제한 효소 기반의 복제 방법을 평가하기 위해 시험관 HIV-1 서브 타입 C 개그 - MJ4 키메라 바이러스의 복제 능력

이 절차의 전반적인 목표는 아형 CHIV 1 감염자에서 유래한 개그 유전자를 복제 가능한 HIV 1 플라스미드에 통합하는 것입니다. HIV one 복제 능력에 대한 개그 서열 다형성의 효과를 시험관 내에서 평가하기 위해, 이는 먼저 환자의 혈장에서 개그 유전자를 증폭함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 환자 유래 개그 서열을 복제 유능한 감염성 분자 클론 MJ 4로 복제하는 것입니다.

다음으로, 감염성 바이러스 스톡을 생성하기 위해 gag MJ four chimera plasmid를 transfection하고 지표 세포주에서 감염성을 평가하기 위해 역정합니다. 마지막 단계는 G XR 25 T 세포주에서 체외 복제 능력을 측정하는 것입니다. 궁극적으로, 무선 표지 역전사효소 분석법은 바이러스 복제 역학을 시각화하기 위해 시간 경과에 따른 비리온 생산을 정량화하는 데 사용됩니다.

오늘 설명할 방법은 HIV 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 HIV 복제 적합성의 결정 요인을 정의하고 HIV 적합성이 장기적인 발병에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 것이 포함됩니다. 오늘 이 방법에 대해 설명할 사람은 제 대학원생인 제시카 프린스(Jessica Prince)와 댄 클라반(Dan Klaban

이 절차를 시작하려면 RNA에서 CDNA를 역전사하고 1단계 RT PCR에서 역전사효소와 열 안정성 DNA 중합효소를 사용하여 1차 DNA 산물을 증폭합니다. 그런 다음 DNA 템플릿으로 첫 번째 라운드 PCR 증폭의 1마이크로리터를 사용하여 중첩된 두 번째 라운드 PCR 증폭을 수행합니다. 다음으로, 5 x loading 염료 3 마이크로 리터를 두 번째 라운드 반응 부피 5 마이크로 리터에 추가합니다.

밴드가 분해될 때까지 UV 형광 DNA 염색이 포함된 120% aros, TAE 젤에서 1볼트로 실행합니다. 그런 다음 청색광 조명기에서 1.6KB 대역을 시각화합니다. 그 후, DNA 염색을 포함하는 1%aros, TAE gel에서 나머지 45마이크로리터 반응 부피를 실행합니다.

깨끗한 면도날로 적절한 밴드를 절제하고 개인당 세 가지 긍정적인 반응을 결합합니다. 그런 다음 겔 정제 키트를 사용하여 겔 슬라이스에서 DNA를 추출하고 뉴클레아제가 없는 물에서 ute합니다. 이 절차의 뒷부분에서 사용할 수 있도록 제품을 섭씨 영하 20도에서 동결하십시오.

긴 말단을 증폭 한 후, MJ 4 개의 플라스미드의 5 개의 프라임 UTR 영역을 반복한다. illuminator에서 1.3 KB PCR 산물을 시각화하고, 양성 앰플리콘을 절제한 다음, 앞서 설명한 대로 정제 및 동결합니다. 다음으로, 스플라이스 중첩 확장 PCR을 통해 융합된 MJ 4개의 LTR 개그 앰플리콘을 생성합니다.

3.2kb 길이의 앰플리콘을 시각화, 절제, 정제 및 동결합니다. 이제 1.5 μg의 MJ 4 플라스미드 및 1.5 μg의 정제 된 LTR gag PCR 제품을 BCL 1 제한 엔도뉴클레아제로 섭씨 50도에서 1.5 시간 동안 분해합니다. 그 후, 1마이크로리터의 NGOM four를 분해 반응에 첨가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.

