Name: 소설 보컬 폴드 생물 반응기의 구조 및 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 배우세요 진동 자극이 중간엽 줄기세포에 미치는 영향을 바이오리액터를 이용하여 연구하는 방법을. 폴리(ε-카프로락톤) 스캐폴드와 실리콘 멤브레인을 활용하여 성대와 유사한 환경을 조성하고 레이저 도플러 진동 측정법으로 특성을 분석합니다.

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우리는 공 촛점 이미징에 대한 자신의 훈련과 조언을 닥터 제프리 캐플란 감사합니다. 우리는 또한 SEM의 지원 중사 전자 현미경 연구소 박사 Chaoying 니켈 감사합니다. 이 작품은 건강 (NIDCD, R01DC008965 및 R01DC011377)의 국립 연구소에 의해 자금 지원됩니다. ABZ은 NSF 통합 대학원 교육 및 연구 훈련생 자금 (IGERT) 프로그램을 인정합니다.

1. 생물 반응기 조립 (비디오 1) <ol><li> 미리 정해진 내부 및 외부 치수 알루미늄 형 (원형 다이 + 스페이서 핀) (그림 1) 확인합니다. </li><li> 에서 (그림 1의 스페이서 핀에 의해 형성 12mm, 두께 ~ 0.25 mm, 직경) 입지를 굳힌 슬리브 단계 1.1에서 금형을 사용하여, 실리콘 막 (1.5 mm, 그림 1 : 42mm, 두께 직경) 제작 시판되는 실리콘 엘라스토머 키트를 사용하여 중간. </li><li> 일치하는 능선과 홈과 블록 (0.9 cm 두께) 상단을 조각 (1.8 cm 두께)과 하단, 중간에 : 원형 개구 (24mm 직경)와 아크릴 블록 쌍 (그림 2 (4, 5)) 확인 . 10 </li><li> 페어링 아크릴계 블록 사이 실리콘 막을 샌드위치. 일정한 힘 (35 CN · m)로 설정 마이크로 토크 드라이버를 사용하여 네 모서리의 나사를 사용하여 어셈블리를 고정합니다. 결과적으로, 방수, 24mm 폭 18mm 깊이 진동 챔버 (그림 2C)가 생성됩니다. </li><li> 바닥 아크릴 블록에 각 나사의 또 다른 세트를 통해 진동 실 아래 3 &quot;확장 된 범위의 미니 우퍼 (그림 2D, 8 Ω/20 W)를 설치합니다. 이 시점에서, 개별 진동 모듈 조립된다. </li><li> 7 개의 추가 진동 모듈을 복제합니다. 바로 절단 균등하게 원형 구멍 (: 7cm, 두께 2cm 직경)의 스피커 기지를 배치하여 두 개의 고정 된 알루미늄 바 (40cm X 10cm X 2.5 cm) 중 하나에 4 개를 붙입니다. 각각의 원형 구멍에 알루미늄 막대의 측면을 통해 나사를 삽입하여 각 스피커를 안정. </li><li> 개별 스피커를 선택하여 스피커를 제어 할 수 있습니다. 선택의 해당 출력에 다음 스피커 본체의 양극과 음극 입력에 와이어를 연결하여 선택 개별 스피커를 연결합니다. 스피커의 선택은 수 t의 신호그 함수 발생기는, 전력 증폭기를 통과 한 후, 일단 (도 2E)에 모두 팔 스피커에 도달한다. </li><li> 반대로 습도가 인클로저에 두 개의 챔버 어레이 스피커 선택 및 관련 전자 제품을 놓습니다. 상업 세포 배양 인큐베이터에서 전체 어셈블리를 집. </li><li> 인큐베이터의 뒤쪽에 필터 조립체를 통해 파워 앰프와 스피커를 연결 선택기 (의료용 PVC 튜빙을 통해) 메인 케이블 피드. </li></ol> 2. 비계 제조 및 특성 <ol><li> 15 중량 %의 농도로 클로로포름 PCL 펠릿을 용해. 21 G의 무딘 엔드 바늘로 덮인 10 ML의 주사기에 솔루션을로드합니다. </li><li> 프로그램 주사기 펌프에 주사기를 잠그고 / 시간 1 ㎖에 유량을 설정합니다. </li><li> ~ 18cm의 바늘 끝 - 투 - 컬렉터 거리를 수평으로 바늘 맞은 편에 알루미늄 호일 덮인 집 놓습니다. </li><li> 긍정적 인 알리 클램프바늘의 중간, 알루미늄 집 전체에 접지 악어 클립 게이터 클립은, 다음에 15 kV의 고전압 전원 장치에 전압을 설정한다. 주의 : 고전압, 바늘에서 거리를 유지. </li><li> 순차적으로 주사기 펌프와 전원 공급 장치의 전원을 켭니다; 신속 클린 / 안정 섬유 제트 전에 건조 종이 타월을 이용하여 바늘의 선단부를 둘러싸는 잔류 중합체 용액을 제거하고 테일러 콘 (19)을 형성한다. </li><li> 섬유는 250 ~ 300 μm의 ~의 두께로 알 수집기에 축적 할 수 있도록 (~ 현재 회전 상태에서 7 시간). 잔류 용매를 제거 1-2 일 동안 진공 건조기에서 얻어진 지지체를 저장한다. </li><li> 화상 지지체가 일관된 섬유 형태를 보여주기 위하여 주사 전자 현미경을 사용하여, 금으로 스퍼터 코팅. 10 </li></ol> 3. 생물 반응기 조립 및 특성 <ol><li> 네 팔 (길이 : 원통형 디스크 (8mm 직경) : 펀치 2우선 디스크의 외경을 잘라 12mm 직경 생검 펀치를 사용하여 같은 회전 PCL 매트 (도 2a) 중 mm). 그런 균등 팔이 절단 어디 점수를 원형 블레이드 주위에 간격 네 2mm 긴 홈을 만들기 위해 두 번째, 8mm 생검 펀치를 사용합니다. 8 개 mm 펀치로 득점 한 후, 바깥쪽으로 팔의 가장자리를 잘라 메스 블레이드를 사용합니다. 연장 아암을 통해 실리콘 막의 홈에 지지체를 삽입 (비디오 1). 온화 납작한 핀셋을 사용하여 표면을 눌러 삽입 비계 평평. </li><li> 레이저 반사를 돕기 위해 PCL 지지체에 얇은 알루미늄 포일의 작은 조각 (8mm × 2 mm의 수직 모양, 그림 2B)를 연결합니다. </li><li> 진동 실에서 조립 된 실리콘 막 / PCL 발판을 (단계 1.4에 설명 된대로)에 고정합니다. 