생물 의학 연구에 소 폐 : 시각적으로 유도 기관지, Intrabronchial 접종 및

다음 실험의 전반적인 목적은 소의 호흡기 감염 모델에서 숙주와 병원체 간의 상호작용을 연구하는 것입니다. 이는 질병의 경과 동안 관심 병원체를 기관지로 접종하여 송아지에게 호흡기 감염을 유도함으로써 달성됩니다. 동물은 기관지 폐포 세척술을 통해 반복적으로 샘플링됩니다.

다음으로 상피 세포와 각각 폐포 또는 폐 조직 샘플을 회수하기 위해 기관지 브러싱과 경기관지 폐 생검을 수행합니다. 최종적으로 세척액의 염증성 변화, 세포학적 분석 및 병원체의 면역조직화학적 검출 등을 통해 병원체 특이적 호흡기 질환을 확진할 수 있습니다. 경기관지 폐 생검에서 나타납니다. 다른 기존 동물 모델 및 설치류 모델과 비교하여 이 대동물 모델의 주요 장점은, 동일 개체에서 반복적인 샘플링을 통해 장기간에 걸친 질병 경과를 연구할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 생체 내(in vivo) 호스트-병원체 상호작용에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 병원체나 호스트 종과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 마취 유지 및 샘플링 보조는 저희 실험실의 수의사인 피셔(Fisher)가 담당할 것입니다. 절차를 시작하기 전, 세 개의 주사기에 접종액을 각각 1, 2, 5 mL씩 채우십시오.

마취가 확인되면 동물의 혀를 당기고 목을 폅니다. 다음으로, 금속 설압자를 약간 회전시키며 동물의 입안으로 삽입합니다. 후두가 보일 때까지 플래시라이트로 확인하면서 설압자를 전방으로 밀어 넣습니다.

다음으로, 내시경의 작업 채널에 테플론 튜브를 삽입합니다. 이때 튜브가 내시경 끝단 밖으로 돌출되지 않아야 합니다. 내시경을 질경을 통해 삽입합니다.

내시경을 사용할 수 있도록 질경을 약간 조정해야 할 수도 있습니다. 후두를 통과하려면, 모니터 상의 이미지를 정렬하는 데 도움이 되도록 폐의 오른쪽으로 분지되는 기관지를 사용하십시오. 그런 다음 5 mL의 접종액이 담긴 주사기를 테플론 튜브 끝에 연결하십시오.

접종물을 주입할 분지까지 튜브를 이동시킨 후, 적절한 양의 접종물을 투여합니다. 다음으로, 1 mL의 접종물이 들어있는 주사기를 튜브에 연결합니다. 기관지로 이동하여 보조 분지에 접종물을 주입합니다.

내시경과 질경을 제거합니다. 그런 다음 마지막 주사기를 액추에이터에 연결하고 각 콧구멍에 접종액 1 mL를 분무합니다. 동물은 엎드린 자세로 다시 우리에 넣고 깨어날 때까지 기다립니다.

회복실은 냉난방 시설이 갖춰져 있어야 합니다. 전신 마취 하에서는 동물의 체온 조절 능력이 저하되기 때문입니다. 샘플링을 원하는 시점에 밸브 샘플을 채취하기 위해, 멸균 생리식염수 20 milliliters를 각각 담은 주사기 5개를 38 °C 항온수조에서 가온합니다. 그 다음, 내시경의 작동 채널에 세척 카테터를 삽입하고 내시경을 금속 질경 내로 삽입합니다.

다음으로, 쐐기 위치에 도달하여 내시경을 더 이상 앞으로 밀 수 없을 때까지 왼쪽 폐의 주기관지로 진입합니다. 그 후, 세척 카테터에 온염화나트륨 용액이 담긴 주사기를 하나씩 연결하여 액체를 주입하고 즉시 흡인합니다.

