Name: 경고, 헤드 억제 쥐의 하위 대뇌 피질의 뇌 구조 내에서 Juxtacellular 모니터링 및 현지화 단일의 뉴런 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 학습하세요 경고 상태의 쥐에서 하위 대뇌 피질 단일 뉴런을 Juxtacellular 기법으로 기록하고 해부학적 위치를 확인하는 방법을. 이 기술은 명확한 단일 단위 분리와 정확한 위치 식별을 가능하게 합니다.

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우리는 이 연구에 자금을 지원해 준 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research, MT-5877 보조금), 미국 국립보건원(National Institutes of Health, NS058668 및 NS066664 보조금), 그리고 미국-이스라엘 양국 재단(US-Israeli Binational Foundation, 보조금 2003222)에 감사한다.

연방 정부가 규정 된 동물 관리 및 사용 지침에 따라 - (350 g을 250)와 캘리포니아 샌디에고 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 실험 프로토콜은 여성 롱 에반스 쥐에서 수행되었다. 1. 신체 구속에 쥐 익숙해 질 참고 : 제한된 다이어트에 쥐를 놓습니다. 구속 (아래에서 설명)에 쥐를 적응 즉시 각 매일 처리 세션 후 하루에 한 번 쥐를 넣습니다. 초기 체중의 80 %에서 동물을 유지하기에 충분한 공급을 제공합니다. 이 금액은 250g 여성 롱 에반스 쥐에 대한 하루 공급의 약 6g이다. <ol><li> 인간에 ​​의해 처리되기 쥐를 적응. 부드럽게 약 5 초마다 30 초 동안 손으로 쥐를 억제. 2 일 연속 15 분 하루 동안이 작업을 수행합니다. 훈련 기간 동안 스트레스의 징후를 매일 쥐를 모니터링합니다. 징후 내가 어려움을 겪고 포함구속, 발성, 치아 채터에 n 개의 응답. </li><li> 제 3 회 하루에 15 분 이틀 연속에 하루 동안 신체 구속 천 양말 (그림 1)에 쥐를 놓습니다. </li><li> 5 번째 날, 양말 내부의 쥐를 배치하고 실험 지그에 단단한 튜브 (그림 4) 내부의 양말을 배치합니다. 2 일 연속 15 분 하루 동안 튜브에 쥐를 남겨주세요. </li><li> 각 훈련 직후 쥐 피드. 마지막 세션 (6 일째)의 끝에서 음식에 제한없이 액세스 할 수 있습니다. 주입을위한 마지막 훈련을 하루에 과도한 스트레스의 징후를 표시하지 않습니다 만 쥐를 선택합니다. 참고 : 주입 쥐의 선택은 우리의 손에, 주관적이지만 쥐의 90 % 이상이 습관화에 반응과 이식을 받아야 할 것으로 밝혀졌다. </li></ol> 2. 기록 회의소 헤드 억제 메커니즘을 주입 <ol><li> 다시 확인핀 커넥터에 베어 스테인레스 스틸 와이어를 납땜 전파 방해 와이어. 3-5mm의 유적이 핀에 의해 발견 있도록 전선을 잘라. 모든 수술 도구와 함께, 기준 선을 압력솥. </li><li> 케타민 / 자일 라진 마취를 관리. 95 ㎎ / 복강 / kg 자일 라진 (xylazine) 5 mg을 혼합 kg 케타민을 관리합니다. 초기 용량은 1.5 ~ 2 시간 동안 지속됩니다. 필요에 따라, 모든 30 ~ 45 분 후 마취를 보충. 안과 연고와 동물의 눈을 윤활합니다. </li><li> 마취의 평면을 결정하고, 필요에 따라 마취를 유지하기 위해 발가락 철수 반사를 확인합니다. </li><li> 귀 바 정위 유지 프레임에 쥐를 놓습니다 (그림 3A). 머리에 모발을 면도 포비돈 요오드 (10 % 용액)와 상처 부위를 소독. 그들은 고막에 손상을주지 않도록 적절하게 귀 막대를 삽입 할주의하십시오. 이어 무딘 팁 막대가 바람직하다. </li><li> 메스 approxi와 절개를합니다후면부로 귀 뒤쪽에 눈의 rostro - 꼬리 수준에서 두개골의 정중선을 따라. 절단 및 절개의 양쪽에 피부의 2 ~ 3 밀리미터 스트립을 제거하기 위해 가위를 사용합니다. </li><li> 측면 능선에 밖으로 두개골의 표면을 노출 골막 멀리 다 쳤어요. superglue의 얇은 층으로 노출 된 두개골을 커버. </li><li> ½ mm 직경의 드릴을 이용하여 버어, 0-80 나사보다 약간 작은 직경의 작은 구멍을 뚫는다 (원료 섹션을 참조). 나사가 바닥보다 더 많은 측면 상단에 갈 수 있도록 구멍이 바로, 브레 그마 봉합이 측면 능선을 충족하고 두개골에 30 ~ 45 ° 각도로 위치로 후부 드릴. </li><li> 30 ~ 45 ° 각도로 구멍 (약 3 회전)에 0-80 평면 바닥 기계 나사에 나사. 기본 뇌 조직 손상을 방지하기 위해 너무 깊이에 나사하지 않도록주의하십시오. </li><li> 도시 된 구성에 추가로 나사 (6)에 대해이 절차를 반복 <strong&gt; (그림 3B). 모든 나사의베이스에 superglue를 적용합니다. </li><li> stereotax 조작기에 주사기 바늘을 놓습니다. 