발작과 같은 활동을 분석하고 운동을위한 저가의 방법 초파리

이 절차의 전반적인 목표는 초파리의 운동 또는 발작 행동의 변화를 확인하는 것입니다. 이것은 먼저 마취를 사용하여 파리를 개별 바이알로 분리함으로써 수행됩니다. 다음으로, 간단한 웹캠을 사용하여 파리의 움직임을 기록합니다.

그런 다음 데이터를 Image J로 가져와 분석을 시작합니다. 마지막으로, 맞춤형 플라이 분석 소프트웨어를 사용하여 기록 기간 동안의 거리, 속도 및 이동 시간을 결정합니다. 궁극적으로 이 분석은 유전적 및 약리학적 조작과 관련된 운동 또는 발작 행동의 변화를 보여줄 수 있습니다.

이제 우리가 설명할 이 저비용 기록 기술은 초파리의 발작 행동과 움직임을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 특히, 우리는 이 파리의 발작 행동을 수정하는 유전적, 약리학적 조작을 식별하는 데 이를 사용했습니다. 하지만 오늘 제 연구실의 연구 조교인 크리스 버너(Chris Burner)가 이 기술을 시연할 예정입니다.운동 및 발작 분석 중에 파리를 기록할 웹캠을 설정하기 시작합니다.

카메라가 제자리에 설치되면 편리한 VI 소프트웨어 프로그램을 엽니다. 녹화 설정을 조정하려면 캡처 탭에서 타임랩스 이미지 옵션을 선택하고 새 창이 열리면 웹캠을 캡처 장치로 선택합니다. 대부분의 실험에서는 6 40 x 4 80의 비디오 프레임 크기가 적절합니다 압축 옵션에서 Intel IUV 코덱을 선택하고 분석에 따라 프레임당 초를 설정합니다.

고급 탭에서 각 캡처에 대한 비트맵 이미지 파일을 만들고 기록된 이미지 스택을 저장할 프로그램의 폴더를 선택합니다. 다음으로 종이 위에 죽은 파리를 놓습니다. 비디오 설정 상자를 클릭하고 장치 설정 탭에서 밝은 흰색 배경이 어두운 파리와 선명한 대비가 될 때까지 설정을 조정합니다.

시작 버튼을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 녹음 기간이 끝나면 중지 버튼을 클릭합니다. 이제 이미지 스택이 운동 활동 분석을 시작하기 위해 선택한 폴더에 있어야 합니다.

파리를 면 마개로 덮인 개별 바이알로 옮깁니다. 진행하기 전에 파리를 20-30분 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오. 이 시간이 지나면 바이알에서 페트리 접시 덮개 아래에서 테스트할 플라이를 부드럽게 두드립니다.

덮개에는 공기 흐름이 허용되도록 작은 슬릿이 있어야 합니다. 준비가 되면 시작을 눌러 운동 활동 기록을 시작합니다. 발작 분석의 첫 번째 단계는 표준 배지 또는 테스트할 약물과 혼합된 배지 중 2일 된 발작에 민감한 파리를 먹이

이틀 동안 먹이를 준 후, 각각의 빈 바이알을 부드럽게 두드려 파리를 옮기고 면봉으로 바이알을 덮습니다. 관찰하기 전에 파리를 20분 동안 방해받지 않고 앉혀 두십시오. 준비가 되면 실험실 소용돌이에 바이알을 소용돌이치거나 가장 높은 설정을 사용하여 10초 동안 소용돌이합니다.

즉시 움직이지 못하는 파리를 웹캠 바로 아래에 있는 흰색 종이에 놓습니다. 제자리에 고정되면 녹음을 시작합니다. 이것은 활동을 파리합니다.

파리는 마비 기간과 함께 산재 한 빠르고 조정되지 않은 움직임을 겪을 것입니다. 파리가 스스로 바로잡으면 녹음이 종료됩니다. 데이터 분석을 시작하려면 무료 이미지 처리 소프트웨어 image J를 엽니다.

먼저 파일 탭을 클릭한 다음 가져오기를 선택하여 원하는 이미지 스택을 가져옵니다. 마지막으로 이미지 시퀀스입니다. 이미지 스택이 포함된 폴더를 선택하고 이미지를 엽니다.

