세포와 조직 Mechanobiology의 응용 프로그램에 대한 새로운 스트레칭 플랫폼

이 절차의 전반적인 목표는 복잡한 기계적 변형에 대한 단세포 반응을 조사하고 생물학적 조직의 기계적 특성을 정량화하는 데 사용할 수 있는 등방성 스트레칭 플랫폼의 참신함을 입증하는 것입니다. 이것은 먼저 유연한 멤브레인을 제작하고 이 멤브레인을 클램프 세트에 장착함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 하룻밤 동안 멤브레인에서 C 2 개의 C 12 세포를 배양하고 다음 날 스트레칭 플랫폼에 클램프를 장착

다음으로, 두 번째 실험 세트에서는 흉부 대동맥 조직을 마우스 모델에서 거부하고 결합 조직에서 청소합니다. 그런 다음 대동맥 조직은 다른 클램프 세트를 사용하여 스트레칭 플랫폼에 장착됩니다. 궁극적으로, 스트레칭 플랫폼은 도립 현미경을 사용하여 정량화할 수 있는 두 개의 직교 방향을 따라 세포의 변형을 유도하는 데 사용됩니다.

또는 힘 변환기가 스트레칭 장치에 통합되어 조직 강성을 측정합니다. uni actual 또는 biaxial cell stretching과 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포가 부착된 투명한 멤브레인에서 두 직교 방향의 변형을 독립적으로 제어할 수 있으므로 살아있는 세포 이미징이 가능하다는 것입니다. 현미경 검사는 또한 다른 클램프 세트의 신중한 설계입니다.

플랫폼에 4개의 스트링 사용자가 통합되어 기계적 특성의 정량화를 위해 생물학적 조직에 대한 10개의 세포 테스트를 수행할 수 있습니다. 이 동영상은 세포 수준에서 기질 변형의 영향을 조사하고 생체 조직에 대한 인장 시험을 수행하는 데 사용할 수 있는 맞춤형 장치인 Biaxial Stretching 플랫폼을 소개합니다. Biaxial stretching platform의 설계 및 기능은 단일 세포의 기계적 변형의 영향을 조사하기 위해 함께 제공되는 원고에 자세히 설명되어 있으며, 세포가 부착될 수 있는 유연하고 투명한 기판을 먼저 제작해야 합니다.

이 절차를 시작하려면 500마이크로리터의 형광 마이크로스피어 용액을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 피펫팅하고 16, 200Gs에서 10분 동안 원심분리기를 한 다음 슈퍼넷을 버리고 500마이크로리터의 이소프로판올을 첨가한 다음 5분 동안 볼텍싱합니다. 다음 날 아침에 큰 입자 응집체가 침전될 수 있도록 바이알을 밤새 어두운 곳에 두고, SNAT를 깨끗한 마이크로 원심분리기 바이알에 조심스럽게 옮깁니다. 이 비드 용액은 비드 용액이 다음 3일 동안 계속 침전되기 때문에 5개 이상의 기판을 제조하는 데 사용할 수 있습니다.

Resus가 펠릿을 현탁액으로 만들지 않는 것이 중요합니다. PDMS 키트와 함께 제공된 경화제 0.5g을 1.5ml 마이크로 원심분리기 바이알에 붓습니다. 15마이크로리터의 형광 구슬을 넣고 1분 동안 소용돌이칩니다.

이것을 5회 더 반복하여 총 90마이크로리터의 구슬을 추가합니다. 따로 보관하십시오. PDMS 10g의 무게를 측정하고 경화제 0.5g을 추가하고 형광 구슬을 보충하고 최소 12분 동안 혼합합니다. 다음으로, 전사 피펫을 사용하여 비드가 있는 PDMS 4mg을 표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 이전에 제작된 SUH 2050 십자형 금형으로 전사합니다.

