Name: 제한 효소 기반의 복제 방법을 평가하기 위해 시험관 HIV-1 서브 타입 C 개그 - MJ4 키메라 바이러스의 복제 능력 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 학습하세요 환자 유래 gag 유전자를 HIV-1 MJ4 플라스미드에 클로닝하여 시험관 내 복제 능력을 평가하는 방법을. 방사성 표지 역전사효소 분석으로 바이리온 생성을 정량화하여 HIV-1 병원성 메커니즘을 규명합니다.

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연구자들은 이 연구에 참여한 잠비아의 모든 자원봉사자들과 이 연구를 가능하게 해준 루사카의 잠비아 에모리 HIV 연구 프로젝트의 모든 직원들에게 감사를 표합니다. 조사관들은 기술 지원과 검체 관리에 대해 Jon Allen, Smita Chavan 및 Mackenzie Hurlston에게 감사의 뜻을 전합니다. 또한 GXR25 세포에 대한 논의와 관대한 기부에 대해 Mark Brockman 박사에게 감사드립니다.
이 연구는 R01 AI64060 및 R37 AI51231(EH) 및 국제 AIDS 백신 이니셔티브의 지원을 받았습니다. 이 작업은 미국 국제개발처(USAID)를 통한 미국 국민의 관대한 지원에 의해 부분적으로 가능했습니다.내용은 연구 저자의 책임이며 반드시 USAID 또는 미국 정부의 견해를 반영하는 것은 아닙니다. 이 연구는 또한 에모리 에이즈 연구 센터(Emory Center for AIDS Research)의 바이러스학 코어(Virology Core, Grant P30 AI050409)의 지원을 받았습니다. DC와 JP는 Action Cycling Fellowships의 일부 지원을 받았습니다. 이 연구는 Yerkes National Primate Research Center 기본 보조금(2P51RR000165-51)의 일부 지원을 받았습니다. 이 프로젝트는 또한 National Center for Research Resources P51RR165에서 부분적으로 자금을 지원받았으며 현재 Office of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132의 지원을 받고 있습니다.

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인해 길이 및이 프로토콜의 기술적 특성상 키메라 개그-MJ4 플라스미드의 성공적인 구조 모두에 중요뿐만 아니라 바이러스 복제 용량의 정량 용으로 여러 가지 방법이 있습니다. 이 프로토콜에 설명 MJ4에 외국 개그 유전자의 도입에 대한 제한 효소 기반의 복제 전략은 이전에 사용 된 재조합 기반 방법에 비해 많은 장점을 가지고 있지만 중요한 단계가 정확하게 준수하지 않을 경우, 프로토콜은 기술적으로 문제가 될 수 있습니다. 첫째, DCM 및 댐 DNA의 methylases 결여 유능한 균주 생성 된 MJ4 플라스미드 DNA를 사용하는 것이 절대적으로 필수적이다. 이것은 MJ4 백본에 개그 유전자를 복제하는 데 사용되는 BclI의 제한 효소의 효소 활성 등 필요 댐 / DCM 메틸화를 구분합니다. JM110와 SCS110 (ENDA 부정적인 JM110 유도체) E. 대장균 균주MJ4 메틸화 플라스미드 DNA를 생성하기에 적합한 재. ...