폐포 대식세포가 유리 표면에 부착되는 것을 방지하기 위해, 회수 직후 기관지폐포 세척액을 실리콘 처리된 유리병에 넣어 얼음 위에 보관하십시오. 주입한 식염수의 양과 회수된 액체의 양을 모두 기록하십시오. 그런 다음 상피 세포를 수집하기 위해 작업 채널에서 세척 카테터를 제거하십시오.

다음으로, 내시경을 원하는 샘플링 위치로 이동시킵니다. 예를 들어, 본 실험에서는 기관 분기점까지 이동하며, 내시경이 제자리에 위치하면 기관지 브러시를 튜브로 감싼 후 브러시 끝부분이 모니터에 보일 때까지 내시경의 작동 채널(working channel)에 삽입합니다. 브러시와 플라스틱 튜브를 앞으로 약 5 cm 밀어 넣습니다.

그런 다음 브러시 핸들을 밀어 플라스틱 튜브에서 브러시를 꺼냅니다. 브러시가 제자리에 위치하면 브러싱할 부위로 이동시킵니다. 그런 다음 내시경을 조작하면서 브러시를 앞뒤로 부드럽게 밀고 당깁니다.

상피세포를 긁어내기 위해 브러시가 기관지 벽에 밀착되도록 합니다. 출혈이 발생하면 문지르는 것을 멈춥니다. 그 다음 브러시를 튜브로 덮어 작업 채널에서 끌어냅니다.

상피세포가 코팅된 브러시를 최대 5개의 현미경 슬라이드 위에 부드럽게 굴려 도말한 후, 차가운 메탄올에서 10분 동안 고정합니다. 그 다음 슬라이드를 공기 중에서 건조시킨 후, 경기관지 폐 생검을 수행하기 위해 영하 20°C에서 보관합니다. 이어서 내시경을 원하는 샘플링 위치로 이동시킵니다.

예를 들어, 본 실험의 LOAs crans의 pars Alis와 같이, 생검 포셉을 작업 채널에 삽입하기 전에 포셉을 몇 번 열고 닫아 기능이 정상인지 확인한 다음, 약간의 저항이 느껴질 때까지 기관지 기관의 coddle branch로 포셉을 밀어 넣습니다. 이제 포셉을 2~3cm 정도 뒤로 뺀 후 포셉을 엽니다. 포셉을 다시 약 2cm 앞으로 밀어 넣은 다음 포셉을 닫습니다.

작업 채널에서 포셉을 뒤로 당겨 제거합니다. 바늘을 사용하여 생검 포셉에서 조직을 조심스럽게 제거하고, 자가분해 과정이 일어나는 것을 방지하기 위해 적절한 고정액에 보관합니다. 마지막으로, 송아지가 축사에서 회복하도록 한 후, 다시 한번 24시간 동안 기흉 발생 여부를 모니터링하며 사료와 깨끗한 물을 제공합니다.

동물이 완전히 의식을 회복하면, 경기관 내 폐 생검의 동결 절편을 면역조직화학적으로 염색할 수 있습니다. 접종된 병원체를 시각화하기 위해, 샘플링 4일 전에 클라미디아 C를 접종한 이 동물의 폐에서 갈색 클라미디아 봉입체가 나타남에 주목하십시오. 세척 세포의 면역조직화학적 염색을 통해 세포 내 병원체를 시각화할 수 있습니다.

예를 들어, 이 이미지에서는 송아지에서 채취한 폐포 대식세포 내에 존재하는 클라미디아 봉입체가 나타나 있습니다. 클라미디아를 기관 내 접종한 지 9일 후에 CTAC를 관찰할 수 있습니다. 기관지폐포 세척 세포는 세포학적 염색을 통해 구분할 수 있습니다.

폐포 대식세포는 세척액에서 가장 우세한 세포 유형입니다. 하지만 염증 과정이 존재할 때는 호중구 과립구의 수가 증가합니다. 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 접종은 10분에서 15분 내에, 샘플링은 20분에서 30분 내에 완료할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 마취된 동물에서 기관지 내 접종 및 송아지 접종을 수행하는 방법과 기관지폐포 세척액, 기관지 브러싱 및 경기관지 폐 생검 샘플을 채취하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.