금형의 높이는 320마이크로미터, 면적은 13.4제곱센티미터이며 428마이크로리터 또는 440밀리그램의 PDMS를 포함할 수 있어 섭씨 80도에서 2시간 동안 PDMS를 경화시킬 수 있습니다. 금형에서 기판을 경화 박리 한 후, 기판은 큰 변화와 기계적 특성을 나타내지 않고 실온의 페트리 접시에 2 주 동안 보관할 수 있습니다. 직경이 약 4mm인 페트리 접시에 PDMS 방울을 붓고 섭씨 80도에서 2시간 동안 거꾸로 경화한 다음 경화 과정에서 방울이 평평해지는 것을 방지하기 위해 접시를 거꾸로 유지해야 합니다.

이러한 고정 기능은 몇 주 동안 페트리 접시에 보관할 수 있습니다. 공기 플라즈마는 기판 및 8 개의 고정 기능을 처리하고, 클램프에 멤브레인을 장착하기 위해 기판에 존재하는 사각형 모양의 들여 쓰기에서 4 밀리미터 거리에서 기판의 각 끝에있는 기능을 바인딩합니다. 클램프의 홈 원통형 부분에 기판의 각 끝을 감싸고 상단에서 두 개의 고정 나사로 제자리에 고정합니다.

4개의 cl을 나사로 조입니다.amp 홀더에 있습니다. 그런 다음 기판과 클램프의 홈이 있는 부분 사이의 계면에 PDMS를 붓습니다. 1.5mm 육각 키를 사용하여 홈이 있는 원통형 부품 주위에 경화되지 않은 PDMS를 펼칩니다.

모세관 작용으로 완전히 채워질 때까지 홈에 PDMS를 붓고 멤브레인에 세포를 파종하기 전에 섭씨 80도에서 2시간 동안 어셈블리를 경화시킵니다. 공기 플라즈마. 콜라겐 코팅을 허용하기 위해 기판을 살균하고 기능화하기 위해 전체 어셈블리를 처리합니다.

1밀리리터의 0.02몰 아세트산과 16마이크로그램의 쥐꼬리 콜라겐을 보충하여 실온에서 1시간 동안 파종하는 기질 영역을 기능화합니다. 원하는 최종 콜라겐 밀도는 제곱센티미터당 5마이크로그램입니다.1시간 후 인산염 완충액으로 기질을 세 번 헹구고 실온에서 최소 10분 동안 건조시킵니다. 10%의 소 태아 혈청과 1%페니실린이 보충된 40마이크로리터의 배양 배지를 추가합니다.

스트렙토마이신은 1제곱센티미터의 면적을 커버하기 위해 기질의 중앙 부분에 2000개의 세포를 함유하고 있습니다. 이 예에서 셀 밀도는 제곱센티미터당 20셀입니다. 그러나 세포 밀도는 실험 요구 사항에 따라 변경될 수 있습니다.

전체 어셈블리를 표준 세포 배양 인큐베이터에 넣고 기질이 위를 향하도록 하여 세포를 포함하는 배양 배지를 떨어뜨립니다. 어셈블리는 세포가 증발을 방지하기 위해 단단히 부착될 수 있도록 최소 3시간 동안 기판이 위를 향하도록 유지해야 합니다. 30 마이크로 리터의 따뜻한 배양 배지가 기판의 드롭에 추가됩니다.

3시간 후 45분마다 전체 어셈블리를 신선한 배양 배지로 채워진 페트리 접시에 뒤집어 기질을 밤새 배양하여 다음 날 세포가 증식할 수 있도록 합니다. 반전 위상차 또는 형광 현미경에 설정을 장착합니다. cl 장착amp 기판 어셈블리를 이중 축 스트레칭 플랫폼에 장착하고 모터는 페트리 식기 히터 내부의 페트리 접시를 갓 준비된 HEP 완충 소금 용액으로 채웁니다.

