Name: 인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 배우세요 인간 다능성 줄기세포에서 신경 능선 전구세포를 유도하는 무사육층 프로토콜을. 소분자와 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 18일 만에 재현성 높은 세포를 생성하는 방법입니다.

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및 트라이 제도 줄기 세포 이니셔티브 (스타 재단)이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서와 NYSTEM (C026447 C026446)에서 교부금을 통해 고급 연구자를위한 친교에 의해 지원되었다.

1. 문화 미디어, 코팅 식기 hPSCs의 유지 보수의 제조 1.1 미디어 준비 참고 : 최대 2 주 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 살균 및 저장에 대한 모든 미디어를 필터링 할 수 있습니다. 시약 이름, 회사 및 카탈로그 번호는 자료 표에 나와 있습니다. <ol><li> DMEM/10 % FBS : 885 ml의 DMEM, 100 ㎖의 FBS, 10 ㎖ 펜 / Strep의 5 ML L-글루타민을 결합합니다. </li><li> HES - 중간 : 800 ml의 DMEM/F12, 200 ㎖의 KSR, 5 ㎖ L-글루타민, 5 ㎖ 펜 / Strep의, 10 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액 1 ㎖ β-메르 캅토 에탄올을 결합합니다. FGF-2 미디어를 필터링 한 후 10 NG / ㎖를 추가합니다. 주의 : β-메르 캅토 에탄올은 흡입, 섭취, 피부 접촉을 피할 것, 독성이다. </li><li> KSR-차별화 매체 : 820 ml의 녹아웃 DMEM, 150 ㎖의 KSR, 10 ㎖ L-글루타민, 10 ㎖ 펜 / Strep의, 10 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액 1 ㎖ β-메르 캅토 에탄올을 결합합니다. </li><li> N2-differentiati매체 : 980 ml의 dH보다 2 O에 12g의 DMEM/F12 분말을 녹여 1.55 g 포도당, 2g 중탄산 나트륨 100 mg의 APO 인간 트랜스페린을 추가합니다. 매체에 용해 된 솔루션을 추가, 25 mg의 인간 인슐린과 40 ㎕의 1 N NaOH로 2 ㎖ Dh를 2 O 혼합. 100 ㎕의 퓨 트레 디 히드로 클로라이드, 60 μL 셀렌, 100 ㎕의 프로게스테론을 추가하고 dH보다 2 O로 1 L까지의 볼륨을 일정하게 </li></ol> 문화 요리의 1.2 코팅 <ol><li> 리겔 코팅 : 해동 1 ㎖는 용해 될 때까지 나누어지는에 19 ㎖의 DMEM/F12를 피펫으로 리겔 나누어지는 냉동. 40 μm의 셀 스트레이너 및 판 (8) ml/10 cm 접시를 통과하여 덩어리를 제거합니다. 실온에서 1 시간 동안 요리를 품어. 즉시 세포를 도금하기 전에 리겔을 대기음. 참고 : 4 ° C 이상의 온도에서 응집 할 수 있기 때문에 리겔 빠르게 작업 </li><li> PO / 램 / FN 코팅 : 10cm 접시에 15 ㎍ / ㎖의 폴리-L Ornithin 브롬화 수소 산염을 포함하는 1X PBS의 10 ML을 추가. 37 ℃에서 밤새 요리를 품어 한 번 1X PBS로 접시를 씻고 2 ㎍ / ㎖의 마우스 라미닌-I 및 2 ㎍ / ml의 피브로넥틴을 포함하는 1X PBS의 10 ml/10 cm 접시를 추가합니다. 37 ℃에서 밤새 요리를 품다 세포를 도금하기 전에 완전히 솔루션을 제거하고 플레이트에 뚜껑없이 조직 문화 후드의 벽에 그들을 서서 15 ~ 20 분 동안 실온에서 건조시킵니다. 참고 : 요리는 하나 (눈에 보이는) 표면에 결정 구조를 볼 수 있습니다 때 완전히 건조 및 세포 도금을위한 준비가되어 있습니다. 번호판이 건조 상태에서 몇 시간 동안 RT에서 유지 될 수있다. PO / 램 / FN 요리 2 일간 미리 준비해야합니다. 비상 사태의 경우 램 / FN은 2 ~ 4 시간 동안 배양 할 수있다. 그러나, 이는 차선의 분화 / 생존 결과 위험있다. </li></ol> hPSCs 1.3 유지 참고 : hPSCs는 0.1 % 젤라틴 및 mitotically 불 활성화 된 마우스 배아 섬유 아 세포 (M에 유지HES 매체에서 EFS를) 보충 10 NG / ML FGF-2 이전에 10, 12 설명한대로. 세포는 6~8일마다 분할해야합니다. <ol><li> 5 분 동안 실온에서 (마그네슘이나 칼슘없이 1X PBS에서) 8 ㎖의 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 접시. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 신속하게 냉동 MEFs 해동. 10 ㎖ DMEM/10 % FBS에 1 백만 MEFs를 추가합니다. </li><li> 젤라틴을 기음과 세포를 접시. 최소 6 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 한 번 1X PBS로 접시를 씻고 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드로 보충 10 ㎖의 HES 매체를 추가, 준비된 MEF 플레이트에서 DMEM/10의 %의 FBS를 대기음. 매체는 20 분 동안 37 ° C로 예열합니다. 참고 : hPSCs 수동 분할하는 임베디드 현미경 층류 후드가 사용된다. 그러나, 세포는 적절한 대안적인 방법을 사용하여 계대 배양 할 수있다. </li><li> 임베디드 현미경으로 층류 후드에서 셀 리프터를 사용하여 별도의 식민지를 분리하고 그들을 떠 보자. </li><li> 을 사용하여부동 식민지를 대기음 신선하고 따뜻한 MEF 접시에 그들을 파견하는 1 ML의 주사기. 