Name: 세포와 조직 Mechanobiology의 응용 프로그램에 대한 새로운 스트레칭 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 16 min 46 s
Description: 배우세요 단세포가 복잡한 이방성 이축 기계적 변형에 반응하는 과정을 조사하는 새로운 스트레칭 플랫폼을 활용한 방법입니다. C2C12 세포와 마우스 흉부 대동맥 조직을 사용하여 생물학적 조직의 기계적 특성을 정량화합니다.

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DT는 르 퐁 드 공들인 뒤 퀘벡 - 자연 등 기술 (FQRNT)와 MITACS 높이기 전략 원정대에서 박사 재학에 의해 지원되었다. CMC는 르 퐁 드 공들인 엉 상테 뒤 퀘벡 (FRSQ)와 어니스트 오타와 심장 연구소의 대학에서 마가렛 포드 심장 부여 연구 활동에서 박사 재학에 의해 지원되었다. EOB는 운영 보조금 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR)에서 MOP80204과 마음에서 T6335과 온타리오의 뇌졸중 재단에 의해 지원되었다. CIHR과 메드 트로닉은 집단적으로 피어 리뷰 연구 의자 (URC # 57093)와 EOB를 제공합니다. AEP는 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) 디스커버리 그랜트 NSERC 발견 가속기 보충에 의해 투자하고 감사 한 캐나다 연구 의자 (CRC) 프로그램 및 온타리오 주에서 조기 연구원 상의 지원을 인정한다.

