석하려면, cell lysate 50 µg을 PBS로 희석하여 최종 부피 10 µL로 준비하고 5x sample buffer를 최종 농도 1x가 되도록 첨가합니다.

5% stacking 젤과 8% resolving 젤로 구성된 native poly acrylamide 젤에 샘플을 즉시 로딩하십시오. 지체될 경우 native complex가 손실될 수 있습니다. 젤을 4 °C에서 젤당 20 milliamps로 전기영동하십시오.

브로모페놀 블루(Bromo phenol blue) 밴드가 젤을 빠져나온 후 45분 뒤에 전기영동을 중단하며, 총 소요 시간은 약 1.5시간에서 2시간입니다. 이후 동봉된 문서에 기술된 대로 RIG-I 및 PKR에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅을 수행함으로써, RIG-I 또는 PKR에 의한 바이러스 작용제 인식으로 유도된 구조적 전환 및 올리고뉴클레오타이드를 분석합니다. 제한적 프로테아제 소화 및 네이티브 PAGE는 본 비디오에 설명된 대로 수행되었습니다. 모의 감염된 세포 용해물을 트립신으로 소화시킨 결과 RIG-I가 빠르게 분해되었으나, clone 13 감염의 경우 30 kDa의 내성이 있는 RIG-I 단편이 생성되었습니다. PKR 또한 감염된 샘플에서 트립신 소화에 대해 부분적인 내성을 보이며, 이는 PKR의 인산화와 일치합니다. 트립신 소화의 효율성과 특이성을 모니터링하기 위해 젤을 Coomassie Brilliant Blue G-250으로 염색하였습니다. 처리하지 않은 샘플은 동일한 양의 단백질이 로딩되었음을 보여주며, 모의 감염 및 C13 세포 용해물을 트립신으로 소화시키면 전체적인 단백질 양이 유사하게 감소합니다.

이는 비감염 세포에서 트립신 처리가 mock 및 CL 13 감염 시료에 대해 동일한 효율을 가짐을 보여줍니다. 추가 대조군으로서 R EYE 및 PKR의 단량체만이 검출되었습니다. 단량체로 존재하지만 R Eye를 통해 활성화되면 이량체화되는 것으로 알려진 전사 인자 IRF three가 포함되었습니다.

Clone 13 감염은 스미어(smear) 형태의 RIG-I 올리고머 복합체의 강력한 축적과, 뚜렷한 단백질 밴드 형태의 PKR 및 IRF3 이량체 또는 올리고머의 축적을 유도합니다. 이러한 결과는 제한된 트립신 소화(trypsin digestion)와 네이티브-PAGE(native PAGE)가 감염 시 RIG-I 및 PKR의 구조적 변화와 올리고머 형성을 모니터링하는 유용한 도구임을 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후, 숙달된다면 RIG-I 및 PKR의 구조 전환과 올리고머화를 모니터링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 기술은 다음 절차에 따라 이틀에 걸쳐 수행할 수 있습니다. 자극 리간드의 발달 이후 안정적인 상호작용이 존재하는지 등 추가적인 질문에 답하기 위해 pro assay와 같은 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 선천 면역 분야의 연구자들이 바이러스로 자극된 세포 내 패턴 인식 수용체의 활성화 상태를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.