기준 마크로서, 원하는 개두술 위치의 브레 그마 봉합에서 측정하고 근처 바늘 두개골에 구멍을 내 만들지 만, 외부. 참고 :이 데모에서는, 마크의 정위 좌표가 3mm 후방와 브레 그마 봉합에 측면 1mm이다. </li><li> 영구 마커 덴트을 표시합니다. 이 정위 기준점이 될 것 같은, 마크의 정위 좌표를 참고 (그림 3B). </li><li> 원하는 좌표 (3mm 후방이 예에서 정수리하는 측면 3mm)을 중심으로 개두술을 확인합니다. 그대로 뇌경막을 남겨주세요. 수정 된 인공 뇌척수액으로 개두술을 커버 (125의 NaCl, 10mM 포도당, 10 mM의 HEPES, 3.1 mM의 염화칼슘 2, 1.3 mM의의 MgCl 2, pH를 7.4) (13) (그림 3C). </li&gt; <li> (4)에 0.2 ml의 원심 분리 튜브 컷 - 길이 5 ㎜, 및 캡을 절단. 두개골에 튜브를 놓고 개두술에 그것을 중심. </li><li> 두개골에 튜브의 기부를 밀봉 튜브 바닥 주위 치과 시멘트 적용. 노출 개두술 (그림 3D)에 시멘트를 누출하지 않도록주의하십시오. </li><li> 반대쪽 두개골 판에 다른 작은 구멍 (약 ½ mm 직경) 드릴 조심스럽게 참조 와이어를 삽입합니다. (장치 섹션 참조) 와이어의 단부에, 기록 증폭기와 인터페이스 핀을 납땜 기준 선을 구축. 참조 와이어를 이동하지 마십시오 그것은이 발생할 수있는 손상과 뇌에 한 번. </li><li> 와이어가 삽입 된 구멍에 superglue를 적용합니다. 이것은 일시적으로 장소에 핀과 와이어를 밀봉합니다. </li><li> 실리콘 겔 키트의 두 부분 믹스 대략 동등한 부분 (원료 섹션을 참조). 혼합 FIL 2 분을 기다립니다L 원심 분리기 튜브 약 ⅓ 젤 전체. </li><li> 직각 포스트 클램프를 부착 헤드 구속 바 (자료 섹션 참조). 플레이트의 바닥은 동물의 코 향하도록 45 ° 피치 각도 유지 바 (도 2B)에 헤드 판 (도 2A)를 붙여. 이 실험 지그 (도 4)와 일치되도록 피치 각도를 설정 경사계를 사용하는 것이 도움이된다. </li><li> 막대가 귀 바 평행이되도​​록 stereotax 조작하는 팔에 들고 줄을 연결합니다. 판 꼬리 가장 나사에 람다 봉합과 전방의 후방가되도록 바, 플레이트를 낮 춥니 다. </li><li> 프론트 헤드 볼트 잡고 (8-32 스터드 또는 나사, 자료 섹션 참조) 나사의 머리가 아래로 동물의 꼬리쪽으로 향하도록, 도움의 손길 암과 클램프 약 45 ° 각도로. 이 개미에 닿을 수 있도록 나사를 내립니다erior 0-80 나사 (그림 3 층, G). </li><li> 치과 아크릴과 장소에 볼트와 플레이트를 고정합니다. 뼈 스크류 헤드 주위 치과 아크릴, 기준 핀을 적용하고, 원심 분리 튜브의 측면 주위. 치과 아크릴이 마를 때까지 약 10 분을 기다립니다 (그림 3H). </li><li> 임플란트에 피부를 확고히, 치과 아크릴의 가장자리 주위에 치과 시멘트의 층을 적용합니다. 시멘트가 마를 때까지 기다립니다. </li><li> 원심 분리기 튜브의 캡에 여러 구멍을 찌를, 튜브의 캡을 배치합니다. </li><li> 도움의 손길 클램프를 제거합니다. 그런 다음 조심스럽게 stereotax에서 머리를 들고 줄을 제거한 다음 줄 (그림 3I)에서 헤드 플레이트를 제거합니다. </li><li> stereotax에서 동물을 제거하고 모든 적용 가능한 규칙, 규정 및 법률 (에 따라 수술 후 관리 및 모니터링을 관리 예, 부 프레 놀핀 0.02 ㎎ / ㎏, 24의 최소마다 8 ~ 12 시간시간). 염증이 임플란트의 가장자리 주위에 개발하면 해결 될 때까지, 매일 영향을받는 사이트에 항생제 연고의 얇은 층을 적용합니다. </li></ol> 신경 단위의 3 Juxtacellular 모니터링 <ol><li> 이산화탄소 레이저 마이크로 피펫 풀러에 수정 모세관 튜브를 당겨 1 μm 미만이다 (도 5a)의 선단부 직경 (장치 섹션 참조). 주 : 가열 파라미터는 특정 악기에 따라 다양하며, 필요한 목 직경 관심 뇌 구조에 따라 다를 것이다. 쥐의 시상에서 녹음을 위해, 마이크로 피펫은 5-7mm까지 올라 있습니다. </li><li> 긴 작동 거리 목표에 장착 된 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경 장소에 피펫을 고정합니다. 현미경의 무대에 장소에 피펫을 유지하는 점토를 사용합니다. </li><li> MAK에 사용 된 유리의 조각; 1cm 두께 - 0.5 천천히 유리 블록 (이동울트라 마이크로톰 나이프를 보내고하는 것은 피펫 팁과보기의 필드에) 편리합니다. 무대 미세 조작기 사용, 가볍게 휴식 원인, 유리 피펫 팁을 터치합니다. 피펫 팁의 외경은 1 내지 3 ㎛의 사이가 될 때까지 필요한만큼 반복 (그림 5B, C). 이러한 마이크로 피펫은 약 5 ~ 15 MΩ 사이의 임피던스를 가지고 있는지 확인하십시오. </li><li> 세포 외 식염수 (135 mM의 NaCl을, 5.4 mM의 KCl을, 1.8 mM의 염화칼슘 2, 1 ㎜의 MgCl 2, NaOH로 5 mM의 HEPES, pH를 7.2) (8)을 준비하고 시카고 스카이 블루 (/ V W) 2 %를 추가합니다. 