로컬 및 전신 사이트에서 병원체에 의한 만성 염증을위한 마우스 모델

다음 프로토콜의 전반적인 목표는 생리학적으로 관련된 동물 모델을 사용하여 생체 내 만성 염증에 대한 미생물 감염의 영향을 조사하는 것입니다. 이는 생쥐를 포르피로모나스 진지발리스(porphyromonas gingivalis)로 경구 감염시켜 국소 및 전신 만성 염증을 유발함으로써 달성됩니다. 그런 다음 MRI를 사용하여 살아있는 동물의 전신 염증의 진행을 측정할 수 있으며, 국소 염증성 뼈 손실은 마이크로 CT로 평가하고 죽상경화성 플라크는 희생 후 얼굴 지질 염색으로 시각화할 수 있습니다.

궁극적으로, P gingivalis 감염된 마우스와 감염되지 않은 대조군 사이의 폐포 뼈 부피와 죽상 경화성 플라크 축적의 차이는 각각 마이크로 CT 분석과 얼굴 지질 염색을 기반으로 측정할 수 있습니다. 우리 동물 모델의 가장 큰 장점은 만성 염증과 관련된 숙주 및 병원성 메커니즘, 특히 감염에서 멀리 떨어진 부위를 모두 검사할 수 있다는 것입니다. 따라서 형질전환 마우스와 정의된 박테리아 돌연변이를 사용하여 전신 부위와 국소 감염 부위를 볼 수 있습니다.

이 모델은 질병에 기여하는 숙주 및 미생물 요인과 같은 발병의 주요 측면을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 염증성 뼈 손실 및 죽상 동맥 경화증과 관련된 특정 숙주 및 병원체 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 류마티스 관절염, 당뇨병 및 암을 포함한 다른 질병 마우스 모델에도 적용할 수 있습니다. 이것은 Boston University의 High Field MRI 핵심 시설이며, 저의 박사 후 연구원 Ning은 마우스 이미징의 측면을 시연할 예정입니다.복숭아 gingivalis 3 81의 얼어붙은 줄기를 혐기성 혈액 한천 플레이트에 줄무늬를 긋는 것으로 시작하여 섭씨 37도의 혐기성 챔버에서 플레이트를 배양합니다.

3-5일 후, 플레이트에서 배양한 유기체를 사용하여 5밀리리터 액체 배양액의 뇌 심장 주입 육수(BHI)를 접종합니다. 하룻밤 동안 성장한 후 배양물을 45ml의 BHI로 옮기고 추가로 18-24시간 동안 배양물을 혐기성으로 배양합니다. 중간 로그 단계에서, 7, 000 GS 및 실온에서 10 분 동안 원심 분리로 박테리아를 수확 한 후, 철저하게 PBS Resus의 50 밀리리터에서 펠릿을 3 번 세척 한 후 혈청 피펫으로 PBS의 5 밀리리터에 펠릿을 현탁시키고, 배양물의 1-10 희석이 660 나노 미터에서 1.0의 광학 밀도를 갖도록 PBS의 펠릿

그런 다음 충분한 중간 점도의 카르복시 메틸 셀룰로오스를 제거하여 2% 중량 대 부피 용액을 달성하고 뭉침을 피하기 위해 와류를 치면서 카르박스 에틸 셀룰로오스를 박테리아 현탁액에 천천히 첨가합니다. C 2에서 염증의 진행을 측정합니다. 먼저 쥐의 머리가 누운 자세로 동물 홀더를 30mm 수직 프로브와 11.7 TMRI 스캐너의 수직 구멍에 놓습니다.

워블링(wobbling)과 시밍(shimming) 프로세스 후, 희귀 시퀀스를 사용하여 세 개의 직교 방향을 따라 스카우트 이미지를 획득하여 축방향 관상 및 시상 이미지를 생성합니다. 그런 다음 저해상도 자기공명혈관조영술을 사용하여 획득된 이미지가 대상 영역 내에 있는지 확인한 후 다음 매개변수를 사용하여 연결되지 않은 3D 구배 에코 시퀀스로 무명 동맥의 고해상도 자기공명혈관조영술을 수행합니다. 1.5cm의 슬래브 두께, 45도의 플립 각도, 20밀리초의 반복 시간, 2.2밀리초의 에코 시간, 1.5 x 1.5 x 1.5cm의 시야, 1 28 x 1 28 x 1 28의 매트릭스 및 약 22분의 총 스캔 시간에 대한 평균 4의 수.

