Name: 분자 대장 암 세포의 3 차원 모델의 침윤성 종양 미세 환경의 프로파일 및 예 생체 내 섬유 아세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 배우세요 대장암 침윤성 종양 전선에서 악성 상피세포와 암 관련 기질세포 간의 생물학적 특성을 프로파일링하는 방법을 레이저 미세절단과 오가노타이픽 공배양 모델을 사용하여 연구하세요.

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MB는 MRC의 교제에서 보조금에 의해 지원됩니다. KP와 AHM은 웨 섹스 의학 연구 및 암 연구 UK / RCS (영국) (C28503/A10013)에서 보조금에 의해 지원된다. 우리는 사우 샘프 턴 조직 화학 연구 단위의 대학의 지원에 대한 감사합니다.

대장의 Explants에서 주요 섬유 아세포 문화 1. 설립 <ol><li> 직접 수술 수술실에서 정상적인 인간의 대장 점막 조직의 샘플을 확보, 7 ~ 10에서 중단 PBS의 ML 100 단위 / ML 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 및 / ㎖ Fungizone 0.25 μg로 보충. </li><li> 실험실에서, 10-cm 조직 배양 접시의 중앙에 시료를 배치하고 PBS / 펜 연쇄상 / Fungizone로 3 회 세척 하였다. 최종 세척 후 흡인하지 마십시오. </li><li> 멸균 집게와 메스로 (약 2 mm) 작은 조각으로 조직을 잘라 12 - 웰 플레이트에 메스 블레이드와 그린 크로스의 중심에 각 조각을 배치합니다. 이 준수 할 수 있도록 조직에 부드럽게 메스 록. </li><li> 농경 750 μL의 시료는 일차 섬유 아세포 성장 배지 subme한다 (DMEM은 20 % 송아지 태아 혈청 (FCS), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신 및 292 ㎍ / ml의 L-글루타민)플로트를 사용하지 않고 조직을 RGE. 2 일마다 재 공급을 제외하고 향후 5 일 동안 플레이트를 방해하지 마십시오. </li><li> 향후 5 일 동안 섬유 아 세포는 천천히 조직의 가장자리에서 밖으로 성장하기 시작합니다. 대략 7 일째에, 이것은 더 볼 수 있습니다. 밖으로 성장 충분한 섬유 아 세포가 있는지 후 약 3 ~ 4 주와, 각 웰에 750 ㎕의 트립신을 추가합니다. 세포는 T-25 조직 배양 플라스크에, 수영장 및 전송 (5 ~ 10 분의 시간이 걸릴 수 있음) 분리 한 후. </li></ol> 2.의 Organotypic 준비 섬유 아세포 임신의 Organotypic 겔의 제조 : <ol><li> 10 % FCS 및 292 ㎍ / ml의 L-글루타민이 보충 된 DMEM에서의 Organotypic 당 5 × 105 세포를 포함하는 섬유 아세포의 세포 현탁액을 준비한다. </li><li> 다음과 같은 비율로, 얼음의 Organotypic 젤 메이크업 : <ul><li> 쥐 꼬리 콜라겐의 7 권 : 리겔의 혼합 (1:1) </li><li> 필터링 10 배 DMEM의 1 볼륨 </li><li> FCS의 1 볼륨 </li><li> 5 × 5 섬유 아세포를 함유하는 섬유 아세포의 세포 현탁액 1 부피 9 젤 (젤 당 1 ㎖)의 경우 10 ㎖를 준비하고 거품을 피하기 위해 조심스럽게 섞는다. </li></ul></li><li> 24 웰 플레이트의 각 웰에 1 mL를 넣고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양 젤이 설정할 수 있도록 가습 분위기에서 C를 °. 1 시간 후 젤 위에 1 ML DMEM (10 % FCS) / 과잉 추가 하룻밤 인큐베이터로 돌아갑니다. </li><li> 다음 날, 젤 및 5 × 5 CRC 상피 세포를 포함하는 미디어의 판 1 ㎖의 상단에서 대기음 매체. </li></ol> 겔 코팅 된 나일론 시트의 제조 : <ol start="5"><li> 1.5 cm 크기의 멸균 나일론 시트는 사전에, 1.5 cm를 멸균 x 다음 준비합니다. </li><li> 무균 핀셋을 사용하여, 10cm 배양 접시 (통상 4 나일론 시트 인 접시 당 수용 할 수있다)에 나일론 시트의 필요 개수를 배치. </li><li> 다음과 같은 순서로 얼음 젤 메이크업 (250 μL의 총볼륨은) 나일론 장에 필요합니다 : <ul><li> 쥐 꼬리 콜라겐의 7 권 </li><li> 필터링 10 배 DMEM의 1 볼륨 </li><li> FCS의 1 볼륨 </li><li> 1 DMEM의 볼륨 10 % FCS / 공급 과잉 </li></ul></li><li> 액이 황색 인 경우,이 솔루션은 분홍색으로 변할 때까지 50 μL 씩 분주 0.1 M NAOH를 추가하여 중화. </li><li> 각 나일론 시트에이 솔루션을 250 μl를 추가하고 37 품어 ° C 젤이 설정할 수 있도록 30 분 동안 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서. </li><li> PBS에 1 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde) 솔루션을 구성한다. 