인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

이 절차의 전반적인 목표는 짧고 재현 가능하며 규명된 프로토콜을 통해 인간 다능성 줄기세포로부터 신경능 전구세포를 생성하는 것입니다. 이렇게 생성된 세포는 인비트로(in vitro)에서 신경능 관련 질환을 연구하거나, 이 세포들을 하위 분화 세포로 지속적으로 분화시키는 데 사용할 수 있습니다. 이는 먼저 고밀도의 인간 다능성 줄기세포를 매트리젤(matrigel) 위에 단층으로 플레이팅함으로써 수행됩니다.

두 번째 단계는 주요 신호 전달 경로에 영향을 미치는 저분자 화합물의 정해진 순서와 조합을 사용하여 세포를 신경 상피 세포로 분화시키는 것입니다. 다음으로, 신경 상피 세포를 재배양하여 신경능 조상 세포로 추가 분화시킵니다. 마지막 단계는 형광 활성 세포 분류법을 사용하여 신경능 세포를 분리하는 것입니다.

최종적으로, 면역형광법과 세포 이동 능력과 같은 기능적 분석을 통해 적절한 신경능세포가 생성되었음을 확인합니다. 인간 다능성 줄기세포로부터 신경능세포를 유도하는 기존 프로토콜과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 기간이 더 짧다는 것입니다. 단 18일이면 가능합니다.

MS5 피더 세포가 필요하지 않기 때문에 재현성이 더 높습니다. 스케일업이 용이하며, 인간 다능성 줄기세포주 간의 재현성이 매우 높습니다. 이 기술의 함의는 신경계 혈통과 관련된 인간 질병 기전 연구로 확장되며, 이러한 질병의 정밀한 인비트로(in vitro) 모델링 및 약물 스크리닝을 개선할 가능성을 보여줍니다.

본 프로토콜을 시작하기 전에 인간 다능성 줄기세포(human pluripotent stem cells) 콜로니가 육안으로 보일 만큼 충분히 크고, 가장자리에 분화된 세포가 거의 없으며 경계가 뚜렷한지 확인하십시오. hPSCs를 분할할 준비가 되면, 배지를 흡입하여 제거하고 1X PBS 5 mL로 한 번 세척한 후, 세포에 0.05% Trypsin-EDTA 4 mL를 첨가합니다. 다음으로, 현미경으로 보았을 때 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts)가 단일 세포 형태로 플레이트에서 떨어져 나갈 때까지 디쉬를 2분 동안 수평으로 강하게 흔들어 줍니다.

HPSC 콜로니는 디쉬에 콜로니 형태로 부착된 상태로 유지됩니다. 이때 즉시 트립신을 완전히 흡입하여 제거하고, 플레이트를 상온에서 2~4분 동안 둡니다. 플레이트에 HES 배지 2 mL를 첨가하고 P 1000 피펫을 사용하여 세포를 떼어냅니다. 세포가 쉽게 떨어지지 않는 경우, 플레이트를 2~3분 더 인큐베이션합니다.

실온에서 세포 현탁액을 10 µM Y 2 7 6 3 2 dihydrochloride가 첨가된 8 mL의 HES 배지가 들어 있는 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 그 후, 이전에 처리된 10 cm 디쉬에서 매트리젤을 흡입하여 제거하고, 매트리젤이 처리된 플레이트에 세포를 1:1 또는 1:2 비율로 분주합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.

세포가 분화 준비가 될 때까지 매일 HES 배지로 배양합니다. 그 후 세포의 밀도가 90%에서 100%에 도달하면 신경 분화를 시작합니다. 이때를 0일차로 합니다.

0일부터 3일까지 매일 0.1 µM LDN-193189와 10 µM SB431542가 포함된 KSR 분화 배지 10 mL를 세포에 공급합니다. 그 후 4일과 5일에는 75% KSR 분화 배지, 25% 분화 배지 2, 0.1 µM LDN-193189 및 10 µM SB431542가 포함된 배지 10 mL를 공급합니다. 6일과 7일에는 0.1 µM LDN-193189와 10 µM SB431542를 추가하고, KSR 분화 배지 50%와 분화 배지 2 50%로 조정된 배지를 세포에 공급합니다.

8일째부터 9일째까지, 0.1 µM LDN 193189 및 10 µM SB 431542가 포함된 25% KSR 분화 배지와 75% N2 분화 배지로 세포를 배양합니다. 이후 9일째와 10일째에, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 poly-L-ornithine, laminin 1 및 fibronectin으로 배양 접시를 준비하여 11일째 세포 재배양에 사용합니다. 11일째에 0.1 µM LDN 193189 및 10 µM SB 431542가 첨가된 N2 분화 배지로 세포를 배양합니다. 10일째 또는 11일째에, 미리 준비한 배양 접시에서 laminin 1 및 fibronectin 용액을 흡입하여 제거하고, 조직 배양 후드 내의 실온에서 20분에서 30분 동안 건조시킵니다.

