Name: 신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-20T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 학습하세요 생쥐 급성 해마 절편을 이용해 신경 활동에 따른 성상 세포 GPCR 신호 변화를 유도하는 방법을. 공초점 현미경으로 칼슘 신호를 관찰하여 수용체 가소성 메커니즘을 규명합니다.

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저자는 스케일링 프로토콜과 데이터의 가치있는 토론을위한 아교 세포 - 신경 세포의 상호 작용을위한 UC 리버 사이드의 센터를 인정하고 싶습니다. 저자는 또한 자신의 작품의 출판을 후원에 ABCAM에 진심으로 감사 당신을주고 싶습니다.

<ol><li>Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+acetylcholine+evokes+Ca2%2B+elevations+in+astrocytes+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices.</a> J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).</li>
<li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+mediate+neuron-astrocyte+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication.</a> Neuron. 57, 883-893 (2008).</li>
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<li>Sutton, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+neurotransmission+stabilizes+synaptic+function+via+tonic+suppression+of+local+dendritic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of local dendritic protein synthesis.</a> Cell. 125, 785-799 (2006).</li>
<li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57, 819-826 (2008).</li>
<li>Xie, A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+scaling+of+astrocytic+metabotropic+glutamate+receptor+signaling+following+long-term+changes+in+neuronal+firing+rates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Bidirectional scaling of astrocytic metabotropic glutamate receptor signaling following long-term changes in neuronal firing rates.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li>
<li>Petravicz, J., Fiacco, T. A., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+IP3+receptor-dependent+Ca2%2B+increases+in+hippocampal+astrocytes+does+not+affect+baseline+CA1+pyramidal+neuron+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of IP3 receptor-dependent Ca2+ increases in hippocampal astrocytes does not affect baseline CA1 pyramidal neuron synaptic activity.</a> J. Neurosci. 28, 4967-4973 (2008).</li>
<li>Nett, W. J., Oloff, S. H., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+in+situ+exhibit+calcium+oscillations+that+occur+independent+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity.</a> J. Neurophysiol. 87, 528-537 (2002).</li>
<li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, 380-386 (2006).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+101+as+a+specific+marker+of+astroglia+in+the+neocortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo.</a> Nat. Methods. 1, 31-37 (2004).</li>
<li>Prezeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+carboxyl-terminal+domain+of+metabotropic+glutamate+receptor+1+by+alternative+splicing+generate+receptors+with+differing+agonist-independent+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with differing agonist-independent activity.</a> Mol. Pharmacol. 49, 422-429 (1996).</li>
<li>Shao, Y., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+relationship+between+alpha+1-adrenergic+receptor+density+and+the+receptor-mediated+calcium+response+in+individual+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Quantitative relationship between alpha 1-adrenergic receptor density and the receptor-mediated calcium response in individual astroglial cells.</a> Mol. Pharmacol. 44, 247-254 (1993).</li>
<li>Wang, S. S., Thompson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+changes+in+functional+muscarinic+acetylcholine+receptor+density+in+single+neuroblastoma+cells+using+calcium+release+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Measurement of changes in functional muscarinic acetylcholine receptor density in single neuroblastoma cells using calcium release kinetics.</a> Cell Calcium. 15, 483-496 (1994).</li>
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<li>Aguado, F., Espinosa-Parrilla, J. F., Carmona, M. A., Soriano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+correlated+network+properties+of+spontaneous+calcium+transients+in+astrocytes+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ.</a> J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).</li>
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<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRET+biosensors+to+study+GPCR+biology%2C+pharmacology%2C+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction.</a> Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).</li>
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</ol>

저자는이 연구에 사용 된 테트로도톡신이 ABCAM에서 구입 한 것을 공개하고 싶습니다. ABCAM는 가설, 디자인, 또는 데이터의 컬렉션에 참여했다. 피어 리뷰 프로세스가 완료된 후 ABCAM에 의해 작품의 후원에 관한 모든 통신이 발생했습니다.