새 접시에 세포의 약 사분의를 전송합니다. 37 ° C에서 알을 품다 </li><li> 신선한 HES 매체 매일 세포를 피드. </li></ol> 차별화를위한 hPSCs 2. 도금 참고 : hPSCs (그림 1B 참조) 분할 또는 도금 차별화 식민지가 대형 인 경우에,하지만 여전히 자신의 테두리에서 가능한 차별화 된 세포와 같은 적은 날카로운 가장자리가되어야한다. 세포 계대 설명서를 사용하여 유지하는 경우 콜로니를 쉽게 눈으로 볼 수 있도록 충분히 커야한다. 이 시점에 맞는 느낌을 얻으려면 하나는 계대없이 2 주 동안 별도의 hPSC 요리를 유지하고 세포에 도달보고를 차별화 / 계대를위한 최적의 시점을 통과 할 수있다. <ol><li> 분화를 시작하기 전에 리겔 1 시간으로 10 센티미터 요리를 준비합니다. 성공적인 매트 리겔이 도포 될 수있다배의 배율로 확인. </li><li> hPSCs 분할 할 준비가되면, 매체를 기음과 세포에 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4 ㎖를 추가합니다. </li><li> 하나 하나의 세포가 현미경으로 접시를 들기로 MEFs을 볼 수 있습니다 적극적으로 될 때까지 2 분 동안 수평으로 요리를 흔들어. hPSC 식민지는 식민지로 첨부 남아있다. </li><li> 즉시 철저하게, 트립신을 대기음 판은 2-4 분 동안 RT에 서 보자. </li><li> 플레이트에 HES - 중간 2 ML을 추가하고 P1000 피펫을 사용하여 세포를 분리. 주 : 세포가 쉽게 표면으로부터 들어 올려 질 수없는 경우에, 플레이트가 다른 2-3 분 동안 RT에서 비어 인큐베이션 될 수있다. </li><li> 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드 보충 8 ML의 HES-매체에 세포를 전송합니다. </li><li> 이전에 준비 10cm 접시에서 리겔을 대기음. 리겔 판에 (한 10cm 접시에서 세포가 2 개의 10 센티미터 요리로 분할됩니다 예를 들어) 1:1 또는 1:2의 세포를 접시. 37 ° 품다밤에 C. 참고 :이 도금은 약 10 만 셀 / ㎠가 발생한다. </li></ol> 신경 분화 3. 유도 참고 : 세포 90-100 % 년 합류 (그림 1C 참조), 일반적으로 다음과 같은 일 때 차별화 (0 일) 시작할 수 있습니다. 정확한 컨 플루가 아직 도달하지 않은 경우가 차별화를위한 준비가 될 때까지, 세포 HES 중간 매일 공급 될 수있다. 대안 적으로, 도금 셀의 초기 수는 증가 될 수있다. <ol><li> 3 0 일에, 0.1 μM의 LDN193189 및 10 μM SB431542를 포함 KSR-분화 매체를 접시 10 ml/10 cm 매일 세포를 공급. </li><li> 하루 4, 5 급지 75 % KSR-분화 매체 및 25 % N2-분화 배지로 세포 LDN193189와 SB431542을 포함 모두. </li><li> 6 일, 7 사료에 50 % KSR-분화 배지와 50 % N2-분화 배지로 세포 LDN193189 및 SB4를 포함 모두31542. </li><li> 하루에 8, 9 공급에 25 % KSR-분화 매체 75 % N2-분화 배지로 세포 LDN193189와 SB431542을 포함 모두. </li><li> 하루 11 세포의 replating 1.2.2에 표시된 날에 9와 10은 PO / 램 / FN 요리를 준비합니다. </li><li> 날 N2-분화 배지로 10 피드 세포 LDN193189와 SB431542를 포함. </li></ol> NC 사양의 물방울 4. Replating <ol><li> 하루 11 대기음 램 / FN의 이전 준비 판에서와 1.2.2에 설명 된대로 그들이, 20 ~ 30 분 동안 실온에서 완전히 건조 보자. </li><li> 분화 세포에서 매체를 제거 1X PBS로 한 번 세포를 씻어 8 ML의 accutase/10 센티미터 요리를 추가합니다. 37 ℃에서 20 분 동안 품어 </li><li> 셀 리프터를 사용하여 세포를 분리하고 5 ㎖ 피펫 accutase에이를 재현 탁. 15 ML 튜브에 현탁액을 전송합니다. </li><li> 1X PBS의 5 ML을 추가, 114 X g에서 5 분 동안 세포를 스핀. </li><li> 10 ㎖ 1 세포를 재현 탁X PBS. 단일 세포 현탁액을 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터링 및 혈구 또는 이에 상응하는 기술을 사용하여 세포 수를 세는 방법을 보여줍니다. </li><li> 아래 세포를 스핀 100,000의 농도 200 μM 아스 코르 빈산 (AA), 20 NG / ML BDNF, 100 NG / ML FGF8, 20 NG / ML SHH, 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드를 포함하는 N2-분화 배지를 재현 탁 -150,000 cells/10 μL. </li><li> 그들이 건조 PO / 램 / FN 15cm 접시에 닿지 않고 서로 가까이 반복 - 피펫, 판 (10) μL 방울을 사용. 참고 : 분화 된 세포의 한 10cm 접시는 일반적으로 약 2 ~ 3 배 15cm 접시 또는 약 100 × 10 μL의 droplets/15 센티미터 요리를 초래한다. </li><li> 물방울 N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y 30 ㎖를 추가하고 37 ℃에서 부화 (방울을 방해하지 않는) 매우 신중하게 한 다음, 20 ~ 30 분 동안 실온에서 서 보자 </li><li> 하루에 12에서주의 깊게 20 ml/15 cm 접시 N2/AA/BDNF/FGF8/SHH으로 세포를 공급. </li><li> 다에서Y 14-17 N2/AA/BDNF/FGF8으로 모든 두 번째 또는 세 번째 날 세포를 공급. </li><li> 하루에 16, 17에 FACS 정렬 후 NC 세포를 replate하는 PO / 램 / FN 판을 준비합니다. </li></ol> 오. 