진동 전에 PCL의 발판을 수화하기 위해 챔버에 1.5 ㎖의 물을 추가합니다. </li><li> 함수 발생기를 이용하여 진동 신호 소개ALS 개재 아크릴 챔버 (0.1 V의 피크 - 피크 전압 Vpp로 가진 예를 들면, 200Hz의 사인파). 정확하게 각 스피커로의 입력 전압을 측정하기위한 전압계를 사용한다. 참고 : 함수 발생기에서 Vpp로 판독 스피커에 전달되는 최종 전압이 다를 것입니다. </li><li> 단일 지점 LDV를 조립하고 팬 틸트 헤드 삼각대에 광섬유 레이저 센서 헤드를 고정합니다. 각도 센서 헤드는 테이블 탑에 수직을 가리 키도록. 동축 케이블을 통해 데이터 수집 모듈 LDV 센서 헤드를 연결 한 후 USB를 통해 노트북에 모듈. </li><li> 실리콘 막 (도 2b 및도 3)에 다양 소정 지점에서 수직으로 레이저 빔을 집중. </li><li> 데이터 수집 소프트웨어를 이용하여, 중간 막 변위를 기록한다. &quot;옵션&quot;메뉴에서 &quot;획득 설정&quot;을 클릭합니다; 다음 측정 모드를 &quot;FFT 변경221;. 다음으로, 기본 도구 모음에서 &quot;연속 측정&quot;을 클릭 한 후 변위를 기록 선택된 주파수 (그림 6D)에 형성하는 피크를 클릭합니다. </li><li> 기판에 걸쳐 상대적 위치의 함수로서 정상 미드 막 변위 (0 w)를 그린다. 원래 8.5 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 표면 진동 프로파일의 3D 컬러 맵을 구축. </li></ol> 4. 진동 세포 배양 <ol><li> MSC 유지 보수 미디어 / ㎠ 4,000 ~ 5,000 세포의 초기 시딩 밀도 T150 조직 배양 플라스크에서 하위 문화 인간 골수 유래 중간 엽 줄기 세포. </li><li> 세포 배양 7-8 일 후 (~ 85 % 컨 플루로) 등 accutase 같은 세포 해리 시약과 세포를 Trypsinize, 혈구, 원심 분리 (5 분 440 XG)를 사용하여 계산하고, 다시 중단 세포 펠릿 4.5 × 106 세포 / ml의 농도로 신선한 MSC 유지 매체. </li><li> PCL의 scaffo를 담가70 % 에탄올 O / N.에 LD 용매를 증발 한 후 5-8 분 동안 UV 광 (254 ㎚ 인) 살균하는 지지체의 양면을 노출. </li><li> 1 시간 동안 37 ° C에서 20 ㎍ / ml의 피브로넥틴 솔루션의 PCL의 발판을 적신다. 실리콘 막에 피브로넥틴 코팅 된 지지체를 삽입합니다. 1 단계에서 설명하는대로 생물 반응기를 조립합니다. </li><li> 보안 PCL 발판에 균등하게 세포 현탁액의 40 μl를 배포합니다. 세포가 진동 챔버에 추가 1.5 ML 신선한 매체를 추가하기 전에 1 ~ 1.5 시간 동안 부착 할 수 있습니다. </li><li> 문화 MSC 라덴 PCL 3 일간 정적으로 비계와 정적 문화가 완료되면 미디어를 새로 고칩니다. </li><li> 세포 구조에 선정 진동 정권을 부과. 참고 : 예를 들어, 세포는 최대 7 일 동안 하루에 12 시간 ~ 40 ㎛, 아 0에서 200 Hz에서 진동 (의) 1 - 시간 -에 - 1 - 시간 - 오프를 실시한다. 진동 자극을받는 구조는 VIB 샘플 및 그 cultu로 지정정적으로 동일한 진동 챔버 빨간색은 정적 컨트롤 (합계) 역할을한다. </li></ol> 5. 생물 대한 평가 <ol><li> 매일 각 챔버로부터 200 ㎕의 세포 배양 배지를 수집 (일 1, 3, 5, 7) 및 (800 μL 각) 함께 동일 샘플로부터 분취 풀. </li><li> 매트릭스 메탈-1 (MMP1)와 제조 업체의 절차에 따라, 각각 MMP1 ELISA 개발 키트 및 히알루 론산 경쟁 ELISA 키트를 사용하여 HA의 세포 생산을 정량화. 한편, 이전에보고 된 ELISA 절차에 따라 수용성 엘라스틴 전구체의 생산을 분석 실험. 8 </li><li> 일 7시에 마지막 진동주기가 완료되면, 신속하게 날카로운 핀셋을 사용하여 진동 챔버에서 세포 구조를 제거하고 간단하게 감기 인산염 완충 생리 식염수 (PBS, 4 ° C)로 헹구어. </li><li> 라이브 / 죽은 염색의 경우, 요오드화 프로피 디움 (PBS에서 1:2,000)와 구문을 배양하고SYTO-13 RT에서 5 분을 동시에 (PBS에서 1:1,000). 이미지 다 광자 공 초점 현미경으로 얼룩진 구조. </li><li> 이와는 별도로, 드라이 아이스의 PBS-씻어서 세포 구조를 스냅인 동결 및 유전자 분석을위한 이전에보고 된 프로토콜 다음 전체 세포 RNA를 추출 할 수 있습니다. 9 </li><li> UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 추출 된 RNA의 수량과 품질을 확인합니다. 1.8 ~ 2.2의 A260/A280과 A260/A230 비율이 RNA 샘플은 다음의 qPCR 분석을 위해 사용됩니다. </li><li> 역 시판 역전사 키트를 사용하여 cDNA를에 RNA (500 NG / 샘플)를 표기. </li><li> 이전에 설명 된 절차에 따라 시판 PCR 마스터 믹스를 이용한 실시간 연속 검출 시스템에 대한 PCR 반응을 수행한다. 8 </li><li> 상업적 qPCR의 데이터 분석 소프트웨어를 사용 qPCR의 결과를 분석한다. 데이터 분석의 신뢰도를 보장하기 위해, 여러 표준 발현 유전자 (YWHAZ, TBP, PPIA)는 INT로서 이용된다ernal 컨트롤 및 특정 프라이머 효율성의 분산을 고려해야한다. 8 </li></ol>