설명 확장 모델은 성상 교세포 그룹 I mGluRs의 장기 가소성 연구를위한 실제적인 방법을 나타냅니다. 이미징 자연과 유발 칼슘 2 + 이벤트, 회사 증거가 성상 세포 칼슘 2 + 고도가되어 Gq GPCR 활성화 (10)의 다운 스트림 IP 3 R-민감한 상점에서 릴리스를 다음 발생하는 설립 한 바와 같이, 성상 교세포되어 Gq GPCR 활동의 변화를 측정하는 중요한 분석을 제공합니다 12, 17, 18. 인구의 성상 세포의 비율은 그룹 I mGluR 작용제와 같은 칼슘 2 + 반응의 패턴에 응답은 성상 세포에 의해 그룹 I mGluRs의 변화를보고합니다. 칼슘 2 + 지표와 성상 세포를로드하는 데 사용되는 특정 기술은 성상 교세포되어 Gq GPCR 활동의 변화를 보는 실험의 설계에서 중요한 고려 사항이다. 알약 로딩 또는 대량로드 여러 성상 세포, 또는 p개인 성상 세포의 ATCH 클램프 로딩 성상 세포에서 이미지 칼슘 2 + 과도로 사용할 수 있습니다. 각각의 접근 방법은 어떤 장점과 단점이 있습니다. 직접 패치 클램프를 통해 칼슘 2 + 지표와 성상을 작성하는 등 SR-101 차 마커없이 성상 세포로 세포의 명백한 식별 할 수 있습니다. 표시의 패치 클램프 배달도 세포가 건강하게하는 조각과 시냅스 (사용 가능한 레이저 파워에 따라) 더 그대로 상호 작용 가능성이 깊은 덤불 미세 공정 등의 작은 성상 세포 구획에서 칼슘 2 + 활동을 기록 할 수 있습니다. 데이터는 한 번에 하나의 셀을 모아진다 그러나 패치 - 클램프로드 낮은 처리량에서 겪고있다. 벌크로드는 대조적으로, 성상 세포의 다수 칼슘 2 + 표시기로드 동시에 묘화 될 수있다. 단, 성상 세포 표면 근처의 슬라이스 (&lt;20 μM)는 연관된 문제와,로드세포의 건강과 그대로 시냅스에 대한의. 여기에 제시된 배압 알약 로딩 프로토콜은 상대적으로 높은 처리량 및 조각 (40 ~ 75 μm의) 내 깊은 칼슘 2 + 활동을 모니터링 할 수있는 기능으로, 중간을 제공합니다. 알약 로딩 기술을 사용하여 자발적으로 활동 성상 세포의 비율이 크게 증가는 신경 세포의 시냅스와 성상 세포 프로세스 사이의 연결이 15보다 완벽한 것을 제안, 대량로드에 비해 관찰된다. 좋은 로딩 중 하나는 종종 2 광자 현미경을 이용하여 아스트로 사이트 (데이터 미도시) 또는 잠재적으로 더 작은 구획의 주요 공정에서 칼슘 2 + 활동을 모니터링 할 수있다. 그러나,주의를 경계 비특이적 배경 염색을 바꿀 같은 특정 성상 세포에 작은 프로세스를 할당에서 수행 될 필요가있을 것이다. 대량로드하거나 알약 로딩 절차의 사용과 추가 관심사는 보조 마르 필요하다성상 세포의 식별을위한 KER. 이 성상 세포가 우선적으로 칼슘 2 + 지표 AM 에스테르를 수행하는 것이 여러 해 동안 알려져되었지만, 보조 마커 SR-101는 종종 성상 세포로로드 세포를 확인하는 데 사용됩니다. SR-101은 자체 신경 (29)의 고유 흥분을 변경할 수 있습니다. SR-101의 사용은 신경 세포의 흥분에 가능한 SR-101의 효과를 제한하는 TTX의 모든 성상 세포 칼슘 2 + 측정을 수행 할 필요가 확증. 제어 및 실험 그룹이 모두 SR-101을 포함한다고 가정하면, 자체 마커는 신경 활동 전위의 장기 조작 다음 성상 세포 칼슘 2 + 신호에서 관찰 된 효과를 고려하지 않아야합니다. 그것이 2.5 mM의 K + 대비의 차이를 줄일 수 있으므로 SR-101은, 그러나, 높은 K + 실험 우려 이상일 수있다 5.0 mM의 K + 기초 발사 속도가 비례 적으로 변경되지 않은 경우. 칼슘 2 +를 전달하는 매우 유망한 방법 </sup&gt; 성상에 표시 칼슘 2 + 염료를 사용하여 전통적인 방법에 매력적인 대안을 제공하는 최근에 등장했습니다. 상당한 진보가 성상 세포 30-32을 대상으로 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)와 함께 지난 몇 년 동안되었습니다. GECIs는 해마와 같은 관심의 뇌 영역에 아데노 - 관련 바이러스 벡터의 생체 내 미세 주입하여 성상 세포에 전달 될 ​​수있다. GECIs의 표현은 바이러스 감염 32 다음 약 2 주 후에 달성된다. 성상 세포의 GECIs의 사용에 의해 제공 많은 장점이 있습니다. 첫째, 벡터는 성상 세포 - 특이 적 프로모터를 사용하여 성상 세포를 대상으로, 그래서 표지 세포 성상 세포 (32)에 근거합니다. 둘째, 신호 대 잡음 지금 만 셀 (32)에 패치 피펫을받은의 침입하지 않고, 염료의 패치 클램프 배달을 사용하여 얻을 수있는 것과 비슷한 것 같다. 셋째, 지표 델이 될 수 있습니다ivered 벌크 로딩 전달 방법을 사용하여 문제가 성인 조직, 표현. 또한, 발현은 여러 성상 구비 분화하는 능력을 제공하고, 모자이크이다. 또한 동시에, 소마 미세 branchlets 녹화하면서 따라서, 몇개의 성상 세포는 잠재적으로 동시에 이미지화 될 수있다. 따라서 잠재적으로 하나의 기술은 효율성을 크게 증가, 성상 교세포되어 Gq의 GPCR에의 확장 활동을 기록하기 위해 별도의 세 가지 기술 (벌크 로딩, 알약 로딩 및 패치 클램프로드) 대신에 사용될 수있다. 성상 세포에 칼슘 2 + 지표의 바이러스 매개 배달을 사용하여 하나의 잠재적 인 단점은 슬라이스 건강 (32)에 가능한 효과입니다. GECIs을 전달하는 데 사용되는 아데노 - 관련 바이러스 성 벡터는 성상 세포 (33)의 반응성 신경교 증의 원인이 이전에 표시되었습니다. 일반적으로 뇌 조각의 준비 가능성 INF의 방출 등의 병리의 초기 단계를 시작lammatory 10을 분자. 따라서 GECIs를 사용하는 바이러스 벡터를 사용하여 전달 성상 세포 수용체의 조절을 유도하기 위해 필요한 긴 배양 시간과 결합 이런 종류의 실험에서 슬라이스 건강의 컨텍스트에서 추가적인 고려를받을 필요가있는 것이다. 이 프로토콜을 사용하면 응답을 생성하는 효능에 대한 응용 프로그램 시간이 수용체의 가용성 기능으로 달라질 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요하다. 작용제의 특정 농도의 경우,인가 시간은 수용체가 스케일 다운 및 짧은 경우 수용체는 칼슘 2 +을 생성하기 위하여 충분히 수용체를 활성화하는 조직에서 적절한 농도에 도달하는 약물에 대해, 최대 크기를 조정 한 경우에 이상되어야 할 것이다 응답. 따라서 약 응용 시간 및 잠재적으로 그들의 농도는, 스케일링의 의도 된 방향에 따라 조정되어야 할 수도있다. 예를 들어, 작용제 농도 C 저하 될 필요가있다TTX의 ASE는 반응을 포화 방지, 심지어 응답을 볼 높은 K의 + 슬라이스를 배양 후 증가합니다. 특히, DHPG 농도는 15 μM이 종종에서 신뢰할 수있는 응답을 생성하기에 너무 낮은 때, 칼슘 2 + 응답 패턴을 연구하기 위해 5.0 mM의 K +의 치료 후 30 ~ 50 μM에 TTX 처리 후 5 ~ 15 μM에서 이동했다 그룹 I mGluRs 다운 스케일링 후 성상 세포. 성상 세포 칼슘 2 + 활동의 기록은 세포막이나에서 수용체 삽입 또는 국제화의 직접적인 증거를 제공하지 않습니다. 그러나되어 Gq GPCR 발현 수준과 자연 사이의 직접적인 관계를 조사하고 칼슘 2 + 과도 21-24, 칼슘 2 +의 변화의 가장 논리적 인 해석을 유발 체외에서 이전 연구에서 데이터와 데이터의 놀라운 유사성에 근거 시그널링은 성상 세포 표면 수용체 발현 수준을 가지고있다변경. 