형광 활성화 된 셀 NC 셀들 (FACS)를 정렬 참고 : FACS에 대한 세포의 준비는 약 2 시간이 필요합니다. <ol><li> 18 일째 제거 매체에서 접시에 1X PBS로 한 번 세포를 세척하고 12 ML의 accutase를 추가합니다. 37 ℃에서 20 분 동안 세포를 품어 </li><li> 셀 리프터를 사용하여, 표면으로부터 세포를 분리하고 그들을 플로트하자. 50 ML 튜브로 전송하고 1X PBS 30 ㎖를 추가, 5 ㎖ 피펫을 사용하여 현탁액에 세포를 피펫. 114 X g에서 5 분 동안 세포를 스핀. </li><li> P1000 피펫을 사용하여, 1 ㎖ 2 % FBS / HBSS (HBSS 15 mM의 HEPES를 포함)에있는 세포를 재현 탁. 2 % FBS / HBSS의 19 ML을 추가하고 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터링 할 수 있습니다. 15m 얼음에 세포를 품어항체 블로킹에서 다음 혈구를 사용하여 계산합니다. </li><li> 아래 세포를 스핀 및 2 % FBS / HBSS에서 천만 세포 / ml의 농도로 재현 탁 그들을. </li><li> 컨트롤 만 (APC 만 및 488 만) FACS 염색 흠, 단일 염색 (HNK-1 만 만 P75) 및 이차 항체에 대한 1 백만 세포에게 별도로 각을 설정합니다. </li><li> 적절한 샘플을 1 ㎖ 정학 천만 셀 당 P75 차 항체의 HNK-1과 5 μL의 5 μl를 추가하고 얼음에 20 분 동안 품어. </li><li> 10 ㎖의 1X PBS (114 XG에 원심 분리기 5 분)에서 세포를 세척하고 1 ㎖ 2 % FBS / HBSS에있는 세포를 재현 탁. 적절한 샘플을 1 ㎖ 정학 APC의 2 μL 및 1,000 만 셀 당 488 차 항체의 1 μl를 추가하고 어둠 속에서 얼음에 20 분 동안 품어. 참고 : APC와 488은 각각 HNK-1, P75 염색 여기에 사용되는 이차 항체이다. </li><li> 10 ㎖의 1X PBS로 세포를 씻어 두 번, 500 ㎕의 1 천만 세포를 재현 탁DAPI (0.5에서 NG / μL) 또는 FACS 분석에서 죽은 세포를 제외 할 수있는 대체 라이브 셀 얼룩을 포함하는 2 % FBS / HBSS. </li><li> FACS 튜브를 충당하기 위해 샘플을 전송합니다. </li><li> 세포 수집에 0.5 ㎖의 2 % FBS / HBSS와 FACS 튜브를 준비합니다. 참고 : 세포 및 수집 튜브가 정렬 시간 동안 어둠 속에서 얼음에 보관됩니다. </li><li> DAPI, APC와 488 종류의 DAPI-/HNK-1 + / P75 + 더블 양성 세포를 검출 할 수있는 레이저와 셀 정렬 기계를 사용. 주 : 이들 세포가 정렬 된 모집단에서 제외하기위한 준비 시간 및 셀의 처리는 세포 사멸의 작은 비율에 이르게 DAPI 얼룩 사균에만 따라서 허용한다. 어떤 대안 죽은 / 라이브 얼룩은이 목적을 위해 동일하게 작동합니다. DAPI 자체는 살아있는 세포 인구의 세포 독성을 유발하지 않습니다. </li></ol> 6. 순위 세포의 Replating, NC 유지 보수 및 확장 참고 : FACS 분류 세포는 손이어야한다최적의 생존을 보장하기 위해 특별한주의와 함께했다. 그들을 replating까지 얼음에 있습니다. 와동 또는 가혹를 피펫하지 마십시오. 셀은 튜브를 가볍게 치면 재현 탁 될 수있다. <ol><li> FACS 정렬 한 후, 그 아래로 회전 한 후, NC 세포를 계산하고 N2-분화 배지에서 재현 탁 30,000 세포에서 그들을 replate에 해당하는 양의 10 NG / ML FGF2, 20 NG / ML EGF와 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드로 보충 / 10 μL 방울. </li><li> 완전히 건조 이전에 PO / 램 / FN 접시와 10cm 접시 당 플레이트 약 50 ~ 70 방울을 준비했다. 요리는 20 ~ 30 분 동안 실온에서 서 보자. </li><li> 매우 조심스럽게 방울을 방해하지 않고 N2/FGF2/EGF/Y-27632 20 ml/10 cm 요리를 추가합니다. 37 ° C에서 세포를 품어 </li><li> N2/FGF2/EGF으로 2-3 일마다 세포를 공급. 참고 : 그들은 방울 내에서 말뚝 박기 시작할 때 NC 세포가 확장 또는 계대마다 약 4 ~ 5 일이나된다. </li><li> 통로 NC 세포는 배지, WA 제거SH 세포는 한 번 1X PBS와 및 CM 요리 accutase/10 8 ML을 추가합니다. 37 ℃에서 20 분 동안 품어 </li><li> 5 ㎖ 피펫을 사용하여 플레이트 떨어져 세포를 피펫과 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. PBS 1X 6 ML을 추가합니다. </li><li> 114 X g에서 5 분 동안 세포를 스핀. </li><li> 물방울 μL 20,000 cells/10을 위해 10 NG / ML FGF2, 20 NG / ML EGF와 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드 보충 N2-분화 배지에서 세포를 Resuspend. </li><li> 건조 PO / 램 / FN 판에 10 μL 방울의 세포를 Replate. 요리는 20 ~ 30 분 동안 실온에서 서 보자. </li><li> 조심스럽게 N2/FGF2/EGF/Y-27632 20 ml/10 cm 요리를 추가합니다. 37 ° C에서 알을 품다 참고 : NC 세포가 유지되거나 상대적으로 균일 한 전구 인구로 최대 2 주 동안 확장 할 수 있습니다. 더 이상 문화가 다양한 자손 세포 유형으로 분화하도록 발생할 수 있습니다. </li></ol>