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체외에서 기능 성대 조직의 성공적인 설계는 다 능성 세포의 행동을 중재하기 위해 성대와 같은 미세 환경의 휴양이 필요합니다. 그것은 일반적으로 조직 또는 장기 구조 그들이 수행하는 데 필요한 기능을 반영하는 것으로 받아 들여진다. 성대 조직 22는, 발성 중에 발생 고주파 진동은 조직의 성숙을위한 중요한 것으로 제시된다. 성대 생물 반응기 배양 된 중간 엽 줄기 세포에 생리 학적으로 관련된 기계적인 신호를 소개하기 위해 설계되었습니다 동안 우리의 연구에서, PCL 지지체는 인대와 같은 구조 지원을 제공하는 데 사용됩니다. (J2) 여기에 설명 된 생물 반응기는 전자 기적으로 각각의 스피커를 통해 진동을 생성하고 배양 된 세포에 에너지의 공기 역학적으로 전송합니다. 우리의 이전의 설계에 비해, 18 현재 시스템은 fo를 허용 직접적 아니라 각 샘플 아래에 진동 자극의 소스 이동라보다 효율적인 에너지 변환. 결과적으로, 상당히 큰 통상의 변위 및 높은 가속도가...

상피 층으로 구성된 인간의 성대는 고유 층 (LP) 및 vocalis 근육, 사운드 제작을위한 음향 파에 폐에서 공기 흐름을 변환하는 전문 부드러운 조직이다. 1 성대가 정상 발성을하는 동안 정기적으로 진동, 에 이르기까지 기본 주파수에서 최대 30 %의 변종을 나타내는 100 ~ 300 Hz에서에서. 2 성인 성대 LP는 표면 (SLP)로 구성된 그라데이션 구조, 중간 (ILP)과 깊이 (DLP) 층이다. 또한 분류 그룹 상피 세포와 점막 층으로 SLP, 그리고 보컬 인대에 ILP 및 DLP를 결합합니다. 3 인대가 성숙 콜라겐과 엘라스틴 섬유가 풍부하면서 SLP 층, 띄엄 띄엄 분산 된 콜라겐 섬유와 주로 비정질 매트릭스를 포함 충분한 강도를 제공 할 수 있습니다. 4의 구조와 신생아 성대의 역학은 성숙한 대응 크게 다릅니다. 비록 메커니즘성대의 발전과 성숙을 조절의는 아직 완전히 실험적인 증거가 발성 파생 기계적 스트레스의 정의 역할을 지적했다, 이해되지 않습니다. 음성 남용, 감염, 화학적 자극 및 수술 등 여러 가지 건강 상태는 성대가 손상 될 수 있습니다. 성대 장애는 미국 인구의 추정 3-9% 영향을 미친다. 성대 질환에 대한 현재의 치료 방법은 5 개 제한하고 줄기 세포 기반 조직 공학 방법은 성대 기능 복원을위한 유망한 전략으로 떠오르고있다. 중간 엽 줄기 세포 (MSC) 성대 조직 공학에 대한 기본 성대 섬유 아 세포에 대한 적절한 대안입니다. 6-9 줄기 세포의 운명 사양 및 이후의 조직 개발은 기계 상태가되는가에있는 특정 틈새 시장에 의해 매개되는 중요한 요소. 10 기계적 힘은 조직의 형태 형성에 필수적인 레귤레이터이다ND 특히 일상적으로 조직 공학의 관점에서로드. 11을 실시하고 조직에 대한 항상성은, 그것은 노출 생리학 관련 기계적 자극이 세포 분화 및 조직 별 매트릭스 리모델링 줄기 촉진하는 것으로 입증되었다. 12-15 조직 배양 용 바이오 리액터는 시험 관내 세포 또는 조직 성장을위한 바람직한 생리적 환경을 시뮬레이션하기 위해 설계된다. 성대 조직 공학의 경우, phonating 성대의 기계적인 환경을 재현하는 것이 특히 중요합니다. 이상적인 성대 생물 반응기 효과적으로 주파수, 진폭과 진동의 기간 동안 손쉬운 제어를 허용, 배양 세포에 진동 신호를 제공한다. Titze 및 동료 기질 단백질의 세포 생산을 자극하는 높은 주파수 (20 ~ 200 Hz에서) 진동과 정적 스트레칭을 결합한 성대 생물 반응기 (T1 생물 반응기) 16을 고안했습니다. 저기서g이 생물 반응기, 웹의 동료 (17)은 히알루 론산 (HA) 기반의 하이드로 겔에서 배양 피부 섬유 아세포에서 10 일, 100 Hz에서 진동의 영향을 연구했다. 진동이 구문은 HA 합성 효소-2 (HAS2) 정적 컨트롤을 기준으로, decorin, fibromodulin 매트릭스 메탈-1 (MMP1)의 높은 발현을 보였다. 자극 효과가 따라 시간이 될 것으로 밝혀졌다. 더 최근에는, 단체 (18)는 전력 증폭기, 함수 발생기, 봉입 시끄러운 스피커 및 세포 부착에 진동 공기 전송 원주 정박 실리콘 막을 사용 성대 생물 반응기 (J1 생물 반응기)를 조립했다. J1 생물 반응기에서 배양 신생아 포피의 섬유 아 세포는 최대 0.05 %의 평면 변형으로, 60, 110 또는 300 Hz에서 진동이 1 시간을 실시 하였다. qPCR의 결과는 몇 가지 ECM 유전자의 발현이 적당히 다양한 진동 주파수에 대한 응답으로 변경된 것을 제안및 진폭. 이러한 생물 반응기 설계, 음모를 꾸미는 동안, 몇 가지 제한이 있습니다. 예를 들어, T1 시스템이 달성 가능한 최대 주파수를 제한하는 기계적 결합을위한 커넥터와 바의 다수를 필요로한다. 또한, 세포는 데이터 해석을 복잡 바람직 기계적 교반 및 액체 섭동을 거치게된다. J1 생물 반응기는, 반면에, 상대적으로 낮은 에너지 변환 효율을 나타내고 사용자 친화적 아니다. 또, 진동이 빈번 내부 실리콘 막에서 세포 함유 구조물을 분리. J1 버전과 동일한 원칙에 따라 설계 여기에보고 J2 성대 생물 반응기는, 일관성과 재현성에 최적화되어 있습니다. 발성을 흉내 낸 진동은 MSC-채워 섬유 폴리 (ε-카프로 락톤) (PCL) 발판이 effectiv 있습니다 개별적으로 장착되어 진동 챔버에 공기 역학적으로 생성됩니다엘리 확보했다. 레이저 도플러 진동계 (LDV)는 사용자가 멤브레인 / 지지체 조립체의 진동 프로파일을 확인한다. 우리의 데모에서는 중간 엽 줄기 세포 7 일 동안 12 시간의 매일의 총 1 시간 -에 - 1 - 시간 - 오프 (의) 패턴으로 200 Hz의 정현파 진동에 노출되어 있습니다. 부과 된 진동 신호에 대한 세포 반응을 체계적으로 조사하고 있습니다. 전반적으로, J2 성대 동적 세포 배양 연구는 높은 처리량과 재생 가능한 방식으로 수행 할 수 있도록, 가장 사용자 친화적 인 기능을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>100 &#176에서 멤브레인 경화; C 2 시간</td></tr><tr><td>PCL</td><td>시그마 Aldrich</td><td>440744-500G</td><td>Mn ~ 80 kDa, O/N</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>인간 골수 유래 MSC</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>통로 2</td></tr><tr><td>MSC 유지 관리 매체</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>10% FBS L-글루타민, 겐타마이신 및 암포테리신</td></tr><tr><td>이 보충된 기저 배지 와 함께 수신Accutase 세포 해리 