항 바이러스 패턴 인식 수용체 RIG-I와 PKR에 의해 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지의 모니터링 활성화

바이러스 감염에 대한 선천적 방어는 패턴 인식 수용체 또는 prr에 의해 촉발됩니다. 감염 중 선천면역 체계의 세포에 존재합니다. 세포질 PRRS, 리그 아이 및 PKR은 바이러스 시그니처 RNA에 결합하고, 모든 리가 안을 변경하고, 항바이러스 신호를 활성화하여 리그 아이 및 PKR 확인 변화 및 모든 인대화 in vitro human A 5, 49 세포가 Rift Valley 열병 바이러스에 감염됩니다.

PRR 활성화를 자극하기 위해 클론 13을 사용합니다. 그런 다음 대조군 및 감염된 세포의 세포 용해물을 준비하여 rig eye 및 PKR 확인 변화를 분석합니다. 제한된 tryin 소화가 수행됩니다.

단백질 구조의 확인 변화가 발생한 경우 단백질은 소화에 더 강하고 밴드는 웨스턴 블로팅 분석으로 볼 수 있습니다.allgas 네이티브 페이지의 형성을 분석하기 위해 웨스턴 블로팅 분석이 수행 된 후 웨스턴 블로팅 분석이 수행됩니다. 모든 인대화가 더 높게 발생하면 모든 리가 리그 아이와 PKR 복합체가 보입니다. 제한된 프로테아제 분해 및 native page의 주요 장점은 이러한 기술이 rega 및 PKR 활성화의 직접 측정을 용이하게 한다는 것입니다.

이러한 방법은 리그 아이 및 PKR 활성화와 관련된 RNA 종의 정확한 특성과 기원이 무엇인지와 같은 선천성 면역 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 방법은 리그 아이 및 PKR 작용제에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그들은 또한 MDA five와 같은 다른 세포질 센서 단백질에 적용될 수 있으며, 이 절차를 시작하기 전에 내 실험실의 박사 과정 학생인 Mila Viva가 절차를 시연할 것입니다.

이하 CL 13이라고 하는 리프트 밸리 발열 바이러스 클론 13은 약독화 바이러스 돌연변이이며, 독일에서는 5%FCS를 함유한 PBS 무혈청 배지 및 세포 배양 배지를 예열하기 위해 BSL 두 가지 조건에서 처리해야 합니다. 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 담긴 수조에 넣습니다. 무혈청 배지에서 CL 13 밀리리터당 1.25 곱 10 - 7번째 PFU를 2.5 곱하기 10 - 6번째 PFU를 준비합니다.

감염의 다양성 또는 MOI가 5인 5 49개의 세포는 파이펫팅 오류를 설명하는 데 필요한 것보다 약 10% 더 많이 준비합니다. 인큐베이터에서 A 5 49 세포를 제거하고, 배지를 흡인하고, 10ml의 PBS 소용돌이 또는 배양 플라스크를 기울여 세포를 세척한 다음 PBS를 제거합니다. 다음으로, 희석된 CL 13 1밀리리터를 첨가하거나 감염되지 않은 대조군 또는 모의 감염을 위해 추가합니다.

1ml의 무혈청 배지를 넣고 15분마다 1시간 동안 배양합니다. 매체가 균등하게 분포되도록 플라스크를 조심스럽게 기울이십시오. 감염 1시간 후 안구를 제거하십시오.

5%FCS가 함유된 예온된 세포 배양 배지 5ml를 추가하고 5시간 동안 배양합니다. 0.5%tritton X 100으로 PBS를 준비하고 섭씨 4도에 놓습니다. 시리아 프로테아제 억제제를 첨가하지 마십시오.

다음으로, 차가운 PBS로 세포를 씻고 10ml의 새 PBS를 첨가합니다. 그런 다음 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 셀을 분리합니다. 세포 현탁액을 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 800배 G로 원심분리합니다.

스핀 후 상등액을 제거하고 0.5% Triton X 100으로 30마이크로리터의 PBS에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 용해물을 새 1.5ml 튜브에 옮기고 얼음에서 최소 10분 동안 배양합니다. 10, 000 시간 G에 용해물을 4 섭씨 온도에 10 분 동안 원심 분리기.

원심분리 후 정화된 세포 용해물을 새 튜브로 옮깁니다. 브래드포드 분석을 수행하여 정화된 세포 용해물의 단백질 농도를 측정하고 섭씨 영하 20도에서 보관하거나 즉시 분해를 시도하거나 패턴 인식 수용체의 확인 변화를 위한 분석을 위해 네이티브 페이지를 진행하여 먼저 PBS의 L 1 토스토 클로로, 메틸 케톤 처리 또는 TPCK 트립신을 각 조건에 대해 두 개의 새 튜브에서 밀리리터당 2마이크로그램의 최종 작업 농도로 희석합니다. PBS로 9 마이크로 리터의 최종 부피에서 CL 13 및 비감염 대조군 단백질 용해물의 최종 단백질 농도를 25 마이크로 그램으로 조정하고, 한 세트의 용해물은 입력 대조군으로 사용되며 다른 세트는 처리되지 않은 대조 튜브에 TPCK 트립신으로 처리됩니다. 나머지 두 개의 튜브에 1마이크로리터의 PBS를 추가합니다.