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hESC의 / hiPSCs에서 R-NC 세포의 성공적 분화를 들어 다음과 같은 고려 사항이되어야한다. 그것은 항상 무균 배양 조건에서 작동하는 것이 중요합니다. 특히,이 오염이 성공적 분화를 방해 할 것이기 때문에, 정기적으로 마이코 플라스마 오염 hPSC 배양 물을 시험하는 것이 중요하지만, 좀처럼 hPSC 배양 시각적 검출 될 수 없다. R-NC 차별화 90-100% 세포 밀도에서 시작되어야한다; 낮은 세포 밀도는 세포의 생존과 R-NC 분화의 효율성에 영향을 미친다. 그것은 경험적으로 효율적인 NC 차별화를 지원하는 특정 KSR에서 최적의 농도와 시약의 일부 로트 번호를 확인하는 것이 중요합니다. 세포에서 물방울 일 11시 replated 때, 10 ㎕의 방울 내의 셀 밀도가 높아야하고 유용한 실험적으로 결정된다. 적절한 장미와 NC-형성은 액적 내에서 적절한 세포 밀도에 따라 달라집니다. 우리는 obser을 경험적으로세포가 accutase 치료 후 두 번 이상 세척 할 때 VED는 세포의 생존을 증가 시켰습니다. FAC...