호스트와 HIV-1 병인과 병의 진행이 합리적인 백신 설계를위한 가장 중요하다 영향을 바이러스의 특성을 모두 결정. 세포 성 면역 반응은 HIV-1 감염에 대한 인간의 면역 반응의 핵심 구성 요소입니다. 세포 독성 T 림프구 (CTL)는 급성 바이러스 혈증의 초기 제어에 필요한, 및 호스트가 정상 상태 (설정치) 1,2 바이러스 부하를 확립 할 수있다. 이 이펙터 세포의 실험 고갈 바이러스 제어 3,4의 손실이 발생합니다. 그럼에도 불구하고, 돌연변이가 바이러스처럼 감염된 세포 5-9의 CTL 인식을 파괴하는 바이러스 게놈 내에서 발생 탈출. 특정 HLA 대립 유전자는 낮은 바이러스 부하와 B * 57, B * 27와 B * 81 ~ 15를 포함하여 느린 질병의 진행과 관련이있다. HLA 클래스 I 대립 유전자의 보호 효과의 부분들은 같은 개그 같은 게놈의 기능적 제한 지역을 대상으로한다는 사실에 기인 할 수있다체외 16-21에 복제하는 바이러스의 능력을 감소 탈출 돌연변이 선택합니다. 세포 면역 시스템으로부터의 탈출 내가 대립 선택 HLA 클래스의 맥락에서 바이러스에 유익하지만, 이러한 돌연변이의 효과는 HLA-일치하지 않는 22, 23 개인에게 전송시 호스트에 대한 차등 결과를 초래할 수 있습니다. 따라서, 바이러스 복제 능력에 전송 HLA 관련 탈출 돌연변이의 영향을 이해하는 것은 초기 HIV-1 병인에 대한 우리의 이해를 증진하는 것이 중요 할 것입니다. 많은 진전이 나는 24-29을 대립 유전자 특정 HLA 클래스와 연관된 개별 탈출 돌연변이의 피트니스 결함을 식별하고 특성화하기 위해 만든 하였지만, 자연적으로 HIV-1 균주는 HLA-관련 유전자 다형성의 독특하고 복잡한 발자국 가능성이 HLA에서 발생, 한 발생 다른 immunogenetic 배경 30 - 매개 면역 압력. AP에서revious 분석, Goepfert 등. 88 심하게 감염된 잠비아 유래의 개그 송신 시퀀스에서 HLA-관련 돌연변이의 축적이 설정치 바이러스 부하 (31)의 감소와 연관된 것으로 나타났다. 이 HLA-일치하지 않는받는 사람에게 특히 개그에 해로운 탈출 돌연변이의 전송, 임상 적 혜택을 제공하고, 바이러스 복제를 감쇠로 인해 수 있다는 것을 제안했다. 나아가, 이러한 복제 용량, 초기 복제가 차례로 HIV-1 임상 매개 변수와 마지막 단계에 영향을 미칠 수있는 방법으로 전송 된 바이러스의 특성을 정의하는 콘서트에서 작동하는 방법을 복잡 개그 다형성의 조합 자연적으로 발생하는 균주 내에서 공부하는 것이 필수적입니다 병인. 브록 등은. 첫번째 서브 타입 C와 B 모두에서 감염의 만성 감염 단계 및 바이러스 부하 중에 고립 개그 프로 서열의 복제 능력 사이의 링크를 입증32 ~ 35. 이 연구에서 제시하는 실험적인 접근 방식, 만성적으로 감염된 사람에서 파생 된 시퀀스의 체외 복제 능력을 조사하기위한 있지만 적절한은 심하게 감염된 개인 어려운 서브 타입 C에서 HIV-1 증식 및 용량을 공부 할 수있는 여러 가지 기술주의 사항 및 제한 사항이 있습니다. 이 방법은 LAV에서 일부 파생 된 서브 타입 B NL4-3의 프로 바이러스로 인구 기반의 PCR 증폭 시퀀스의 재결합에 의존 연구소는 바이러스 스톡 (36)을 적용. 바이러스의 생성은 PCR 증폭 산물과 CEM 기반 T 세포 라인 (37)의 공동 형질 감염에 의해 달성 및 델타 개그 프로 NL4-3 DNA를 소화시켰다. 이 방법은 잠재적으로 생체 내에서 바이러스 quasispecies 관련 회수 바이러스 스톡의 성격을 기울이기 때문에 생체 외에서 복제 능력의 측정을 변경, 주 개월의 기간에 걸쳐 바이러스의 파생물을 필요로한다. 이 방법의 난만성적으로 감염된 개인의 다수로부터 다수의 상이한 바이러스 변이체를 복제 효과적으로 증식 및 높은 용량 바이러스를 선택하는 경우, 만성적으로 감염된 개인을 연구하고, 여기서 더 적합한 s의 것은 가능하므로 상당히 노동 집약적이고 아니다. 그러나, 심하게 감염된 개인에서, 일반적으로 1-2 변형이 존재하며, 따라서, 생체 외 선택 압력을 통해 회수 된 바이러스 스톡의 성격을 기울일의 위험을 제거하는, 시험 관내 복제 능력의 더 정확한 평가를 허용한다. 둘째,이 방법은 하위 B 파생 백본으로 서브 타입 C 개그 프로 시퀀스를 재결합이 필요하며, 분석에 백본 호환성 편견을 소개 할 수있다. 이러한 한계로 인해, 다수 서열이 도입 잠재적 인 편견을 극복하기 위해 분석되어야한다. 여기에서 우리는 또 다른 실험 아프로을 설명서브 타입 C 심하게 감염된 개체로부터 유래 된 서열을 연구 적절한 ACH. 우리는 서브 타입 C의 프로 바이러스 백본, MJ4에 HIV-1 아형 C 감염된 개인의 급성 감염 시점에서 파생 된 개그 유전자를 도입하는 제한 효소 기반의 복제 전략을 사용합니다. 개그 유전자를 복제하는의 일반적인 백본 MJ4의 사용은 서브 타입 C 파생 시퀀스의 분석을 위해 매우 중요합니다. MJ4 인해 백본 및 개그 유전자 사이의 하위 호환성에 바이어스를 소개하는 거의 없을 것입니다 따라서 기본 분리 38에서 유래하고있다. 프로 바이러스를 293T 세포에 직접 형질 감염 될 구축하고, 클로닝 개그 서열 동일한 클론 바이러스 스톡의 복구를위한 또, 제한 효소 기반 복제를 사용하는 방법은 허용한다. 아래에 제시된 방법은 유도 개그-MJ4 서브 타입 C의 복제 능력을 평가하기위한 높은 처리 방법키메라 바이러스. 293T 세포로 형질 간단하고 바이러스의 회수는 단지 세 일이 걸린다. 관내 복제 용량. 브록 등에 의해 작성된 동일 CEM-CCR5 기반 T 세포 라인 (37)을 정량하지만, 성공적인 복제를 위해 필요한 중요한 프로토콜의 수정을 사용 서브 타입 C MJ4 키메라 바이러스. 오히려 PBMC를보다 적절한 T-세포주의 사용은 높은 분석 재현성 테스트되는 서브 타입 C-MJ4의 키메라 바이러스의 다수 허용한다. 마지막으로, 상청액에서 바이러스의 정량화를위한​​ 방사성 표지 된 역전사 효소 분석을 사용하여 시판 P24 ELISA 키트를 사용하는 것보다 더 비용 효율적이다. 또한 동일한 분석 내에서 모두 좋지 높은 복제 바이러스를 검출하고 분리 복제 사이에 미묘한 차이를 검출하기위한 중요한 높은 동적 범위를 제공한다. 결론적으로, 여기에 제시된 방법은 허용하고있다HIV-1 아형 C에서 파생 된 개그 시퀀스의 복제 능력에 대한 심층적 인 연구는 급성 잠비아에서 개인을 감염, 및 서면으로, 또한 C는 인구를 감염 다른 하위 유형을 연구하기 위해 확장 될 수있다. 다른 개그 균주 간의 복제 용량의 변화의 높은 수준이 관찰되었다. 또한, 우리는 3 년 동안 39 이상 CD4 + 하락 전송 개그의 복제 용량 및 설정치 바이러스 부하 사이뿐만 아니라와 통계적 연관성을 보여줄 수 있었다. 