하나는 칼슘 2 + 활동에 미치는 영향의 궤적에 대한 추가 증거를 제공하고자하는 경우 보완적인 접근 방식은 중요한 고려 사항이 될 수있다. 우리가 사용하는 전략은 성상 세포 MrgA1R 쥐의 해마 슬라이스 TTX 배양의 효과를 알아보고자 하였다. 이러한 형질 전환 마우스는 성상 세포의 외래되어 Gq GPCR (MrgA1R)을 표현한다. 이 수용체는 뇌에 네이티브 아니기 때문에, 그것의 활동 수준을 변경할 수있는 어떠한 내인성 신경 전달 물질이 없다. 이전 작업은이 수용체가 동일한 성상 세포 (34)에 내생 그룹 I mGluRs 같은 신호 분자 같은 세포 내 결합하는 것이 좋습니다. TTX에 MrgA1R 마우스에서 슬라이스 한 후 장기 배양은 littermate 제어에 비해 효능 - 유발 MrgA1R 응답의 차이는, 조각은 성상 세포에 미치는 영향은 칼슘 2 + 활동이 표면의 수용체에 지역화 변경 등에 따라 증거를 제공 할 것입니다 배양하지 특히 그룹 I mGluR의 반응은 여전히​​ 상당히 더있는 경우icantly 같은 성상 세포에서 강화. 대안 아마도 더 복잡한 전략만큼 막 분획은 표면 수용체 발현 수준의 변화를 분석 할 수 있기 때문에, 웨스턴 블롯 분석을위한 슬라이스에서 성상 세포를 분리하는 것이지만. 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 또는 유동 세포 계측법은 여기에 도움이 될 수 있습니다. 신경 세포의 연구에이 기술의 응용 가능성은 성상 세포와 성상 세포 - 신경 세포의 상호 작용이 많다. 우리의 실험에서, 만 DHPG-유발 그룹 I은 성상 세포 칼슘 2 + 응답이 청소년 생쥐에서 분리 급성 해마 조각에서 공부했다 mGluR. 이 혼합물은, 본래의 심성 (샤퍼의 담보), 또한 그 (CA3 피라미드 세포)에 상승을주는 신경이 가능 시냅스 후 세포 (CA1 피라미드 세포)에있는 글루타메이트 신경 세포의 발사 속도를 조작 할 만들고뿐만 아니라 그 과정 associat 지층 radiatum의 성상이러한 시냅스와 전자. 급성 해마 조각이 신경 세포의 다른 유형의 발사 속도를 조작하기위한 최선의 준비를하지 않을 수 있습니다, 그러나, 많은 구 심성은 그들에게 야기 뉴런에서 절단됩니다. 그럼에도 불구하고, 다른 성상 세포되어 Gq GPCR의 하위 유형의 가소성을 준수하기 위해 특정 슬라이스 준비에서 할 수있다. 예를 들어, 조각은 그대로 해마 기저 전뇌의 콜린성 신경 세포와 그 돌기를 준비 할 수 있습니다. TTX 또는 높은 K +의 이러한 조각의 외피는 콜린성 입력 1의 상당 부분을받을 수 지층 oriens의 성상에 mAchRs의 확장으로 이어지는, 콜린성 뉴런의 기초 발사 속도에 영향을 미칠 것입니다. 대안 스케일링이 발생하면서, TTX의 서방이 플라 스트의 주입에 의해 달성되는 생체 모델을 사용하는 수 있습니다 그대로 모든 연결과 뇌의 특정 영역 내에서 성상 세포 수용체 조절을, 공부하는 아직 검증되지 않은 방법IC 폴리머로 명명 된 ELVAX 40W 관심 (35)의 영역 위. 이 방법은 신경 스케일링의 연구에서 이전에 사용 된뿐만 아니라, 성상 세포 확장에 적용 할 수 있어야합니다. 마지막으로, 적절한 판독으로, 미래의 연구는 G s 또는 G I의 GPCR의 변화를 포함하여 다른 GPCR의 가족을 조사 할 수 있습니다. 하나는 내가 GPCR에 로컬로 모든 슬라이스 준비에서 GABA의의 interneurons을 투사하는 발사의 억제 다음과 같은 영향을받을 성상 세포 GABA B 형 G를 예측할 수 있습니다. 이러한 두 번째 메신저 캠프의 실시간 표시와 같은 다른 신호 전달 분자를 표적으로하는 새로운 지표의 개발, 신경 세포 간 성상 세포 수용체 통신에 대한 연구의 새로운 영역을 열어 것입니다. 기초 신경 세포의 발사 속도의 조작에 의한 성상 세포 mGluRs의 양방향 스케일링은 신경 전달 물질의 AP-매개 릴리스 성상 세포의 감도를 나타내는 값을 제공합니다. 성상 세포는 분명히 자연 AP와 glutama를 감지 할 수세포 외 K +는 생리적 범위도 샤퍼 담보 CA1 피라미드 세포 시냅스에서 테 릴리스. TTX의 급성 응용 프로그램은 자연 성상 세포의 주파수 성상 세포 수용체가 AP 감지기하다는 증거를 제공하는 칼슘 2 + 활동 18, 36, 37,됩니다 (36) 역 상관 인구의 성상 세포 사이의 칼슘 2 +의 활동을 감소하지 않지만. 이 성상 세포가 더 전반적인 칼슘 2 + 활동에 미치는 영향과 자연의 연결 AP를 감지하는 것이 좋습니다. 그것은 널리 IP 3의 세포 내 농도가 검출 칼슘 2 + 상승으로 이어질 충분히 IP 3 R을 자극하는 임계 수준에 도달 할 필요가 허용됩니다. 자연의 연결 AP는 측정 칼슘 2 + 고도를 생산하지 않고 성상 ​​세포의 GPCR을 활성화 할 수 있을까요? 미래 연구는 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 또는 유사한 techn을을 활용할 수<html> 수용체에 대한 G 단백질 커플 링 (수용체 활성화의 측정) 및 내부 저장소에서 칼슘 2 + 방출 사이의 관계를 검사 (예 BRET 등) 개새끼. 이 기술은 그대로 티슈 제제에 사용하기에 들어가 전에 시간이 될 수 있지만 BRET는 G 단백질에 커플 링 GPCR-38를 검출하기 위해 시험 관내에서 광범위하게 사용되어왔다. 이것은 성상되어 Gq의 GPCR에 훨씬 더 빈번중인 칼슘 2 + 이미징 도구를 사용하여 기록 될 수있는 것보다 활성화되는 것이 가능하다. 활동 전위를 감지뿐만 아니라, 성상 교세포되어 Gq의 GPCR에 또한 최근의 연구 (39)에보고 된 신경 전달 물질의 소형 계량 적 자료를 검색 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 양방향 스케일링 방법은 성상 세포가 GPCR에 이용되어 Gq 배양 프로토콜에서 bafilomycin A1을 포함하여 신경 전달 물질의 계량 적 소포 동의서를 감지하는 정도의 척도를 제공하기 위해 미래의 연구에 사용될 수있다. 성상 세포 수용체 스케일링은 성인 쥐에서 얻은 조직에서 유도 될 수 있다면 ntent이 &quot;&gt; 지금까지 스케일링 프로토콜은 청소년 마우스 (P12-P18)에서 해마 조각에 사용되었습니다. 따라서 현재 알 수 없습니다. 강력한 최근 연구 성상 세포의 그룹 I mGluR의 표현이 시대의 첫 주 이후 상당히 감소와 성인 성상 세포 (40)의 수용체 발현의 매우 낮은 수준으로, 성인이 될 때까지 계속 감소 것을. 그것은 따라서 성상 세포 mGluRs은 다음과 같은 확장 여부를 확인하는 흥미로운 일이 될 것이다 제안 긴 청소년 마우스의 성상 세포에서 보인 그들에 접근하는 수준으로 성인 마우스 해마 슬라이스에있는 신경 세포의 발화의 장기 억제.이 발견은 성상 세포 수용체 발현은 주어진 나이에 정적이 아니라 신경 활동의 수준에 따라 신속하게 변경할 수 있습니다 제안했다. 대조적으로 성인 생쥐 그룹 I mGluRs의 감소 표현, 증거를 포함하여 &amp; # 그 아드레날린 수용체를, 신흥945, 1A, α의 2A, 및 β 1 부속 유형은 주로 성인 뇌의 3, 4의 성상 세포에 의해 표현된다. α의 1A 아드레날린되어 Gq GPCR은이 수용체는 아드레날린 성 신경 세포의 발사 속도의 변화에 민감하게 반응하는지 여부를 포함하여 신경 세포 간 성상 세포 통신의 미래 연구를위한 매력적인 대상이 될 수 있습니다.