시퀀스 옵션 대화 상자가 열리면 숫자순으로 이름 정렬을 선택한 다음 을 선택합니다. 그래. 이제 이미지 스택이 이미지 J에 로드됩니다.다음으로, 이미지 탭을 선택하고 값 유형을 8비트로 설정합니다. 이미지 탭을 다시 클릭하고 조정 옵션에서 임계값을 선택합니다.

이렇게 하면 모든 이미지의 임계값이 설정되어 각각이 흰색 배경으로 구성되고 파리가 검은색 점으로 변환되도록 합니다. 이렇게 하면 차단 지점을 조정할 수 있는 임계값 대화 상자도 열립니다. 이미지를 스캔하여 여분의 검은색 점이 있는지 또는 점이 없는지 확인합니다.

필요한 경우 임계값을 조정하여 문제를 완화합니다. 조정이 완료되면 임계값 대화 상자에서 적용을 선택합니다. 마스크로 변환 대화 상자가 열리면 확인을 클릭하여 이미지 스택의 임계값을 설정합니다.

파리의 움직임을 픽셀 단위로 측정하려면 플러그인 탭에서 멀티 트래커 플러그인을 선택하십시오. 개체 추적기 대화 상자가 나타나면 제공된 네 가지 옵션을 모두 클릭하고 선택합니다. 그래. 그러면 멀티 트래커 플러그인이 검은색에 좌표를 첨부합니다.

을 클릭하고 결과 창에 나열하고 총 길이(픽셀)를 나열합니다. 경로 창은 파리가 이동한 경로를 그래픽으로 표시합니다. 결과 창에서 X 및 Y 좌표 목록을 복사하고 데이터를 Excel 스프레드시트에 붙여넣습니다.

스택의 슬라이드에 검은색이 없는 경우.그 안에 Multi Tracker 프로그램은 해당 슬라이드에서 멈춥니다. 이 경우 스택의 임계값을 다시 설정하여 파리가 검은색으로 등록되도록 합니다.

문제의 슬라이드에서. 경로 길이를 픽셀에서 센티미터로 변환하려면 빈 흰색 종이에 알려진 거리만큼 떨어져 있는 두 개의 점을 이미지화합니다. 두 점에 대한 XY 픽셀 좌표를 결정하고 이 정보를 사용하여 보다 정확한 결과를 위해 1cm에 해당하는 픽셀 수를 결정합니다.

XY 좌표를 맞춤형 플라이 해석 프로그램으로 가져와서 이미지에서 노이즈를 제거합니다. 일단 열리면 각 유전자형 또는 치료의 데이터를 별도의 스프레드시트로 가져옵니다. 그런 다음 요약 시트 탭을 선택하고 click me 버튼을 클릭합니다.

분석 유형에 따라 임계값을 선택하고 확인을 클릭하면 프로그램이 속도, 시간 및 이동 거리를 계산합니다. 이러한 대표적인 경로는 메트포르민 치료를 받은 경우와 받지 않은 돌연변이 파리에서 발작과 유사한 활성을 보여줍니다. 발작 활성은 테스트된 두 돌연변이체에서 처리로 감소했습니다.

메트포르민은 발작 분석 중 이동한 거리와 발작과 유사한 활동의 총 지속 시간을 모두 유의하게 감소시켰습니다. 대조적으로, 이러한 개별 운동 경로에서 평균 속도에는 변화가 없었습니다. 야생형 CS 플라이의 경로는 원형 경기장 주변에 집중되어 있음을 보여줍니다.

돌연변이 BSS 파리의 경로는 동일한 농도를 보이지만 전체적으로 움직임이 적습니다. 새로운 환경에서 이동을 테스트했을 때, BSS 돌연변이는 CS 파리에 비해 경로 길이가 크게 감소한 것으로 나타났습니다. 이 분석은 또한 CS 파리가 운동 분석 중에 탐색하는 동안 이동 속도의 변화를 감지했습니다.

BSS 파리는 몇 번의 폭발적인 활동을 제외하고는 시험 내내 상대적으로 비활동적인 상태를 유지했습니다. 이 기술로 이러한 행동 분석을 수행할 때 염두에 두어야 할 가장 중요한 사항 중 하나는 녹음을 수행하기 전에 파리를 마취하지 않도록 하는 것입니다. 마취는 발작 행동과 기관차 행동 모두에 영향을 미치며 결과를 크게 바꿀 수 있는 것으로 나타났습니다.