단일 세포의 1. 기계 변형 <ol><li> 임베디드 형광 구슬을 가진 PDMS 기판의 제조 이전에 기판의 제조에, 물 해결책에있는 형광 마이크로 스피어의 소수성으로 인해 PDMS에 구슬 혼합을 향상시키기 위해 이소프로판올에 재현 탁하고 있습니다. <ol><li> 10 분 동안 16,200 XG에 1.5 ML의 microcentrifuge 관과 원심 분리기에 형광 마이크로 피펫 500 μL. </li><li> 뜨는을 취소하고 추가 이소프로판올 500 μL은 소용돌이로 교반의 5 분으로 하였다. 어떤 큰 입자가 침강 집계 있도록하기 위해 어둠 속에서 밤새 옆 유리 병을 넣어. </li><li> 다음 날 아침, 조심스럽게 깨끗한 마이크로 원심 유리 병에 뜨는을 제거합니다. 이 비드 용액을 5 개 이상의 기판을 제조하는데 사용될 수있다. 주 : 구슬 솔루션은 다음 3 일 동안 침전 할 것입니다. 펠렛을 재현 탁 않도록주의하십시오. </li><li> 제공된 경화제 0.5 g을 붓고과학적인 균형을 사용하여 1.5 ML의 마이크로 원심 유리 병에 PDMS 키트. 연속적인 단계로, 각 추가 사이에 1 분 동안 소용돌이로 교반, (6 개 15 μL의 추가에) 비즈 90 μL의 총을 추가합니다. 옆으로 설정합니다. </li><li> PDMS의 10g을 달아 형광 비드로 보충 경화제 0.5 g과 적어도 12 분 동안 혼합한다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 표준 포토 리소그래피 기술을 이용하여 SU-8 2050 십자가 모양의 몰드를 제작. 사용되는 금형은 320 ㎛의 높이 13.4 cm 2의 면적 (그림 3). 형은 428 μL 또는 PDMS의 440 밀리그램을 포함 할 수 있습니다. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 십자가 모양의 금형에 구슬과 PDMS의 400 밀리그램을 넣어 80 ℃에서 2 시간 동안 치료 경화 후, 주형 (도 5a)로부터 기판을 벗긴다. 기판은 그것의 기계적 특성에 상당한 변화를 나타내지 않고, 실온에서 2 주간 배양 접시에서 유지 될 수있다. </리&gt; <li> 직경 약 4mm의 최종 크기와 페트리 접시에 (1:20 비율로 PDMS 경화제)와 80 ° C (그림 5B)에서 2 시간 동안 거꾸로 그들을 치료 PDMS의 방울을 붓는다. 이러한 고정 기능은 주 페트리 접시에 보관하실 수 있습니다. NOTE : 경화 공정 중에 평탄화로부터 방울을 방지하기 위해 거꾸로 접시를 유지한다. </li><li> 에어 플라즈마 치료 (30 W에서 30 초) 기판과 8 고정 기능을 제공합니다. 기판 (그림 5C)에 존재하는 사각형 모양의 들여 쓰기의 4 mm의 거리에서 기판의 양쪽에있는 기능을 결합한다. </li></ol></li><li> 클램프에 막 설치 <ol><li> 클램프의 홈이있는 부분의 주위에 원통형 기판의 각 끝을 감싸고 위로부터 2 개의 고정 나사 (그림 2B 및 그림 5D-E)와 함께 제자리에 고정. </li><li> 클램프 홀더 4 클램프 나사와 일회용 T를 사용하여 PDMS (비율 1:20) 부어기판 클램프 그루브 원통형 부분 사이에서 인터페이스를 ransfer 피펫. 1.5 mm 육각 키를 사용하여 홈이 원통 부분의 주위에 경화 PDMS를 확산. </li><li> 완전히 모세관 작용에 의해 채워지고 2 시간 (그림 5 층) 80 ° C에서 어셈블리를 치료할 때까지 홈에 PDMS (1:20) 붓는다. </li></ol></li><li> 막에서 셀 시드 <ol><li> 에어 플라즈마 치료 (30 W에서 30 초) 콜라겐 코팅이 가능하도록 기판을 소독 및 기능화하는 전체 집합. </li><li> 세포를 실온에서 1 시간 동안 쥐 꼬리 콜라겐을 16 ㎍ / ㎖로 보충 된 0.02 M 아세트산 1 ㎖ 시드 될 기판의 영역을 기능화. 원하는 최종 콜라겐 농도가 5 ㎍ / cm 2입니다. </li><li> 인산염 완충액으로 기판의 3 배를 세척하고 실온에서 건조 적어도 10 분 동안 식히십시오. </li><li> 10 % 소 태아 오는 보충 문화 매체의 40 μl를 추가합니다m 및 1cm 2의 면적 덮도록 상기 기판의 중앙부에서 2000 세포를 포함하는 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (셀 밀도 : 20 세포 / mm 2). 세포 밀도는 실험 요구 사항에 따라 변경 될 수 있습니다. </li><li> 기판은 그 위에 세포를 포함하는 배양 배지의 드롭 위로 향하게 표준 세포 배양 인큐베이터에서 전체 어셈블리를. 참고 : 어셈블리 기판이 세포가 단단하게 부착 할 수 있도록 적어도 3 시간 동안 향하도록 유지해야합니다. 증발을 방지하기 위해, 따뜻한 문화 매체의 30 μL은 기판의 드롭 3 시간 동안 매 45 분에 추가됩니다. </li><li> 3 시간 후, 기판을 담그고 세포가 증식 할 수 있도록 밤새 품어 신선한 배지로 가득 페트리 접시에 전체 어셈블리를 플립. </li><li> 다음 날, HEPES 버퍼 소금 솔루션 (HBSS를 준비, 헤 페스, 염화나트륨 120 밀리미터,의 KCl 5.3 밀리미터, 망초 0.8 밀리미터, 염화칼슘 1.8 ㎜, 드의 11.1 mm의 20 mM의xtrose). 7.4으로 산도를 조정합니다. 참고 : HBSS 용액을 매일 준비하고 실험하는 동안 37 ° C로 유지되어야한다. 