젤이 설정되면 각 10cm 배양 접시에 10 mL를 넣고 1 시간 동안 4 ° C에서 알을 품다. </li><li> 세척 나일론 시트는 PBS와 DMEM에 1X (10 % FCS) / 글루의 3 배, 4 ℃에서 DMEM / 글루에서 하룻밤 배양 </li></ol> 침공 강철 격자에의 Organotypic 젤을 올리기 : <ol start="12"><li> 삼각대 형성에 스테인리스 강판을 접어 발판 그리드를 미리 준비합니다. 사용 전에 압력솥.</li><li> 여섯 웰 플레이트의 각 웰에 철강 격자를 배치 에탄올 소독 집게를 사용합니다. </li><li> 각 그리드에, 최상위 콜라겐면 젤 코팅 된 나일론 시트를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 에탄올 소독 주걱을 사용하여 제기 나일론 시트를 24 웰 플레이트에서의 Organotypic 젤을 전송합니다. </li><li> 나일론 시트 매체와 접촉하지만 침수되지 때까지 10 % FCS와 보충 DMEM 10 % FCS / 공급 과잉으로 잘 입력합니다. 매체의 Organotypic 젤을 만지지 않도록하십시오. </li><li> 2 일마다 미디어를 교체, 5 % CO 2의 습한 분위기에서 37 ° C에서 14 일 동안 배양한다. </li></ol> 3.의 Organotypic 고정 <ol><li> 우물에서 나일론 시트를 포함한 전체의 Organotypic를 제거하고 집착 필름에 배치합니다. </li><li> 의 Organotypic 깨끗한 일회용 메스를 사용하여 나일론 시트를 양분하고 실온에서 24 시간 동안 포름 알데히드의 두 반쪽을 고정합니다. </li><li> 70 %의 에탄과 포름 알데히드를 교체올 24 시간 후 전에, 파라핀에 삽입 구획 및 염색에 하룻밤 둡니다. </li></ol> 침략적인 여백의 4. 레이저 미세 절제 <ol><li> 막 상에 10 ㎛ 두께로 섹션 슬라이드를 장착. </li><li> 1 분 동안 크실렌을 적용하여 Deparaffinize 섹션은​​ 다음 추가로 1 분 동안 크실렌을 제거하고 75 %의 에탄올에 고정합니다. </li><li> 1 분 0.125 % 크레 실 바이올렛 용액을 에탄올과 얼룩을 제거합니다. 크레 실 바이올렛 상피 세포를 강조하고 기질에서 쉽게 차별을 허용합니다. </li><li> 크레 실 바이올렛을 제거하고 100 % 에탄올로 세척하기 전에 추가로 1 분 동안 100 % 에탄올을 적용합니다. 30 분 동안 공기 건조에 슬라이드를 허용합니다. </li><li> 선택 플랫폼 (예를 들어, 라이카 AS 시스템)를 사용하여 레이저 미세 절제를 실시한다. </li><li> 현미경 무대에 얼굴을 아래로 microdissected 할 스테인드 섹션 유리 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 컬렉션 카세트에 0.5 ㎖ microcentrifuge 관을 장착하고 50 μL의 추가microdissected 조직을 수집 할에 대한 상한에 세포 용해 버퍼 (예 : DNA, RNA 또는 단백질의 용해 버퍼). </li><li> 직시 하에서, 그 조직을 식별하기 위해 조이스틱을 사용하고, 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 종양 침윤 전면 microdissected 할 셀을 강조 더러워 유기 부분을 주석. </li><li> 강조 표시된 부분을 잘라해야 모두 발사 레이저를 지시하고 microcentrifuge 관의 뚜껑에 microdissected 조직을 추진. </li><li> 일단 충분한 자료를 수집 한, 컬렉션 카세트를 꺼내 microcentrifuge 관을 닫고 튜브의 바닥에 용해 버퍼를 그리는 부드럽게 회전. </li><li> 미세 절제가 완료 될 때까지 얼음에 샘플을 놓습니다. 적절한 방법으로 처리 샘플은 관심의 분석을 추출 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li>
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</ol>