30 G 바늘 이하로 주사기를 사용하여, 용액을 피펫의 후단 채우기. 또한, 단일 셀 juxtacellular 라벨 2 %를 추가 (w / v)의 Neurobiotin 또는 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA-3000 또는 BDA-10000) 시카고 스카이 블루 대신에 생리 식염수에. </li><li> 적절한 실험 지그에 단단한 튜브 내부의 천 양말 내부의 쥐를 놓습니다 ( <strong&gt; 그림 4) .Wait 헤드 구속 지그에 동물을 배치하기 전에 수술 후 72 시간의 최소. 기도의 폐색을 방지하기 위해, 오히려 목보다 상부 흉골 주위에 조임끈을 조입니다. 호흡이 곤란한 또는 방해 할 나타나면, 조임끈을 풀거나 후방으로 이동합니다. 쥐가 경고 상태에서이 절차를 수행합니다. </li><li> 지그의 해당 부분에 쥐의 머리를 억제 플레이트를 연결합니다. 이렇게하려면 처음에 머리 구속 판을 고정하고 4-40 나사를 사용하여 고정합니다. 동물이 머리에 과도한 토크를 적용 피하기 위해 진정 될 때까지 대기해야합니다. 다음으로, 쥐에 이식 된 머리 억제 볼트에 8-32 너트를 배치합니다. 그런 다음 머리 볼트 나사 스테인리스 스틸 막대에 나사. 이 자리에 체결 될 수있는 방법 (그림 4)에서 실험 지그에로드를 붙입니다. 참고 : 헤드 구속 플레이트 분뿐만 아니라 머리 볼트와 동물을 보호장치의 굽힘 imizes 및 기록 안정성을 향상시킵니다. 첫 날에 시작 할 수 있습니다 기록 대부분의 경우 동물은 머리를 억제합니다. 동물이 과도하게 fidgets 또는 vocalizes 경우, 모든 녹음을 시작하기 전에 머리 구속 습관화 훈련의 일일를 제공합니다. 이 경우에, 15 분 동안 지그에 동물을두고 그 후 케이지를 제자리. 다음날이 단계를 반복하고 프로토콜을 계속합니다. </li><li> 기록 챔버를 열고 실리콘 젤을 제거합니다. 조직은 개두술에 다시 성장 경우 미세 집게를 사용하여 개두술을 청소합니다. </li><li> 전동 미세 조작기에 피펫을 연결하고 headstage 프리 앰프에 연결합니다. 참고 : 본 데모에서는 headstage에 작은 릴레이 회로는 증폭기 리드선과 높은 컴플라이언스 (도 6A-C)와 함께 외부의 전류원을 전환하는데 사용된다. 일부 앰프가 내장 적절한 높은 준수 소스를 가지고 있습니다(토론 및 재료 섹션 참조). </li><li> 녹화 실에서 stereotaxically 식별 표시로 피펫의 팁을 이동하는 전동 미세 조작기를 사용합니다. 이 위치의 좌표를합니다. 두개골에 피펫의 끝을 중단하지 않도록주의하십시오. </li><li> - 전방 후방 및 메디 오 - 측면 축에서 원하는 기록 위치에 피펫을 이동합니다. 그것이 의도 된 기록 위치에 약 500 μm의 지느러미가 될 때까지 경질을 통해 복부 피펫을 진행합니다. </li><li> 피펫 팁과 기준 와이어 사이에 기록 된 증폭 된 전압의 오디오 모니터에 이벤트를 급상승에 대한 들으면서 천천히 피펫을 진행합니다. 한 번 요동 치고 이벤트를 식별, 약 500 μV이 관찰 된 것보다 더 긍정적 인 것 전압 처짐까지 피펫 0 ~ 100 μm의 이동을 계속합니다. 주 : 전극 저항은 약 1.5 ~ 10 (WH)의 인자에 의해 증가 할 것이다이 문제가 발생 갖추고 있습니다. </li><li> 일단 단위가 관심의 다른 모든 행동 및 생리 학적 측정과 함께, 3.11 단계에 따라로 고립 된 기록을 시작합니다. 본 데모에서는, 자체 생성 된 vibrissa 운동은 (자료 섹션 참조) 고속 비디오 그래피와 모니터링됩니다. </li><li> 기록 위치에 라벨을, 전극은 전류원에 연결하는 리드 스위치. , 내장 수동으로 현재 앰프에 소스, 또는 (그림 6D 단계를 참조 3.8 및 토론) - 중 릴레이 회로 (C 그림 6A)를 사용하여이 작업을 수행하는 여러 가지 방법이 있습니다. 합격 -4 μA를 50 % 듀티 사이클에서 2 초 펄스 4 분간 피펫을 통해 이온 삼투 시카고 스카이 블루를 주입. </li><li> 죽이고 표준 관행에 따라 여러 라벨링 절차 후 동물을 관류. 제 필요에 따라 뇌와 Counterstain과는 기록의 해부학 적 위치가 앉아 식별전자. (14)에 따라 시토크롬 산화 효소의 반응성에 대한 조직을 Counterstain과. 대안 적으로, 형광 현미경을 이용하여 시카고 스카이 블루 침전물을 식별. 참고 : 정확하게 라벨 사이의 피펫을 언 클램프없이, 그것은 모든 라벨은 같은 날 같은 피펫으로 만든 것이 중요하다 다른 레이블 단위 구분하기 위해. 이 경우 기록 사이트는 각 사이트의 언급 조작하는 좌표와 함께 사후 조직학의 상대적 위치에 의해 구별 될 수있다 (단계 3.9 참조). 명확한 식별을 위해, 서로, 및 뇌 영역 당 최대 3-5 레이블에서 적어도 200 ㎛의 간격을 표시 라벨. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.