시약</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마 Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>시그마 Aldrich</td><td>F2006-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MMP1 DuoSet ELISA 키트</td><td>R& D 시스템</td><td>DY901</td><td></td></tr><tr><td>HA ELISA 키트</td><td>Echelon Biosciences</td><td>&nbsp; K-1200&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드&nbsp;</td><td>생명 기술</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Syto-13&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect 역전사 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR 마스터 믹스</td><td>Life Technologies</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>교체 스피커</td><td>DAYTON 오디오 (Parts Express를 통해)</td><td>DS90-8</td><td>페이퍼 콘, 전체 범위 (80-13,000 Hz), 85 dB</td></tr><tr><td>Ergo 마이크로 토크 스크루드라이버</td><td>Mountz</td><td># 020377</td><td>토크 범위: 20-120 cN&#183; m</td></tr><tr><td>스테레오 스피커 선택기</td><td>RadioShack</td><td>40-244</td><td>최대 전력 처리 50W</td></tr><tr><td>함수 발생기&nbsp;</td><td>애질런트&nbsp;</td><td>33220A</td><td>주파수 범위 1 &마이크로; Hz-20MHz</td></tr><tr><td>전력 증폭기&nbsp;</td><td>PYLE 오디오</td><td>PylePro PT2400</td><td>주파수 응답: 10 Hz-50 kHz, 두 개의 스피커 채널</td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터&nbsp;</td><td>써모 피셔&nbsp;</td><td>Steri-Cult 3307</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프&nbsp;</td><td>New Era 펌프 시스템</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>고전압 전원 공급 장치</td><td>Spellman</td><td>CZE 1000R</td><td>출력 전압: 0-30 kV</td></tr><tr><td>주사 전자 현미경&nbsp;</td><td>JEOL-USA</td><td>JSM-7400F</td><td></td></tr><tr><td>데스크 골드 스퍼터 코터</td><td>Denton Vacuum</td><td>DSK00V-0013</td><td></td></tr><tr><td>도플러 레이저 진동계&nbsp;</td><td>Polytec</td><td>PDV-100</td><td>비접촉 속도 측정(0-22kHz)</td></tr><tr><td>PCR 염기서열 검출 시스템&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI7300</td><td></td></tr><tr><td>다광자 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510Meta NLO</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS 분광 광도계&nbsp;</td><td>NanoDrop 제품 Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>VibSoft 데이터 수집 소프트웨어를</td> 통한 <td>Polytec</td><td></td><td>수집 대역폭 최대 40MHz</td></tr><tr><td>Origin 8.5 데이터 분석 소프트웨어&nbsp;</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qbasePlus qPCR 데이터 분석 소프트웨어&nbsp;</td><td>Biogazelle</td><td>V2.3</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 합금&nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td>합금 6061</td><td></td></tr><tr><td>아크릴 블록</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 항습 챔버</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td>충격 저항성&nbsp; 폴리카보네이</td></tr>트 <tr><td>나사&nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전자 케이블/와이어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>의료용 PVC 튜브</td><td>US Plastic Corp.</td><td>Tygon S-50-HL</td><td>Clear, biocompatible</td></tr><tr><td>10 ml 주사기&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>21 G 둔기 끝 바늘</td><td>소형 부품</td><td>NE-213PL-25</td><td>1-1/2" 길이</td></tr><tr><td>악어 클립 어댑터&nbsp;</td><td>RadioShack</td><td>270-354</td><td>완전 절연</td></tr><tr><td>8mm 생검 펀치</td><td><a href="http://www.sklarcorp.com/ProductListUS.aspx? 부서ID=10& 카테고리ID=96">Sklar&nbsp; 수술 기구</A</td><td>>96-1152</td><td>멸균, 일회용</td></tr><tr><td>12mm 생검 펀치</td><td>아퀴덤(Fisher Scientific 제공)</td><td>NC9998681</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크</td><td>코닝</td><td></td><td>세포 배양 처리</td></tr></tbody></table>