이 생리 용액 정상 조직 / 혈액 환경을 흉내 현미경 스테이지에서 세포를 유지하기 위해 사용된다. </li><li> 반전 위상차 또는 형광 현미경 마운트 BAXS 플랫폼과 모터의 클램프 기판 조립품의 세트 업을 탑재합니다. HEPES 버퍼 (그림 2D)와 페트리 접시 히터 내부의 페트리 접시를 채우십시오. </li></ol></li></ol> 작은 구경의 선박 2. 강성 측정 <ol><li> 준비하기 <ol><li> 크렙스 생리 솔루션 : 118.1 mM의 NaCl을, 11.1 mM의 D-글루코스, 25 mM의 탄산 수소 나트륨, 4.7 밀리미터의 KCl, 1.2 mM의 망초, 1.2 ㎜ KH 2 PO 4, 2.5 mM의 염화칼슘 용액을 준비합니다. 7.4로 pH를 조정하고, 30 분간 carbogen 의료 가스 (95 % O2 / 5 % CO 2)와 용액에 산소. 참고 : 크렙스 soluti입니다에 매일 준비하고 실험하는 동안 37 ° C로 유지되어야한다. 이 생리적 솔루션은 정상 조직 / 혈액 환경을 흉내 살아있는 조직을 유지하는 데 사용됩니다. </li><li> 외과 용 가위, 굽은 핀셋, 마이크로 가위, 외과 해부 현미경, 50 ㎖ 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브, 10 ㎖의 혈청 피펫 : 절개 대동맥 혈관의 기계적 평가를위한 장비를 수집합니다. 수술 및 실험 절차는 무균 조건을 필요로하지 않습니다. 미리로드 셀과 함께 BAXS 플랫폼의 클​​램프를 장착합니다. </li></ol></li><li> 조직 분리 및 해부 실험 동물을 포함한 모든 실험 절차는 국가의 사용자의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드를 준수 기관, &#39;사용자의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아야합니다. <ol><li> 99 % CO 2의 흡입으로 마우스 안락사를 수행합니다 (7 PSI)플렉시 유리 챔버 (그림 6A)에. </li><li> 오픈 마우스의 복부와 마우스를 피 흉부 대동맥을 잘라. </li><li> 다이어프램, 흉곽과 폐 엽 (叶) (그림 6B)를 제거합니다. 참고 : 조직 손상의 위험을 최소화 대동맥에 부착 된 마음을 유지하고 직접 용기에 닿지 않도록하지만, 마음을 사용하여 조작 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 용기와 척추 사이에 절단하여 심장, 대동맥 근부 및 흉부 대동맥을 제거합니다. 참고 : 조직 손상 (그림 6C)의 내부 구조를 유지하기 위해 절단하는 동안 용기의 모든 신도를 유도하지 마십시오. </li><li> 즉시 담그고 크렙스 용액에 심장과 대동맥을 유지합니다. </li><li> 잘라 내기 및주의 깊게 혈전을 제거하는 크렙스 용액에 대동맥을 씻는다. 마이크로 가위, 핀셋, 외과 해부 현미경 (그림 6D-E)를 사용하여 결합 조직을 제거합니다. 참고 : 모든 선박의 길이를 유지하고 AOR을 사용선박의 방향을 결정하는 TIC 루트. </li></ol></li><li> 선박 치수 측정 및 설치 용기의 강성을 확인하려면 언로드 용기 치수가 필요하고 보정 현미경으로 확인할 수 있습니다. <ol><li> 길이가 약 2 ㎜의 대동맥 고리를 잘라 정밀 (그림 6 층-G)를 설정 보정 현미경을 사용하여 길이를 측정합니다. 크렙스 용액에 옆이 세그먼트를 넣습니다. </li><li> 2mm 세그먼트 (그림 6 층)의 각각의 사이에 가능한 한 작은 다른 대동맥 고리를 잘라. 루멘이 위로 향 현미경 유리 슬라이드에이 작은 세그먼트를 넣고 교정 현미경 설정 (그림 6H)를 사용하여 벽 두께를 측정합니다. </li><li> 크렙스 용액으로 BAXS 플랫폼에서 페트리 접시를 입력하고 (그림 4C의 확대 그림) 당기 핀에 2mm의 대동맥 링 세그먼트를 삽입합니다. </li></ol></li></ol> GE = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig5highres.jpg" width="500" /> 치료 후 그림 5. PDMS 기판의 제조 및 설치.는), 기판은 조심스럽게 SU-8 2050 형을 벗겨. B) PDMS 만든 기능을 앵커 페트리 접시에 따로 넣고에 기판을 보호하는 데 도움이됩니다 4 클램프에 장착 된 기판의 기판이어서 클램프 홀더에 장착되는 4 클램프 (인셋 참조) 상에 장착된다. D)를 장착하기위한 준비 기능 정박와 페이. C) 기판. E) 상세한 그림. F 기판 아래 홈에 PDMS를 붓는) 절차. 화살표는 천천히 모세관 현상에 의해 홈을 채우는 PDMS를 보여줍니다. 454fig6highres.jpg &quot;폭 =&quot;500 &quot;/&gt; 그림 6. 준비 및 흉부 대동맥의 분리.) 길이 복부 절개를 통해 수술기구와 안락사 마우스. B)를 준비, 흉곽과 폐의 LOB가 제거됩니다. C) 대동맥은 신중하게 조작 할 마음을 사용하여 제거 조직. D) 심장과 대동맥은 크렙스 생리 솔루션에 배치됩니다. 대동맥은 모든 결합 조직을 제거하여 청소한다. 두께 측정에 사용되는 작은 세그먼트와 함께 강성 평가에 사용되는 심장과 대동맥. F) 대동맥 세그먼트. GH)의 정확한 길이 (G) 및 두께를 나타내는 E) 상세한 그림 (H)에게 각 용기의 세그먼트들은 역 현미경 및 분석 프로그램을 이용하여 평가된다.