그런 다음 ROI 분석을 위해 쇄골하 분기점 아래 0.3-0.5mm의 명부 동맥의 축 이미지를 선택하여 대동맥을 고정하고 조직을 항상 PBS로 덮은 상태로 유지합니다. 대동맥의 전구를 왼쪽에 놓고 대동맥을 해부학적 위치에 놓는 것으로 시작합니다. 그런 다음 대동맥의 상단, 아치의 세 번째 분기 아래, 하행 대동맥의 중간, 하행 대동맥의 하단 근처, 대퇴 동맥 분지 위의 5개 위치에 임시 므누신 핀을 연속적으로 배치합니다.

다음으로, 매우 가는 스프링 가위를 사용하여 대동맥의 왼쪽 분지에서 시작하여 상행 대동맥의 가장 낮은 가지 아래까지 대동맥의 왼쪽을 자릅니다. 그런 다음 각 가지를 자르고 고정하여 내부 표면을 노출시킨 후 조직을 계속 고정합니다. 전체 내부 표면이 노출되어 위에서 명확하게 볼 수 있으며 핀의 시각적 간섭이 없습니다.

지질을 염색하고 병변을 정량화하려면 먼저 고정된 대동맥을 갓 준비한 수단 4 용액 또는 오일 레드 O 용액으로 덮습니다. 50분 후 70% 이소프로판올로 조직을 1-5분 동안 세척한 다음 조직에서 나오는 물이 더 이상 붉지 않을 때까지 이중 증류수로 대동맥을 부드럽게 헹굽니다. 다음으로, 대동맥을 PBS로 덮고 조직 옆에 자를 놓아 이미지 보정을 돕습니다.

그런 다음 해부 현미경에 부착된 고해상도 카메라로 조직의 이미지를 캡처하여 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다. 마지막으로, 이미지 분석 소프트웨어에서 각 내부 표면을 수동으로 추적하여 해당 영역을 결정합니다. 그런 다음 자동화된 색상 임계값을 사용하여 병변 영역을 계산하려면 각 이미지에 대한 임계값을 설정하여 병변과 정상 영역을 구별하는 색상 강도를 정의합니다.

죽상경화성 병변으로 덮인 내막 표면의 비율은 p gingivalis에 감염된 마우스를 사용한 이 대표적인 실험에서 계산할 수 있습니다. 체적 분석은 감염된 마우스가 감염되지 않은 대조군에 비해 상당한 뼈 손실을 보이는 것으로 나타났습니다. 재건된 Hemi 상악골의 육안 검사는 감염된 마우스에서 어금니의 노출된 표면적이 죽상동맥경화증이 발생하기 쉬운 대조군에 비해 증가했음을 보여줍니다.

POE 결핍 마우스. P gingivalis는 마지막 감염 후 24시간 이내에 대동맥동맥 및 지정 동맥 내에 폐포 뼈 손실 및 염증성 플라크 침착을 유발하는 만성 염증을 유발하며, 이러한 대표적인 이미지에서와 같이 감염 후 다양한 시점에서 연속 생체 내, MRI를 통해 살아있는 마우스에서 모니터링할 수 있습니다. 또한, 수단의 4개 염색 대동맥의 얼굴 측정은 P gingivalis 감염이 내막 표면의 지질 침착 및 병변 영역을 크게 증가시키는 것을 보여줍니다.

또한 대동맥동 병변에 대한 면역조직화학적 분석은 선천성 면역 수용체 톨 유사 수용체 2 IV에 감염된 마우스의 마이크로세포 침투 증가와 발현 증가를 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 염증을 평가하는 실험 기간 시점이 질병 진행과 적절하게 일치해야 한다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 다른 사람의 MR 이미징 후, 얼굴 서 있거나 면역 히스토 화학과 같은 다른 방법을 수행하여 전반적인 죽상 경화성 부담 또는 병변의 세포 구성 요소와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 만성 염증과 관련된 숙주 및 병원성 요인을 모두 검사할 수 있는 생체 내 마우스 모델에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 병원체와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 PPE의 적절한 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.