소설 보컬 폴드 생물 반응기의 구조 및 특성

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

기계적으로 활성화된 조직의 체외 엔지니어링은 배양된 세포에 생리학적으로 관련된 기계적 조건을 제시해야 합니다. 성대의 역동적인 환경을 모방하기 위해 기본 발성 주파수에서 진동 자극을 생성할 수 있는 새로운 성대 생물반응기가 구축되고 특성화됩니다. 이 장치는 함수 발생기, 전력 증폭기, 스피커 선택기 및 병렬 진동 챔버로 구성됩니다. 개별 진동 챔버는 한 쌍의 아크릴 블록 사이에 맞춤형 실리콘 멤브레인을 끼워 만듭니다. 실리콘 멤브레인은 챔버의 바닥 역할을 할 뿐만 아니라 셀이 포함된 골격을 고정하는 메커니즘을 제공합니다. 바닥 아크릴 블록 아래에 장착된 스피커에서 생성된 진동 신호는 진동하는 공기에 의해 공기역학적으로 멤브레인으로 전달됩니다. 2개의 고정식 금속 막대에 고정된 8개의 동일한 진동 모듈이 세포 배양 인큐베이터에서 장기간 작동할 수 있도록 방습 챔버에 보관됩니다. 성대 생물반응기의 진동 특성은 레이저 도플러 진동계(LDV)를 사용하여 비파괴적으로 분석됩니다. 동적 배양 장치의 유용성은 40μm의 중간 멤브레인 변위와 함께 200Hz 정현파 진동이 있는 곳에서 세포 구조를 배양함으로써 입증됩니다. 생물반응기에서 배양된 중간엽 줄기세포는 성대와 관련된 세포외 기질 구성 요소의 합성 및 분해를 변경하여 진동 신호에 반응합니다. 여기에 제시된 새로운 바이오리액터 시스템은 진동 유도 기계 전달을 연구하고 기능적 성대 조직의 엔지니어링을 위한 우수한 체외 플랫폼을 제공합니다.