이 생리학적 솔루션은 정상 조직의 혈액 환경을 모방하여 현미경 단계에서 세포를 유지하는 데 사용됩니다. 동일한 이축 스트레칭 플랫폼을 사용하여 작은 조직 샘플의 강성을 정량화할 수도 있습니다. 이 데모에서는 분리된 마우스 aortas가 사용됩니다.

안락사된 쥐에서 횡격막, 흉곽 및 폐엽을 제거하여 조직 손상 위험을 최소화합니다. 심장을 대동맥에 부착하고 혈관을 직접 만지지 말고 조작하지 마십시오. 심장을 사용합니다.

조직의 내부 구조를 그대로 유지하기 위해 혈관과 척추 사이를 부드럽게 절개하여 심장, 대동맥 뿌리 및 흉부 대동맥을 제거합니다. 절개 부위 중 혈관의 신장을 유발하지 않도록 주의합니다. 즉시 심장과 대동맥을 Krebs 용액에 담그고 매일 준비하고 실험 중에 섭씨 37도로 유지합니다.

Krebs 용액에서 대동맥을 자르고 조심스럽게 세척하여 외과 해부 현미경으로 작동하는 모든 혈전을 제거합니다. 마이크로 가위와 핀셋을 사용하여 결합 조직을 제거합니다. 모든 혈관 길이를 유지하고 대동맥근을 사용하여 혈관 방향을 결정하는 것이 중요합니다.

하역된 선박 치수는 선박의 강성을 결정하는 데 필요합니다. 약 2mm 길이의 대동맥 고리를 절단하고 보정된 현미경 설정을 사용하여 길이를 정확하게 측정합니다. Kreb의 솔루션에서 이 세그먼트를 따로 보관하십시오.

다음으로, 두 개의 밀리미터 분절을 제거한 후 남은 대동맥 부분에서 두 개의 작은 대동맥 고리를 자릅니다. 하나는 2mm 분절 앞의 대동맥 부분에서 나온 고리이고, 다른 하나는 대동맥 부분에서 나온 고리입니다. 2mm 세그먼트 후에 내강이 위를 향하도록 하여 현미경 유리 슬라이드에 양쪽 대동맥 고리를 놓고 보정된 현미경 설정을 사용하여 벽 두께를 측정합니다.

대동맥 벽 두께는 이 두 개의 고리를 사용하여 측정되고 평균화됩니다. 이축 스트레칭 플랫폼의 페트리 접시에 Krebs 용액을 채우고 당기는 핀에 2mm 대동맥 고리 세그먼트를 삽입합니다. 이 프로토콜에서는 25% 변위 변형의 기질 변형에 노출된 단일 마우스 근아세포 내 핵의 기계적 반응을 조사하기 위해 Biaxial stretching platform을 사용했습니다.

표준 및 순수 단일 축 스트레칭 수행과의 관계가 이러한 대표적인 결과에 표시되어 있습니다. 형광 비드는 비디오의 첫 번째 프레임에서 수동으로 선택하고 수평 및 수직 방향을 따라 최대 스트레치에 도달할 때까지 한 프레임에서 다른 프레임으로 추적됩니다. MATLAB 스크립트는 각 프레임에 대한 녹색 변형 텐서의 성분을 자동으로 계산하고 모터 변위에 대한 변형률의 보정 곡선을 생성합니다.

이 그래프에서 파란색 선과 빨간색 선은 각각 수평 및 수직 방향을 따라 녹색 변형 히어의 구성 요소에 해당합니다. 이러한 결과는 두 개의 직교 방향을 따라 기판의 변형을 유도하기 위한 이축 스트레칭 플랫폼의 기능을 보여줍니다. EQU 이축 스트레인 필드의 표준 단축 외에도 이축 스트레칭 플랫폼은 기판에 복잡한 스트레인 필드를 유도할 수 있습니다.