이러한 결과는 복제, 용량 등의 방법에 전송 된 바이러스의 특성을 공부의 중요성을 강조 초기 감염시 발병에 영향을 미칠 수있는 호스트의 면역 시스템과 상호 작용하고 효과적인 백신 개입뿐만 아니라 치료를 개발하기위한 통합 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">PCR 시약</td></tr><tr><td>GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>맞춤형 올리고</td><td>25 nmol, 표준 탈염</td></tr><tr><td>VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>맞춤형 올리고</td><td>25 nmol, 표준 탈염</td></tr><tr><td>GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>맞춤형 올리고</td><td>25 nmol, 표준 탈염</td></tr><tr><td>BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>맞춤형 올리고</td><td>25 nmol, 표준 탈염</td></tr><tr><td>MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>맞춤형 올리고</td><td>25 nmol, 표준 탈염</td></tr><tr><td>MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>맞춤형 올리고</td><td>25 nmol, 표준 탈염</td></tr><tr><td>BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'</td><td>IDT DNA</td><td>맞춤형 올리고</td><td>25 nmol, 표준 탈염</td></tr><tr><td>GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>맞춤형 올리고</td><td>25 nmol, 표준 탈염</td></tr><tr><td>For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>맞춤형 올리고</td><td>25 nmol, 표준 탈염</td></tr><tr><td>GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>맞춤형 올리고</td><td>25 nmol, 표준 탈염</td></tr><tr><td>Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>맞춤형 올리고</td><td>25 nmol, 표준 탈염</td></tr><tr><td>Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCCA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>맞춤형 올리고</td><td>25 nmol, 표준 탈염</td></tr><tr><td>CoolRack PCR 96 XT</td><td>살생물</td><td>BCS-529</td><td></td></tr><tr><td>CoolRack M15</td><td>살생물</td><td>BCS-125</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제 자유 물</td><td>피셔</td><td>SH30538FS</td><td>Hyclone</td></tr><tr><td>QIA에서 제조한 바이러스 RNA 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Simport PCR 8 스트립 튜브, 파란색(플랫 캡)</td><td>Daigger</td><td>EF3647BX</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 원스텝 RT-PCR 시스템</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>12574035</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot-start II DNA 중합효소</td><td>Fisher</td><td>F-549L</td><td></td></tr><tr><td>PCR 뉴클레오티드 </td><td>Roche</td><td>4638956001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, 높은 젤 강도</td><td>Fisher</td><td>50-213-128</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>Promega 1kb DNA ladder</td><td>Fisher</td><td>PRG5711</td><td>Promega</td></tr><tr><td>Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel 및 PCR 클린업 시스템</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>면도날, Surgical</td> Design Thermocycler<td>에서 제조한</td>단일 모서리 <td>Fisher</td><td>12-640</td></tr>, <tr><td>PTC-200</td><td>MJ Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microbiology & 클로닝 시약</td></tr><tr><td>LB 한천, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수, Lennox</td><td>Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>멸균 100 x 15 mm 폴리스티렌 페트리 접시</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>암피실린 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 ml 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>352059</tr><tr><td>MIV 제한 엔도뉴클레아제</td><td>New England BioLabs</td><td>R0564L</td><td></td></tr><tr><td>BclI 제한 엔도뉴클레아제</td><td>New England BioLabs</td><td>R0160L</td><td></td></tr><tr><td>HpaI 제한 엔도뉴클레아제</td><td>New England BioLabs</td><td>R0105L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제, 5 U/&mu; l</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td></td></tr><tr><td>JM109 유능 셀, >108 cfu/&mu; g</td><td>Promega</td><td>L2001</td><td></td></tr><tr><td>PureYield 플라스미드 미니프렙 시스템</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18 centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Culture Reagents</td></tr><tr><td>Amphyl cleaner/disinfectant</td><td>Fisher</td><td>22-030-394</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD, 1 ml</td><td>VWR</td><td>PAE2311</td><td>Promega</td></tr><tr><td>Hexadimethrine bromide (Polybrene)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Costar 플레이트, 6-well, flat</td><td>Fisher</td><td>07-200-83</td><td>Corning Life Costar</td></tr><tr><td>Plates, 24-well, flat</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>Corning