인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC는) 좋은 동물 모델도 기본 조직이 모두 사용할 수있는 인간의 질병의 조사와 미래의 치료에 특히 엄청난 잠재력을 보여 주었다. hESC의 / hiPSC 기술의 적용 예는 다음과 같습니다 특히 관심의 세포는 무제한 수량 1에서 재생 의학에 hESC의 / hiPSCs에서 생성 할 수 있습니다. 세포는 특정 질환을 운반 환자에서 생산하고 시험 관내 질병 모델에서 2,3 확립하는데 사용될 수있다. 이러한 질병 모델은 신약 화합물 4에 대한 탐구뿐만 아니라 효능과 독성 5에 대한 기존의 약물 테스트에서 대규모 약물 검사를 위해 사용될 수있다. 체외 질병 모델이 새로운 질병 메커니즘의 식별로 이어질 수 있습니다. hESC의 / IPSC 기술의 모든 애플리케이션에 특정 작업을하는 것이 중요하다, 잘 정의그 질병에 영향을 D의 세포 유형. 따라서, 고체 및 재현 시험 관내 분화 프로토콜의 가용성은 hESC의 / hiPSC 기술의 모든 응용 프로그램에 대해 매우 중요합니다. 프로토콜의 hESC / hiPSC 라인과 다른 연구자들 사이 최소한의 변화, 시간 비용, 노력, 어려움과 비용뿐만 아니라 최대 재현성을 표시하는 것이 바람직하다. 신경 능선 (NC) 세포는 표피와 신경 상피 세포 사이의 척추 neurulation 동안 등장. 그들은 증식과 배아에 걸쳐 광범위하게 마이그레이션 및 뼈 / 연골, 두개 안면 골격, 감각 신경, 슈반 세포, 멜라닌 세포, 평활근 세포, 장내 신경, 자율 신경, 크롬 친화 세포를 포함, 자손 세포 유형의 인상적인 다양성을 일으키다 , 심장 중격 세포의 치아와 부신 / 갑상선 선의 세포 6. 따라서, NC 세포 매력적인 셀 줄기 세포들에 대한 분류 및 위해 중요이러한 Hirschsprung의 질병 7, 가족 성 자율 신경 8뿐만 아니라 신경 모세포종 9로 암과 같은 질병의 다양한 모델링. 또한, 그들은 체외에서 인간의 배아 발달의 양상을 연구 할 수있는 가능성을 제공합니다. 현재 널리 인간 배아 줄기 세포 (10, 11)에서 NC 세포의 유도에 대한 시험 관내 분화 프로토콜에 적용 분화 35 일까지 요구하고는 MS5 세포와 같은 기질 피더 세포에 신경 유도를 포함하고, 따라서 제대로 정의되지 않은 조건에서 수행된다. 이 NC 세포를 대량으로 생성하는 스케일 업 할 수 있지만, 높은 처리량 약물 스크리닝 4 필요한 예를 들어, 이는 노동 및 비용 집약적이다. 또한, 재현하기 어려울 수 있습니다 신경 근엽, 수동 계대을 포함하고는 hESC의 또는 hiPSC의 큰 다양성에 적용 할 경우, 따라서 특히 전반적인 변동성이 적용됩니다선. 여기서, 피더 세포의 자유 18 일간 ​​프로토콜 NC 세포의 단계적 유도가 도시된다. 이 방법은 현재 사용되는 프로토콜보다 더 짧고 더 정의된다. 또한, 다른 hiPSC 라인 구비 NC 세포 생성에 매우 강력하다. 중요한 것은이 두 프로토콜에 의해 산출 NC 세포가 신경 근엽 (이하 불리는 장미-NC 또는 R-NC)의 경계에서 나오는 것을 알 수있다. 이 프로토콜을 사용하여 유도 된 세포들은 동일한 NC 마커를 표현하고 마이크로 어레이 분석에 함께 클러스터 형태 학적으로 동일하게 보인다. 새로운 프로토콜 (R-NC)를 사용하여 유도 된 NC 세포들은 마이그레이션 및 상기 뉴런으로 분화 할 수 있도록 이전 프로토콜 (MS5-R-NC)를 사용하여 유도 된 NC 세포와 유사한 기능이다. 따라서 세포는 MS5-R-NC 세포와 동시에 사용될 수있다. hESC의 / IPSC에서 NC 세포의 유도를위한 R-NC 세포 프로토콜은 NC의 혈통을 포함 hESC의 / IPSC 기술의 모든 응용 프로그램에 도움이 될 것입니다. &lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 세럼 교체</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>로트 테스트 필요</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>페니신린/스트렙토마이신</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>MEM 최소 필수 아미노산 용액&nbsp;</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올&nbsp;</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>독성</td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF 염기성(FGF2)</td><td>R& D 시스템</td><td>233-FB-001MG/CF</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 파우더&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12500-096</td><td></td></tr><tr><td>글루코스</td><td>시그마</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>소듐 바이카보네이트&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>APO 인간 트랜스퍼린</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>인간 인슐린&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Putriscine dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selenite</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L Ornithin hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Laminin-I</td><td>R& 앰프; D Systems</td><td>3400-010-01</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution에 분배 5 U/ml</td><td>줄기세포 기술</td><td>7013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 디하이드로클로라이드</td><td>Tocris-R& D 시스템</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산&nbsp;</td><td>시그마</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D 시스템</td><td>248-BD</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>R& D Systems</td><td>423-F8</td><td></td></tr><tr><td>마우스 재조합 음파 고슴도치(SHH)</td><td>R& D Systems</td><td>464SH</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>1563-080</td><td></td></tr><tr><td>인간 재조합 EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236EG</td><td></td></tr><tr><td>gelatin (Mg/Ca 없는 PBS)</td> <td>사내</td><td></td><td></td></tr><tr><td>항체:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM</td><td>Sigma</td><td>C6680-100TST</td><td>lot must be tested</td></tr><tr><td>anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)</td><td>Advanced Targeting systems</td><td>AB-N07</td><td>lot should be</td></tr><tr><td>tested APC rat anti-mIgM</td><td>BD Parmingen</td><td>550676</td><td>로트는</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 염소 안티-마우스 IgG1을 테스트해야 합니다&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>로트는</td></tr><tr><td>Anti Oct4 mIgG2b(1:200 희석으로 사용)</td>를 테스트해야 합니다.<td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>로트는 테스트를 거쳐야 합니다</td></tr>.<tr><td>재료/장비:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 배아 섬유아세포(700만 세포/바이알)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6105M</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시: 10cm 및 15cm 플레이트, 원심분리기, FACS 튜브,&nbsp; 피펫, 피펫 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 혈구 분석기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 원심 분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터 (CO2, 습도 및 온도 제어)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td></td><td></td><td></td>이 내장된 세포 배양 층류 후드</tr><tr><td>세포 배양 생물 안전 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 선별 기계, i.e. MoFlo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1ml TB 주사기 27Gx1/2</td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>세포 리프터 폴리에틸렌</td><td>코닝 주식회사</td><td>3008</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 접시에 인간의 질병을 모델링하고 질병이나 사고 후 재생 응용 프로그램에 이식 가능한 세포의 원천으로, 인간의 배아 발달을 연구하기위한 큰 잠재력이있다. 신경 능선 (NC) 세포는 말초 신경계 및 아교, 멜라닌 세포 및 간엽 세포에서 세포와 같은 성숙한 체세포 많은 다양한 대한 전구체이다. 그들은 세포의 운명 사양 및 마이그레이션을 포함하여 인간의 배아 발달의 측면을 연구하는 세포의 중요한 원천입니다. 말단 분화 세포 유형으로 NC 전구 세포의 분화는 또한, 시험 관내에서 인간의 질병을 모델링 질병 메커니즘을 조사하고 재생 의료용 세포를 생성 할 수있는 가능성을 제공한다. 이 문서 hPSCs에서 NC 세포의 유도에 대한 현재 사용할 수있는 체외 분화 프로토콜의 적응을 선물한다. 이 새로운 프로토콜은 diffe 18 일이 필요합니다rentiation는 장치가없는 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 라인뿐만 아니라 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 선 사이에서 쉽게 확장 가능하고 높은 재현성이다. 과거와 현재 프로토콜은 동일한 정체성 NC 세포를 얻을 수 있습니다.