실험 지그의 건설 이 다양한 방법으로 구성 될 수있는 지그 실험 (도 4)를 구축하는 데 사용되는 기계 부품의 설명은 생략 프로토콜. 이 데모 표준에서 광학 기계 부품 및 지원 클램프 헤드 구속 바, 신체 구속 튜브 (자료 섹션 참조) 마운트하는 데 사용됩니다. 유사 광학 기계식 전동 부를 미세 조작기에 전극 홀더를 장착하는데 사용될 수있다. 이 지그에 머리 받침대 바 수술 중에 절제 헤드 플레이트를 이식하는데 사용되는 바 같은 피치 각도로 장착되는 것이 중요하다. 전극이 표준 정위 축을 따라 이동하는 경우 (후 전극의 x 축은 정면 구속 바 평행 이동해야하고 지상 람다 및 브레 그마 평행으로 함유하는 평면에 수직 인 Z 축 <strong&gt; 그림 4). 적절한 증폭기 및 전류 소스의 종류</str...

적극적으로 행동 작업에 종사하는 경고 동물에서 신경 세포의 활동을 모니터링 신경계의 기능과 조직을 이해하는 것이 중요합니다. 하나의 신경 세포 단위에서 전기 활동의 세포 외 녹음이 긴 시스템 신경 과학의 주식 도구 왔으며 현재 광범위하게 사용되고 여전히있다. 전극의 종류와 구성의 다양 한 특정 실험의 과학적, 기술적 요구에 따라 사용할 수 있습니다. 만성 또는 마이크로 드라이브를 주입 전극 배열은 종종 조류, 설치류 및 영장류를 포함 1-4 자유롭게 움직이는 동물에서 사용된다. 또한, 외부 미세 조작기를 통해 금속 또는 유리 미세 전극 급성 관통 자주 마취 또는 머리를 억제 동물에서 기록하는 데 사용됩니다. 유리 마이크로 피펫 전극들이 사용될 juxtacellular 또는 &quot;세포 부착&quot;될 수있는 이점이 명백하게 구성을 분리5 정렬 사후 스파이크의 합병증없이 단일 뉴런의 활동. 이들이 염료 또는 신경 해부학 트레이서 작은 예금을 주입하는, 또는 심지어는 개개의 셀을 기록 채우기 위해 사용될 수있다 이들 전극은 또한, - 식별 된 해부학 세포 또는 위치에서의 기록을 허용한다. 이 구성은 성공적으로 쥐, 마우스, 조류 6-10에 적용되었습니다. 현재 기술 기술은 juxtacellular 모니터링 및 경고에 ​​세포 외 색소 침착, 머리 억제 쥐에 초점을 맞추고있다. 이러한 염료 보증금은 세포 형태 또는 축삭 돌기 (11)에 대한 정보를 제공하지 않는 채 웁니다 juxtacellular는 달리 하나의 셀을 참고하지만 그들은 경고 동물에서 상당히 높은 수율을 가지고 비판적으로, 약 50 μm의 정확한 해부학 적 위치 파악을 가능하게합니다. 그럼에도 불구하고 해부학 라벨링을위한 대안 전략으로 제공됩니다 채워 juxtacellular 단일 셀에 대한 정보. 요컨대,프로토콜은 세 가지 주요 단계로 구성됩니다. 첫 번째 단계에서, 래트 6 일의 기간에 걸쳐 천 깔창 (도 1) 신체 구속에 순응된다. 두 번째 단계에서, 헤드 레스트 장치 (도 2) 기록 챔버 수술 래트에 여러 후속 기록 회의 (도 3) 중에 정위 평면에서 유지 될 수 있도록 주입; 이 절차는 표준 참조 (12) 좌표를 기반으로 전기 생리학 연구를 위해 뇌의 특정 하위 대뇌 피질의 영역을 대상으로 실험을 할 수 있습니다. 세 번째 단계는 명백하게 하나의 단위로 6-9을 분리 juxtacellular 신경 녹음을, (그림 5) 석영 모세관 튜브에서 전극을 구성, 행동 적, 전기 생리 실험 (그림 4)를 수행하기에 적합한 지그에 쥐를 배치 포함하고, 해부학 locati 마킹시카고 스카이 블루 염료 (도 6 및도 7)와 기록 사이트에서. 녹음 동시 행동 모니터링을 수행; 그러나, 행동의 기술적 인 세부 사항은 각 실험의 과학적 목표에 따라 달라집니다 단일 프로토콜의 범위를 벗어 포함된다. 여러 일에 반복 될 수 실험 절차의 종료 후, 동물은 안락사된다. 뇌는 시야 또는 형광 현미경을 사용하여 표준 신경 해부학 적 기술에 따라 추출 및 처리됩니다.