Life 제조</td></tr><tr><td>Costar 플레이트, 96-well, 라운드</td><td>Fisher</td><td>07-200-95</td><td>Corning Life</td></tr><tr><td>Flasks 제조, Corning 필터 상단/경사 넥, 75 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-37</td><td></td></tr><tr><td>플라스크, Corning 필터 상단/경사 넥, 150 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-34</td><td>Corning Life</td></tr><tr><td>Conical Tubes에서 제조, 50 ml, 파란색 캡</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>BD Biosciences</td></tr><tr><td>Conical Tubes에서 제조, 15 ml, 파란색 캡</td><td>Fisher</td><td>14-959-70C</td><td>BD Biosciences</td></tr><tr><td>제조 Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CI</td><td>Mediatech</td></tr><tr><td>RPMI에서 제조, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/ 스트렙토마이신/글루타민, 마그네슘 및 칼슘이 포함된 100x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 마그네슘 및 칼슘이 없는 500ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS Life</td><td>Technologies/Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Sarstedt 튜브, 다양한 색상</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.996</td><td></td></tr><tr><td>저장소 트레이 멀티 채널, 55 ml</td><td>Fisher</td><td>13-681-501</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Fisher</td><td>NC9691007</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 웰 클리어 V 바닥 조직 배양 처리 마이크로 플레이트</td><td>Fisher</td><td>07-200-96</td><td>Corning Life</td></tr><tr><td>HEPES에서 제조, 1 M 버퍼 솔루션</td><td>Life Technologies / Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 정의, 500 ml</td><td>Fisher</td><td>SH30070 03</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>VWR</td><td>PAV3941</td><td>Promega</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde, Grade II, H2O 25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1 M 염화마그네슘 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액, 분자 생물학용, 36.5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 헥사시아노페레이트(II) 삼수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9387-100G</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 헥사시아노페레이트(III)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P8131-100G</td><td></td></tr><tr><td>알레그라 X15-R 원심분리기</td><td>벡크만 쿨터</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>TC10 자동 세포 계수기</td><td>Bio-Rad</td><td>1450001</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision 도립 현미경</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reverse-Transcriptase Quantification Assay Reagents</td></tr><tr><td>dTTP, [&alpha;-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEG605H001MC</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-Cl, pH 8.0</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15568025</td> KOH 2 M 염화칼륨(KCl)<td>을 사용하여 pH 7.8로 조정해야 합니다</td></tr><tr><td></td><td>AM9640G</td><td>.</td><td> 1 M 용액</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Roche</td><td>11333941103</td><td></td></tr><tr><td>Polyadenylic acid (Poly rA) potassium salt&nbsp;</td><td>미들랜드 시약 (주)</td><td>P-3001</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) 프라이머</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td><td>시그마-알드리치</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>SR, 초고해상도 인광체 스크린, 소형</td><td>Perkin-Elmer</td><td>7001485</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Thermowell 96웰 플레이트 모델(M) 폴리카보네이</td>트 <td>Fisher</td><td>07-200-245</td><td>Corning Life에서 제조</td></tr><tr><td>Corning 96-well Microplate 알루미늄 밀봉 테이프, 비멸균</td><td>Fisher</td><td>07-200-684</td><td>Corning Life</td></tr><tr><td>제조 DE-81 음이온 교환지</td><td>Whatman</td><td>3658-915</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Autoradiography cassette</td><td>Fisher</td><td>FB-CA-810</td><td></td></tr><tr><td>사이클론 스토리지 형광체 스크린</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