MS5-R-NC 프로토콜 (11)를 통해 R-NC 프로토콜의 두 가지 가장 중요한 개선 피더가없는, 정의 분화 조건 및 시간 요건의 전체적인 단축이다. MS5 피더 셀 (13)는 인간 배아 줄기 세포 (14)로부터의 신경 분화를 지원하기 위해 표시되었습니다 쥐의 골수 유래 기질 세포이다. 인간 배아 줄기 세포 따라서 초기 인간 신경 발달을 흉내 낸, NC 세포가 10 등장하는의 주변에, 저밀도 형태의 상피 구조와 신경 근엽 15에 MS5 피더 세포 배양. 그러나, 분자 및 성장 인자 시그널링 MS5 피더 세포로부터 방출하는지 명확하지 않다. 따라서 분화 조건을 제대로 어려운 재발 실험과 hPSC 라인을 통해이를 재현하고, 정의되어 있습니다. 적절한 신경 유도를 들어, 인간 배아 줄기 세포는 합병증이 MS5 피더 세포에 작은 식민지에서 낮은 밀도로 접종 할 필요가팅 스케일링 업 및 분화 된 세포의 높은 수율에 도달. 2009 년, ...

인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC)에서 파생 된 신경 능선 (NC) 세포는 인간 발달과 질병 모델링을위한 세포 대체 요법에 대한 큰 가능성이있다. 여기에, 현재 널리 사용의 공급이없는 적응<em&gt; 시험관</em&gt; hPSCs에서 NC 세포의 유도를위한 분화 프로토콜이 제공됩니다.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