마이크로리터당 2마이크로그램 TPCK 트립신 1마이크로리터를 첨가하여 최종 농도를 마이크로리터당 0.2마이크로그램으로 만듭니다. 파이펫팅으로 반응을 혼합합니다. 용해물을 섭씨 37도에서 25분 동안 배양합니다.

5 x 변성 시료 완충액을 첨가한 다음 섭씨 95도에서 5분 동안 끓여 반응을 중지합니다. 트립신 배양 시간을 연장하지 않는 것이 중요합니다. 트립신 분해의 정확한 타이밍은 내성 단백질이 검출되지 않거나 너무 많은 단백질이 검출되는 경우 분해 기간을 조정한 경우 배경 없이 내성 단편을 검출하는 데 중요합니다. 그러므로.

끓인 후 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관하거나 두 개의 독 황산나트륨에 샘플을 로드합니다. 12%resolving 젤에 5% 쌓는 젤로 이루어져 있는 많은 아크릴아미드 젤. 브로모 페놀 블루가 다 떨어질 때까지 젤당 25밀리암페어에서 단백질을 분리합니다.

겔을 실행 한 후, 하나의 겔에서 폴리 덩굴 불소 멤브레인으로 단백질을 옮기고 리그 눈과 PKR에 대한 항체로 웨스턴 블로팅으로 분석하여 다른 겔을 kumasi brilliant blue G two 50으로 염색합니다. 그런 다음 겔을 섭씨 4도에서 25% 에탄올, 8% 아세트산 및 4% 글리세롤에 보관하거나 이미징 및 분석을 진행합니다. 패턴 인식 수용체의 올리고머 상태를 분석하기 위해 PBS를 사용하여 10마이크로리터의 최종 부피에 50마이크로그램의 세포 용해물을 준비하고 1x의 최종 농도에 5개의 샘플 버퍼를 추가합니다.

즉시 천연 폴리 아크릴아미드 겔에 5% 적층 및 8% 분해능 겔로 샘플을 로드합니다. 지연되면 네이티브 복합체가 손실됩니다. 섭씨 4도에서 젤당 20밀리암페어로 젤을 실행합니다.

브로모 페놀 블루 밴드가 겔을 떠난 후 45분 후에 전기영동을 중지하고, 총 약 1.5 내지 2시간 후에 리그 아이 및 PKR에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅을 수행하고, 첨부 문서에 설명된 바와 같이 리그 아이 또는 PKR에 의한 바이러스 작용제의 인식에 의해 유도된 올리고를 확인하기 위한 분석을 수행하고, 리그 아이 또는 PKR 제한 프로테아제 분해 및 네이티브 페이지를 본 비디오에 설명된 바와 같이 수행하고, 모의 감염된 세포 용해물의 트립신 분해는 리그 아이의 급격한 분해를 초래한 반면, 클론 13 감염은 30 킬로달톤 저항성 리그 아이 단편을 생성했습니다. PKR은 또한 감염된 샘플에서 트립신 분해에 대한 부분적인 내성을 보이며, 이는 트립신 분해 겔의 효율성 및 특이성을 모니터링하기 위해 인산화와 일치하며, kumasi brilliant blue G two 50으로 염색되었습니다. 처리되지 않은 샘플은 동일한 양의 로드된 단백질을 보여주며, 모의 및 C 13 세포 용해물을 트립신 소화에 노출시키면 전체 단백질 양이 비슷하게 감소합니다.

이는 트립신 처리가 감염되지 않은 세포에서 모의 및 CL 13 감염 샘플에 대해 동일한 효율성을 갖는다는 것을 보여줍니다. R EYE 및 PKR의 단량체만이 추가 대조군으로 검출되었습니다. 전사 인자 IRF 3가 포함되었는데, 이는 단량체로 존재하지만 R Eye를 통해 활성화될 때 이합체화되는 것으로 알려져 있습니다.

클론 13 감염은 도말 형태의 리그 눈 올리고머 복합체와 PKR 및 IRF 3 이량체 또는 올리고머가 정의된 단백질 띠로 강력하게 축적됩니다. 이러한 결과는 소화 및 네이티브 페이지(native page)의 제한된 이동이 감염 시 리그 아이 및 PKR의 확인 변화 및 올리고 형성을 모니터링하는 데 유용한 도구임을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 WIC eye 및 PKR 확인 스위칭 및 마스터한 후 화를 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술은 이 절차에 따라 2일 이내에 수행할 수 있습니다. 프로 분석법과 같은 방법으로, 개발 후 자극 리간드와 안정적인 상호 작용이 있는지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 분석을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 선천면역 분야의 연구자들이 바이러스 자극 세포에서 패턴 인식 수용체의 활성화 상태를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.