성상 세포는 2 + 성상 세포되어 Gq의 GPCR에의 활성화에서 거의 독점적으로 인해 발생하는 세포 내 칼슘의 증가와 신경 세포 또는 신경 세포의 축색 돌기의 자극에 초 이내에 응답합니다. 예를 들어, 무스 카린 성 아세틸 콜린 수용체 1, 칸 나비 노이드 수용체 2, α의 1A 아드레날린 수용체 3, 4, 그룹 I mGluRs (아래 참조) 심하게 신경 세포의 활동에 응답 모든 성상되어 Gq GPCR의 하위 유형. 성상 세포 그룹 I mGluRs의 활성화는 (급성 해마 조각 등) 현장에있는 신경 세포의 글루타메이트의 구 심성 신경의 자극 5-7뿐만 아니라 생체 내에서 성인 마우스 피질의 감각 자극 8 다음 다음, 가장 광범위하게 증명되었다. 생물학 및 성상 세포, 신경 세포, 성상 세포 또는 신경 세포의 상호 작용의 생리에 신호 성상 교세포되어 Gq GPCR의 활성화의 결과는 논쟁 9-12의 문제이다. 이들 것입니다신경 세포 간 성상 세포 수용체 신호의 기능 전에 오메 시간은 충분히 높게 평가되고 있습니다. 이 신경 세포는 실험 프로토콜을 사용하여 성상 세포 수용체를 활성화 할 수있는 것은 분명하지만, 제대로 이해 남아있는 신경 세포 간 성상 세포 수용체 통신의 측면이 있습니다. 우선, 성상 교세포되어 Gq의 GPCR을 활성화하는 데 필요한 신경 활성의 실제 양이 잘 정의되지 않고, 둘째, 사용 의존 가소성을 나타내도록 성상 세포 수용체의 능력은 거의 주목을 받고있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 시작하려면, 우리는 최근 신경 세포의 활동 전위의 장기 변화 (AP)에 의존하는 시냅스 활동에 대한 응답으로 성상 세포 그룹 급성 청소년 해마 슬라이스에있는 I mGluRs의 양방향 확장을 유도하는 프로토콜을 개발했다. I mGluRs이 fo를 확장 신경 세포의 이온 성 글루타메이트 수용체 (13, 14), 성상 교세포 그룹의 양방향 항상성 소성에 발견 된 것과 유사한llowing의 신경 세포의 활동 전위의 봉쇄와 신경 세포 활동 전위 주파수가 15 증가 할 때 아래로 확장 할 수 있습니다. 성상 세포 수용체에 이러한 보상 변화는 자연 기록하여 측정 및 성상 세포 칼슘 2 + 과도 상태를 유발하고 제어 조건에서 성상 세포에서 사람들에게 이러한 이벤트의 특성을 비교 할 수 있습니다. 이 논문에서, 우리는 성상 세포 수용체의 조절을 유발하는 급성 해마 슬라이스, 배양 조건의 준비를 포함하여,이 프로토콜의 사용을위한 완벽한 방법을 설명하는, 성상 세포 칼슘 2 + 지시 염료 로딩, 칼슘 2 + 영상 공 초점 현미경을 사용하여 기술 및 기대 효과 성상되어 Gq GPCR 활동에. 성상 세포에 대한 효과를 예측 칼슘 2 시그널링 속성 + -되어 Gq의 GPCR의 다른 발현 형질 배양 세포에 이전에 기록 된 것과 일치 -로 변경을 검정 미래 연구에 사용될 수있는 &quot;로드맵&quot;을 제공한다trocytic GPCR 식입니다. 이 기술의 사용에 대한 파급 효과와 잠재적 인 응용 프로그램은 건강하고 병에 걸린 뇌의 성상 세포 - 신경 세포의 상호 작용에 대한 우리의 이해에 기여할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Chamber Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brinkmann 피펫 보관 용기</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-491</td><td>서랍 부분을 인큐베이션 챔버로 사용</td></tr><tr><td>전기 드릴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유연한 튜빙</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 솔기 밀봉제&nbsp;</td><td></td><td></td><td>수족관 솔기 실러라고도 함</td></tr><tr><td>가스 탱크</td><td></td><td></td><td>95% 산소, 5% 이산화탄소</td></tr><tr><td>천연 베벨 피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1000</td><td>산소 라인을 연결하기 위한 절단</td></tr> 라인 <tr><td>1-6 라인 매니폴드</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0210 (MP-6)</td><td>마이크로로더 매니폴드 장치용</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td>마이크로 로더 매니 폴드 장치의 경우, slice</td></tr> holder 600 &micro<tr><td>에</td>맞게<td>Floating Bubble Rack</td><td>Bel Art Scienceware</td><td>F18875-0400</td></tr>;<tr><td> m Sefar Nitex 나일론 메쉬</td><td>ELKO 필터링 (주)</td><td>06-600/51</td><td>슬라이스 홀더용</td></tr><tr><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td><td>슬라이스 홀더용</td></tr><tr><td><강력한>시약</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Fisher Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-6-Hydroxy-2,5,7,8- 테트라메틸크로만-2-카르복실산 (Trolox)</td><td>Acros Organics</td><td>53188-07-1</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Acros Organics</td><td>401471000</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxin citrate (TTX)</td><td>Abcam</td><td>ab120055</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101 (SR-101)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>284912</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>플루론산 F-127</td><td>인비트로겐, 분자 프로브</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *세포 퍼민(특수 포장)</td><td>인비트로겐, 분자 프로브</td><td>O6807</td><td></td></tr><tr><td>(RS)-3,5-DHPG</td><td>Abcam</td><td>ab120020</td><td></td></tr><tr><td>히스타민</td><td>시그마-알드리치</td><td>H7125</td><td></td></tr><tr><td>카르바모일콜린 염화물 (카르바콜)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4382</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5'-ATP 디소듐 (Na-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single-edge razor blade&nbsp;</td><td>GEM</td><td>62-0161</td><td>이분법&nbsp;</td></tr><tr><td>양날 면도날</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>121-6</td><td>슬라이스 절단용</td></tr><tr><td>Mayo 가위, 슈퍼컷</td><td>WPI</td><td>14010-15</td><td>참수용</td></tr><tr><td>파인 아이리스 가위, 스트레이트</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14094-11</td><td>두개골</td></tr><tr><td>아이리스 집게 절단용, 곡선형</td><td>WPI</td><td>15915</td><td>피부와 두개골 제거용</td></tr><tr><td>소형 주걱</td><td></td><td></td><td>뇌 제거/이식</td></tr><tr><td>Dumostar Dumont #5 Biologie Tip 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td>해마 해부용</td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-678-20B</td><td>뇌 슬라이스 이송용</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 고무 전구</td><td>Fisher</td><td>03-448-22</td><td>뇌 슬라이스 이송용</td></tr><tr><td>폴리스티렌 100mm 조직 배양 접시</td><td>Corning</td><td>25020</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Fisher</td><td>ISOTEMP 210</td><td>따뜻한 배양용</td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>볼루스 로딩 피펫용</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>Olympus Fluoview 1000</td><td></td></tr><tr><td>PM-1 플랫폼이 있는 로우 프로파일 오픈 다이아몬드 배스 이미징 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td>다이아몬드 배스 로우 프로파일</td></tr><tr><td>보로실리케이트 유리 피펫</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>볼루스 로딩 피펫</td></tr><tr><td>Micromanipulator용&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>ROE-200</td><td>볼루스 로딩 피펫용</td></tr><tr><td>Spin-X 원심분리기 튜브 필터 0.22 &마이크로; M 셀룰로오스 아세테이트&nbsp;</td><td>코스타</td><td>8161</td><td></td></tr></tbody></table>