<table><tbody><tr><td>케타셋 (케타민 HCl)</td><td>포트 닷지</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Anased (자일라진 용액)</td><td>로이드 연구소</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>베타다인 (포비돈-요오드)</td><td>CVS 약국</td><td>269281</td><td></td></tr><tr><td>록타이트 495</td><td>그레인저 산업 공급</td><td>4KL86</td><td>20 - 40 cp 시아노아크릴레이트</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>그립 시멘트 분말</td><td>Dentsply Intl</td><td>675571</td><td>기록 챔버 바닥용</td></tr><tr><td>그립 시멘트 액체</td><td>Dentsply Intl</td><td>675572</td><td>기록 챔버 바닥</td></tr><tr><td>실리콘 젤</td><td>Dow Corning</td><td>3-4680</td><td></td></tr><tr><td>제트 의치 수리 아크릴 분말</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>머리 지지대를 두개골에 고정하기 위해</td></tr><tr><td>Ortho-Jet 빠른 경화 교정 아크릴 수지 액체</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>헤드레스트 장치를 두개골에 고정하기 위해</td></tr><tr><td>시카고 스카이</td>블루 <td>시그마</td><td>C8679</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>158127</td><td>관류 및 조직 고정용</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>시그마</td><td>P3813</td><td>관류 및 조직 고정용</td></tr><tr><td>사이토크롬 C</td><td>시그마</td><td>C2506</td><td>사이토크롬 산화효소 염색용, <강>그림 7</td></tr><tr><td>Diaminobenzidine</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td>사이토크롬 산화효소 염색용, 그림 7</td></tr><tr><td>Rat 양말</td><td>Sew Elegant (San Diego, CA)</td><td>N/A</td><td>주문제작, 그림 1, 4</td></tr><tr><td>PVC 튜브 2 &frac12; "</td><td>미국 플라스틱 (주)</td><td>34108</td><td>그림 4</td></tr><tr><td>초소형 D 핀 및 소켓</td><td>TE Connectivity</td><td>205089-1</td><td>그림 3</td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 뮤직 와이어 0.010" 직경</td><td>Precision Brand Products, Inc.</td><td>21010</td><td>그림 3</td></tr><tr><td>Stereotaxic holding frame</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>Stereotaxic ear bars</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 957</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>Stereotaxic manipulator</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 960</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>&frac12; mm 드릴 버</td><td>Henry Schein</td><td>100-3995</td><td></td></tr><tr><td>Quiet-Air 치과 드릴</td><td>Midwest Dental</td><td>393-1600</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 0-80 &frac18; &rdquo; 스크류</td><td>패스너 슈퍼마켓</td><td>247438</td><td>그림 3</td></tr><tr><td>0.2 ml 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-407-8A</td><td>그림 3</td></tr><tr><td>사용자 정의 헤드 홀딩 바</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>맞춤형 제작, 그림 2 - 4</td></tr><tr><td>사용자 정의 헤드 홀딩 플레이트</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>주문품, 숫자 2 - 4</td></tr><tr><td>직각 포스트 죔쇠</td><td>Newport</td><td>MCA-1</td><td>그림 3, 4; 실험용 지그를 위한 표준 광기계 부속 (그림 4)는 또한 Newport Corp.에서 이다.</td></tr><tr><td>8-32 &frac34; &rdquo; 스크류</td><td>패스너 Superstore</td><td>240181</td><td>머리 고정용, 그림 3</td></tr><tr><td>4-40 &frac14; &rdquo; 스크류</td><td>패스너 Superstore</td><td>239958</td><td>머리 지지대, 그림 3, 4< / 강></td></tr> <tr><td>석영 모세관 튜브</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF-100-60-10</td><td>그림 5</td></tr><tr><td>Carbon dioxide laser puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>전동 마이크로 매니퓰레이터</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>미세 전극 증폭기</td><td>분자 장치</td><td>Multiclamp 700B</td><td>대체 부품: 분자 장치 Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>미세 전극 증폭기 헤드 스테이지</td><td>분자 장치</td><td>CV-7B</td><td>대체 부품: HS-9Ax10 및 분자 장치 Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>절연 펄스 자극기</td><td>AM 시스템</td><td>모델 2100</td><td>대체 부품: HS-9Ax10 및 분자 장치 Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>오디오 모니터</td><td>Radio Shack</td><td>32-2040</td><td></td></tr><tr><td>피펫 홀더</td><td>Warner Instruments</td><td>#MEW-F10T</td><td>대체 부품: Discussion, 그림 6A</td></tr><tr><td>전극 리드선</td><td>Cooner 와이어</td><td>NEF34-1646</td><td>(옵션), 그림 6D</td></tr><tr><td>Relay for ampliifier head-stage</td><td>COTO Technology</td><td>#2342-05-000</td> <td>참조(선택 사항) 맞춤형 인쇄 회로 기판 (UCSD Physics Electronics Shop)과 함께 사용, 그림 6A-C</td></tr><tr><td>디지털 비디오 카메라</td><td>Basler</td><td>A602fm</td> <td>(옵션) 행동 모니터링의 경우 그림 7</td></tr><tr><td>Puralube vet ointment</td><td>Amazon.com, Inc</td><td>NC0138063</td><td></td></tr></tbody></table>