저자는 그 잠재적 인 충돌을 공개하지 않습니다.

여기에 우리가 특별히 분리하고 상피와 기질 세포의 3 차원 공동 문화 구조의 전이성 진행의 초기 단계에서 암 관련 기질을 공격 할 수있는 능력을 획득 한 종양 세포의 특성을하는 방법을 설명합니다. 생체 인간의 대장 섬유 아 세포를 포함하는 합성 기질과 나란히 CRC 상피 세포로 구성된 공동 문화 모델은 3 차원에서 CRC의 침략을 연구하는 데 사용되었습니다. 생체 내 조건에서의 모방은 상피 세포를 대체하고 다양한 해부학 적 기원의 생체 섬유 아 세포를 사용하여 기질을 구성하여 다른 암의 시나리오에 적용 할 수있는이 생리 학적으로 관련 시스템. 생체 내에서 대장의 기질이 변화 CEL와 복잡하고 역동적 인 조직이기 때문에이 방법의 한 가지 제한은 단지 섬유 아세포의 세포를 사용하여 기질 구획의 지나친 단순화이다L 성분. 한 가지 예는 기본 종양 물질에 상당한 수량에 존재하지만이 모델에서 결석 면역 유래 세포입니다. ...

의 Organotypic 공동 배양하는 중요한 세포 외 기질 구성 요소 1-3를 포함하는 콜라겐 겔에 악성 상피 세포와 기질 세포를 병치하여 3 차원 생체 내 종양 미세 환경을 재구성에 도움 조직 공학적 모델입니다. 주로 종양의 침략을 측정하는 방법으로 잉태, organotypics 생체 내 동물 모델에 대한 의존도를 줄이고, 이러한 침입 세포가 단 분산 상태 2-4로 인위적으로 강제되는없이 Transwell 분석과 같은 다른 생체 기술의 단점을 피할 수 있습니다. 이러한 섬유 아세포와 같은 이러한 모델에서 기질 세포의 포함은, 악성 침윤과 전이 3-4 조절에 종양 미세 환경의 필수적인 역할을 반영하지만 기질의 표현형 이질성은하다의 Organotypic의 생리 학적 관련성을 최대화하기 위해 모델, 장기 별, 해부학 적으로 정확한 생체가능하면 3,6 섬유 아 세포가 포함되어야한다. Organotypics 종양 및 간질 세포 사이의 상호 작용을 연구 할 수있는 다양한 플랫폼이며, 점점 화학 억제제의 종양 침윤에 미치는 영향 및 표적 유전자 변경 7,8를 검사하는 새로운 방법으로 사용된다. 침략 종양 마진을 공부하는 것은 특히 흥미로운 전망이다. 의 Organotypic 모델 확립 결장암 (CRC) 세포주는 일반적으로 잘 성층 상피 층을 생산하고, 단면에서, 세포 외 기질 (ECM)를 침입 할 수있는 능력을 획득 한 세포가 쉽게 식별 할 수있다. 레이저 미세 절제를 사용하여 분리를 공부하고이 세포를 추출 종양 및 생체 내에서 종양 관련 기질 세포의 설립 마이크로 지형 이성의 빛으로, 대장 암 전이의 기원에 관한 중요한 생물 학적 통찰력을 보여줄 수 있습니다, 어떻게보다 효율적으로 될 수있다 대상. 나는N 다음과 같은 방법론은 조직의 동의서를 작성 샘플을 제공하고, 연구를 기증 한 모든 환자는 지역 연구 윤리위원회 기관에 의해 승인되었습니다.