제한 효소 기반의 복제 방법을 평가하기 위해<em&gt; 시험관</em&gt; hiv-1 서브 타입 c 개그 - mj4 키메라 바이러스의 복제 능력

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 발병 및 질병 진행에 대한 많은 HLA class I 대립유전자의 보호 효과는 부분적으로 HIV-1 게놈의 보존된 부분을 표적으로 삼는 능력에 기인합니다. 세포 면역 압력에 기인하는 염기서열 변화는 감염 중 게놈 전반에 걸쳐 발생하며, Gag와 같은 게놈의 보존된 영역 내에서 발견되는 경우 바이러스의 체외 복제 능력에 영향을 미칠 수 있습니다. Gag에서 HLA 불일치 수용자에게 HLA 결합 다형성이 전달되는 것은 설정점 바이러스 부하 감소와 관련이 있습니다. 우리는 이것이 바이러스의 복제 능력이 감소했기 때문일 수 있다는 가설을 세웠습니다. 여기에서는 HIV-1의 시험관 내 복제를 평가하기 위한 새로운 방법을 제시합니다. 이 방법은 제한 효소 기반 복제를 사용하여 gag 유전자를 일반적인 아형 C HIV-1 proviral backbone인 MJ4에 삽입합니다. 이는 만성적으로 파생된 개그-프로 염기서열의 체외 복제를 평가한 이전의 재조합 기반 방법보다 아형 C 염기서열 연구에 더 적합합니다. 그럼에도 불구하고, 이 프로토콜은 다른 아형의 바이러스 연구를 위해 쉽게 수정될 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 CEM 기반 T 세포주에서 Gag-MJ4 키메라 바이러스의 복제 능력을 평가하기 위한 강력하고 재현 가능한 방법을 자세히 설명합니다. 이 방법은 149개의 C형 아형이 급성으로 감염된 잠비아인에서 유래한 Gag-MJ4 키메라 바이러스의 연구에 활용되었으며, 복제에 영향을 미치는 Gag의 잔류물을 식별할 수 있었습니다. 더 중요한 것은 이 기술의 구현으로 바이러스 복제가 설정점 바이러스 부하 및 종적 CD4+ T 세포 감소와 같은 초기 HIV-1 발병의 매개변수를 어떻게 정의하는지에 대한 더 깊은 이해가 촉진되었다는 것입니다.