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 제시된 BAXS 플랫폼은 단일 세포의 조사에서 전체 조직에, mechanobiology의 연구에서 많은 실험을 용이하게한다. 또한, 플랫폼은 다수의 기계적인 자극 실험 및 다축 인장 시험을 허용하고 매우 유연한 구성이다. 이 플랫폼은 또한 생리 학적 조건에서 세포와 조직의 유지를 가능하게하고 스트레칭 실험시 현미경을 동시에 할 수 있습니다. 설치 클램프의 적절한 세트를 사용할 때 이전 섹션에서 설명 된 두 개의 실험 BAXS 플랫폼의 다양성을 설명한다. 모듈 제작 샘플 장착 시스템, 광 액세스 및 추가 센서 (예를 들어로드 셀)를 추가 할 가능성이 수행 될 실험 밖의 유형의 다양한 가능성을 열어. 위에서 밝힌 프로토콜을 수행해야합니다 많은 중요한 단계를 포함하는dequately 최상의 결과를 생산하기 위해. 세포 스트레칭 프로토콜 내에서 클램프에 PDMS 기판을 장착하여 섬세하고 정확한 조작을 요구한다. PDMS 기판 ...

기계적인 미세 환경은 조직의 발달 및 항상성에 또한 질병 1-6에 지대한 영향을 미칠 예컨대 증식, 이동 및 분화와 같은 다양한 세포 기능에 중요한 역할을한다. 수년에 걸쳐, 실험의 여러 도구는 기계적으로 세포 나 조직을 자극하고 기본 mechanobiology에 대한 우리의 이해를 증가시키고 질병 6-17의 발병과 진행을 공부하는 것을 목표로 생물 조직의 기계적 특성을 측정하는 데 사용되었다. 그러나, 하나는 종종 특정 연구의 목적을 달성하기 위하여 여러 가지 실험 장치에 의존한다. 이 문서에서는 기계적 특성 및 기계적 힘이 전체 조직 저울의 길이에 하위 세포 생물학에서 재생하는 역할을 조사 연구를 허용하는 단일, 멀티 기능, 이축 연신 (BAXS) 플랫폼을 제공합니다. BAXS 플랫폼은 quantificatio 수 있습니다뿐만 아니라,또한 기계적 격리 조직의 특성 만의 N은 생체 내에서 발생하는 연신 그들의 응답을 이해하기 위해 살아있는 세포로, 간단한 복소 및 동적 스트레인 필드를 적용하는 능력을 용이하게한다. BAXS 플랫폼은 세포와 조직에 기계적인 테스트와 동요 동안 라이브 세포 현미경을 수행 할 수있는 능력을 유지합니다. BAXS 플랫폼은 세포 수준에서, 기판 변형의 효과를 조사하여 생체 조직 (도 1a)에서 인장 시험을 수행하는 데 사용할 수있는 맞춤식 장치이다. 알루미늄 히터는 표준 10 cm 페트리 접시를 수용 및 온도 제어기와 캡톤 히터 (도 1b)를 사용하여 37 ° C에서 어떠한 생리적 용액을 유지하기 위해 제조 하였다. 이 BAXS 플랫폼은 반전 위상 콘트라스트 및 / 또는 형광 현미경에 통합 및 동시 영상 (그림 1C)을 허용 할 수 있습니다.요컨데, BAXS 플랫폼은 이동 부분이이 수직축 (도 1D)을 따라 배향 소형 선형 모션 볼 베어링 슬라이드 상에 장착되어있는 4 개의 선형 보이스 코일 모터로 구성된다. 선형 위치 결정 스테이지 (도 1E)를 사용한다 클램핑 시스템의 수직 운동을 허용하기 위해 4 개의 모터의 각각에 장착된다. 각 모터의 위치는 500 nm의 해상도 (그림 1 층)와 광 인코더에 의해 모니터링된다. 네 개의 모터가 독립적으로 동작 명령 (그림 1G)를 실행하기 위해 옵티컬 엔코더 피드백을 이용한 모션 컨트롤러로 제어된다. LabVIEW는 인터페이스는 세포 또는 조직 샘플의, 완전히, 사용자 정의 정적 및 동적 변형을 생성하기 위해 변위의 크기, 속도 및 각 모터의 가속을 완전히 제어 할 수 있습니다. 세포에서 변형을 유도하는 데 사용되는 기술은 단순히 allowin함으로써 달성된다g 세포 단단히 플렉시블 투명 기판에 부착하고 BAXS 플랫폼의 네 개의 모터를 사용하여이 기판을 연신한다. BAXS 플랫폼은 음성 코일 모터에 기판을 연결하는 클램프의 맞춤 설계 세트로 장착 할 수 있습니다. 이 목적을 위해, 우리는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)로 이루어지는 유연하며 투명 기판이, (도 2A-C 및도 3)에 접속 될 수있는 클램프 세트를 설계했다. 클램프 생리적 용액에 노출 될 수있는 바와 같이, 모든 부품은 멸균 수 있도록 스테인레스 스틸로 기계 가공 하였다. 이러한 클램프 정중 (도 2d)를 연신하는 동안 기판 상에 스트레스를 최소화하면서 이미지 품질을 향상시키기 위해 현미경 대물 최대한 가까운 기판을 가지고 고안되었다. 동일한 BAXS 플랫폼은 ADAP와 클램프 적절한 세트를 사용하여, 작은 조직 샘플의 강성을 정량화하는데 사용될 수있다테드 조직 샘플 및 힘을 감시하는 로드셀 지원한다. 여러 가지 방법이 BAXS 플랫폼 모터에 조직을 마운트 가지고 갈 수있다; 이 경우에는 스텐레스 곤충 minutiens 핀은 인장 시험 (도 4A-B)를 수행하기 위해 혈관 조직의 개구부를 통해 연결 할 수있다. 대안 적으로, 천연 열지 않고 두꺼운 조직에 대한 조직 가장자리 역시 보이스 코일 모터에 부착 또는 생물학적 접착제와 작은 유리 슬라이드에 접착 및 클램프 모터에 연결된 클램프 위치에 유지 될 수있다. 인장을 수행하기 위해 소형 로드셀이 요구되는 테스트 용이 BAXS 플랫폼 모터에 혼입 및 연신 사이클 (도 4C) 동안 조직에 작용하는 힘을 측정 할 수있다. BAXS 플랫폼은 네 개의 모터로 구성 될 때, 제 2로드 셀을 도입 한 두 개의 직교하는 방향을 따라 인장 시험을 수행 할 수있다. 이 기능은 하나의 quantif 할 수 있습니다Y 동일한 실험을하는 동안 두 개의 수직 방향에 따라 단일 조직의 기계적 강성. 중요한 사실은, 모든 구성에서, 셀 또는 또한 조직 샘플은 항상 사용자에게 액세스 온도 조절 욕에서 유지된다. 이 능력은 샘플의 시간 응답을 조사하기 위해서 샘플 연신 동안 약리 제제의 도입을 허용한다. 도립 현미경의 광축이 막히지 남아 또한, 현미경의 모든 형태는 여전히 사용자가 이용할 수있다. BAXS 플랫폼의 네 개의 모터가 독립적으로 작동 마지막으로, 그 샘플에 높은 구성 변형 필드를 적용하는 것이 가능하다. 생체 세포와 조직이 노출되는 복잡하고 반대하는이 플랫폼에보다 적절하게 모방 할 수있는 스트레칭 이방성 전통적인 축 연신 플랫폼 7,13,15,18,19합니다. 또한, 물리적 특성변형 필드의 실험 기간 동안 즉석에서 변경 될 수 있습니다. 이러한 능력은 사용자가 시간적으로 매우 복잡한 이방성의 다양한 수, 및 공간적으로 다양한 변형 필드 세포 및 조직 수준의 응답을 검사 할 수있다. 이 문서는 장점과 한계에 BAXS 플랫폼뿐만 아니라 디자인, 작동 원리, 그리고 단일 세포 및 전체 조직 실험에 대한 실험 내용을 설명합니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig1highres.jpg" width="500" /> BAXS 플랫폼의 그림 1. 개요. 네 보이스 코일 모터 플랫폼 수행 라이브 거꾸로 현미경에 장착 할 수 있습니다) 37 ° C. C에서 세포와 조직을 유지하기 위해 사용되는 배양 접시 히터. B) 상세한 그림을 보여주는 BAXS 플랫폼의 윗면) 스트레칭 실험 도중 세포 이미징.D) 보이스 코일 모터의 상세한 그림; 클램핑 시스템 모션 컨트롤러. G) 상세 사진에 모터의 실시간 위치를 제공하는 광학 인코더의. F) 상세 사진의 수직 변위를 허용하는 선형 위치 결정 스테이지의 플랫폼의 이동 부분. E) 상세한 그림 네 개의 보이스 코일 모터로 네 광학 엔코더 입력과 전원 출력을 나타낸 모션 컨트롤러. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. 세포 스트레칭 실험 시스템을 클램핑. 기판은 그것의 앵커 featur와 클램프의 원통형 부분의 주위에 싸여있다. C)를 연신위한 보이스 코일 모터에 PDMS 기판을 연결하는 데 사용되는 클램프의 상세를 도시 AB) 이미지에스 상단에있는 홈에 앉아. 