행동 경험에 따라 뇌 샘플에서 전사 역학의 종합 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 행동 경험 이후 마우스의 전사 역학과 특정 뇌핵을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 동물들을 순화시키고 식염수 주입 후의 운동 활성도를 기록함으로써 이루어집니다. 순화가 완료되면 코카인을 단회 투여한 후 운동 활성도를 기록하고, 측좌핵(nucleus accumbens)에서 샘플을 채취하여 RNA 분리 및 cDNA 준비에 사용합니다.

다음으로, 행동에 의해 유도된 유전자 발현을 연구하기 위해 QPCR 분석을 수행합니다. 최종적으로 코카인 경험 이후의 전사 역동성을 보여주는 결과를 얻게 됩니다. 실험 프로토콜 시연은 실험실 관리자인 Dr.Hatu, 대학원생 Dum Muer, 그리고 학부생 Duran이 수행하며, 3일 연속으로 진행됩니다. 각 마우스는 핸들링 및 주사 절차에 적응 과정을 거치며, 실험 시작 전 마우스를 케이지에 배치하여 향후 케이지 간 이동이 없도록 하고 마우스가 장기간 격리되지 않도록 합니다.

테스트 시작 30분 전에 모든 테스트 케이지를 행동 실험실로 옮겨 동물이 환경에 적응하도록 합니다. 250 µL의 식염수를 복강 내 주사한 직후, 마우스를 행동 챔버에 넣어 15분 동안 운동 활성도를 모니터링합니다. 마우스는 행동 챔버에 20분 동안 머무를 수도 있습니다.

2분부터 17분까지 활동을 모니터링합니다. 다음 2일 동안 하루 중 같은 시간에 이 단계들을 반복합니다. 넷째 날에는 그룹에 따라 코카인 또는 식염수를 단회 투여하고, 즉시 생쥐를 챔버에 넣어 코카인 노출 후 선택된 시점에서 20분 동안 국소 운동 활동을 모니터링합니다. 이후 뇌를 적출하여 얼음처럼 차가운 A CSF 용액에 1~2분 동안 담가 냉각 및 경화시킵니다.

소뇌를 제거하고 과잉 액체를 흡수시킨 후, 뇌의 주둥이 쪽(rostral part)이 위를 향하도록 vibram 스테이지에 접착합니다. 챔버를 차가운 A CSF로 채우고, nucleus accumbens가 명확하게 확인될 때까지 200 micron 두께로 절편을 만듭니다. 절단하는 동안 뇌량(corpus callosum)의 형태, 전교합(anterior commissure) 및 뇌실(ventricles)의 위치와 형태에 세심한 주의를 기울이십시오.

정확한 부위를 확인한 후, 실체 현미경 하에서 측좌핵을 분리하기 위해 400 micron 두께의 절편 두 개를 자릅니다. 미세 칼날을 사용하여 절편에서 측좌핵을 분리해 냅니다. 정확한 부위에 칼날을 네 번 빠르게 움직이면 적절한 조직을 즉시 분리할 수 있습니다.

분리된 조직을 900 µL의 lysis reagent에 넣고 RNA 추출 전까지 -80 °C에서 보관하십시오. 튜브를 37 °C에서 녹이기 시작한 후 균질화합니다. 25 gauge 바늘을 사용할 때, 처음 몇 차례는 조직을 튜브 벽면으로 밀어 작은 조각으로 균질화하는 과정이 어려울 수 있습니다. 적절한 균질화를 확인하기 위해, 용해물을 kaya shredder mini spin column에 피펫으로 옮긴 후 원심분리하십시오.

용해물을 새로운 미세 원심분리 튜브에 피펫으로 옮기고 제조사의 지침에 따라 RNA를 추출합니다. RNA 정제 후, cDNA로의 역전사 및 분석을 위해 선택한 유전자 군을 표적으로 하는 프라이머를 이용한 샘플의 표적 특이적 preamplification을 수행합니다. 이러한 절차는 프로토콜의 텍스트 버전에 설명되어 있습니다.

포괄적인 QPCR 분석을 위한 상용 미세유체 칩은 48x48 포맷과 96x96 포맷으로 제공됩니다. 48x48 포맷은 48개의 샘플을 48개의 프로브 세트로 분석할 수 있게 하며, 96x96 포맷에서는 96개의 샘플을 96개의 프로브로 분석합니다. 대부분의 경우, 칩의 선택은 주로 분석할 샘플의 수에 따라 결정됩니다.

먼저, 실험에 선택한 칩에 따라 샘플 혼합물을 준비합니다. 20 XDNA 결합 염료 샘플 로딩 시약을 파이펫팅할 때 주의하십시오. 샘플 혼합물 용액을 최소 20초 동안 교반하고 최소 30초 동안 원심 분리합니다.

준비된 반응물은 칩 로딩 준비가 될 때까지 4°C에서 단기간 동안 보관할 수 있습니다. 다음으로, 어세이 믹스를 준비하고 샘플 믹스를 충분히 흔들어 섞은 후, 원심분리하여 모든 구성 성분을 가라앉힙니다. 앞서 보았듯이, 동적 배열(dynamic array) IFC 칩에는 샘플과 어세이용 입구뿐만 아니라 미세유체 챔버에 압력을 가하는 데 사용되는 컨트롤 라인 유체용 지정 입구가 있습니다.

먼저, 칩의 각 어큐뮬레이터에 제어 라인 유체를 주입합니다. 그다음, 칩을 IFC 컨트롤러에 장착하고 적절한 스크립트를 실행하여 칩을 프라이밍합니다. 스크립트 실행이 완료되면, 프라이밍된 칩을 IFC 컨트롤러에서 꺼내고 각 어세이 5 µL를 피펫팅합니다.

칩 위에서 혼합합니다. 각 시료 혼합액 5 µL를 해당 입구에 넣고 IFC 컨트롤러 소프트웨어를 사용하여 칩을 IFC 컨트롤러로 되돌립니다. 스크립트를 실행하여 시료와 분석 시약을 칩에 로드합니다.

로드 믹스(load mix) 스크립트가 완료되면, IFC 컨트롤러에서 로드된 칩을 제거하십시오. 다음으로, 칩을 써멀 사이클러(thermal cycler)에 장착하고 멜팅 커브 분석(melting curve analysis)이 포함된 새로운 칩 런(chip run)을 생성하십시오. 써멀 사이클러 소프트웨어를 사용하여 반응 챔버가 제대로 인식되었는지 확인하고, 반응이 완전히 끝날 때까지 진행하십시오.

단회성 급성 코카인 주입 후 운동 활성이 증가한 것이 나타났습니다. 이 관상면 절편에서 굵은 흰색 선은 측좌핵의 경계를 정의하기 위해 절개한 위치를 표시합니다. 박리 과정 중, c-Fos 및 phos B를 대상으로 하는 프라이머의 증폭 곡선은 프라이머 쌍이 표적 전사체를 약 100% 효율로 증폭시킴을 보여줍니다.

매 주기마다, 코카인은 노출 후 1시간 및 2시간 뒤에 nucleus accumbens 내 CFOs와 phos B의 발현을 가장 높게 유도하는 것으로 결과가 나타났습니다. 이 절차 이후에는 새로운 미특성 전사체를 식별하기 위해 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.