전기 방사에 의해 제조 된 PCL 발판은 마이크론 크기의 중간 세공 및 4.7 μm의 (그림 4A)의 평균 직경이 무작위로 얽혀 섬유가 포함되어 있습니다. 높은 배율에서, 나노 그루브와 모공 개별 섬유 (그림 4B)에서 볼 수 있습니다. 피브로넥틴과 비계의 코팅은 친수성을 향상시키고 초기 세포 부착 / PCL 지지체 (게시되지 않은 관찰)의 확산을 용이하게한다. 원하는 주파수 (F, 100 ~ 300 Hz에서) 및 전압의 사인 파형 (Vpp로 : 0-0.125 V)의 각 진동 챔버 아래의 스피커 및 실리콘 막의 바닥의 종이 콘 사이에 밀폐 된 공기에 소개 미니 우퍼는 진동으로 구동된다. 공기의 진동은 또는 세포없이 PCL 지지체에 전달된다. LDV는 F와 관련 Vpp로에서 지지체의 진동 특성을 분석하는 데 사용고려 물의 굴절율 (1.33)을 복용. 20도</su...

배양된 세포에 생리학적으로 관련된 진동 자극을 전달할 수 있는 새로운 성대 생물반응기가 구성되고 특성화됩니다. 이 동적 배양 장치는 섬유질 폴리(ε-카프로락톤) 골격과 결합될 때 중간엽 줄기 세포의 행동을 조절하는 성대 모방 환경을 만듭니다.