그런 다음, 기판 상단 홈에 기능을 고정 / 기판을 밀어 고정 나사를 사용하여 고정한다. 클램프 자리에 기판을 들고 BAXS 플랫폼의 D) 그림. 삽입물은 부착 세포는 단지 커버 슬립과 현미경 대물 위에 앉아있는 기판의 세부를 도시한다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig3highres.jpg" width="500" /> 도 3. 막과 클램핑 시스템의 재료의 명세서. 주요부의 치수를 나타낸 도면 셀 연신 실험을 수행하기 위해 이축 플랫폼에 통합. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig4highres.jpg" width="500" /> 그림 4. 예소 구경 혈관의 강성 평가 1mm 직경 쥐 대동맥에서 변형을 유도하기 위해 사용되는 클램핑 시스템. AB) 상세한 그림 클램핑 시스템의 충분한. 스테인레스 스틸 핀은주의 깊게 선박이 두 핀에 클램프 선박 및 고정 모터와 왼쪽 클램프 사이에 부착 된 로드셀을 들고 BAXS 플랫폼. C) 그림을 슬라이드 할 수 있도록 열려있는 삼각형으로 형성되었다. 삽입 된 핀에 장착 된 용기에 대한 자세한 높은 전망을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>이 프로토콜에 사용된 베이스와 가교제의 비율은 20:1입니다. 먼지가 당신을 오염시키는 것을 막기 위해 층류 후드를 섞으십시오.</td></tr><tr><td>FluoSpheres 형광 마이크로스피어</td><td>Invitrogen</td><td>F8810</td><td>빛을 멀리하십시오.</td></tr><tr><td>리니어 보이스 코일</td><td>Moticont</td><td>LVCM-051-051-01</td><td>motro는 두 조각(자석과 코일)으로 제공됩니다. 작동하려면 볼 베어링 시스템에 장착해야 합니다.</td></tr><tr><td>볼 베어링 슬라이드</td><td>Edmund Optics</td><td>NT37-360</td><td>미니어처 및 소형 선형 모션 볼 베어링 슬라이드</td></tr><tr><td>선형 포지셔닝 스테이지</td><td>Edmund Optics</td><td>38-960</td><td>센터 드라이브 1.25" 스퀘어 선형 변환 스테이지</td></tr><tr><td>광학 인코더</td><td>GSI microE 시스템</td><td>Mercury II 1600S - 0.5um 해상도</td><td>반사 증분 인코더.</td></tr><tr><td>모션 컨트롤러</td><td>Galil</td><td>DMC-2143 (DIN) -DC48 AMP-20440</td><td>4 축 증폭기가있는 4 축 컨트롤러</td></tr><tr><td>로드셀</td><td>Honeywell</td><td>31</td><td>0-150g 범위의 저소형 로드셀</td></tr><tr><td>곤충 minutiens 핀 (0.20 mm)</td> <td>핀 서비스 Austerlitz 곤충 핀</td><td></td><td>열린 삼각형 모양으로 구부러진 스테인레스 스틸 핀</td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Micro Chem</td><td>SU-8 2050</td><td>영구 에폭시 네거티브 포토레지스트. 열과 빛으로부터 멀리하십시오</td></tr><tr><td>공기 플라즈마 치료 시스템</td><td>Glowresearch</td><td></td><td>Autoglow 산소 플라즈마 시스템</td></tr><tr><td>쥐꼬리 콜라겐</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>콜라겐 I, 쥐 꼬리 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>DNA 특이적 형광 염료. 냉장고에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>캡톤(폴리이미드 필름) 절연 플렉시블 히터</td><td>omega.ca</td><td>KHLV-0504/(10)-P</td><td>28V 플렉시블 히터, 24V</td></tr><tr><td>1/16 DIN 자동 조정 온도 및 프로세스 컨트롤러</td><td>omega.ca</td><td>CN63200-R1-LV</td><td>온도 컨트롤러와 함께 제공 가능, 24V 공급.</td></tr><tr><td>DMEM 배양 배지</td><td>Hyclone</td><td>SH3024301</td><td>Dulbecco' s 수정 된 30 독수리 매체. 4 &#176으로 유지; C</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>하이클론</td><td>SV30010</td><td>재고를 냉동 상태로 유지하십시오. 4 &#176;C에서 솔루션을 계속 작동시킵니다.</td></tr><tr><td>소 태아 세럼 (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3039603C</td><td>냉동 보관.</td></tr><tr><td>트립신 0.05%</td><td>하이클론</td><td>SH30236.02</td><td>냉동 보관. subcultivation</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Wisent Inc</td><td>330-050-EL</td><td>HEPES 완충 염 용액을</td></tr> 위한 세포 부착 단백질의 소화;<tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>HEPES 완충 염 용액 / Krebs 생리학적 용액</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>HEPES 완충 염 용액 / 크렙스 생리학적 용액</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td>HEPES 완충 염 용액 / 크렙스 생리학적 용액</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-500</td><td>HEPES 완충 염 용액 / 크렙스 생리학적 용액</td></tr><tr><td>덱스트로</td><td>오스 Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td>HEPES 완충 염 용액 / 크렙스 생리학적 용액</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-1</td><td>크렙스 생리학적 용액</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>Krebs 생리학적 용액 Carbogen</td></tr><tr><td>95% O2/5% CO2</td><td>Lindle</td><td>DIN:02154749</td><td>Krebs 생리학적 용액 산소화</td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td>미세소관 탈중합제</td></tr><tr><td>Cytochalasin-D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td>Actin 필라멘트 탈중합제</td></tr><tr><td>Anti-&alpha;- SMA-FITC</td><td>Sigma</td><td>F3777</td><td>평활근 세포 함량을 염색하고 정량화하는 데 사용</td></tr><tr><td>Picrosirius red stain</td><td>Fluka</td><td>43665</td><td>콜라겐 함량을 염색하고 정량화하는 데 사용됩니다</td></tr></tbody></table>.