그 후, 제한 분해 반응에 5 x loading 염료를 첨가하십시오. 천천히 전기 영동은 100 볼트에서 1-2 시간 동안 DNA 염색을 포함하는 1 % aros, TAE 젤의 총 부피를 전기로 영동합니다. 앞에서 설명한 대로 클로닝을 위해 표시된 band를 시각화, 절제 및 정제합니다.

다음으로, 정제된 LTR 개그를 사용하여 접합 반응을 준비합니다. MJ 4 vector DNA를 3:1 삽입 대 벡터 비율로 삽입합니다. 결찰 반응을 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

그런 다음 JM 1 0 9 화학적으로 유능한 박테리아를 밀리리터당 100마이크로그램의 LB 오거 플레이트에 퍼뜨린 결찰 산물로 변형시킵니다. 암피실린은 적어도 22시간 동안 섭씨 30도에서 변형된 박테리아를 성장시킵니다. 클로닝 충실도를 확인하기 위해 NGO M 4 및 HPA 1 제한 효소가 포함된 미니 프렙 DNA를 섭씨 37도의 이중 분해에서 2시간 동안 절단합니다.

그런 다음 1%아로스에서 분석합니다. TAE 젤. TZM BL 세포 분석의 마이크로리터당 IU 역가를 기반으로 각 스톡에서 필요한 바이러스의 양을 계산하여 5배 10에서 5번째 G XR까지 5개의 세포를 0.05의 감염 다중도에서 감염시킵니다.

감염 당일 전체 가운, 안면 마스크 및 이중 장갑을 포함하여 복제 가능한 HIV와 함께 작업하기 위해 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 영하 80도의 냉동고에서 바이러스 스톡을 제거하고 해동합니다. 다음으로, C-R-P-M-I 매체에서 바이러스를 100마이크로리터 부피로 희석합니다.

0.05 MOI를 달성하려면 각 복제 실험 세트에서 양성 대조군과 음성 대조군을 모두 포함하여 vbo 조직 배양 처리된 96웰 플레이트에 추가하고 웰 간의 교차 오염을 제한하기 위해 다른 모든 컬럼이 비어 있도록 플레이트를 설정합니다. 그런 다음 자동 세포 계수기를 사용하여 GXR 2개의 5개 세포를 계수하고 모든 감염에 필요한 총 세포 수를 계산합니다. 필요한 부피를 50ml 원뿔형 튜브와 원심분리기에 분주하여 세포를 펠릿화합니다.

그런 다음 배지를 조심스럽게 흡인하고 100 마이크로 리터 당 5 번째 세포에 5 곱하기 10의 농도로 C-R-P-M-I에 재현 탁하고 세포를 멸균 골짜기에 피펫으로 넣고 철저히 혼합합니다. 그 후 멀티채널 피펫을 사용하여 희석된 바이러스가 포함된 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 세포를 추가하고 철저히 혼합합니다. 그 후, 폴리 브레인 1 밀리리터 당 5 밀리그램 용액 2 마이크로 리터를 각 웰에 넣고 세포를 철저히 혼합하십시오.

그런 다음 감염된 세포 원심분리기를 세척하기 위해 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에서 5%CO2로 3시간 동안 배양합니다. 세포를 펠릿화하는 96 웰 V 바닥 플레이트. 그런 다음 150 마이크로 리터의 배지를 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 150 마이크로 리터의 새로운 C-R-P-M-I로 교체하십시오.

마지막 원심분리 후 세포를 충분히 세척하기 위해 절차를 두 번 더 반복하고 150마이크로리터의 C-R-P-M-I를 첨가하여 세포 펠렛을 다중 채널 피펫으로 재현탁합니다. 각 웰의 혼합물을 24웰 조직 배양 플레이트의 웰에 있는 800마이크로리터의 C-R-P-M-I에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 이틀에 한 번씩 섭씨 37도의 5%CO2 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다.

