절단 조각의 탐지와 전류 측정을 결합하여 상피 나트륨 채널 (ENAC)의 단백질 분해 활성의 데모

다음 실험의 전반적인 목적은 zap lava cytes에서 이종 발현된 상피 나트륨 통로(epithelial sodium channel) 또는 ENaC에 대한 프로테아제의 영향을 조사하는 것입니다. 이를 위해 먼저 난모세포의 amiloride 민감성 전체 세포 전류를 측정합니다. 난모세포를 회복시킨 후, 프로테아제에 노출시키고 전류를 다시 측정합니다.

그다음, 병행하여 난모세포를 비오틴화하고 웨스턴 블로팅을 수행하여 세포 표면에 gamma ENaC 절단 단편이 나타나는지 모니터링합니다. 이 결과는 이 전극 전압 고정법과 비오틴 접근법의 조합을 바탕으로 채널 절단과 채널 활성화 사이의 인과 관계를 보여줍니다. 비계획 측정과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 소량의 테스트 용액 내에서 두 측정 사이에 난모세포를 프로테아제나 다른 약리학적 제제에 다양한 시간 동안 노출시킬 수 있다는 점입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 Xenopus laevis 난모세포를 분리하고 cENAC를 주입한 이틀 후, 중력 공급 관류 시스템의 한 주사기는 ND 96으로 채우고, 두 번째 주사기는 아미드(amide)가 포함된 ND 96으로 채웁니다.

주사기를 배스 챔버(bath chamber) 위 50 cm 높이에 설치한 후, 150 W 할로겐 냉광원을 켜고 이를 난자 배스 챔버 위 10 cm 높이로 조정하여 쌍안 현미경으로 잘 보일 수 있도록 합니다. 흡입기를 켜고 흡입 튜브를 난자 배스 챔버 내의 슈퍼퓨전(superfusion) 튜브 어댑터 반대편에 배치합니다. 다음으로, IV 중력 흐름 제어 장치를 사용하여 각 용액의 슈퍼퓨전 속도를 3~5 mL/min으로 조정합니다. 그런 다음, 어댑터를 사용하여 슈퍼퓨전 튜브를 난자 배스 챔버에 연결하며, 이때 마이크로 피펫 폴라 풀(polar pull) 유리 모세관을 사용하여 팁 직경이 1 µm 미만이 되도록 합니다.

그다음 3 M potassium chloride를 사용하여 약 4분의 1 정도를 채웁니다. 모세관을 전류 및 전압 전극의 전극 홀더에 삽입하고, 마이크로 조작기를 사용하여 2 µM Amide 용액이 포함된 ND 96에 배치합니다. amide 민감성 전체 세포 전류를 측정하려면, 먼저 VM offset 버튼을 조정하여 전압 전극의 전극 전위를 0으로 맞추고, VE offset 버튼을 조정하여 전류 전극을 0으로 맞춥니다.

UO 부위를 욕조 챔버 내의 전압 감지 전극과 가까운 곳에 배치하십시오. 그 다음 두 개의 미세 전극을 사용하여 UO 부위를 조심스럽게 찌르고, 증폭기의 유지 전위를 -60 mV로 설정한 뒤 차트 기록기를 켭니다. 이어서 아미드 함유 용액을 주입하십시오.

다음으로 기록을 시작하고, 필요한 경우 게인을 조정하십시오. 측정된 전류가 안정적인 평탄면에 도달하면, 아미드-프리 용액으로 전환하십시오. 전류 평탄면에 도달하면, 다시 아미드 함유 용액으로 관류를 전환하십시오. 그 후 UO 부위의 전류가 초기 기선 전류에 도달하면, 전압 클램프를 끄고 전극을 조심스럽게 제거하여 천자 부위의 세포막이 다시 밀폐되도록 합니다.

UOC 부위를 protease-free ND 96 용액 100 to 150 µL가 들어 있는 96-well 플레이트의 한 웰에 5분 동안 넣은 후, UOC 부위를 protease가 포함된 용액 또는 protease가 없는 대조군 용액으로 옮깁니다. 배양 후 30분 동안 현재 측정을 반복하고, 실체 현미경 하에서 결함이 있는 난자를 제거하며, 적절한 protease를 포함하거나 포함하지 않은 anti 96를 준비합니다. 파스텔 피펫에 라벨을 붙이고 팁 끝을 짧게 화염 멸균하여 난자가 손상되지 않도록 준비합니다.