패널 G는 동일한 기판을 X축을 따라 4mm씩 늘리고 Y축을 따라 빨간색으로 강조 표시된 1.5mm만큼 약간 늘리면 기판에 압축 변형이 없는 순수한 단일 축 자기장이 생성됨을 보여줍니다. 패널, H는 x축을 따라 기판을 3.5mm 늘리면 25%의 변형과 7%의 압축 변형이 발생한다는 것을 보여줍니다.수직 축을 따라 기판의 끝이 고정될 때 빨간색으로 강조 표시된 스트레칭 중 라이브 셀 현미경 이미징을 수행할 수 있는 능력으로 핵은 DNA를 결합하는 라이브 셀 형광 염료로 염색한 다음 각 직교 스트레칭 축을 따라 25%씩 늘어납니다. 여기에 설명된 바와 같이, 각 스트레칭 주기 단계 사이에, 형성되지 않고 변형된 핵의 대비 이미지와 EPI 형광 이미지가 획득되었습니다. 형성되지 않은 상태를 따른 장축과 소핵의 길이, 그리고 핵이 장축과 소축을 따라 순차적으로 늘어날 때를 이미지 J 플러그인을 사용하여 결정하고 길이의 상대적 변화를 계산하는 데 사용했습니다.

이 막대 그래프의 각 축을 따라 X 또는 장축은 파란색으로 표시되고 Y 또는 단축은 빨간색으로 표시됩니다. 핵의 변형 능력은 장축에 비해 단축을 따라 상당히 높은 변형 능력을 나타내기 때문에 기계적 이방성을 나타내며, 핵 변형 능력을 조절하는 액틴 및 미세소관 세포골격의 역할은 탈중합에 의해 조사되었으며, 액틴 필라멘트 또는 미세소관은 각각 cyto D 및 neol을 사용하여 선택적으로 탈중합을 수행했습니다. 액틴 필라멘트 또는 미세소관은 핵의 이방성 형성성의 손실을 유도하는 것으로 밝혀졌습니다.

이러한 결과는 세포골격 구성 요소가 기질에서 핵으로 힘을 전달하고 핵의 자연스러운 기계적 거동을 보존하는 데 필수적이라는 발견을 뒷받침합니다. 변형 중에는 이축 연신 플랫폼을 사용하여 열 충격 단백질 27 또는 HP 27의 만성 과발현이 발현에 대한 혈관 강성 HSP에 미치는 영향을 평가했습니다. 죽상동맥경화증이 발생하기 쉬운 마우스 모델에서 POE 동형접합 음성은 내막 평활근 세포와 콜라겐 함량을 증가시켜 죽상동맥경화증 병변의 조직학적 구성을 수정합니다.

이러한 조직학적 리모델링이 혈관의 기계적 특성에 미치는 영향을 확인하기 위해 스트레칭 플랫폼을 사용하여 대동맥 경직도를 측정했습니다. 이 그래프는 대동맥 혈관을 스트레칭하여 얻은 일반적인 응력 변형률 곡선을 보여주며, 강성은 변형률의 30%에서 계산됩니다. 강성은 곡선에 대한 빨간색 선으로 표시된 접선의 기울기입니다.

HSP 27의 대동맥 분절의 경직도가 대조군 마우스 모델에 비해 41% 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. 종합하면, 혈관 및 플라크 조직학과 결합된 기계적 평가는 HSP 27의 과발현이 혈관 강성 및 콜라겐 평활근 세포 함량 증가를 특징으로 한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 결과는 HSP 27이 잠재적으로 죽상경화성 병변의 안정성을 증가시킬 수 있으며, 따라서 발병 후 플라크 파열의 위험을 감소시킬 수 있음을 시사합니다.

이 기술은 생명공학 분야의 연구자가 기계 생물학의 응용 분야에서 복잡하고 수축성 기계적 변형에 대한 세포 반응을 탐구할 뿐만 아니라 질병에서 생물학적 조직 역학을 모니터링하는 새로운 방법을 제공합니다.