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

연구 년에 가까운이 현장과 생체 내에서 성상 세포가 neuronally 출시 송신기에 의해 자극 될 수 많은 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)을 표현하는 설립했다. 그러나, 신경 활성의 변화에​​ 응답하여 가소성을 나타내도록 성상 세포 수용체의 능력은 거의 주목을 받고있다. 여기에 우리가 전 세계적으로 확장 또는 성상 교세포 그룹 아래 내가 급성 뇌 조각에 글루타민산 염 수용체 (mGluRs을)의 대사에 사용할 수있는 모델 시스템을 설명합니다. 포함 양방향 형광 칼슘 2 + 지표와 신경 활동 전위 주파수, 부하 성상 세포와 성상 세포 프로세스를 조작, 장기 슬라이스 배양에 적합한 챔버를 구성, parasagittal 해마 조각을 준비하고, 녹음에 의한 성상 세포되어 Gq GPCR 활동의 변화를 측정하는 방법에 대한 방법은 다음과 같습니다 공 초점 현미경을 사용하여 자연과 유발 성상 세포 칼슘 2 + 이벤트. 본질적으로, &quot;칼슘 Roadmap &quot;성상되어 Gq의 GPCR에의 가소성을 측정하는 방법을 제공합니다. 성상 세포의 연구를위한 기술의 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 성상 세포 수용체 신호가 신경 활동의 변화에​​ 의해 어떻게 영향을 받는지에 대한 이해를 갖는 것은 두 정상 시냅스 기능뿐만 아니라 프로세스 기반 신경 장애 및 신경 퇴행성 질환에 대한 중요한 의미가 있습니다.