제대로 완전한 기능, 전염성 개그 - MJ4의 키메라를 조립 할 수있는 프로 바이러스 플라스미드를 생성이 프로토콜을 실행하기 위해 큰 관심은 적절한 PCR 증폭 산물을 생성하기 위해주의해야합니다. PCR은 적절한 크기의 개그 앰플 리콘을 생성 여부를 결정하는 것은 매우 중요합니다. 제품도 1a에 도시 된 약 1,700 bp의 증폭 물 100 염기쌍 (bp의) 내에 있어야합니다. 이 조각의 정확한 길이는 연구중인 개그 유전자에 따라 달라질 수 있습니다. 다음에, MJ4 분자 클론의 5 &#39;긴 말단 반복 (LTR)는 증폭 부와 후속 클로닝에 적합하게하기 위해 개그 앰플 리콘에 접합되어야한다. MJ4 LTR의 amplicon의 길이는 1,474 bp의이어야한다. 그림 1B는 올바른 밴드 크기가 표시되어있는 대표적인 젤 이미지를 보여줍니다. 스플 라이스 - 중첩 연장 PCR (41) 후, 결합 LTR-...

HIV-1 발병기전은 바이러스 특성과 숙주 유전적 요인에 의해 정의됩니다. 여기에서는 gag 유전자 염기서열 변이가 바이러스의 체외 복제 능력에 미치는 영향을 평가하기 위해 재현 가능한 측정을 할 수 있는 강력한 방법을 설명합니다.

제한 효소 기반의 복제 방법을 평가하기 위해<em&gt; 시험관</em&gt; HIV-1 서브 타입 C 개그 - MJ4 키메라 바이러스의 복제 능력