<table><tbody><tr><td>대장암 세포주 - 예시: SW480</td>, <td>ATCC</td>, <td>ATCC, CCL-228</td><td></td></tr>, <tr><td>콜라겐</td>, <td>BD, Biosciences</td><td>, 354265</td><td></td></tr>, <tr><td>Matrigel</td>, <td>BD, Biosciences</td><td>, 354234</td><td></td></tr>, <tr><td>나일론, 멤브레인</td>, <td>Merck, Millipore</td><td>, VVLP01300</td><td></td></tr><tr><td>, 메탈 그리드</td><td>, The Mesh Company</td>, <td>WSS20-A4</td>, <td>themeshcompany.com</td></tr><tr><td>레이저 microdissection platform</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica AS LMD</td><td></td></tr><tr><td>Membrane mounted slides</td><td>분자 소자</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet</td><td>Merck Millipore</td><td>1052350025</td><td></td></tr></tbody></table>

분자 대장 암 세포의 3 차원 모델의 침윤성 종양 미세 환경의 프로파일 및<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 섬유 아세포

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

대장 암에 침입 (CRC) 세포는 자신의 여동생 세포에서 무료로 휴식 기질에 침투하고, 세포 외 기질 (ECM)를 개조 할 수있는 능력을 획득했다. 세포의 표현형이 서로 다른 그룹의 생물학을 특성화하는 것은 실질적으로 전이 놓기 동안 초기 사건에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 종양의 침략 악성 상피 암 관련 기질 사이의 양방향 상호 작용에 의해 촉진 역동적 인 과정이다. 우리는 공동의 문화와 레이저 마이크로 해부 기술의 Organotypic을 결합했다 종양의 기질 인터페이스에서 세포 고유의 반응을 조사하기 위해. 이러한 섬유 아세포와 같은 주요 기질 성분 3 dimentioanally 암 상피 세포와 공동 배양 된의 Organotypic 모델, 가까운 산도에서 공부하는 침략과 암 - 기질 상호 작용을 가능하게 높은 처리 가능한 실험 도구입니다ysiological 조건. 레이저 미세 절제 (LMD)는 미크론 수준의 정밀도를 가진 종양 조직 내에서 다양한 계층의 외과 절개 및 추출을 수반하는 기술입니다. 게놈 transcriptomic과 성적인 프로파일과 이러한 기술을 결합함으로써 우리는 종양 세포를 침입 및 간질 조직을 주변의 분자 특성에 대한 깊은 이해를 개발하고, 그렇게함으로써 잠재적으로 새로운 바이오 마커 및 CRC에있는 약물 개발을위한 기회를 공개하는 것을 목표로하고 있습니다.

우리는 CRC 세포주 및 간질 세포의 여러 조합에 상기 방법을 적용했다. 여기에 제시 한 예는 인간의 기본 생체 대장 섬유 아세포와 상피 CRC SW480 세포주이다. 3 차원의 공동 문화는 침략 종양 전면 세포 사이의 차등 발현의 miRNAs의 비교 현미경과 레이저 캡처 미세 절제 (그림 2)을 실시한다 (그림 1), 건설 및 마이크로 RNA (miRNA의) 프로파일 (그림 3)에 의해 분석 성층 (비 침입) 종양 영역에서 그. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51475/51475fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51475/51475fig1.jpg" /> 그림...

합성, 조직 공학 대장 암 모델에서 레이저 microdissected 세포 및 기질의 분자 프로파일은 침습적 전방 및 암 관련 기질 세포에서 종양 세포 간의 계면에서 독특한 생물학을 특성화하고 해부 소설과 같은 처리 방식을 나타낸다.

