신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

이 절차의 전반적인 목표는 신경 세포 시냅스 전달의 변화에 반응하여 성상세포 GQG 단백질 결합 수용체 신호의 장기적인 증가 또는 감소를 유도하는 것입니다. 이것은 먼저 야생형 마우스에서 급성 해마 조각을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 sulur Rumine 1 0 1을 슬라이스에 적용하여 성상세포를 라벨링하는 것입니다.

다음으로, 급성 해마 절편을 4-6시간 동안 테트로다톡신(tetrodatoxin)을 배양하여 신경 활동 전위를 차단하거나 일반 인공 대뇌 척수액에서 배양합니다. 마지막 단계는 배압 로딩 프로토콜을 사용하여 슬라이스의 방사선층 원자에 있는 성상세포에 칼슘 지시약을 로드하는 것입니다. 궁극적으로, 컨포칼 현미경 검사는 자발적 및 유발된 성상세포 칼슘 과도 상태의 변화를 기록하여 성상세포 GQ GPCR 신호 활동의 변화를 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법은 성상세포 수용체 가소성 및 TQG PCR 신호전달의 관련 변화에 대한 통찰력을 제공합니다. 또한 뉴런에서 대사성 수용체의 항상성 가소성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 비브라토를 켜고 배수구가 닫혀 있는지 확인하십시오.

그런 다음 절단 챔버를 비브라토에 고정하고 절단 챔버 주위에 얼음을 포장합니다. 다음으로, 양날 면도날을 70% 에탄올에 5분 동안 담근 다음 이중 증류수로 헹궈 공장 그리스를 제거합니다. 조심스럽게 반으로 자르고 뇌 절편 준비를 위해 절단 블록에 절반을 장착합니다.

쥐를 얻은 후, 냉각과 산소 공급을 위한 더 많은 표면적을 허용하기 위해 페트리 접시에 식힌 면도날로 뇌를 이등분했습니다. 이등분된 반구를 얼음처럼 차가운 슬라이스 버퍼에 2-3분 동안 두었다가 완전히 식고 더 단단해집니다. 그 후, 비브라토 접착제의 플랫폼에 미친 접착제의 얇은 층을 바르고, 양쪽 반구를 플랫폼에 바르십시오.

절단면이 아래를 향하고 측면을 위로 향하게 하고 후각 전구가 앞을 향하도록 한 다음 플랫폼을 절단 챔버에 고정합니다. 절단 챔버를 얼음처럼 차갑고 산소가 공급된 슬라이싱 버퍼로 채웁니다. 비브라토를 사용하여 300미크론 두께의 파라 시상 슬라이스를 준비하면서 절단 챔버에 산소를 계속 공급합니다.슬라이스 후 얼음처럼 차가운 우물 산소 슬라이스 완충액에서 각 파라 시상 슬라이스에서 해마와 인접한 엔드린 피질을 해부합니다.

피펫을 옮기려면 유리 목초지 피펫의 긴 끝을 떼어내고 파손된 부분을 피펫 전구로 덮습니다. 해마 조각을 한 번에 하나씩 섭씨 35도의 수조에 있는 배양실로 옮깁니다. 가시성을 위해 이러한 단계는 섭씨 35도 수조 외부의 배양 챔버와 함께 표시됩니다.

35도 수조에서 저칼슘 A CSF로 희석한 1마이크로몰 SR 1 0 1에서 해마 조각을 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 SR 1 0 1이 없는 저칼슘 A CSF로 10분 더 옮깁니다. 웜 리커버리.

그 후, 따뜻한 배양의 나머지 15분 동안 슬라이스를 대조군 또는 실험용 A CSF로 옮깁니다. 45분 회복 후 배양 챔버를 섭씨 35도의 수조에서 벤치탑으로 조심스럽게 옮기고 슬라이스가 볼루스 로딩 프로토콜을 시작하기 전에 총 3시간 동안 실온에서 계속 배양하도록 합니다. 이 절차에서는 염료 용액으로 채울 때 약 1.3메가 옴의 저항으로 당겨진 보로 규산 유리 모세관에서 피펫을 준비합니다.

다음으로, 해마 절편을 기록실에 넣고 분당 1.5밀리리터의 산소가 공급된 A CSF를 지속적으로 관류한 다음, 건강한 CA 1 파라메탈 세포의 비율이 높고 표면이 매끄럽게 보이는 해마 절편만 사용하고 건강하지 않아 보이면 폐기합니다. 미분 간섭 대비 광학 장치를 사용하여 절편 표면 아래 40-70미크론의 라듐 층에서 적절한 성상세포를 찾습니다. 그런 다음 D 용액이 미리 로드된 유리 피펫을 표준 패치 cl에 놓습니다.amp 마이크로 전극 홀더

피펫이 슬라이스 표면에 있도록 필드 위의 슬라이스 표면으로 내립니다. 피펫에 양압을 가하여 염료 배출을 시작합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 슬라이스 표면 아래 약 40미크론으로 천천히 낮추고 약 45-60초 동안 염료가 배출되도록 합니다.