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

다음 실험의 전체적인 목표는 발성을 모사하도록 설계된 바이오리액터를 사용하여 중간엽 줄기세포에 가해지는 진동 자극의 효과를 조사하는 것입니다. 이는 성대 인대와 유사한 세포 배양용 3차원 기질을 제공하기 위해 poly epsilon Capralactone 스캐폴드를 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 스캐폴드를 실리콘 막에 통합하여 진동이 세포 구조물로 전달될 수 있도록 합니다.다음으로, 각 막 스캐폴드 조합의 진동 특성을 결정하기 위해 레이저 도플러 진동계가 활용됩니다. 최종적으로, 단백질 및 번역 수준에서의 세포 반응을 평가하기 위해 EISA 및 정량적 R-T-P-C-R 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 성대 성숙 과정 및 성대 오남용의 결과와 같이 후두과학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 제공할 수 있습니다.이 기술은 스캐폴드를 제작할 때 현재 이 방법으로 가능한 수준의 세포 제어가 가능하므로 성대 질환 치료로 응용 범위가 확장될 수 있습니다. 먼저 PCL 펠릿을 클로로포름에 15 weight percent 농도로 용해합니다. 그런 다음 생성된 용액을 21 gauge 둔탁한 끝 바늘이 캡핑된 10 milliliter 주사기에 채웁니다. 주사기를 프로그래밍 가능한 주사기 펌프에 고정하고 유속을 1 milliliter per hour로 설정합니다.그런 다음, 바늘 끝에서 수집기까지의 거리가 약 18 centimeters가 되도록 알루미늄 호일로 덮인 수집기를 바늘 맞은편에 수평으로 배치합니다. 이어서, 양극 악어 클립을 바늘 중앙에 고정하고 클립을 수집기에 접지합니다. 바늘에서 멀리 떨어져 주의하며, 고전압 전원 공급 장치의 전압을 15 kilovolts로 설정합니다.그 다음 시린지 펌프와 전원 공급 장치를 켭니다. 안정적인 섬유 제트와 테일러 콘(tailor cone)이 형성되기 전, 마른 종이 타월을 사용하여 바늘 팁 주변의 잔류 폴리머 용액을 빠르게 제거합니다. 섬유가 알루미늄 콜렉터 위에 약 7시간 동안 쌓여 두께가 250 to 300 micrometers가 될 때까지 방치한 후, 잔류 용매를 제거하기 위해 결과물인 스캐폴드를 진공 데시케이터에 1 to 2일 동안 보관합니다. PCL 스캐폴드는 마이크론 크기의 틈새 기공과 평균 직경 약 4.7 micrometers의 무작위로 얽힌 섬유를 포함하게 됩니다.더 높은 배율에서 보면, 바이오리액터를 조립하기 위한 개별 섬유의 나노 규모 홈과 기공을 확인할 수 있습니다. 먼저 12 mm 직경의 생검 펀치를 사용하여 최근에 방사한 PCL 매트에서 외경 8 mm의 원형 디스크를 절단합니다. 그다음 두 번째 8 mm 생검 펀치를 사용하여 암(arm) 부분이 절단될 위치에 표시를 합니다.점수를 매긴 후, 메스 날을 사용하여 암(arm)의 가장자리를 바깥쪽으로 절개하고, 확장된 암을 통해 스캐폴드를 실리콘 막의 홈에 삽입합니다. 평두 핀셋으로 표면을 가볍게 눌러 삽입된 스캐폴드를 평평하게 편 다음, 8 mm × 2 mm 크기의 얇은 알루미늄 호일 조각을 PCL 스캐폴드에 부착합니다. 레이저 반사를 돕기 위해, 조립된 실리콘 막 PCL 스캐폴드를 진동 챔버에 고정합니다.그 다음 실리콘 막을 한 쌍의 아크릴 블록 사이에 끼웁니다. 마이크로 토크 드라이버를 35 cN·m의 일정 힘으로 설정하여 네 모서리의 나사로 조립체를 고정함으로써, 너비 24 mm, 깊이 18 mm의 수밀 진동 챔버를 생성합니다. 이어서 하단 아크릴 블록의 또 다른 모서리 나사 세트를 통해 진동 챔버 아래에 3피트 확장 범위 미니 우퍼를 장착하여 개별 진동 모듈의 조립을 완료합니다.7개의 진동 모듈을 추가로 복제한 후, 스피커 베이스를 일정한 간격의 원형 구멍에 배치하여 두 개의 고정식 알루미늄 바 중 하나에 4개의 모듈을 부착합니다. 바에 홈을 내어, 알루미늄 바 측면에서 각 원형 구멍으로 나사를 삽입하여 각 스피커를 고정합니다. 그런 다음 스피커 본체의 양극(+) 및 음극(-) 입력단과 셀렉터의 해당 출력단을 전선으로 연결하여 개별 스피커를 셀렉터에 연결합니다.스피커 선택기를 사용하면 전력 증폭기를 거친 함수 발생기의 신호가 8개의 모든 스피커에 동시에 전달됩니다. 그런 다음 두 개의 챔버 어레이, 스피커 선택기 및 관련 전자 장치를 제습 인클로저에 넣고, 전체 어셈블리를 상용 세포 배양 인큐베이터 내에 배치합니다. 메인 케이블을 의료용 PVC 튜브에 통과시켜 인큐베이터 후면의 필터 어셈블리를 통해 전력 증폭기와 스피커 선택기를 연결합니다.먼저 바이오리액터를 특성화하기 위해, 진동을 가하기 전 PCL 스캐폴드를 수화시키도록 진동 챔버에 물 1.5 milliliters를 넣습니다. 그다음 함수 발생기를 사용하여 샌드위치 구조의 아크릴 챔버에 진동 신호를 입력합니다. 이때 전압계를 정확하게 사용하십시오.각 스피커 입력단의 전압을 측정하고, 단일 지점 레이저 도플러 진동계를 조립합니다. 광섬유 레이저 센서를 고정합니다. 팬-틸트 헤드 삼각대로 이동하여 센서 헤드가 테이블 상면에 수직이 되도록 각도를 조절합니다.그런 다음 동축 케이블을 통해 센서 헤드를 데이터 수집 모듈에 연결하고, USB 포트를 통해 모듈을 노트북에 연결합니다. 실리콘 막의 미리 정해진 여러 지점에 레이저 빔을 수직으로 초점을 맞춘 후, 데이터 수집 소프트웨어의 옵션 메뉴에서 획득 설정(acquisition settings)을 클릭합니다. 다음으로 측정 모드를 FFT로 변경한 후, 메인 툴바에서 연속 측정 도구를 클릭합니다.선택한 주파수에서 형성되는 피크를 클릭하여 변위를 기록하고, 기판 가로 방향의 상대적 위치에 따른 정규 중간 막 변위를 도식화합니다. 진동 세포 배양을 설정하려면, 먼저 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 T150 조직 배양 플라스크에 cm²당 4~5 × 10³ cells의 초기 파종 밀도로 유지 배지에서 7~8일 동안 계대 배양합니다. 실험 전날, PCL 스캐폴드를 70% ethanol에 하룻밤 동안 담가 둡니다.다음 날 아침, Accutane으로 세포를 떼어낸 후 세포를 원심 분리하고, 펠렛을 4.5 × 10⁶ cells/mL 농도의 신선한 유지 배지에 재부유시킵니다. 에탄올이 증발하면, 스캐폴드의 양면을 5~8분 동안 살균 UV 광선에 노출시킵니다. 그런 다음 PCL 스캐폴드를 37 °C의 20 µg/mL 피브로넥틴 용액에 1시간 동안 담급니다.방금 시연한 대로 바이오리액터를 준비한 다음, 고정된 스캐폴드 위에 세포 현탁액 40 µL를 균일하게 분배합니다. 세포가 부착될 때까지 1~1.5시간 동안 대기한 후, 진동 챔버에 신선한 배지 1.5 mL를 추가로 넣습니다. 중간엽 줄기세포가 적재된 PCL 스캐폴드를 3일 동안 정적으로 배양한 후, 배지를 교체하고 세포 구조체에 선택한 진동 조건을 적용합니다.진동 주파수는 인간의 기본적인 발화 주파수를 반영하도록 선택되었으며, 테스트된 모든 주파수에서 수직 변위와 peak-to-peak 전압 사이에는 0에서 0.125 V 범위 내에서 선형 관계가 존재합니다. 특정 peak-to-peak 전압에서 주파수가 100에서 300 Hz로 증가함에 따라 수직 변위는 감소합니다. 필수 성대 세포외 기질 단백질인 elastin, hyaluronan synthase 1, collagen type three alpha 1, 그리고 matrix metalloproteinase 1의 발현량을 통해 mRNA 수준에서 진동 자극에 대한 세포 반응을 조사한 결과, 1시간 작동 및 1시간 중단의 주기적 진동이 정적 대조군에 비해 elastin 발현을 2.3배 증가시키는 것으로 나타났습니다.7일 차에 진동 자극은 콜라겐 발현 또한 완만하게 증가시킵니다. 특히 주요 세포외 기질 리모델링 효소인 hyaluronan synthase one과 matrix metalloproteinase one의 발현은 3일 차부터 7일 차까지 진동 신호에 의해 유의미하게 증가한다는 점에 주목할 필요가 있습니다. 동적 배양된 세포는 7일간의 진동 후 Elisa로 검출했을 때, 건조 지지체 무게 1mg당 4.2 ± 0.1 µg의 수용성 엘라스틴을 생성합니다.반면 정적 대조군은 밀리그램당 엘라스틴 2.7 ± 0.2 µg만을 축적합니다. 평균적으로 7일 동안 1시간 간격으로 진동을 가했을 때, 정적 대조군과 비교하여 히알루론산 분비는 2.2배, MMP1 분비는 4.7배 증가했습니다. 본 시스템은 VOCO 형태의 생리학을 연구하기 위해 설계되었으나, 다른 많은 시스템에도 적용 가능합니다.예를 들어, 귀 및 인간 진피 조직 등이 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