그림 3의 대표적인 결과는 SR 성상 세포 칼슘 2 + 활동에 4-6 시간 동안 TTX 급성 마우스 해마 슬라이스 배양의 효과를 발휘합니다. 데이터는 ACSF 플러스 TTX 대 제어 ACSF 배양 조각에서 자연 칼슘 2 + 과도 및 DHPG-유발 그룹 I mGluR 칼슘 2 + 반응을 모두 포함한다. 기본 특성을 형태 학적 특징, 별 모양의 프로세스 조립 및 작은 소마 크기 (~ 10 ㎛) 외, 성상 세포가 선택적 성상 세포 마커 SR-101 19, 20 (과 칼슘 2 + 표시 OGB-1 오전 오버레이하여 SR에 식별 도 3A). 성상 세포의 세포체 이상의 번호를 바꾸거나도 3b에 도시 된 시간 트레이스 위에 형광 번호에 대응한다. 그룹 1 mGluR 작용제 (RS)-3.5-DHPG은 성상 세포에서 1 군 mGluRs에 특정 스케일링 효과를 결정하기 위해 적용된다. 은 phys 구별하기다른되어 Gq의 GPCR에 비해 1 군 mGluRs로 스케일링 효과의 특이성에 iology, 작동 제의 칵테일은 각 실험의 끝에인가한다. 여기에서 우리는 히스타민, carbamylcholine 클로라이드 (카바 콜)과 아데노신 5&#39;-ATP 나트륨 (NA-ATP)를 주작 동근 10 μM되어 Gq GPCR의 각을 사용했다. 작용제 칵테일은 그 특정 성상 세포는 DHPG에 대한 응답을 유도하는 수용체의 충분한 양을 표현하지 아마도 때문에, 세포가 DHPG에 반응하지 않는 경우에 가능한 응답 성 성상 세포를 식별 할 수있는 긍정적 인 제어 역할을합니다. 우리는 성상 세포 그룹 I mGluRs의 변화를 드러내는을 지원하기 위해 5 μM 및 15 μM (그림 3B)뿐만 아니라, 30 μM, 50 μM (그림 4A)를 포함 DHPG의 다른 농도를 사용했다. 세포 칼슘 2 + 반응과되어 Gq GPCR 발현 수준 사이의 관계는 시험 관내 21 ~ 24 이전에 조사되었다. 우선,특정 작용제의 농도에 대응하는 임계 값은 각각의 셀에 의해 표현 수용체의 밀도에 의존한다. 세포 집단에서보다 세포는 세포가 수용체의 높은 밀도로 형질 작용제의 농도에 관련 칼슘 2 + 상승으로 반응한다. TTX 슬라이스 잠복기 후에, 인구 성상 세포의 비율이 증가 작용제의 고정 농도 (도 3B 및 3C)에 응답. 우리는 30, 50 μM DHPG가 5.0 밀리미터 K + 조절 대 처리에 그룹 I mGluR의 응답을 비교하는 데 필요한 반면, 5 μM 및 15 μM DHPG는, 제어 및 TTX 처리 된 세포 사이의 반응 성상 세포의 비율 분명한 차이를 보여 것을 발견했다 세포 (그림 4A). 성상 세포 칼슘 2 + 반응 패턴 및 작용 물질 농도의 관계는 또한 동일 반응계에서 조사되었다. 효능을 증가농도는 단일 피크 칼슘 2 + 고도 2 + 고도 25 ~ 27 주 multipeak와 고원에서 성상 세포에서 칼슘 2 + 반응의 패턴을 이동합니다. 이러한 이전의 연구 결과에 기초하여, 우리는 수용체 발현 수준의 변화가 있는지 작용제의 단일 농도 응답 패턴이 교대 것이라고 예측 하였다. 따라서, 두 개의 스케일링 방법 중 어느 (신경원 발화를 억제 또는 증가) 활용되고에 따라 특정 응답 패턴을 생성하는데 필요한 작용제의 농도를 증가 또는 감소 할 것이다. 예를 들어, TTX 배양 성상 세포는 더 많은 고원 형 칼슘 2 + 고도에 자신의 DHPG-유발 칼슘 2 + 응답 패턴을 이동하고 성상 세포 (그림 3C)를 제어에 비해 효능 농도를 낮추기 위해 반응한다. 계정에 이전 연구를 복용, 이러한 관찰은 그룹 성상 세포에서 I mGluR 수용체의 발현이 증가하는 것이 좋습니다. 칼슘 2 + 고도의 시간과 발병 (지연) 상승은 직접 배양 세포 22 ~ 24에되어 Gq GPCR 발현 수준의 변화에 상관 관계를 보여왔다. 수용체 밀도 감소가 반대의 효과를 생성하는 동안 높은 수용체 발현 수준은 짧은 응답 대기 시간 및 더 빠른 상승 시간을 초래한다. TTX, 캘리포니아에있는 성상 세포 배양을 위해 DHPG의 응용 프로그램에 의해 유발 2 + 과도 제어 ACSF (그림 3D) 배양 성상 세포에 비해 훨씬 더 빠른 상승 시간이 있습니다. 효능 - 유발 칼슘 2 +의 답변으로 이전에 언급, 진폭에 관계없이 작용 물질 농도 또는 스케일링 모델 15 (그림 3D)의 변경되지 않습니다. 직접 그룹을 활성화하여 관찰 된 변화뿐만 아니라 내가 DHPG와 mGluRs, 자연 성상 세포 칼슘 2 + 활동도 크게이 조작에 의해 영향을받습니다. 우리는 관찰제어 대 TTX 배양 자발적으로 활동 성상 세포의 비율에 다 2.26 배 증가했다. 이 성상 세포 (그림 3E)를 배양 TTX에서 42.1 %로 소마의 자발적인 활동을 나타내는 제어 성상 세포의 단지 12.9 %의 증가이다. 그것이 공지되어 있으므로 그 작용제 (21), (26), (28)의 부재, 및 수용체 발현 정도가 증가함에 따라이 고유 활성 증가의 수준은, 이러한 데이터를 제시한다는 점에서 GPCR에 전시 &quot;진성&quot;또는 구성 적 활성 해당 성상되어 Gq GPCR에 증가 밀도 신경 활동 전위 소성 장기 환원을 다음. 효능 - 유발 반응과 유사하게, 자연 칼슘 2 + 고도의 상승 시간은 (그림 3E)을 증가합니다. 제 2 프로토콜, 상승 된 세포 외 칼륨 (5.0 ㎜)의 인큐베이션을 사용하여 대표 데이터는 인터넷에 도시되어gure 4. 세포 외 K +의 기초 CA3 신경 세포의 활동 전위의 주파수 (15)의 상당한 증가에 2.5-5.0 mM의 결과에서 증가했다. DHPG (30 μM 및 50 μM)의 높은 농도가 높은 칼륨 (그림 4a 및도 4b)에서 배양 성상 세포에서 그룹 I mGluR 칼슘 2 + 반응을 불러 일으킬하기 위해 필요합니다. 이것은 신경 활동 전위에서 장기간 상승 다음 교세포에서 그룹 I mGluR 반응성의 감소 수준과 일치한다. 또한, DHPG의 고정 농도 유발 반응 패턴은 약한 단일 피크 응답 (그림 4B)에 고원과 같은 반응에서 이동합니다. 이 칼륨 조건에서 자발적 활성 성상 세포의 비율을 조사하는 것은 높은 K + 배양 닫기 교세포는 제어 조건 (도 4C)에 비하여 자발적으로 활성임을 보여준다. 이 효과는 opposit에자발 칼슘 2 + 입면도를 나타내는 성상 세포의 백분율이 증가되는 TTX 조건의 E 방향. 마지막으로, 모두가 유발과 자발적인 칼슘 2 + 고도는 제어 조건 (그림 4C와 4D)에 비해 높은 K + 배양 성상 세포의 느린 상승 시간이 있습니다. 전반적으로 이러한 데이터는 성상 교세포되어 Gq GPCR 발현 수준이 양방향으로 확장 된 기간 동안 신경 세포의 활동 전위 활동의​​ 수준에 따라 가늠자를하는 것이 좋습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1. 슬라이스 배양 챔버 제조 및 설정합니다. (A)의 밀폐 뚜껑과 함께 브 링크 피펫 저장 용기의 서랍 부분은 슬라이스 배양 챔버를 구성하는 데 사용됩니다. (B) D정상에서의 컨테이너 약 1 ¼의 측면에서 케이 구멍 ¼의 측면에서. 유연한 튜브의 조각에 맞게. (C)는 유연한 튜브의 안쪽 끝에 microloader 매니 폴드 장치를 연결합니다. 참고 컷에 맞는 천연 200 μL 피펫 팁 (흰색 화살표). (D) 식스 20 ㎕를 에펜 도르프 microloaders 자르에 맞는 한 - 투 - 여섯 줄의 매니 폴드에 microloader 매니 폴드 장치를 만들 수 있습니다. (E) 뚜껑에 두 개의 작은 구멍을 뚫습니다. (F) 슬라이스 홀더를 만들기위한 부동 거품 랙. (G) 나일론 메쉬 재료의 조각이 바닥에 접착 될 수 있도록 부동 버블 랙 바닥 &quot;다리&quot;가 제거된다. (H) ACSF의 충분한 양으로 배양 챔버를 채우기 슬라이스 홀더 떠오른다. microloaders의 끝이 실 바닥의 한 구석에서 휴식 할 수 있도록 튜브의 길이를 조정합니다. 에서 배양 챔버를 배치 할 때물 목욕은 욕조에 물 수준은 챔버의 ACSF 같은 수준에 있어야합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. 슬라이스 건강의 추정. (A) 미분 간섭 대비 (DIC) 광학 장치를 사용하여 건강 찾고 해마 조각. 건강한 조각 부드러운 벨벳 모양과 건강한 CA1 피라미드 뉴런의 높은 비율이있다. 지층 radiatum에 돌출 혀끝의 수상 돌기를합니다. 여기에 표시된 것과 같이 신경의 패치 클램프는 몇 자발적인 활동 전위 표준 2.5 mM의 K + ACSF의 낮은 휴식 막 잠재력 (-61 ~ -62 MV)를 알 수있다. 막 잠재력과 발사 속도는 EX의 함수로 변화 할 것이다tracellular K + (샤오 등. 15). 화살표는 추정 성상을 가리 킵니다. 요약 : SR, 지층 radiatum, s.py., 지층 pyramidale. 스케일 바, 10 μm의. (B) 건강에 해로운 슬라이스 기름에 튀긴 된 계란 (흰색 화살표가 죽은 신경 세포의 핵을 가리 - 기름에 튀긴 된 계란의 &quot;노른자&quot;)의 모양이 죽은 CA1 피라미드 뉴런의 높은 비율을해야합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" width="500" /> 그림 3. 되어 Gq GPCR의 활동을 증폭 TTX의 배양 신경 세포의 AP의 장기 억제 후 유발 된 그룹 I mGluR 칼슘 2 + 응답 녹음. (A) 기록 필드에있는 세포의 대표 이미지는 C에서 배양ontrol 오레곤 그린 BAPTA - 오전 1시 칼슘 2 + 지시 염료 (왼쪽 패널) 및 SR-101 (중간 패널)를 촬영 한 조건 (상단 패널) 또는 TTX (아래 패널)에서. 스케일 바는 10 ㎛이다. 두 신호의 오버레이 ( &quot;병합&quot;) 칼슘 2 + 표시와 그 성상로드를 나타냅니다. 박스는 성상 세포에서 칼슘 2 + 활동을 모니터링 녹색 채널에 시간이 지남에 따라 형광 강도를 기록하는 개별 성상 세포 소마에 그려집니다. 성상 세포에서 칼슘 2 + 활동의 기록 상자에서 (B) 샘플 트레이스). 응답의 패턴의 변화에 의해 입증 TTX 쇼에서 배양 성상 세포는 자발적인 활동을 증가시키고 더 강력한 유발 그룹 I mGluR 칼슘 2 + 반응. 단일 피크 (원), multipeak (사각형), 및 고원 (점선으로 된 사각형)의 예는 칼슘 2 + 과도가 표시됩니다. 응답 패턴 (C)의 변화는 다른 concent를 사용하여 특히 명백하다그룹 I mGluR 작용제 DHPG의 식량. 더 multipeak 및 고원 응답은 주어진 작용제의 농도 제어에 비해 TTX에서 배양 한 후 분명하다. 진폭 (아래 패널)를 변경하지 않지만 (D)는 &quot;모든 - 또는 - 없음&quot;응답 진폭을 나타내는, 제어 (상단 패널)에 비해 TTX 배양 성상 세포에 빠르게 DHPG-유발 칼슘 2 + 응답 시간을있다 상승 번 응답 임계 값에 도달했습니다. (E) 자연 성상 세포의 배 상승 칼슘 2 + 과도 인구의 성상 세포의 비율이 자발적되어 Gq GPCR 칼슘 2 + 활동 증가 (아래 패널)을 전시하면서, 성상 세포 (상단 패널) 배양도 빠른 TTX의 제어 대 배양 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" fo:content-wiDTH = &quot;6 인치&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg&quot;폭 = &quot;500&quot;/&gt; 그림 4. 높은 세포 외 칼륨 배양 신경 세포의 AP 장기 증가 다음 녹화 감소 성상되어 Gq GPCR 활동 및 유발 그룹 I mGluR 칼슘 2 + 반응. (A) 5.0 mM의 K + ACSF 배양 조각에서 성상 세포 칼슘 2 + 음반의 대표 흔적 뉴런을 탈분극과 ACSF (2.5 mM의 K + ACSF)를 제어에 비해 자신의 기초 발사 속도를 증가시킵니다. 5.0 mM의 K + ACSF 전시 적은 자연 체세포 칼슘 2 + 과도 약한 DHPG와 함께 배양 성상 세포는 제어 ACSF 배양 성상 세포에 비해 반응을 유발. (B) DHPG의 여러 농도 유발 반응의 패턴의 비교는 신경 세포의 AP 장기 상승 후 약한 반응 유형을 보여준다. PO에서 성상 세포의 비율 (C)의 감소자발적인 활동의 상승 시간이 느린 (아래 패널)가있는 동안 자연 칼슘 2 + 활성을 나타내는 pulation는 높은 K 장기 배양 후 관찰 + ACSF (상단 패널)를 제어하기 위해 비교된다. (D) DHPG의 서로 다른 농도로 유발 된 성상 세포의 배 칼슘 2 + 반응을 상승 제어 ACSF 배양 성상 세포에 비해 5.0 mM의 K +의 처리를 다음 느려질. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서 우리는 성상 교세포 G 단백질 결합 수용체의 가소성 연구를위한 신경 세포의 항상성 가소성을 유도하기 위해 사용되는 프로토콜의 적응을 설명합니다. 최근 성상 세포 그룹 청소년 생쥐 내가 mGluRs의 변화를 검사하는 데 사용되는 방법은 현장에서 생체 성인 마우스의 조직에서, 다양한 성상 세포의 GPCR의 확장을 측정하고, 성상 세포 수용체의 감도의 더 나은 인식을 얻기 위해 적용 할 수있는 신경 활동의 변화에​​.