이 절차의 전반적인 목표는 짧고 재현 가능하며 규명된 프로토콜을 통해 인간 다능성 줄기세포로부터 신경능 전구세포를 생성하는 것입니다. 이렇게 생성된 세포는 인비트로(in vitro)에서 신경능 관련 질환을 연구하거나, 이 세포들을 하위 분화 세포로 지속적으로 분화시키는 데 사용할 수 있습니다. 이는 먼저 고밀도의 인간 다능성 줄기세포를 매트리젤(matrigel) 위에 단층으로 플레이팅함으로써 수행됩니다.두 번째 단계는 주요 신호 전달 경로에 영향을 미치는 저분자 화합물의 정해진 순서와 조합을 사용하여 세포를 신경 상피 세포로 분화시키는 것입니다. 다음으로, 신경 상피 세포를 재배양하여 신경능 조상 세포로 추가 분화시킵니다. 마지막 단계는 형광 활성 세포 분류법을 사용하여 신경능 세포를 분리하는 것입니다.최종적으로, 면역형광법과 세포 이동 능력과 같은 기능적 분석을 통해 적절한 신경능세포가 생성되었음을 확인합니다. 인간 다능성 줄기세포로부터 신경능세포를 유도하는 기존 프로토콜과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 기간이 더 짧다는 것입니다. 단 18일이면 가능합니다.MS5 피더 세포가 필요하지 않기 때문에 재현성이 더 높습니다. 스케일업이 용이하며, 인간 다능성 줄기세포주 간의 재현성이 매우 높습니다. 이 기술의 함의는 신경계 혈통과 관련된 인간 질병 기전 연구로 확장되며, 이러한 질병의 정밀한 인비트로(in vitro) 모델링 및 약물 스크리닝을 개선할 가능성을 보여줍니다.본 프로토콜을 시작하기 전에 인간 다능성 줄기세포(human pluripotent stem cells) 콜로니가 육안으로 보일 만큼 충분히 크고, 가장자리에 분화된 세포가 거의 없으며 경계가 뚜렷한지 확인하십시오. hPSCs를 분할할 준비가 되면, 배지를 흡입하여 제거하고 1X PBS 5 mL로 한 번 세척한 후, 세포에 0.05% Trypsin-EDTA 4 mL를 첨가합니다. 다음으로, 현미경으로 보았을 때 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts)가 단일 세포 형태로 플레이트에서 떨어져 나갈 때까지 디쉬를 2분 동안 수평으로 강하게 흔들어 줍니다.HPSC 콜로니는 디쉬에 콜로니 형태로 부착된 상태로 유지됩니다. 이때 즉시 트립신을 완전히 흡입하여 제거하고, 플레이트를 상온에서 2~4분 동안 둡니다. 플레이트에 HES 배지 2 mL를 첨가하고 P 1000 피펫을 사용하여 세포를 떼어냅니다. 세포가 쉽게 떨어지지 않는 경우, 플레이트를 2~3분 더 인큐베이션합니다.실온에서 세포 현탁액을 10 µM Y 2 7 6 3 2 dihydrochloride가 첨가된 8 mL의 HES 배지가 들어 있는 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 그 후, 이전에 처리된 10 cm 디쉬에서 매트리젤을 흡입하여 제거하고, 매트리젤이 처리된 플레이트에 세포를 1:1 또는 1:2 비율로 분주합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.세포가 분화 준비가 될 때까지 매일 HES 배지로 배양합니다. 그 후 세포의 밀도가 90%에서 100%에 도달하면 신경 분화를 시작합니다. 이때를 0일차로 합니다.0일부터 3일까지 매일 0.1 µM LDN-193189와 10 µM SB431542가 포함된 KSR 분화 배지 10 mL를 세포에 공급합니다. 그 후 4일과 5일에는 75% KSR 분화 배지, 25% 분화 배지 2, 0.1 µM LDN-193189 및 10 µM SB431542가 포함된 배지 10 mL를 공급합니다. 6일과 7일에는 0.1 µM LDN-193189와 10 µM SB431542를 추가하고, KSR 분화 배지 50%와 분화 배지 2 50%로 조정된 배지를 세포에 공급합니다.8일째부터 9일째까지, 0.1 µM LDN 193189 및 10 µM SB 431542가 포함된 25% KSR 분화 배지와 75% N2 분화 배지로 세포를 배양합니다. 이후 9일째와 10일째에, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 poly-L-ornithine, laminin 1 및 fibronectin으로 배양 접시를 준비하여 11일째 세포 재배양에 사용합니다. 11일째에 0.1 µM LDN 193189 및 10 µM SB 431542가 첨가된 N2 분화 배지로 세포를 배양합니다. 10일째 또는 11일째에, 미리 준비한 배양 접시에서 laminin 1 및 fibronectin 용액을 흡입하여 제거하고, 조직 배양 후드 내의 실온에서 20분에서 30분 동안 건조시킵니다.다음으로, 분화 중인 세포에서 배지를 제거하고 1X PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 각 10 cm 플레이트에 8 mL의 Accutase를 첨가하고 37 °C에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후, 셀 리프터를 사용하여 세포를 떼어낸 다음 Accutase 용액에 세포를 재부유시킵니다.5 mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 15 mL 원심분리관으로 옮깁니다. 그다음, 튜브에 1X PBS 5 mL를 첨가하고 115 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 1X PBS 10 mL에 다시 현탁합니다. 그런 다음, 단일 세포 현탁액이 되도록 세포 현탁액을 40 µm 세포 스트레이너로 여과합니다.혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 115 Gs에서 5분 동안 다시 원심분리하여 세포를 침전시킨 후, 보충제가 첨가된 N2 분화 배지 10 µL당 100,000 ~ 150,000 cells 농도가 되도록 세포를 재부유합니다. 리피터 피펫을 사용하여 poly-L-ornithine으로 전처리된 15 cm 배양 접시에 세포 현탁액을 10 µL씩 떨어뜨려 분주합니다.라미닌 1 및 피브로넥틴을 처리합니다. 액적(droplet)을 상온에서 15~20분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 액적이 흐트러지지 않도록 주의하며 보충된 N2 분화 배지 30 mL를 플레이트에 매우 조심스럽게 첨가합니다.세포를 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 12일 차에 200 µM as soic acid, 20 ng/mL brain derived neurotrophic factor, 100 ng/mL fiberblast growth factor eight 및 20 ng/mL sonic hedgehog가 포함된 N two 분화 배지 20 mL를 15 cm 디쉬당 주의 깊게 공급합니다.그런 다음 14일째부터 17일째까지, 200 µM의 ascorbic acid, 20 ng/mL의 brain-derived neurotrophic factor 및 100 ng/mL의 fibroblast growth factor 8만 포함된 N2 분화 배지를 2~3일마다 세포에 공급합니다. 신경능 세포의 재배양에 사용할 수 있도록 16일째와 17일째에 poly-L-ornithine, laminin 1 및 fibronectin으로 플레이트를 준비합니다.18일 차에 FACS 분석을 수행하고, 형광 활성 세포 분류법(FACS)으로 세포를 분류한 후, 신경능 세포의 수를 세고 115 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠렛을 10 ng/mL가 첨가된 N2 분화 배지에 재현탁합니다.20 ng/mL의 FGF2, EGF 및 10 µM의 Y 2 7 6 3 2 di hydrochloride를 10 µL당 30,000 cells의 농도로 첨가합니다. poly L-lysine, laminin 1 및 fibronectin으로 미리 코팅하여 준비한 배양 접시를 완전히 건조시킵니다. 그 다음 10 cm 접시당 약 50~70방울의 세포 현탁액을 분주합니다.드롭렛(droplet)이 흐트러지지 않도록 주의하며, 10 nanograms per milliliter FGF two, 20 nanograms per milliliter EGF 및 10 micromolar Y 2 7 6 3 2 dihydrochloride가 첨가된 N two 분화 배지 20 milliliters를 각 10 centimeter 디쉬에 넣고 실온에서 15분에서 20분 동안 세포를 배양합니다.그 후 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 37 °C로 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후에는 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 따라 신경능 세포를 유지 및 계대 배양하며, 이 새로운 무피더(feeder-free) in vitro 분화 프로토콜을 사용하여 인간 다능성 줄기세포로부터 18일 만에 신경능 세포를 유도하였습니다.18일 차의 FACS 분석 결과 HNK-1과 p75 모두에 양성인 세포가 확인되었으며, 이를 통해 신경능선 세포의 존재가 입증되었습니다. 무피더 분화 프로토콜과 피더 세포 의존적 프로토콜 모두에서 신경능선 세포는 신경 로제트 단계를 거쳤습니다. 또한, FACS로 분리된 세포들은 동일한 형태를 보이며 신경능선 마커인 HNK-1과 p75를 발현했습니다. 이 두 가지 분화 프로토콜에서 유도된 신경능선 세포의 전역 유전자 발현을 비교한 결과, 두 세포군 모두 서로 밀접하게 클러스터링되어 있음을 확인하였습니다.피더 프리(feeder free) 프로토콜을 사용하여 유도한 신경능 세포의 이동 능력을 분석한 결과, 48시간 후 세포들이 스크래치 영역으로 성공적으로 이동했음을 확인하였습니다. 또한, 4일간의 추가 분화 후 mash one 및 touch one에 대해 양성 염색이 확인됨으로써, 이 세포들이 자율신경계 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있음이 입증되었습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 인간 다능성 줄기세포를 신경화하고 인 비트로(in vitro)에서 신경능 전구 세포를 유도하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