경고, 헤드 억제 쥐의 하위 대뇌 피질의 뇌 구조 내에서 juxtacellular 모니터링 및 현지화 단일의 뉴런

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

단일 뉴런 단위의 세포 외 활동을 모니터링하는 다양한 기술이 있습니다. 그러나 행동하는 동물의 깊은 뇌 구조에서 이러한 활동을 모니터링하는 것은 특히 구조가 입체적으로 표적화되어야 하는 경우 기술적인 과제로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 동물의 머리를 입체선 평면에 유지하고 단일 뉴런의 스파이크 활동을 명확하게 분리하는 편리한 수술 및 전기 생리학적 기술을 설명합니다. 이 프로토콜은 경보를 발동하는 설치류의 머리 억제, 마이크로피펫 전극을 사용한 병치세포 모니터링, 이온 영동 염료 주입을 결합하여 사후 조직학에서 뉴런 위치를 식별합니다. 이러한 각 기술은 그 자체로 잘 정립되어 있지만, 프로토콜은 단일 실험에서 결합된 사용의 세부 사항에 중점을 둡니다. 이러한 신경 생리학 및 신경 해부학 적 기술은 행동 모니터링과 결합됩니다. 본 예에서는 결합된 기술을 사용하여 자체 생성된 비브리사 움직임이 체성 감각 시상 내 뉴런의 활동에서 어떻게 인코딩되는지 확인합니다. 보다 일반적으로, 쥐, 생쥐 및 기타 동물의 다양한 행동 작업과 함께 신경 활동을 모니터링하기 위해 이 프로토콜을 조정하는 것은 간단합니다. 결정적으로, 이러한 방법의 조합을 통해 실험자는 해부학적으로 식별된 신경 생리학적 신호를 행동과 직접 관련시킬 수 있습니다.

<html> 쥐가 적극적으로 쫓기대로 vibrissa 운동의 위상 자체 생성이 15, 16 쫓기 동안 인코딩 시상 복부 후방 내측 (VPM)의 신경 단위. 그림 7a는 VPM 시상 단위의 샘플 스파이크 활동을 보여줍니다. 그림 7b는 스파이크의 히스토그램을 보여줍니다 시간 vibrissa 운동 (17)의 순시 위상 정렬. 쫓기의 후퇴 단계에서 더 스파이크가 있습니다. 도 7c에 도시 된 바와 같이, 기록 후, 유닛의 위치는, 시카고 스카이 블루 염료의 이온 토 포레 시스를 통하여 표지 하였다. 조직 VPM 시상의 신경 해부학 적 경계를 나타 내기 위해 시토크롬 산화 효소 (cytochrome oxidase) 활동에 대한 대조된다. 이 프로토콜의 유사 버전은 최근 특정 뇌간 핵 (18)에 쫓기 관련 멀티 유닛의 연결 활동 (10 ~ 20 μm의 직경 피펫 팁)를 모니터링하기 위해 적...