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

이 절차의 전반적인 목적은 신경세포 시냅스 전달 변화에 대응하여 성상교세포 GQG 단백질 결합 수용체 신호 전달을 장기적으로 증가 또는 감소시키는 것입니다. 이를 위해 먼저 야생형 마우스로부터 급성 해마 슬라이스를 준비합니다. 두 번째 단계는 성상교세포를 표지하기 위해 슬라이스에 sulur Rumine 1 0 1을 처리하는 것입니다.다음으로, 급성 해마 슬라이스를 뉴런의 활동 전위를 차단하기 위해 테트로도톡신(tetrodotoxin)이 포함된 용액 또는 일반 인공 뇌척수액에서 4~6시간 동안 배양합니다. 마지막 단계로, 배압 로딩 프로토콜(back pressure loading protocol)을 사용하여 슬라이스의 방사상층(stratum radiatum)에 있는 성상교세포에 칼슘 지표를 로딩합니다. 최종적으로, 공초점 현미경을 사용하여 성상교세포의 자발적 및 유발된 칼슘 일시적 변화(calcium transient)를 기록함으로써 성상교세포 Gq GPCR 신호 전달 활성의 변화를 보여줍니다.이 방법은 성상교세포 수용체 가소성과 그에 따른 TQG PCR 신호 전달의 변화에 대한 통찰을 제공합니다. 또한 뉴런 내 대사성 수용체의 항상성 가소성을 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 바이브레이터를 켜고 배수구가 닫혀 있는지 확인하십시오.그런 다음 진동절단기(vibratome)에 절단 챔버를 고정하고 절단 챔버 주변을 얼음으로 채웁니다. 다음으로, 양날 면도날을 70% ethanol에 5분 동안 담근 후 2차 증류수로 헹구어 공장 그리스를 제거합니다. 면도날을 조심스럽게 절반으로 자른 후, 뇌 슬라이스 제작을 위해 절반 하나를 절단 블록에 장착합니다.냉각된 면도날을 사용하여 마우스 뇌를 이등분한 후, 냉각과 산소 공급을 위한 표면적을 넓히기 위해 페트리 접시에 담습니다. 이등분된 뇌 반구들을 얼음처럼 차가운 슬라이싱 버퍼에 2~3분 동안 두어 완전히 냉각시키고 더 단단하게 만듭니다. 그 후, 진동 절편기의 플랫폼에 순간접착제를 얇게 바르고, 양쪽 반구를 플랫폼에 고정합니다.절단면은 아래로, 측면은 위로, 그리고 후각구(olfactory bulb)가 앞을 향하도록 하여 플랫폼을 절단 챔버에 고정합니다. 절단 챔버를 얼음처럼 차갑고 산소가 충분히 공급된 슬라이싱 버퍼로 채웁니다. Vibratome을 사용하여 300 µm 두께의 시상면(para sagittal) 절편을 준비하는 동안 절단 챔버에 계속해서 산소를 공급합니다. 절편 제작 후, 얼음처럼 차갑고 산소가 충분히 공급된 슬라이싱 버퍼 내에서 각 시상면 절편으로부터 해마(hippocampus)와 인접한 내비피질(entorhinal cortex)을 박리합니다.전이 피펫을 만들려면 유리 파스퇴르 피펫의 긴 팁 부분을 부러뜨린 후, 부러진 부분에 피펫 벌브를 끼웁니다. 해마 슬라이스를 하나씩 35 °C 항온수조 내의 배양 챔버로 옮깁니다. 시각적 확인을 위해, 이 단계들은 배양 챔버가 35 °C 항온수조 밖에 있는 상태로 보여지고 있음에 유의하시기 바랍니다.해마 슬라이스를 35°C 항온수조에서 1 µM SR 1 0 1이 희석된 저칼슘 A CSF에 20분 동안 배양합니다. 그 다음, SR 1 0 1이 포함되지 않은 저칼슘 A CSF로 옮겨 10분간 추가로 배양하여 회복시킵니다.그 후 슬라이스를 대조군 또는 실험군 A CSF로 옮겨 남은 15분 동안 온온 배양합니다. 45분간의 회복 시간이 지난 후, 배양 챔버를 35 °C 항온수조에서 벤치탑으로 조심스럽게 옮기고, 볼루스 로딩 프로토콜을 시작하기 전까지 상온에서 총 3시간 동안 슬라이스를 계속 배양합니다. 이 과정에서 염료 용액을 채웠을 때 저항이 약 1.3 MΩ이 되도록 뽑아낸 붕규산 유리 모세관으로 피펫을 준비합니다.다음으로 해마 슬라이스를 기록 챔버에 넣고 산소화된 A CSF를 1.5 milliliters per minute의 속도로 지속적으로 관류합니다. 이때 건강한 CA1 pyramidal cells의 비율이 높고 표면이 매끄러워 보이는 해마 슬라이스만 사용하며, 상태가 좋지 않아 보이면 폐기합니다. 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 광학계를 사용하여 슬라이스 표면에서 40 to 70 microns 아래의 stratum radiatum에서 적절한 성상교세포 영역을 찾습니다. 그런 다음 D 용액이 미리 충전된 유리 피펫을 표준 패치 클램프 미세 전극 홀더에 장착합니다.피펫 끝이 슬라이스 표면에 닿도록 하여 시야 위 슬라이스 표면으로 내립니다. 피펫에 양압을 가해 염료를 분출하기 시작합니다. 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 슬라이스 표면 아래 약 40 microns까지 천천히 내리고, 약 45~60초 동안 염료가 분출되도록 합니다.그 다음 피펫을 35 µm 더 내린 후, 약 45에서 60초 동안 염료를 배출합니다. 그 후, 많은 수의 성상교세포가 염료를 흡수할 수 있도록 피펫 팁을 슬라이스에서 천천히 회수합니다. 보통 약간 떨어진 곳에 두 번째 염료 볼루스를 주입하는 것이 도움이 됩니다.이를 위해 피펫을 슬라이스 표면으로 다시 올리고 피펫이 막히지 않았는지 확인합니다. 그런 다음 피펫을 첫 번째 주입 지점에서 stratum radium을 따라 약 80에서 100 microns 정도 떨어진 곳으로 이동시켜 이 지점에서 볼러스 주입을 반복하고, 공초점 현미경의 이미징 설정을 위해 별도의 시간을 가지며 astrocyte를 이미징하기 전 30에서 45분 동안 대기합니다. 과도한 노출은 염료 표백 또는 광독성을 유발할 수 있으므로, 슬라이스의 레이저 광 노출을 제한하는 것이 무엇보다 중요합니다.각 레이저의 기본값을 높은 광증배관(photo multiplier) 설정, 1배 증폭(gain) 및 0.5% 레이저 출력 전력 시간으로 설정하십시오. 다음으로, 성상세포 돌기를 더 잘 시각화하기 위해 1.5배 줌을 적용합니다. 그런 다음 시야 해상도를 512 픽셀 x 512 픽셀로 설정하십시오.그 후, 스캔 속도를 스캔당 약 1.2초인 최대로 설정합니다. 단방향 스캔 모드를 사용하여, 488 nanometer 레이저에는 503에서 548 nanometer의 밴드 패스 필터를, 559 nanometer 레이저에는 624에서 724 nanometer의 밴드 패스 필터를 사용하여 방출 스펙트럼을 수집합니다. 그런 다음 SR 1 0 1 공동 표지를 시각화하여 칼슘 염료가 로드된 세포가 성상교세포임을 확인합니다.559 nanometer 레이저를 사용하여 성상교세포의 칼슘 활성을 기록합니다. 먼저, 영상 획득 소프트웨어를 사용하여 세포 내 관심 영역, 이 경우에는 성상교세포 세포체 위에 상자를 그립니다. 그런 다음, 참조용으로 배경 위에 상자를 하나 그립니다.ROI에서 10분 동안 자발적 칼슘 활성의 기선(baseline) 기록을 얻습니다. 그 후, 관심 있는 효능제를 순차적으로 증가하는 농도로 처리하고, 수용체 탈감작 가능성을 줄이기 위해 처리 간 최소 5분의 간격을 둡니다. 기록 마지막 단계에서는 성상세포 GQ GPCR 신호 전달 경로의 양성 대조군으로서 다른 성상세포 GQ GPCR에 대한 효능제 칵테일을 처리합니다.칼슘 기록이 완료되면, 이후 성상교세포의 정체성과 ROI 배치를 확인하기 위해 488 nm 및 559 nm 레이저로 정지 영상을 촬영합니다. 다음은 대조군 조건 또는 TTX에서 배양되어 Oregon Green BAFTA 1:00 AM 칼슘 지시약 염료와 SR 1 0 1을 흡수한 기록 시야 내 세포들의 대표 이미지입니다. 두 신호의 오버레이는 칼슘 지시약이 로딩된 성상교세포를 나타내며, 성상교세포의 칼슘 활성을 모니터링하기 위해 개별 성상교세포 세포체 위에 박스를 그려 녹색 채널에서의 시간에 따른 형광 강도를 기록합니다.다음은 성상교세포의 칼슘 활성을 기록한 샘플 트레이스입니다. TTX에서 배양된 성상교세포는 반응 패턴의 변화에서 알 수 있듯이, 자발적 활성이 증가하고 유발된 그룹 1 MGL R 칼슘 반응이 더 강력하게 나타납니다. 단일 피크, 다중 피크 및 고원 형태의 칼슘 일시적 변화 예시가 제시되어 있으며, 여기에는 뉴런을 탈분극시키고 기저 발화율을 높이기 위해 2.5 mM potassium 대조군 A CSF 대비 5.0 mM potassium A CSF에서 배양된 슬라이스의 성상교세포 칼슘 기록 대표 트레이스가 포함되어 있습니다. 5.0 mM potassium A CSF에서 배양된 성상교세포는 대조군 A CSF에서 배양된 성상교세포에 비해 세포체에서의 자발적 칼슘 일시적 변화가 더 적게 나타나며, DHPG 유발 반응이 더 약하게 나타납니다. 성상교세포 칼슘 이미징은 G-단백질 결합 수용체 신호 전달 변화에 대한 훌륭한 기능적 판독 값을 제공합니다.하지만 이러한 변화가 신호 전달 경로의 어느 지점에서 발생하는지 정확히 짚어낼 수는 없습니다. 따라서 보완적인 방법으로 녹색 형광 단백질을 발현하는 성상교세포에 대해 형광 활성 세포 분류법 또는 유세포 분석법을 사용한 뒤, 관심 대상인 G-단백질 결합 수용체에 항체를 적용하고, 웨스턴 블롯을 수행하여 수용체 발현 수준의 변화를 확인하는 것이 좋습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 성상교세포의 자발적 및 Agnes 유발 칼슘 이벤트를 기록하여 뉴런의 시냅스 전달 변화에 따른 성상교세포 tqt PCR 활성의 스케일링을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