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 침습적 종양 전면의 악성 상피 세포와 암 관련 기질 세포 사이의 접점에서 나타나는 독특한 생물학적 특성을 규명하는 것입니다. 이는 우선 결장 이식물로부터 일차 섬유아세포 배양물을 구축함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 일차 결장 섬유아세포와 배양된 대장암 세포를 사용하여 기관형 공동 배양 모델을 구축하는 것입니다.다음으로 장기모사 모델을 고정하고 절편화하여 멤브레인이 부착된 슬라이드에 올린 후 크리스탈 바이올렛으로 염색합니다. 마지막 단계는 레이저 미세절제술을 통해 침습성 종양 세포를 비침습성 종양 세포 및 암 관련 기질 세포와 분리하는 것입니다. 최종적으로, 분자 프로파일링 기술을 사용하여 침습성 및 비침습성 종양 세포와 주변 종양 미세환경의 기질 세포에 대한 생물학적 특성을 분석할 수 있습니다.우리는 대장암의 3차원 장기모사 공배양 모델에서 침습 세포가 비침습 세포와 얼마나 명확하게 구별되는지를 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 우선, 실험실 내의 외과 수술실에서 정상 인간 결장 점막 조직 샘플을 직접 확보하십시오. 10 centimeter 조직 배양 접시 중앙에 검체를 배치한 후, 페니실린, 스트렙토마이신 및 펀지존이 첨가된 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 배양물을 3회 세척하십시오.멸균 핀셋과 메스로 마지막 세척 후 흡입하지 말고, 조직을 작은 조각으로 자릅니다. 그런 다음 각 조각을 메스 날로 그린 십자 표시의 중심에 놓습니다. 12-웰 플레이트에서 메스를 조직 위로 가볍게 흔들어 조직이 배양 접시 바닥에 부착되도록 합니다.조직이 뜨지 않고 완전히 잠길 수 있도록 750 µL의 1차 섬유아세포 성장 배지에 표본을 넣습니다. 그런 다음 표본을 37 °C, 5~10% CO2 인큐베이터에 넣고 5일 동안 배양합니다. 약 7일이 지나면 섬유아세포가 조직의 가장자리에서 서서히 자라나기 시작합니다.이는 약 3~4주 후에 더 뚜렷하게 관찰될 것입니다. 그리고 충분한 섬유아세포가 성장했다면, 세포가 탈락한 후 각 웰에 750 µL의 trypsin을 첨가하고, 이를 수집하여 섬유아세포가 포함된 기관형 겔(organotypic gel) 제작을 위해 T 25 조직 배양 플라스크로 옮깁니다. 먼저, 보충된 dmm 내에 겔당 500,000개의 세포를 포함하는 섬유아세포 세포 현탁액을 준비하십시오.텍스트 프로토콜에 기재된 비율에 따라 9개의 겔을 만들기 위해, 겔당 1mL 기준으로 얼음 위에서 장기 배양 겔(organotypic gels)을 조제합니다. 10mL를 준비하고 기포가 생기지 않도록 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 24-웰 플레이트의 각 웰에 1mL씩 넣고 가습된 환경의 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.겔이 한 시간 동안 굳은 후, 겔 위에 1 mL의 보충된 DM EM을 추가하고 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 겔 상단의 배지를 흡입하여 제거하고, 500,000개의 대장암 상피 세포가 포함된 배지 1 mL를 겔 코팅된 나일론 시트에 플레이팅합니다.멸균된 포셉을 사용하여 1.5 centimeter x 1.5 centimeter 크기의 멸균 오토클레이브 나일론 시트를 미리 준비합니다. 필요한 수량의 나일론 시트를 10 centimeter 배양 접시에 넣습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 얼음 위에서 겔 혼합물을 준비하고, 용액이 중화되었음을 나타내는 분홍색으로 변할 때까지 0.1 molar 수산화나트륨을 겔 혼합물에 첨가합니다.그런 다음, 각 나일론 시트에 이 용액 250 µL를 추가합니다. 