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

이 프로시저의 전반적인 목표는 subtype-C HIV1 감염자 유래의 gag 유전자를 복제 능력이 있는 HIV1 플라스미드에 삽입하여, gag 서열 다형성이 in vitro HIV1 복제 능력에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 환자의 혈장으로부터 gag 유전자를 증폭합니다. 두 번째 단계는 환자 유래 gag 서열을 복제 능력이 있는 감염성 분자 클론인 MJ-four에 클로닝하는 것입니다. 다음으로, gag-MJ-four 키메라 플라스미드를 트랜스펙션하여 감염성 바이러스 스톡을 생성하고, 지표 세포주에서의 감염성을 평가하기 위해 타이터링을 수행합니다. 마지막 단계는 GXR-25 T-세포주에서 in vitro 복제 능력을 측정하는 것입니다. 최종적으로, 바이러스 복제 역학을 시각화하기 위해 방사성 표지 역전사 효소 분석법을 사용하여 시간에 따른 비리온 생성을 정량화합니다.오늘 설명해 드릴 방법은 HIV 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 HIV 복제 적응도의 결정 요인을 정의하고, HIV 적응도가 장기적인 병원성에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 것이 포함됩니다. 오늘 실험 방법의 설명은 저의 대학원생 두 명인 Jessica Prince와 Dan Claiborne가 맡게 되었습니다.본 절차를 시작하려면, 원스텝 RT-PCR을 통해 역전사 효소와 열안정성 DNA 폴리머라제를 사용하여 RNA로부터 cDNA를 역전사하고 1차 라운드 DNA 생성물을 증폭합니다. 그런 다음, 1차 라운드 PCR 증폭물 1 µL를 DNA 템플릿으로 사용하여 네스티드 2차 라운드 PCR 증폭을 수행합니다. 다음으로, 2차 라운드 반응액 5 µL에 5X 로딩 다이 3 µL를 첨가합니다.밴드가 분리될 때까지 UV 형광 DNA 염색제가 포함된 1% agarose TAE gel에서 120 V로 전기영동을 수행합니다. 그 후 청색광 조사기에서 1.6 KB 밴드를 시각화합니다. 그다음, 남은 45 µL의 반응액을 DNA 염색제가 포함된 1% agarose TAE gel에서 전기영동합니다. 깨끗한 면도날을 사용하여 적절한 밴드를 절단하고, 개체당 3개의 양성 반응물을 합칩니다. 이어서 겔 정제 키트를 사용하여 겔 조각에서 DNA를 추출하고 nuclease free water로 용출합니다. 생성물은 추후 사용을 위해 -20 °C에서 냉동 보관합니다. 0:15:56 이 절차에서는 MJ-four 플라스미드의 long terminal repeat 5' UTR 영역을 증폭시킨 후, 조사기에서 1.3 KB PCR 생성물을 시각화합니다. 양성 앰플리콘을 절단한 후, 앞서 설명한 대로 정제하여 냉동 보관합니다. 다음으로, splice overlap extension PCR을 통해 융합된 MJ-four LTR gag 앰플리콘을 생성합니다. 3.2 kb의 긴 앰플리콘을 시각화, 절단, 정제하여 냉동 보관합니다. 이제 1.5 µg의 MJ-four 플라스미드와 1.5 µg의 정제된 LTR-gag PCR 생성물을 BCL-one 제한 효소로 50 °C에서 1.5시간 동안 절단합니다. 이어서 절단 반응액에 1 µL의 NGOM-four를 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 제한 효소 절단 반응액에 5x loading dye를 첨가합니다. 전체 부피를 DNA 염색제가 포함된 1% agarose TAE gel에서 100 V로 1~2시간 동안 천천히 전기영동합니다. 앞서 설명한 대로 클로닝을 위해 표시된 밴드를 시각화, 절단 및 정제합니다.다음으로, 정제된 LTR-gag 삽입물과 MJ-four 벡터 DNA를 3:1의 삽입물 대 벡터 비율로 사용하여 결합 반응을 준비합니다. 결합 반응물을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.그런 다음 ligation 산물을 100 µg/mL Ampicillin이 포함된 LB agar 플레이트에 도말하여 JM-109 화학적 컴피턴트 박테리아에 형질전환시킵니다. 형질전환된 박테리아를 30 °C에서 최소 22시간 동안 배양합니다. 클로닝의 정확성을 확인하기 위해, mini prep DNA를 NGOM-four 및 HPA-one 제한 효소로 37 °C에서 2시간 동안 이중 소화(double digest) 처리합니다.그 후, 1% agarose TAE gel에서 분석합니다. 0.05의 감염 다중도(multiplicity of infection)로 5×10⁵개의 GXR-25 세포를 감염시키기 위해, TZM-BL 세포 분석으로 얻은 µL당 IU 역가를 기준으로 각 스톡에서 필요한 바이러스 부피를 계산합니다. 전신 가운, 안면 마스크 및 이중 장갑을 포함하여 복제 가능 HIV 취급을 위한 적절한 개인 보호 장구를 반드시 착용하십시오. 감염 당일에 바이러스 스톡을 -80°C 냉동고에서 꺼내 해동합니다. 다음으로, 0.05 MOI를 달성할 수 있도록 바이러스를 C-R-P-M-I 배지로 100µL 부피로 희석합니다. 이를 V-bottom 조직 배양 처리된 96-well plate에 첨가하며, 각 복제 실험 세트에는 양성 및 음성 대조군을 모두 포함하고 well 간 교차 오염을 제한하기 위해 한 열 건너 하나씩 빈 열이 되도록 plate를 구성합니다. 그 후, 자동 세포 계수기를 사용하여 GXR-25 세포 수를 세고 모든 감염에 필요한 총 세포 수를 계산합니다. 필요한 부피를 50mL conical tube에 분주하고 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 그런 다음 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 100µL당 5×10⁵ cells 농도의 C-R-P-M-I에 재현탁합니다. 세포를 멸균된 trough에 피펫팅하고 충분히 혼합합니다. 이어서 멀티 채널 피펫을 사용하여, 희석된 바이러스가 들어 있는 96-well plate의 각 well에 100µL의 세포를 첨가하고 충분히 혼합합니다. 그 후, 각 well에 5mg/mL polybrene 용액 2µL를 첨가하고 세포를 충분히 혼합합니다. 그런 다음 5% CO₂ 조건의 조직 배양 인큐베이터에서 37°C로 3시간 동안 배양합니다.감염된 세포를 세척하기 위해 96-well V-bottom 플레이트를 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 그 다음, 세포 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 배지 150 µL를 제거하고 신선한 C-R-P-M-I 150 µL로 교체합니다. 세포를 충분히 세척하기 위해 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 마지막 원심분리 후 150 µL의 C-R-P-M-I를 첨가하고 멀티채널 파이펫을 사용하여 세포 펠릿을 재현탁합니다. 각 웰의 혼합물을 24-well 조직 배양 플레이트의 웰에 들어있는 800 µL의 C-R-P-M-I에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 2일마다 배양 웰 표면에서 상청액 100 µL를 96-well u-bottom 플레이트의 웰로 옮겨 RT 분석을 위해 냉동 보관합니다. 이후 세포를 완전히 재현탁하고, 세포의 과성장을 방지하기 위해 남은 부피의 절반을 제거합니다. 그 다음, 각 웰에 신선한 C-R-P-M-I 550 µL를 추가하여 원래 부피로 복원합니다.본 절차에서는 RT 마스터 믹스 1 mL 분주액 각각에 10 mCi/mL DTTP를 1~2 µL, 1 M DTT를 4 µL씩 첨가합니다. 1000 µL 피펫을 사용하여 RT 마스터 믹스, DTT 및 DTTP가 포함된 각 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브를 조심스럽게 혼합한 후 멸균 트러프(trough)로 옮깁니다.다음으로, 라벨링된 RT mix 25 µL를 96-well thin walled PCR plate의 각 웰에 분주합니다. RT master mix가 포함된 PCR plate에 각 상층액 5 µL를 첨가합니다. 그런 다음 PCR plate를 접착성 포일 커버로 밀봉하고 써모사이클러(thermocycler)에서 37 °C로 2시간 동안 배양합니다. 배양 후, 200 µL 멀티채널 파이펫을 사용하여 포일 커버에 작은 구멍을 뚫습니다. 샘플을 5회 혼합합니다. 각 샘플 5 µL를 DE-81 paper로 옮기고 모든 샘플을 10분 동안 공기 중에서 건조시킵니다. 블롯을 각각 별도의 세척 용기에 넣습니다. 이어서 블롯을 1X SSC로 5회 세척합니다. 그런 다음 90% 에탄올로 1회당 5분씩 2회 세척한 후 공기 중에서 건조시킵니다. 건조가 완료되면 블롯을 새란랩(Saran wrap)으로 조심스럽게 감싸고, 밀봉된 카세트에 넣어 실온에서 밤새 phosphoscreen에 노출시킵니다.준비가 완료되면, 포스포이미저(phosphor-imager)로 포스포스크린(phosphoscreens)을 분석하고 방사성 전사체를 정량화하십시오.표시됨. 다음은 MJ-four 플라스미드 백본에 클로닝 가능한 환자 유래 gag 앰플리콘을 생성하는 데 필요한 다양한 PCR 앰플리콘의 전기영동 분리 결과를 나타내는 대표적인 겔 이미지입니다. 이 대표 겔 이미지는 환자 gag 유전자를 MJ four에 클로닝하기 위한 제한 효소 절단물의 전기영동 분리 결과를 보여줍니다.이 대표적인 젤 이미지는 정제된 gag MJ-four 키메라 플라스미드 DNA의 제한 효소 절단물의 전기영동 분리 양상을 보여줍니다. 이 그래프는 GXR-25 세포주에서 시간 경과에 따른 복제 분석의 재현성을 나타냅니다. 약 1년의 간격을 두고 수행된 두 번의 독립적인 실험에서 동일한 gag MJ four 키메라 바이러스를 사용하여 GXR-25 세포를 감염시켰습니다.복제 점수는 로그 변환된 DLU 값의 기울기를 계산하고, 해당 기울기를 야생형 MJ-four에 대해 정규화하여 생성하였습니다. 두 번의 독립적인 측정값은 강한 상관관계를 보이며, 서로 다른 시점과 서로 다른 계대 세포를 사용하여 수행한 분석의 재현성을 입증합니다. 이 기술은 HIV AIDS 분야의 연구자들이 전 세계적으로 가장 흔한 서브타입인 급성 서브타입 C 감염에서 병원성의 바이러스 결정 요인을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 복제 능력이 있는 HIV를 다루는 것은 매우 위험할 수 있습니다. 살아있는 바이러스가 포함된 모든 단계는 BSL 2+ 시설에서 수행해야 합니다. 모든 표면은 정기적으로 오염 제거해야 하며, 항상 이중 장갑을 착용해야 합니다.