feeder-free-derivation-neural-crest-progenitor-cells-from-human

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

체외에서 신경 크레스트 줄기 세포 (NCSC)을 육성하기 위해 특수 매체 (NCSCM)가 필요합니다. NCSCM의 필수적인 부분은 여자의 배아 추출물 (시)입니다. 우리는 여기서 고립, 물에 담가서 부드럽게 함, 원심 분리 및 여과 공정과 같은 세부 사항을 포함하여 순수하고 고품질시의 최대 금액을 생산하는 정확한 방법을 설명합니다.

Murine 신경 크레스트 줄기 세포의 배양 칙의 배아 추출 생산

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

신경 튜브의 배아 신경 능선의 분리가의 사용을...

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

만능 인간 줄기 세포의 neuronal 차별화 (hPSCs)에 대한 프로토콜은 종종 시간이 소요되어 있으며 상당한 세포 배양 기술을 필요로합니다. 여기, 우리는 통제 된 방식으로 인간의 뉴런의 간단 신속하고 효율적인 생성을 허용하는 multititre 판 형식으로 작은 분자 기반의 차별화 절차를 적응하고 있습니다.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

이 작품은 신경 능선을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 색소, 성숙한 멜라닌 세포를 생산하고 공급이없는 25 일간의 프로토콜을 사용하여 중간 단계 멜라닌하는 체외 분화 프로토콜을 설명합니다.

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

여기서, 우리는 피더-및 제노프리 조건에서 인간 다능성 줄기 세포로부터 혈생 내피를 정밀하게 형성하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 치료 화합물에 대한 질병 모델링 및 스크리닝에 광범위한 응용 프로그램을 가질 것이다.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

이 프로토콜에서, 우리는 인간 만능 줄기 세포에서 포스트 갱글리오닉 교감 뉴런의 생성을위한 안정적이고 매우 효율적인 분화 전략을 설명합니다. 이 모델은 여러 자율 장애의 연구의 사용을 위해 뉴런을 사용할 수 있게 합니다.

피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건 하에서 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 후갱이온 교감 뉴런의 효율적인 분화

우리는 마우스 배아 줄기 세포에서 두개골 신경 능선 세포를 생성하기 위해 재현 가능한 크기의 신경구를 생성하는 3차원(3D) 체외 분화 프로토콜을 제시합니다. 우리는 이 방법론이 이전 프로토콜에 비해 변동성을 줄이고 두개골 신경 능선 세포 발달을 연구하기 위한 다중 분석에 어떻게 사용할 수 있는지 보여줍니다.

Cranial Neural Crest Cells Multiplexed Assay를 위한 3차원 In Vitro Differentiation Protocol

배우세요 인간 다능성 줄기세포에서 신경 능선 전구세포를 유도하는 무사육층 프로토콜을. 소분자와 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 18일 만에 재현성 높은 세포를 생성하는 방법입니다.

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

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