이어서 겔이 굳을 수 있도록 5% CO2 습윤 분위기의 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 10 cm 배양 접시에 PBS에 희석한 1% glutaraldehyde 용액 10 mL를 추가합니다.젤이 굳으면 4°C에서 1시간 동안 배양한 후, 나일론 시트를 PBS로 3회, 보충된 dme로 1회 세척합니다. 스테인리스 스틸 시트를 삼각대 형태로 접어 준비한 멸균 침습 지지체 격자 위에 오가노티픽 젤을 올리기 위해, 동일한 완충액에서 4°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 그 다음, 멸균된 핀셋과 에탄올을 사용하여 6-웰 플레이트의 각 웰에 스틸 격자를 배치합니다.콜라겐 면이 위로 향하도록 젤이 코팅된 나일론 시트를 각 그리드 위에 배치합니다. 멸균된 에탄올 처리 스파출러를 사용하여 24웰 플레이트에서 오가노타이픽 젤을 들어 올려진 나일론 시트로 조심스럽게 옮깁니다. 나일론 시트가 배지에 닿되 잠기지는 않을 정도로 보충된 D mem을 웰에 채웁니다.배지가 기관형 겔(organotypic gel)에 닿지 않도록 주의하십시오. 5%CO2의 습윤한 상태에서 37°C로 14일 동안 배양합니다. 배지는 2일마다 교체하십시오.나일론 시트를 포함한 전체 조직 배양물을 웰에서 제거하여 랩(clinging film) 위에 놓습니다. 깨끗한 일회용 메스를 사용하여 조직 배양물과 나일론 시트를 이등분하고, 두 조각 모두를 포르말린에 24시간 동안 고정합니다. 24시간 후 실온에서 포르말린을 70% ethanol로 교체하고 하룻밤 동안 방치한 다음, 파라핀 임베딩, 절편 제작 및 염색을 거쳐 레이저 미세 절단(laser microdissection)을 수행합니다.먼저, 10 µm 두께의 장기 유사 조직 절편을 막 장착 슬라이드 위에 올립니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 절편을 처리한 후, 선택한 플랫폼을 사용하여 레이저 미세 절단(laser microdissection)을 수행할 준비를 합니다. 미세 절단할 염색 절편이 부착된 유리 슬라이드를 배치합니다.현미경 스테이지 위에 0.5 mL 마이크로 원심분리 튜브를 수집 카세트에 엎어 놓은 상태로 장착하고, 직접 시야 하에 미세 절제된 조직이 수집될 튜브 캡 내부에 세포 용해 버퍼 50 µL를 첨가합니다. 조이스틱을 사용하여 관심 조직을 식별하고, 소프트웨어 인터페이스를 통해 염색된 유기 절편에 주석을 달아 종양 침습 전면에서 미세 절제할 세포들을 표시합니다. 레이저 발사를 지시하면, 표시된 구역이 절단됨과 동시에 미세 절제된 조직이 마이크로 원심분리 튜브의 캡 내부로 튕겨 들어갑니다.관심 분석물을 추출하기 위해 적절한 방법으로 샘플 처리를 진행합니다. 여기서는 장기 모사 기질로 침습하는 SW 480 대장암 세포의 레이저 미세절단 이미지가 표시되어 있습니다. 대장암 상피세포를 강조하기 위해 크레설 바이올렛(Crestal violet)이 사용되었습니다.그 후 레이저 절단이 이루어지기 전에 침습성 종양 섬(invasive tumor islands)을 정의하고, 절단된 조각을 수집 장치로 운송합니다. 비침습성 세포와 기질 세포 또한 동일한 방법론을 사용하여 식별 및 분리합니다. 3차원 공동 배양물은 microRNA 프로파일링을 통해 분석되었으며, 이를 통해 침습성 종양 전면의 세포와 층상 종양 구역 내 세포 간의 차등 발현 microRNA를 비교하였습니다.데이터는 전체 변화량 및 2배 증가 또는 감소 이상의 데이터 값으로 분류되었습니다. 대표적인 실험 결과의 변화량은 침습성 경계 세포와 비침습성 경계 세포 간의 micro RNA 유전자 발현 차이를 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후, 해부학적으로 적절한 기관형 모델을 구축하는 방법과 레이저 미세절단법을 사용하여 추가 연구를 위한 개별 세포 집단을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