이 프로토콜은 경보를 발하는 쥐의 피질하 뇌 구조에서 신경 세포 활동을 모니터링하기 위한 머리 억제 메커니즘의 설계 및 외과적 이식을 설명합니다. 이 책은 병치세포 구성에서 단일 뉴런을 분리하고 해부학적 위치를 효율적으로 식별하는 절차를 설명합니다.

경고, 헤드 억제 쥐의 하위 대뇌 피질의 뇌 구조 내에서 Juxtacellular 모니터링 및 현지화 단일의 뉴런

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

본 절차의 전반적인 목표는 깨어 있는 상태에서 머리가 고정된 쥐의 피질하 뇌 구조 내 단일 뉴런의 활성을 모니터링하고 국소화하는 것입니다. 이는 먼저 천 양말로 몸을 고정하는 방식에 쥐를 적응시켜 수행됩니다. 두 번째 단계는 머리 고정 장치와 기록 챔버를 외과적으로 이식하여, 이후 여러 차례의 기록 세션 동안 쥐가 정위 고정 평면을 유지할 수 있도록 하는 것입니다.다음으로, 행동 및 전기생리학적 실험을 수행하기 위해 쥐를 적절한 고정 장치(jig)에 배치하고 세포 주변 뉴런 기록(juxtacellular neuronal recording)을 수행합니다. 이 과정을 통해 단일 유닛을 명확하게 분리할 수 있습니다. 마지막 단계는 기록 부위의 해부학적 위치를 Chicago Sky blue 염료로 표시하여 사후 조직학적 분석에서 시각화할 수 있도록 하는 것입니다.금속 미세 전극을 이용한 세포 외 기록과 같이 흔히 사용되는 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 단일 단위의 스파이크를 명확하게 분리할 수 있으며, 사후 조직학적 검사를 통해 기록 부위를 확인할 수 있다는 점입니다. 이 절차를 시작하려면 케타민-자일라진을 주입하여 동물을 마취하십시오. 발가락 회피 반사를 확인하여 마취 수준을 결정하고, 마취제를 추가 투여하여 마취 상태를 유지하십시오.필요한 경우 머리를 삭모하고 포비돈 아이오딘으로 수술 부위를 소독합니다. 그 후, 쥐를 스테레오택식 고정틀(stereotaxic holding frame)에 배치하고 이어 바(ear bars)로 머리를 고정합니다. 메스로 양 눈 사이의 중심점에서 귀 뒤쪽까지 두개골 정중선을 따라 절개합니다.그 다음 절개 부위 양측의 피부를 2~3mm 너비의 띠 모양으로 제거합니다. 골막을 긁어내어 외측 능선까지 확장된 두개골을 노출시킵니다. 이어서 노출된 두개골 표면에 순간접착제를 얇게 도포하여 덮어줍니다.다음으로 bgma 봉합선이 외측 능선(lateral ridge)과 만나는 지점의 바로 후방에, 두개골을 향해 30~45도 각도로 작은 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 0.80 평저 머신 나사(flat bottom machine screw)를 해당 구멍에 30~45도 각도로 박으며, 이때 하부의 뇌 조직이 손상되지 않도록 너무 깊게 박히지 않게 주의하십시오.이 구성으로 6개의 나사를 추가하여 동일한 절차를 반복합니다. 그 후, 모든 나사의 바닥 부분에 순간접착제를 도포합니다. 이제 정위 고정

juxtacellular-monitoring-localization-single-neurons-within-sub

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

자유롭게 동물을 이동 고유 뇌 세포 지역에서 신경 전달 물질 수준의 모니터링 신경 전달 물질 방출과 행동 사이의 링크에 통찰력을 제공합니다. 그리고 기초 neurotransmission가 약리 또는 생리적 조작에 의해 변경하는 방법에 대한 정보, 전기 탐지와 결합하여 생체내 microdialysis 우수한 해부 학적 및 화학적 해상도를 제공합니다.

설치류에 살아서 Stereotaxic 외과

anesthetized 쥐의 실리콘 프로브를 사용하는의 연결 활동의 세포외 녹음이 설명됩니다. 이 기법은 동시에 100 개 이상의 뉴런에서 여러 뇌 영역에 걸쳐 정보를 얻을 수 있습니다. 그것은 여러 지역의 회로에의 연결을 ensembles 역학에 대한 단세포 해상도 정보를 제공합니다.

Anesthetized 쥐의 실리콘 프로브와 함께 대규모의 연결 Ensembles 녹음하기

이 비디오는 여러 부위의 뇌 활동에 대한 전기 생리학적 기록을 위해 마취된 쥐를 준비하는 자세한 절차를 보여줍니다. 두개골에 접근하기 위해 두피를 절개하고, 정확한 위치에 구멍을 뚫어 전극을 설치하고 고정합니다. 그런 다음 텅스텐 마이크로 와이어 전극을 대상 위치에 삽입하여 데이터를 기록합니다.

