분자 대장 암 세포의 3 차원 모델의 침윤성 종양 미세 환경의 프로파일 및

본 실험 절차의 전반적인 목표는 침습적 종양 전면의 악성 상피 세포와 암 관련 기질 세포 사이의 접점에서 나타나는 독특한 생물학적 특성을 규명하는 것입니다. 이는 우선 결장 이식물로부터 일차 섬유아세포 배양물을 구축함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 일차 결장 섬유아세포와 배양된 대장암 세포를 사용하여 기관형 공동 배양 모델을 구축하는 것입니다.

다음으로 장기모사 모델을 고정하고 절편화하여 멤브레인이 부착된 슬라이드에 올린 후 크리스탈 바이올렛으로 염색합니다. 마지막 단계는 레이저 미세절제술을 통해 침습성 종양 세포를 비침습성 종양 세포 및 암 관련 기질 세포와 분리하는 것입니다. 최종적으로, 분자 프로파일링 기술을 사용하여 침습성 및 비침습성 종양 세포와 주변 종양 미세환경의 기질 세포에 대한 생물학적 특성을 분석할 수 있습니다.

우리는 대장암의 3차원 장기모사 공배양 모델에서 침습 세포가 비침습 세포와 얼마나 명확하게 구별되는지를 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 우선, 실험실 내의 외과 수술실에서 정상 인간 결장 점막 조직 샘플을 직접 확보하십시오. 10 centimeter 조직 배양 접시 중앙에 검체를 배치한 후, 페니실린, 스트렙토마이신 및 펀지존이 첨가된 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 배양물을 3회 세척하십시오.

멸균 핀셋과 메스로 마지막 세척 후 흡입하지 말고, 조직을 작은 조각으로 자릅니다. 그런 다음 각 조각을 메스 날로 그린 십자 표시의 중심에 놓습니다. 12-웰 플레이트에서 메스를 조직 위로 가볍게 흔들어 조직이 배양 접시 바닥에 부착되도록 합니다.

조직이 뜨지 않고 완전히 잠길 수 있도록 750 µL의 1차 섬유아세포 성장 배지에 표본을 넣습니다. 그런 다음 표본을 37 °C, 5~10% CO2 인큐베이터에 넣고 5일 동안 배양합니다. 약 7일이 지나면 섬유아세포가 조직의 가장자리에서 서서히 자라나기 시작합니다.

이는 약 3~4주 후에 더 뚜렷하게 관찰될 것입니다. 그리고 충분한 섬유아세포가 성장했다면, 세포가 탈락한 후 각 웰에 750 µL의 trypsin을 첨가하고, 이를 수집하여 섬유아세포가 포함된 기관형 겔(organotypic gel) 제작을 위해 T 25 조직 배양 플라스크로 옮깁니다. 먼저, 보충된 dmm 내에 겔당 500,000개의 세포를 포함하는 섬유아세포 세포 현탁액을 준비하십시오.

텍스트 프로토콜에 기재된 비율에 따라 9개의 겔을 만들기 위해, 겔당 1mL 기준으로 얼음 위에서 장기 배양 겔(organotypic gels)을 조제합니다. 10mL를 준비하고 기포가 생기지 않도록 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 24-웰 플레이트의 각 웰에 1mL씩 넣고 가습된 환경의 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.

겔이 한 시간 동안 굳은 후, 겔 위에 1 mL의 보충된 DM EM을 추가하고 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 겔 상단의 배지를 흡입하여 제거하고, 500,000개의 대장암 상피 세포가 포함된 배지 1 mL를 겔 코팅된 나일론 시트에 플레이팅합니다.

멸균된 포셉을 사용하여 1.5 centimeter x 1.5 centimeter 크기의 멸균 오토클레이브 나일론 시트를 미리 준비합니다. 필요한 수량의 나일론 시트를 10 centimeter 배양 접시에 넣습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 얼음 위에서 겔 혼합물을 준비하고, 용액이 중화되었음을 나타내는 분홍색으로 변할 때까지 0.1 molar 수산화나트륨을 겔 혼합물에 첨가합니다.

그런 다음, 각 나일론 시트에 이 용액 250 µL를 추가합니다. 이어서 겔이 굳을 수 있도록 5% CO2 습윤 분위기의 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 10 cm 배양 접시에 PBS에 희석한 1% glutaraldehyde 용액 10 mL를 추가합니다.