그런 다음 피펫을 35미크론 더 낮추고 약 45-60초 동안 염료를 배출합니다. 그런 다음 슬라이스에서 피펫 팁을 천천히 집어넣어 많은 수의 성상세포가 염료를 흡수하도록 합니다. 일반적으로 짧은 거리에 두 번째 염료 볼루스를 주입하는 것이 도움이 됩니다.

이렇게 하려면 피펫을 슬라이스 표면으로 다시 올리고 피펫이 막히지 않았는지 확인하십시오. 그런 다음 이 부위에서 라듐 반복 볼루스 주입을 따라 첫 번째 주입 부위에서 피펫을 약 80-100미크론 떨어진 곳으로 이동하고 성상세포를 이미징하기 30-45분 전에 이미징을 위한 컨포칼 현미경을 설정합니다. 슬라이스 레이저 광에 대한 노출을 제한하는 것이 가장 중요한데, 높은 노출은 염료 표백 및/또는 광독성을 유발할 수 있기 때문입니다.

각 레이저의 기본값을 높은 사진 승수 설정, 1 x 게인 및 0.5% 레이저 출력 전력 시간으로 설정합니다. 다음으로, 성상세포 과정을 더 잘 시각화하기 위해 1.5배 확대/축소를 적용합니다. 그런 다음 필드 해상도를 512 x 512 픽셀로 설정합니다.

그런 다음 스캔 속도를 가능한 가장 빠른 속도(스캔당 약 1.2초)로 설정합니다. 단방향 스캔 모드를 사용하여 488 나노미터 레이저의 경우 503 - 548 나노미터, 559 나노미터 레이저의 경우 624 - 724 나노미터의 대역 통과 필터를 사용하여 방출 스펙트럼을 수집합니다. 그런 다음 SR 1 0 1 co labeling을 시각화하여 칼슘 염료가 함유된 세포의 정체성을 성상세포로 확인합니다.

559 나노미터 레이저를 사용하여 성상세포 칼슘 활동을 기록합니다. 먼저, 이미지 획득 소프트웨어(이 경우 성상세포 세포체)를 사용하여 세포 내의 관심 영역 위에 상자를 그립니다. 그런 다음 참조로 배경 위에 상자 하나를 그립니다.

ROI에서 자발적 칼슘 활성에 대한 10분 분량의 기준선 기록을 얻습니다. 그 후, 농도가 순차적으로 증가하는 관심 작용제를 바르고 수용체 탈감작 가능성을 줄이기 위해 적용 사이에 최소 5분을 남겨 두십시오. 녹음이 끝나면 다른 성상세포 GQ, GPCR에 대해 작용제 칵테일을 Inpact 성상세포 GQ GPCR 신호 경로에 대한 양성 대조군으로 적용합니다.

칼슘 기록이 완료되면 488 나노미터 및 559 나노미터 레이저로 정지 이미지를 촬영하여 나중에 성상세포 식별 및 ROI 배치를 확인할 수 있습니다. 다음은 Oregon Green BAFTA 1:00 AM 칼슘 지시약 염료 및 SR 1 0 1을 채택한 대조군 조건 또는 TTX에서 배양된 기록 필드에 있는 세포의 대표적인 이미지입니다. 두 신호의 오버레이는 칼슘 지표 상자가 로드된 성상세포가 개별 성상세포 소마 위에 그려져 성상세포의 칼슘 활동을 모니터링하기 위해 녹색 채널에서 시간 경과에 따른 형광 강도를 기록함을 나타냅니다.

다음은 성상세포의 칼슘 활성을 기록한 상자의 샘플 흔적입니다: TTX에서 배양된 성상세포는 반응 패턴의 변화에 의해 입증된 바와 같이 자발적 활성이 증가하고 더 강력하게 유발된 그룹 1 MGL R 칼슘 반응을 보여줍니다. 단일 피크, 다중 피크 및 고원 칼슘 일시적인 예가 표시되며, 다음은 5.0 밀리몰 칼륨 A CSF에서 배양된 슬라이스에서 성상세포 칼슘 기록의 대표적인 흔적입니다. 대조군에서 배양된 성상세포에 비해 자발적인 체세포 칼슘 과도 현상이 적고 DHPG가 약한 반응을 유발했습니다. CSF 성상세포 칼슘 영상은 G-단백질 결합 수용체 신호전달의 변화에 대한 우수한 기능적 판독값을 제공합니다.

그러나 신호 경로의 어느 위치에서 이러한 변화가 일어나고 있는지 정확히 파악할 수 없습니다. 따라서 보완적인 접근 방식은 녹색 형광 단백질을 발현하는 성상세포에 대해 형광 활성화 세포 분류 또는 유세포 분석을 사용한 다음 관심 있는 G-단백질 결합 수용체에 항체를 적용한 다음 웨스턴 블롯을 실행하여 수용체 발현 수준의 변화를 찾는 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 성상세포에서 자발적이고 Agnes가 유발한 칼슘 이벤트를 기록하여 신경 세포 시냅스 전달의 변화에 따라 성상세포 tqt PCR 활성의 스케일링을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.