세포와 조직 mechanobiology의 응용 프로그램에 대한 새로운 스트레칭 플랫폼

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

세포와 조직에 기계적인 힘의 응용 프로그램이나 그 수있는 도구는 생물학적 조직의 기계적 특성이 기본 mechanobiology의 이해에 크게 기여 정량화 할 수 있습니다. 이 기술은 광범위하게 각종 질병의 발병과 진행이 크게 기계적 신호에 의해 영향을하는 방법을 설명하는 데 사용되었다. 이 문서는 기계적으로 하나의 세포를 자극하거나 조직의 기계적 강도를 정량화 할 수 있습니다 다기능 축 연신 (BAXS) 플랫폼을 제공합니다. BAXS 플랫폼은 독립적으로 제어 할 수있는 네 개의 보이스 코일 모터로 구성되어 있습니다. 단일 세포는 하나, 복잡한 동적 및 공간적 변화 스트레인 필드에 세포를 노출 할 수 있도록 모터에 부착 될 수있는 유연한 기판상에서 배양 될 수있다. 반대로, 로드셀을 통합하여, 하나는 이들이 변형 사이클에 노출 될 때 기본 조직의 기계적 특성을 정량화 할 수있다.두 경우 모두, 클램프의 적절한 세트를 설계해야하고 단단히 유연성 기판 또는 그 조직을 유지하기 위하여 BAXS 플랫폼 모터에 장착. BAXS 플랫폼은 연신 실험 동안 샘플의 구조적 또는 생화학 적 반응을 조사하기 위해 동시 투과광 및 / 또는 형광 이미징을 수행하는 도립 현미경에 장착 될 수있다. 이 문서에서는 BAXS 플랫폼의 디자인과 사용의 실험 세부 사항을 제공하고 단일 셀 및 전체 조직 연구에 대한 결과를 제시한다. BAXS 플랫폼은 기판 변형시키고 절연 쥐 대동맥의 강성을 측정하는 것에 응답하여 하나의 마우스 근원 세포 세포에서 핵의 변형을 측정 하였다. BAXS 플랫폼은 하위 세포, 세포 및 전체 조직 수준에서 신규 mechanobiological 통찰력을 제공하기 위해 다양한 광학 microscopies과 결합 될 수있는 다양한 도구이다.