합성 음성 접는 모델을 fabricating에 대한 방법론은 설명합니다. 모델은 실물 크기이며, 인간의 보컬 주름의 다층 구조를 모방. 결과는 모델 폐 압력에 비해 압력에 자체 진동과 인간의 보컬 폴드의 것과 유사 흐름 유발 진동 응답을 증명할 보여줍니다.

합성, 멀티 레이어, 셀프 진동 보컬 접어 모델 제작

상피 세포가 3 차원 세포 골재 형성의 결과로 생리적 조건에서 성장할 수있는 회전 세포 배양 시스템이 설명되어 있습니다. 집계는 디스플레이를...

Culturing 및 벽면 선박 생물 반응기를 회전의 응용은 3D 상피 세포 모델을 유래

보컬 폴립은 보컬 접이식 역학을 방해할 수 있으므로 환자의 의사 소통 능력에 치명적인 결과를 초래할 수 있습니다. 벽걸이 모델 용형에 의해 유도된 3차원 유동 분리및 벽 압력 하중에 미치는 영향은 입자 영상 속도측정, 피부 마찰 선 시각화 및 벽 압력 측정을 사용하여 검사됩니다.

모델 보컬 폴드 폴립에 의해 유도된 3차원 유동 분리 조사

배양 세포의 기능적 문제는 3 차원 배양 환경 16-21 -like 생체 내에서 배양함으로써 더욱 향상시킬 수있다. 이 논문은 생체 -like 포유 동물 조직 배양 용 중공 바이오 리액터 시스템의 셋업 및 동작을 설명한다.

에 대한 중공의 생물 반응<em&gt; 생체</em&gt; -처럼 포유류 조직 문화

이 프로토콜의 목표는 관형 전기 스캐폴드에서 인간 대식세포와 근섬유세포의 동적 공동 배양을 실행하여 재료 중심 조직 재생을 조사하는 것이며, 전단 응력과 순환 스트레칭의 분리를 가능하게 하는 생체 반응기를 사용하는 것입니다.

유량 및 스트레치 하에서 생체 재료의 염증 및 재생 능력을 평가하는 다중 큐 생물 반응기

이 프로토콜은 래트 기관지로부터 내인성 상피의 선택적 제거 및 루멘 표면 상의 외인성 세포의 균질한 분포를 허용하는 이미징-활성화된 생물반응기를 기술하고, 이어서 세포-조직 구축물의 장기 시험관내 배양을 허용한다.

생체 공학 기도 조직 생성을 위한 영상 유도 생물반응기

이 연구는 성대 층을 생성하는 특정 방법을 소개하고, 제조 절차에 대한 자세한 설명을 제공하고, 모델의 특성을 특성화하여 끈적임이 없고 매우 부드러운 성대 모델의 제조를 보여줍니다.

비접착식 Super-Soft 보컬 폴드 모델의 제조 공정

우리는 관절 연골 결손에 이전의 이식 연골의 BioComposite을 일축 또는 이축 기계적 변형을 적용 할 수 있습니다 소설 기계적 하중 생물 반응기를 설계했습니다.

조직 공학을위한 이축 기계 로딩 생물 반응기의 설계

발효조는 했나 보지 세포의 배양 수율과 생산성을 향상하는 데 사용됩니다. 쉐이크 플라스크에서 여러 미생물이나 동물 세포 배양 후보를 심사 한 후, 다음 논리적 단계는 발효기로 선택한 문화의 바이오 매스를 증가시키는 것이다. 이 동영상은 일반적인 벤치 탑 생물 반응기 시스템의 설치 및 운영을 보여줍니다.

벤치 탑 생물 반응기의 운전

전체 장기 탈세포화는 재생 의학에 사용될 수 있는 자연적인 생물학적 골격을 생성합니다. 폐 재생의 비인간 영장류 모델에 대한 설명이 제시되는데, 이는 전체 폐가 탈세포화되고 성체 줄기 세포와 내피 세포를 파종하여 혈관 순환과 액체 매체 환기를 촉진하는 생물 반응기에 파종되는 것입니다.

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor(특수 대형 장기 생물반응기를 이용한 비인간 영장류 폐 탈세포화 및 재세포화)

배우세요 진동 자극이 중간엽 줄기세포에 미치는 영향을 바이오리액터를 이용하여 연구하는 방법을. 폴리(ε-카프로락톤) 스캐폴드와 실리콘 멤브레인을 활용하여 성대와 유사한 환경을 조성하고 레이저 도플러 진동 측정법으로 특성을 분석합니다.

소설 보컬 폴드 생물 반응기의 구조 및 특성

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