a-restriction-enzyme-based-cloning-method-to-assess-vitro-replication

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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여기에서는 일본뇌염 바이러스의 양성 가닥 게놈 RNA의 전체 길이 cDNA를 포함하는 감염성 박테리아 인공 염색체를 만들기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 다른 양성 가닥 RNA 바이러스의 기능적 cDNA를 구성하는 데 사용할 수 있어 바이러스 생물학 연구를 위한 강력한 게놈 도구입니다.

세균 인공 염색체 : RNA 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구

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높은 처리량 Cre Lox 활성화 에이즈-1 바이러스 막 융해의 억제제를 식별 하기 위해 바이러스 막 융합 분석 결과

우리는 선택 된 게놈 사이트에 proviral 통합 정리 에이즈-1 감염에 대 한 새로운 체 외 모델의 생성에 대 한 게놈 엔지니어링 워크플로우를 제시. 에이즈-파생 된 기자 들의 CRISPR Cas9 중재, 사이트별 게놈 조작에 의해 촉진 된다. 단일 셀 클론 세대, 심사, 그리고 올바른 대상 확인에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다.

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여기 우리는 초기 3'-테르미니의 공평한 결정 뿐만 아니라 단일 가닥 DNA 분자의 mutational 프로필을 제공 하는 깊은 시퀀싱 방법을 제시. 주요 응용 프로그램은 초기 retroviral 보완 DNAs (cDNAs) retroviral 반전 녹음 방송 과정 중에 생성 된 중간체의 특성 이다.

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에이즈 효율적인 재 활성화의 기능 평가 및 잠재 proviruses의 높은 처리량 프로토콜 설명 이며 HIV 전사에 개입의 영향을 테스트 하 고 접합 하 여 적용 합니다. 대기 시간 반전 LTR 기반 전사에 에이전트와 접합의 효과의 대표적인 결과 제공 됩니다.

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HIV-1에 감염된 T 세포에서 소포체 스트레스 및 풀린 단백질 반응을 측정하고 HIV-1 복제에서 그 역할을 분석합니다.

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