젤이 굳으면 4°C에서 1시간 동안 배양한 후, 나일론 시트를 PBS로 3회, 보충된 dme로 1회 세척합니다. 스테인리스 스틸 시트를 삼각대 형태로 접어 준비한 멸균 침습 지지체 격자 위에 오가노티픽 젤을 올리기 위해, 동일한 완충액에서 4°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 그 다음, 멸균된 핀셋과 에탄올을 사용하여 6-웰 플레이트의 각 웰에 스틸 격자를 배치합니다.

콜라겐 면이 위로 향하도록 젤이 코팅된 나일론 시트를 각 그리드 위에 배치합니다. 멸균된 에탄올 처리 스파출러를 사용하여 24웰 플레이트에서 오가노타이픽 젤을 들어 올려진 나일론 시트로 조심스럽게 옮깁니다. 나일론 시트가 배지에 닿되 잠기지는 않을 정도로 보충된 D mem을 웰에 채웁니다.

배지가 기관형 겔(organotypic gel)에 닿지 않도록 주의하십시오. 5%CO2의 습윤한 상태에서 37°C로 14일 동안 배양합니다. 배지는 2일마다 교체하십시오.

나일론 시트를 포함한 전체 조직 배양물을 웰에서 제거하여 랩(clinging film) 위에 놓습니다. 깨끗한 일회용 메스를 사용하여 조직 배양물과 나일론 시트를 이등분하고, 두 조각 모두를 포르말린에 24시간 동안 고정합니다. 24시간 후 실온에서 포르말린을 70% ethanol로 교체하고 하룻밤 동안 방치한 다음, 파라핀 임베딩, 절편 제작 및 염색을 거쳐 레이저 미세 절단(laser microdissection)을 수행합니다.

먼저, 10 µm 두께의 장기 유사 조직 절편을 막 장착 슬라이드 위에 올립니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 절편을 처리한 후, 선택한 플랫폼을 사용하여 레이저 미세 절단(laser microdissection)을 수행할 준비를 합니다. 미세 절단할 염색 절편이 부착된 유리 슬라이드를 배치합니다.

현미경 스테이지 위에 0.5 mL 마이크로 원심분리 튜브를 수집 카세트에 엎어 놓은 상태로 장착하고, 직접 시야 하에 미세 절제된 조직이 수집될 튜브 캡 내부에 세포 용해 버퍼 50 µL를 첨가합니다. 조이스틱을 사용하여 관심 조직을 식별하고, 소프트웨어 인터페이스를 통해 염색된 유기 절편에 주석을 달아 종양 침습 전면에서 미세 절제할 세포들을 표시합니다. 레이저 발사를 지시하면, 표시된 구역이 절단됨과 동시에 미세 절제된 조직이 마이크로 원심분리 튜브의 캡 내부로 튕겨 들어갑니다.

관심 분석물을 추출하기 위해 적절한 방법으로 샘플 처리를 진행합니다. 여기서는 장기 모사 기질로 침습하는 SW 480 대장암 세포의 레이저 미세절단 이미지가 표시되어 있습니다. 대장암 상피세포를 강조하기 위해 크레설 바이올렛(Crestal violet)이 사용되었습니다.

그 후 레이저 절단이 이루어지기 전에 침습성 종양 섬(invasive tumor islands)을 정의하고, 절단된 조각을 수집 장치로 운송합니다. 비침습성 세포와 기질 세포 또한 동일한 방법론을 사용하여 식별 및 분리합니다. 3차원 공동 배양물은 microRNA 프로파일링을 통해 분석되었으며, 이를 통해 침습성 종양 전면의 세포와 층상 종양 구역 내 세포 간의 차등 발현 microRNA를 비교하였습니다.

데이터는 전체 변화량 및 2배 증가 또는 감소 이상의 데이터 값으로 분류되었습니다. 대표적인 실험 결과의 변화량은 침습성 경계 세포와 비침습성 경계 세포 간의 micro RNA 유전자 발현 차이를 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후, 해부학적으로 적절한 기관형 모델을 구축하는 방법과 레이저 미세절단법을 사용하여 추가 연구를 위한 개별 세포 집단을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.