molecular-profiling-invasive-tumor-microenvironment-3-dimensional

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

그러면 표면 항원 (DotScan CRC microarray)를 인식 맞춤 항체 microarrays에 캡처되어 가능한 단일 세포를 생산하는 대장암 (CRC)의 disaggregation에 대한 절차를 설명했다. microarray에 바인딩된 세포의 하위 인구는 형​​광 염료와 태그 단클론 항체를 사용하여 형광 멀티플렉싱하여 프로파일 수 있습니다.

항체 Microarray 및 형광 멀티플렉싱을 사용하여 대장암 세포 표면 단백질 프로파일

우리는 그들의 microenvironment에서 유방 종양 세포와 다른 세포 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징을위한 3D coculture 모델을 개발했습니다 그 침략적 표현형에 충격 진행. 이 모델들은 invasiveness에 연루 paracrine 유발 proteolytic, 케모카인 / 시토킨 및 키나제 경로를 타겟으로하는 의약품에 대한 잠복기 화면으로 사용할 수 있습니다.

종양의 4D 라이브 세포 이미징을위한 MAME 모델 : Microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행

이 비디오는 미크론 수준의 정밀도로 3D 유기형 공동 배양 모델의 레이저 해부를 설명합니다. 3D 유기형 모델에서는 섬유아세포와 같은 기질 성분이 암 상피 세포와 3차원으로 공동 배양됩니다. 3D 모델은 생리학적 조건에 가까운 조건에서 침입 및 암-기질 상호 작용을 연구할 수 있는 실험 도구 역할을 합니다.

레이저 미세해부: 3D 유기형 배양 모델에서 침입하는 대장암 세포를 분리하는 기술

조직 공학 섬유 아세포 유래 기본 행렬은 상피 세포의 증식과 분화를 지원하는 기질 기판을 생성하는 새로운 도구입니다. 이곳에서 종양 세포 생물학에 다른 간질 세포 유형의 영향을 평가하기 위하여이 방법을 적용하는 프로토콜이 제시된다.

암 세포의 침략에 응용 프로그램을 사용하여 종양의 기질 미시의 조직 공학

이 문서는 유방암 세포의 침입을 정량화하는 3 차원 (3D) 분석의 사용에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 특히, 우리는 세포가 침입 할 때 발생하는 멤브레인 무결성의 손실을 검사하는 등의 분석을 설정하는 데 필요한 절차, 정량화 및 데이터 분석뿐만 아니라 방법에 대해 설명합니다.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

여기에서는 다세포 상호 작용 및 암세포 행동의 세포 외 기질 의존적 조절을 조사하는 데 유용한 3차원에서 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 실험 모델에서는 인간 암 관련 섬유아세포가 내장된 콜라겐 겔에서 암세포를 배양합니다.

종양 기질 상호 작용에 대한 세 가지 차원의 공동 문화 모델

우리는 산소와 영양분을 전달하기 위해 관류 생물 반응기 시스템을 사용하여 배양할 수 있는 3D 유방암 대리모를 생성하는 방법을 시연합니다. 성장 후, 대리모는 관심 매개변수의 평가를 위해 고정되고 파라핀으로 처리됩니다. 이러한 매개 변수 중 하나 인 세포 밀도의 평가가 설명됩니다.

준비 및 분석<em&gt; 체외</em&gt; 3 차원 유방 암 서로 게이트

여기, 우리는 기본 유 방 암 세포 뿐만 monocytes 그리고 콜라겐 저하, 면역 세포 모집, 셀 결과 함께 그들의 직접/간접적인 상호 작용 연구로 형태를 분석 하는 3 차원 문화 방법 설명 침공, 그리고 암 관련 된 염증의 승진.

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

이 프로토콜의 목표는 면역 형광, 전사와 같은 다른 분석 시스템에서 해결 될 수있는 종양 벌크와 같은 환경에서 암 관련 섬유 아세포 (CAFs)의 분화를 연구하는 3D 체외 모델을 확립하는 것입니다. 분석 및 생명 세포 화상 진찰.

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

이 프로토콜은 Caco2 결장 아데노암종 세포에서 3차원 스페로이드를 생성하고 성장시키는 새로운 견고하고 재현 가능한 배양 시스템을 제공합니다. 결과는 화학요법에 대한 반응을 포함하여 암 줄기 세포 생물학을 공부하는 이 접근의 적합성을 위한 개념증명을 제공합니다.

대장암 줄기세포를 연구하는 스페로이드의 3차원 모델

암 전이를 연구하기 위해 이세포성 누화를 캡처하는 3D 암 모델이 매우 필요합니다. 우리의 연구는 침입 및 세포 공간 분포를 연구하는 데 사용할 수 있는 골격 및 골격이 없는 환경에서 이종 다세포 기질-상피의 생성을 제시합니다.

상피암 세포의 스캐폴드가 없는 3D 배양에서 이종다세포 기질 세포(Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion)

배우세요 대장암 침윤성 종양 전선에서 악성 상피세포와 암 관련 기질세포 간의 생물학적 특성을 프로파일링하는 방법을 레이저 미세절단과 오가노타이픽 공배양 모델을 사용하여 연구하세요.

분자 대장 암 세포의 3 차원 모델의 침윤성 종양 미세 환경의 프로파일 및

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