스트레칭 셀 BAXS 플랫폼은 하나의 마우스 근원 세포 세포에서 핵의 기계적 응답 (C2C12) 25 %의 기판의 변형에 노출을 조사하기 위해 사용 하였다. 근원 세포 세포는 근육 조직에서 발견하고 지속적으로 생체 내에서 기계적 스트레칭 및 압축에 노출되어 있습니다. 세포핵의 형상이나 기계적 성질은 유전자 발현 및 전사 활성 (20, 21)의 조절에 또한 발달 결함과 같은 허친슨 - 길 포드의 조로증 증후군 (HGPS), 에머리 같은 다양한 질병에 중요한 역할을하는 것으로 보여 - Dreifuss 근육 퇴행 위축 (EDMD), 확장 성 심근증, 조기 노화 및 암 22 ~ 25. 따라서, 외부로부터의 기계적 미세 힘이 핵의 구조와 기능에 영향을 미치는지 이해하는 것은 극도의 관심이다. BAXS 플랫폼 마일 힘의 전송을 조사하는 데 사용되었다<html> 주요 또는 보조 축에 평행 한 기판을 스트...

우리는이 문서에서 복잡한 이방성 축 기계적 변형에 하나의 세포 반응을 조사하고 생체 조직의 기계적 특성을 정량화하는 데 사용할 수있는 새로운 스트레칭 플랫폼을 제시한다.

세포와 조직 Mechanobiology의 응용 프로그램에 대한 새로운 스트레칭 플랫폼

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

본 절차의 전반적인 목표는 복잡한 기계적 변형에 대한 단일 세포의 반응을 조사하고 생체 조직의 기계적 특성을 정량화하는 데 사용할 수 있는 등방성 신축 플랫폼의 신규성을 입증하는 것입니다. 이는 먼저 유연한 막을 제작하고 이 막을 일련의 클램프에 장착함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, C 2 C 12 세포를 막 위에서 하룻밤 동안 배양한 다음, 다음 날 클램프를 신축 플랫폼에 장착합니다.다음으로, 두 번째 실험 세트에서는 마우스 모델로부터 흉부 대동맥 조직을 적출하고 결합 조직을 모두 제거합니다. 그런 다음 다른 종류의 클램프를 사용하여 대동맥 조직을 신장 플랫폼에 고정합니다. 최종적으로, 신장 플랫폼을 이용하여 두 개의 직교 방향으로 세포 변형을 유도하며, 이는 도립 현미경을 사용하여 정량화할 수 있습니다.또는 대안적으로, 조직 강도를 측정하기 위해 힘 변환기를 신장 장치에 통합할 수 있습니다. 단축 또는 이축 세포 신장과 같은 기존 기술과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 세포가 부착된 투명 막에서 두 직교 방향의 변형을 독립적으로 제어할 수 있어 살아있는 세포 이미징이 가능하다는 점입니다. 현미경 관찰을 위해서는 또한 다른 세트의 클램프를 세심하게 설계해야 합니다.플랫폼에 4개의 스트링 사용자를 통합함으로써, 생물학적 조직의 기계적 특성을 정량화하기 위한 10개 세포 테스트를 수행할 수 있습니다. 이 영상에서는 세포 수준에서의 기질 변형 효과를 조사하고 생물학적 조직에 대한 인장 시험을 수행하는 데 사용할 수 있도록 맞춤 제작된 장치인 Biaxial Stretching 플랫폼을 소개합니다. Biaxial stretching 플랫폼의 설계와 특징은 동반된 논문에 상세히 기술되어 있으며, 단일 세포의 기계적 변형 효과를 조사하기 위해서는 먼저 세포가 부착될 수 있는 유연하고 투명한 기질을 제작해야 합니다.이 절차를 시작하려면, 형광 마이크로스피어 용액 500 µL를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 피펫으로 넣고 16,200 ×g에서 10분 동안 원심분리하십시오. 상층액을 버리고 이소프로판올 500 µL를 추가한 후 5분 동안 볼텍싱합니다. 큰 입자 응집물이 침전될 수 있도록 바이알을 어두운 곳에 하룻밤 동안 보관하고, 다음 날 아침에 상층액을 깨끗한 마이크로 원심분리 바이알로 조심스럽게 옮기십시오. 비드 용액은 향후 3일 동안 계속 침전되므로, 이 용액을 사용하여 5개 이상의 기판을 제작할 수 있습