쥐의 여러 부위에서 뇌 활동에 대한 생체 내 전기생리학적 기록

출처: Maruoka, H., et. al. 깨어 있는 쥐의 미세아교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징.J. Vis. Exp. (2022) 이 비디오는 시각적 자극 중 깨어 있는 쥐의 신경 활동과 미세아교세포 역학을 이미징하기 위한 이광자 현미경 절차를 보여주며 칼슘 과도 및 세포 상호 작용을 강조합니다.

깨어 있는 쥐에서 미세아교세포의 역학과 신경 활동의 동시 이미징(Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse)

출처: Moore, J. D., et al. Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-Arrest Rats(경보, 머리 구속 쥐의 피질하 뇌 구조 내 단일 뉴런의 모니터링 및 국소화). J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 구속되고 깨어 있는 쥐의 병치세포 기록 및 염색 방법을 보여줍니다. 이 절차에는 뉴런의 신호를 기록하고 염료를 주입하여 기록 부위의 위치를 정확하게 파악하는 작업이 포함됩니다. 이 기술을 사용하면 신경 활동을 뇌의 해부학적 구조에 정확하게 매핑할 수 있습니다.

깨어 있는 쥐의 신경 활동을 정확하게 매핑하기 위한 Juxtacellular Recording and Staining 

출처: Lai, J., et al. 설치류 뇌에서 억제제의 동시 전기생리학적 기록 및 미세 주사. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 쥐 상골에서 동시 신경 기록 및 억제를 위한 미세 주입 기반 기술을 보여줍니다. 이 절차에는 정위 표적화, 두개골 드릴링, 신경 활동을 기록하면서 억제성 신경 전달 물질을 전달하는 주사대 삽입이 포함됩니다. 빛 자극은 활동 전위를 유발하는 반면 약물 미세 주사는 신경 흥분성을 억제합니다. 신경 전달 물질 수치가 감소함에 따라 신경 활동이 기준선으로 돌아가 억제와 회복에 대한 연구가 가능해집니다.

쥐에서 신경 활동의 억제 및 전기생리학을 사용한 검출

신경 네트워크의 구조를 이해하기 위해, 개별 뉴런의 기능적, 형태 적 특성이 필요하다. 여기, 우리는 juxtasomal biocytin의 세포 구성에 전기 생리학 녹음을 할 수 있습니다 라벨, 아직 세포 내에서 돌기 및 축삭 아키텍처의 사후 재건 신경 레이블을 할 수있는 능력을 유지을 보여줍니다.

Juxtasomal Biocytin 레이블은 개별 두피 뉴런의 구조 - 기능 관계를 연구하는

이 방법은 탐색 및 동물의 머리의 확고한 고정을 필요로 미세한 영상 또는 단일 세포 전기 생리학 녹음하는 동안 탐험하는 마우스 유형, 친숙한 환경을 만듭니다.

평면 바닥의 공기 해제 플랫폼 : 새로운 방법이 깨어에 현미경 또는 전기 생리학과 행동을 결합하여 자유롭게 설치류 이동

이 연구에서 방법론은 우레탄 마취하에 hyperdirect 통로에서 다중 부위 생체 내 생리 학적 기록을 수행하는 방법에 대해 제시됩니다.

심각한<em&gt; In Vivo</em&gt; 마취 된 래트에서의 Hyperdirect 경로로부터의 국소 장 전위 및 다중 단위 활성의 전기 생리 학적 기록

헤드 플레이트 및 단일 광자 및 이광자 현미경과 호환되는 광학 설계와 통합될 경우, 마이크로프리즘 렌즈는 머리가 고정된 상태에서의 잘 제어된 실험이나 자유롭게 움직이는 동물의 자연스러운 행동 작업을 포함하여 다양한 조건에서 수직 컬럼의 신경 반응을 측정하는 데 상당한 이점을 제공합니다.

자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징

신피질(neocortex)의 일차 감각 영역은 발달 과정에서 독특한 자발적 활동을 보입니다. 이 기사에서는 생체 내 신생아 마우스의 영역별 동기 활동을 분석하기 위해 개별 뉴런 활동과 주요 감각 영역을 시각화하는 방법을 설명합니다.

단일 뉴런 해상도에서 신생아 마우스 감각 피질의 자발적 활동에 대한 In vivo 시각화

학습하세요 경고 상태의 쥐에서 하위 대뇌 피질 단일 뉴런을 Juxtacellular 기법으로 기록하고 해부학적 위치를 확인하는 방법을. 이 기술은 명확한 단일 단위 분리와 정확한 위치 식별을 가능하게 합니다.

경고, 헤드 억제 쥐의 하위 대뇌 피질의 뇌 구조 내에서 Juxtacellular 모니터링 및 현지화 단일의 뉴런

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