inducing-plasticity-astrocytic-receptors-manipulation-neuronal-firing

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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이 프로토콜 산소 수준 재활용된 버퍼의 작은 볼륨과 침수 급성 hippocampal 조각 활동 종속 시 냅 스가 소성 녹음의 방법 론 적 측면에서의 안정화를 설명 합니다.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

여기 astrocytic 네트워크의 조직 평가 프로토콜 선물이. 설명된 방법 셀 수, 크기, 지역, 및 핵 내의 위치 등이 네트워크의 기술적인 조치를 제공 하는 바이어스를 최소화 합니다. 이방성 vectorial 분석 평가 이다.

크기, 모양, 및 결합 된 이다의 네트워크의 방향 분석

여기에 제시된 것은 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 뇌 세포의 종방향 이미징을위한 만성 두개골 창을 이식하기위한 프로토콜입니다.

깨어있는 마우스 에서 반복되는 생체 내 이미징을위한 두개골 창 이식

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

여기에서는 생체 외 뇌 절편에서 유지되는 등쪽 외측 생식기 핵(dorsal lateral geniculate nucleus)에서 중계 뉴런(relay neuron)에서 뉴런 내재적 흥분성(neuronal intrinsic excitability)의 장기 가소성을 유도하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

Inducing Long-Term Plasticity of Intrinsic Neuronal Excitability in Neurons of the Dorsal Lateral Geniculate Nucleus

이 프로토콜은 여러 기억 관련 뇌 영역에 걸쳐 뉴런과 성상교세포로부터 칼슘 신호를 동시에 기록하는 방법을 포괄적으로 설명하며, 학습 및 기억 행동 패러다임에서의 적용 방식을 시연합니다.

학습 및 기억 행동 중 여러 뇌 영역에 걸친 성상교세포-뉴런 활동을 기록하는 이중 색상 섬유 광도 측정법

학습하세요 생쥐 급성 해마 절편을 이용해 신경 활동에 따른 성상 세포 GPCR 신호 변화를 유도하는 방법을. 공초점 현미경으로 칼슘 신호를 관찰하여 수용체 가소성 메커니즘을 규명합니다.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

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