6-well 플레이트의 각 웰에 상온의 ND 96 또는 protease가 포함된 ND 96 2.5 milliliters를 채웁니다. 그런 다음 웰당 oocyte 30개를 넣고 상온에서 30분 동안 배양합니다. 새로운 6-well 플레이트의 웰에 ND 96 2.5 milliliters를 추가한 후, 각 oocyte 그룹을 ND 96이 채워진 웰로 옮깁니다.

남아있는 프로테아제를 씻어내기 위해 oocyte들을 ND 96이 담긴 두 개의 추가 웰로 순차적으로 옮기고, 마지막 웰에서 5분 동안 배양하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 biotin elation buffer로 biotin을 준비합니다. 각 oocyte 그룹을 2.5 milliliters의 biotin elation buffer가 담긴 웰에 넣고 부드럽게 흔들어주며 15분 동안 배양하십시오. 그 후, biotin 반응을 중단시키기 위해 각 oocyte 그룹을 2.5 milliliters의 quench buffer가 담긴 웰에 넣은 다음, 두 번째 quench buffer 웰로 옮겨 5분 동안 배양하십시오.

부드럽게 흔들어 주면서 각 난자 그룹을 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 프로테아제 억제제가 첨가된 1 milliliter의 용해 버퍼를 사용하여 27 gauge 바늘로 통과시켜 세포를 용해합니다. 용해물을 1500 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 TRITTON X 100 및 MP 40이 들어 있는 새로운 1.5 milliliter 튜브로 옮기고, 튜브를 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 난자 그룹당 100 µL의 vagaro 비즈를 평형화한 후, 단백질 세제 용액에 첨가하고 샘플을 4 °C에서 하룻밤 동안 overhead rotation으로 배양하며, 단백질을 용해시키기 위해 튜브를 반복적으로 볼텍싱합니다.

다음 날, 시료를 1500 ×g에서 3분 동안 원심분리합니다. 그 후, 세포 표면의 act 절단 단편을 검출하기 위해 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 2X SDS-PAGE 시료 버퍼를 추가하기 전, 용해 버퍼를 사용하여 비드를 3회 세척하여 젤 시료를 처리합니다. 시료를 20,000 ×g에서 3분 동안 원심분리한 후, 상층액을 새 마이크로 원심분리 튜브에 피펫으로 옮깁니다.

세린 프로테아제인 plasmin이 ENaC 매개 전류를 활성화할 수 있는지 조사하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 웨스턴 블롯으로 샘플을 분석하십시오. ENaC를 발현하는 개별 세포의 delta IE는 세포를 프로테아제가 없는 용액 또는 plasmin이 함유된 용액에서 30분간 배양하기 전과 후에 측정하였습니다. 여기에 제시된 2전극 전압 고정법(two electrode voltage clamp technique)을 사용하여 측정한 결과, plasmin에 노출되었을 때 측정된 모든 세포에서 delta IE가 증가했습니다.

반대로, 프로테아제 프리 용액에서의 배양은 무시할 만한 영향을 미쳤습니다. 이 그림은 chi trypsin이 야생형 ENaC와 prostasin 및 plasmin 절단 부위가 변이된 ENaC에 미치는 영향을 비교한 것입니다. 여기서 볼 수 있듯이, 변이 채널은 chi trypsin에 의한 ENaC 매개 전류의 활성화를 지연시키고 감소시킵니다.

또한, 이는 야생형 ENaC에 비해 낮은 속도로 절단 단편을 생성합니다. 이 영상을 시청한 후에는 설명된 방법들의 조합을 사용하여 프로테아제가 내부 발생에 미치는 자극 효과와 세포 표면에서의 절단 생성물 발생 사이의 상관관계를 어떻게 분석할 수 있는지 충분히 이해하게 될 것입니다. 이는 다양한 응용 분야에 유용할 수 있으며, 예를 들어 다른 이온 채널, 운반체 또는 막 수용체의 조절과 관련된 유사한 문제를 해결하는 데 활용될 수 있습니다.