다음으로, 분화 중인 세포에서 배지를 제거하고 1X PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 각 10 cm 플레이트에 8 mL의 Accutase를 첨가하고 37 °C에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후, 셀 리프터를 사용하여 세포를 떼어낸 다음 Accutase 용액에 세포를 재부유시킵니다.

5 mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 15 mL 원심분리관으로 옮깁니다. 그다음, 튜브에 1X PBS 5 mL를 첨가하고 115 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 1X PBS 10 mL에 다시 현탁합니다. 그런 다음, 단일 세포 현탁액이 되도록 세포 현탁액을 40 µm 세포 스트레이너로 여과합니다.

혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 115 Gs에서 5분 동안 다시 원심분리하여 세포를 침전시킨 후, 보충제가 첨가된 N2 분화 배지 10 µL당 100,000 ~ 150,000 cells 농도가 되도록 세포를 재부유합니다. 리피터 피펫을 사용하여 poly-L-ornithine으로 전처리된 15 cm 배양 접시에 세포 현탁액을 10 µL씩 떨어뜨려 분주합니다.

라미닌 1 및 피브로넥틴을 처리합니다. 액적(droplet)을 상온에서 15~20분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 액적이 흐트러지지 않도록 주의하며 보충된 N2 분화 배지 30 mL를 플레이트에 매우 조심스럽게 첨가합니다.

세포를 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 12일 차에 200 µM as soic acid, 20 ng/mL brain derived neurotrophic factor, 100 ng/mL fiberblast growth factor eight 및 20 ng/mL sonic hedgehog가 포함된 N two 분화 배지 20 mL를 15 cm 디쉬당 주의 깊게 공급합니다.

그런 다음 14일째부터 17일째까지, 200 µM의 ascorbic acid, 20 ng/mL의 brain-derived neurotrophic factor 및 100 ng/mL의 fibroblast growth factor 8만 포함된 N2 분화 배지를 2~3일마다 세포에 공급합니다. 신경능 세포의 재배양에 사용할 수 있도록 16일째와 17일째에 poly-L-ornithine, laminin 1 및 fibronectin으로 플레이트를 준비합니다.

18일 차에 FACS 분석을 수행하고, 형광 활성 세포 분류법(FACS)으로 세포를 분류한 후, 신경능 세포의 수를 세고 115 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠렛을 10 ng/mL가 첨가된 N2 분화 배지에 재현탁합니다.

20 ng/mL의 FGF2, EGF 및 10 µM의 Y 2 7 6 3 2 di hydrochloride를 10 µL당 30,000 cells의 농도로 첨가합니다. poly L-lysine, laminin 1 및 fibronectin으로 미리 코팅하여 준비한 배양 접시를 완전히 건조시킵니다. 그 다음 10 cm 접시당 약 50~70방울의 세포 현탁액을 분주합니다.

드롭렛(droplet)이 흐트러지지 않도록 주의하며, 10 nanograms per milliliter FGF two, 20 nanograms per milliliter EGF 및 10 micromolar Y 2 7 6 3 2 dihydrochloride가 첨가된 N two 분화 배지 20 milliliters를 각 10 centimeter 디쉬에 넣고 실온에서 15분에서 20분 동안 세포를 배양합니다.

그 후 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 37 °C로 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후에는 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 따라 신경능 세포를 유지 및 계대 배양하며, 이 새로운 무피더(feeder-free) in vitro 분화 프로토콜을 사용하여 인간 다능성 줄기세포로부터 18일 만에 신경능 세포를 유도하였습니다.

18일 차의 FACS 분석 결과 HNK-1과 p75 모두에 양성인 세포가 확인되었으며, 이를 통해 신경능선 세포의 존재가 입증되었습니다. 무피더 분화 프로토콜과 피더 세포 의존적 프로토콜 모두에서 신경능선 세포는 신경 로제트 단계를 거쳤습니다. 또한, FACS로 분리된 세포들은 동일한 형태를 보이며 신경능선 마커인 HNK-1과 p75를 발현했습니다. 이 두 가지 분화 프로토콜에서 유도된 신경능선 세포의 전역 유전자 발현을 비교한 결과, 두 세포군 모두 서로 밀접하게 클러스터링되어 있음을 확인하였습니다.

피더 프리(feeder free) 프로토콜을 사용하여 유도한 신경능 세포의 이동 능력을 분석한 결과, 48시간 후 세포들이 스크래치 영역으로 성공적으로 이동했음을 확인하였습니다. 또한, 4일간의 추가 분화 후 mash one 및 touch one에 대해 양성 염색이 확인됨으로써, 이 세포들이 자율신경계 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있음이 입증되었습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 인간 다능성 줄기세포를 신경화하고 인 비트로(in vitro)에서 신경능 전구 세포를 유도하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.