배양정 표면에서 100마이크로리터의 상등액을 96웰 바닥판의 웰로 옮기고 RT 분석을 사용하여 후속 분석을 위해 동결한 다음 세포를 철저히 재현탁하고 나머지 부피의 절반을 제거하여 세포 과증식을 방지합니다. 그 후,이 절차에서 각 웰에 550 마이크로 리터의 새로운 C-R-P-M-I를 첨가하여 원래 부피를 복원하고, DTTP 1 밀리리터 당 10 밀리 큐리의 1-2 마이크로 리터와 1 몰 DIO 3 에톨의 4 마이크로 리터를 ourt 마스터 믹스의 각 1 밀리리터 분취액에 추가합니다. RT 마스터 믹스 DTT 및 DTTP의 각 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 1000마이크로리터 피펫과 조심스럽게 혼합하고 멸균 트러프로 옮깁니다.

다음으로 25마이크로리터의 라벨이 부착된 RT를 분배합니다. 96웰 얇은 벽의 PCR 플레이트의 각 웰에 혼합합니다. 각 상등액 5마이크로리터를 RT 마스터 믹스가 들어 있는 PCR 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 PCR 플레이트를 접착 호일 덮개로 밀봉하고 배양 후 열순환기에서 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하고 200마이크로리터 다중 채널 피펫을 사용하여 호일 덮개에 작은 구멍을 만듭니다.

샘플을 5번 혼합합니다. 각 샘플을 5마이크로리터로 옮기십시오.ample DE 81 종이에 넣고 모든 샘플을 10분 동안 자연 건조시킵니다. 얼룩을 별도의 세척 용기에 넣으십시오.

그런 다음 하나의 XSSC로 얼룩을 5번 세척합니다. 그런 다음 90% 에탄올로 두 번 세탁할 때마다 5분 동안 자연 건조시킵니다. 건조되면 얼룩을 사란 랩으로 조심스럽게 싸서 단단히 밀봉된 카세트에 담긴 포스포 스크린에 실온에서 밤새 노출시킵니다.

준비가 되면 phospho 이미저로 phospho 스크린을 분석하고 방사성 전사체를 정량화합니다. 표시. 다음은 MJ 4 plasmid backbone에 클로닝될 수 있는 환자 유래 gag 앰플리콘을 생성하는 데 필요한 다양한 PCR 앰플리콘의 전기영동 분리를 보여주는 대표적인 겔 이미지입니다. 이 대표적인 겔 이미지는 환자의 gag 유전자를 MJ four로 복제하기 위한 제한 소화물의 전기영동 분리를 보여줍니다.

그리고, 이 대표적인 겔 이미지는 정제된 개그 MJ 4개의 키메라 플라스미드 DNA를 제한하여 전기영동 분리를 묘사한 것입니다. 이 그래프는 G XR two five cell line에서 시간 경과에 따른 복제 분석의 재현성을 보여줍니다. 약 1년 간격으로 수행된 두 개의 독립적인 실험에서 G XR 2개의 5개 세포를 감염시키기 위해 동일한 개그 MJ 4개의 키메라 바이러스를 사용했습니다.

복제 점수는 로그 변환된 DLU 값의 기울기를 계산하고 해당 기울기를 야생형 MJ 4로 정규화하여 생성되었습니다. 두 개의 독립적인 측정은 밀접한 상관관계를 보이며 서로 다른 시간 및 서로 다른 계대에 있는 세포로 수행된 분석의 재현성을 강조합니다. 이 기술은 HIV 에이즈 분야의 연구자들이 발병의 바이러스 결정 요인을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

급성 C형 감염에서 전 세계적으로 가장 널리 퍼진 아형. 복제 능력이 있는 HIV 환자와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있습니다. 살아있는 바이러스와 관련된 모든 단계는 BSL 2 플러스 시설에서 수행해야 합니다.

모든 표면은 정기적으로 오염을 제거해야 하며 항상 이중 장갑을 착용해야 합니다.