만성 신장 질환 환자에서 혈관 기능의 평가

다음 실험의 전반적인 목표는 만성 신장 질환 환자의 혈관 기능을 평가하는 것인데, 이는 먼저 환자로부터 혈관 내피 세포를 수집하여 달성됩니다. 그런 다음 대동맥 맥파 속도를 평가하여 큰 탄성 동맥 강성을 측정합니다. 다음으로, 혈관 내피 기능을 평가하기 위해 상완 동맥 흐름 매개 확장(brachial artery flow mediated dilation)을 측정합니다.

궁극적으로 혈관 내피 기능을 특징짓는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 다양한 단백질의 발현에 대해 세포 수준에서 어떤 일이 일어나는지와 같은 혈관 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 초음파 영상을 마스터하기 위해 광범위한 연습과 훈련이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구 조교인 로니 페리노(Lonnie Perino)입니다. 시작하려면 국소 방부제로 사이트를 준비하십시오. 다음으로 현장 위에 멸균 천공 커튼을 놓습니다.

훈련된 간호사 또는 의사가 IV를 삽입하고 간암 잠금 어댑터를 부착해야 합니다. 커튼에 두 개의 J 와이어를 놓아 J 모양을 풉니다. 두 전선에서 J의 호를 당깁니다.

코일이 풀리면 간봉 잠금 장치의 캡을 풀고 JWI를 약 8cm 정맥에 공급합니다. 와이어에 너무 많은 피가 쌓이지 않도록 제거하기 전에 와이어를 앞뒤로 여러 번 누르십시오. 다음으로, 와이어 커터를 사용하여 와이어를 잘라 약 30ml의 해리 버퍼가 들어 있는 50ml 원추형 튜브에 맞도록 합니다.

샘플 수집이 완료되면 두 번째 와이어에 대해 이 단계를 반복합니다. 습식 실험실로 돌아갑니다. 한 쌍의 집게로 와이어를 잡고 튜브 내부와 용액 위에 10분 동안 유지합니다.

전동 피펫터를 사용하여 튜브의 해리 버퍼로 와이어를 헹굽니다. 버퍼를 풀어 와이어 길이를 따라 흐르도록 하고 과도한 액체를 튜브로 털어냅니다. 와이어를 제거하고 샘플을 펠릿으로 원심분리합니다.

원심분리 전에 샘플을 회수하고 펠릿을 PBS에 다시 현탁시킵니다. 그 후 추가로 5분 동안 흡입 호스 끝에 있는 피펫 팁을 사용하여 튜브에 약 2ml를 남겨둡니다. 펠릿을 방해하지 않고 나머지를 진공 청소기로 청소하십시오.

펠릿을 재현탁하고 이전에 라벨링된 8개의 슬라이드의 타원형 영역에 샘플을 고르게 피펫팅합니다. 슬라이드를 섭씨 37도의 인큐베이터에 5시간 동안 놓은 후 분석을 시작할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 피험자는 일회용 반바지로 갈아입고 조용하고 어둡고 기후가 조절되는 방에 누워있어야 합니다.

시작할 준비가 되면 초음파용 전극과 동맥 경직 장치를 배치합니다. 다음으로, 피험자에게 혈압 커프를 놓습니다. 20분 후에 혈압 판독을 시작하고 측정값이 수은에서 5mm 이내가 될 때까지 판독값을 반복합니다.

각 읽기 사이에 2분을 쉬고 최소 3분을 수행합니다. 다음으로 상완 동맥 맥박을 촉진하고 상완 파형을 기록하기 위해 초음파계를 배치합니다. 요골 동맥, 대퇴 동맥 및 경동맥에 대해 반복합니다.

, 요골동맥, 경동맥은 줄자를 사용하고 대퇴동맥은 맞춤형 자를 사용하여 상흉골 노치에서 각 부위까지의 거리를 측정합니다. 다음으로, 특수 소프트웨어를 사용하여 경동맥, 상완 경동맥 요골 및 경동맥 대퇴 맥파 속도를 계산합니다. 팔뚝 혈압 커프를 reon 과정의 원위부에 놓습니다.

혈관 소프트웨어를 트리거 모드로 설정하고 기준선 상완 동맥, 초음파 이미지 및 혈류 속도 측정의 최소 10개의 심장 주기를 기록합니다. 원하는 경우 기계 암을 사용하여 초음파 프로브를 고정할 수 있습니다. 다음으로, 팔뚝 혈압 커프를 수은 250mm로 팽창시킵니다.

그리고 타이머를 시작합니다. 참가자에게 매우 가만히 있으라고 지시합니다. 타이머가 4분 45초 트리거를 가리키면 속도 기록을 시작합니다.

5분에 커프를 풀고 초음파를 변경하여 B 모드 이미지를 기록합니다. 시계가 5분 10초를 가리키면 시계가 7분을 가리킬 때까지 계속 녹음합니다.

다음으로 피험자의 혈압을 측정합니다. 수축기 혈압이 수은 100mm 이상일 경우, 설하 니트로글리세린 0.4mg을 피험자의 혀 밑에 놓고 타이머를 시작한다. 시계가 3분을 가리키면 B 모드 녹음을 시작하고 녹음을 중지합니다.

시계가 8분을 가리키면 염색된 내피 세포를 분석하기 위해 단일 맹검 실험자가 슬라이드를 체계적으로 스캔해야 하며, 내피 세포는 VE cadherin에 대한 양성 염색으로 식별되고 핵 무결성은 dapi에 대한 양성 염색으로 확인되어야 합니다. 또한, 세포는 관심 단백질에 대해 염색되어야 합니다.

나중에 분석할 수 있도록 슬라이드당 총 30개의 셀을 이미지화해야 합니다. VE 대조군 슬라이드를 포함하여 염색된 배치의 각 슬라이드에 대해 이 과정을 반복합니다. 정성적 소프트웨어는 1차 관심 항체에 대한 염색 강도를 분석하는 데 사용됩니다.

이 이미지는 2분 동안 커프를 풀어준 후 만성 신장 질환 환자를 평가하는 동안 얻은 기준선 상완 동맥 직경을 보여줍니다. 이 기록은 R파 게이트 직경의 변화를 보여줍니다. 이러한 파형은 경동맥과 대퇴동맥 각각에서 얻어졌습니다.

시간과 거리의 차이는 대동맥 맥파 속도의 보고를 계산하는 데 사용되었습니다. 여기서, 대조군 및 환자 세포는 VE cadherin을 사용한 DPI 내피 세포 발현 및 산화 효소 N-A-D-P-H 산화효소에 대한 핵 무결성을 분석했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 정확하고 정량적인 평가를 위해 가능한 최고 품질의 초음파 이미지, 파형 및 내피 세포 이미지를 얻는 것이 중요합니다.

인간 샘플로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.