a-novel-stretching-platform-for-applications-cell-tissue

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜에서는, 우리는 기술의 기반이되는 수직 전이 게시물의 마이크로 액추에이터 어레이의 제조 방법 및이 기본 기술이 모두 2 차원 입체 문화에 높은 처리량 기계 역동적인 세포 배양을 실시하도록 수정할 수 있습니다을 증명 패러다임.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

살아있는 세포의 기계적 변형률에 대한 실시간 반응을 측정할 수 있도록 맞춤형 모터 구동 기계식 액추에이터를 사용하여 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 기계생물학과 관련된 이 시스템은 컨포칼 또는 원자력 현미경으로 거의 실시간 이미징을 허용하면서 최대 20%까지 균주를 적용할 수 있습니다.

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

세포 분화를 모두 매트릭스 조성물과 기판의 재료 특성을 포함한 미세 환경 요인의 호스트에 의해 조절된다. 우리는 여기에 세포 분화 및 미세 환경 콘텍스트의 함수로서 생체 역학적 세포 기질 상호 작용 모두를 평가 견인력 현미경과 함께 세포의 마이크로 어레이를 이용하는 방법을 설명한다.

세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

여기에서, 우리는 간격 접합 connexin 43를 중단하고 견인및 세포간 응력의 관측을 통해 내피 생체 역학에 있는 후속 충격을 측정하기 위하여 역학 기지를 둔 프로토콜을 제시합니다.

코넥신 43 구조적 파괴를 통한 내피 생체역학 의 교란

제시된 방법은 실리콘 고무에 내장된 3D 소프트 하이드로겔의 단종 스트레칭을 포함하면서 살아있는 공초점 현미경 검사를 허용합니다. 섬유 정렬뿐만 아니라 외부 및 내부 하이드로겔 균주의 특성화가 입증된다. 개발된 장치 및 프로토콜은 다양한 변형 정권에 대한 세포의 반응을 평가할 수 있다.

라이브 현미경 이미징 에서 3D 하이드로겔의 제어 변형

이 연구는 세포질로 전달되는 자기 마이크로 비드를 통해 세포핵에 기계적 힘을 직접 적용하고 동시 살아있는 세포 형광 이미징을 수행하는 새로운 프로토콜을 제시합니다.

3D 자기력 액추에이터와 다기능 형광 이미징을 결합하여 핵 역학 연구

여기에 제시된 것은 mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)라고하는 전자 기반 미세 유체 플랫폼을 사용하여 단일 세포를 기계적으로 표현형하는 방법입니다. 이 플랫폼은 1-10 cells/s의 적당한 처리량을 유지하면서 세포의 탄성 및 점성 생물물리학적 특성을 모두 측정합니다.

Mechano-Node-Pore 감지: 다중 파라미터 단일 셀 점탄성 측정을 위한 신속한 무표지 플랫폼

여기에서는 공압식으로 작동되고 고해상도 현미경 검사와 호환되는 다목적 등축 스트레칭 장치를 제시합니다.

고배율 Live-Cell Confocal Fluorescence Microscopy를 위한 Equibiaxial Stretching Device

여기서는 등방성 및 단축 변형 파형을 세포에 적용하면서 조절 가능한 강성과 맞춤형 단백질 매트릭스를 가진 기질에서 배양을 지원하는 새로운 장치를 소개합니다. 이 간단하고 경제적인 플랫폼 덕분에 연구자들은 기초 연구와 질병 관련 맥락에서 기계적 단서가 세포 기능을 어떻게 조절하는지 조사할 수 있습니다.

시험 관 내 세포 신장 및 영상 촬영을 위한 새로운 플랫폼

골드에 긴 사슬 alkane thiols의 형성에서 자기 조립 monolayers은 (샘스) 단백질 패턴 및 셀 감금의 형성을위한 잘 정의된 기판을 제공합니다. 와 backfilling 다음 polydimethylsiloxane (PDMS) 스탬프를 사용하여 hexadecanethiol의 Microcontact 인쇄 글리콜 - 종료 alkane thiol 모노머는 스탬프 hexadecanethiol 지역에 단백질과 세포 adsorb 패턴을 생산하고 있습니다.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

배우세요 단세포가 복잡한 이방성 이축 기계적 변형에 반응하는 과정을 조사하는 새로운 스트레칭 플랫폼을 활용한 방법입니다. C2C12 세포와 마우스 흉부 대동맥 조직을 사용하여 생물학적 조직의 기계적 특성을 정량화합니다.

세포와 조직 Mechanobiology의 응용 프로그램에 대한 새로운 스트레칭 플랫폼

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