Name: 라이브 쥐의 대퇴부 골수 흡인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 학습하세요 생쥐 대퇴부 골수 흡인법으로 반복 채취가 가능한 비살상적 방법입니다. 이 기술은 조혈세포 분석과 장기 연구에 활용되며 흐름 세포측정법으로 결과를 검증합니다.

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O.A.-W.는 NIH K08 Clinical Investigator Award(1K08CA160647-01), U.S. Department of Defense Postdoctoral Fellow Award in Bone Marrow Failure Research(W81XWH-12-1-0041), Josie Roberston Investigator Program 및 Evan's Foundation의 지원을 받는 Damon Runyon Clinical Investigator Award의 지원을 받고 있습니다.

이 프로토콜에 설명 된 모든 동물의 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 실시하고, 메모 리얼 슬로안 - 케터링 암 센터의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUCs)에 의해 승인되었다. 대퇴골에서 골수의 1. 흡인 (BM) 세포 <ol><li> 정밀 기화기 투여 이소 플루 란 (1-4 %)과 대퇴 골수 흡인을 받게 될 것이다 마우스를 마취. 마취 심도가 수술 조작 및 / 또는 귀, 발가락, 테일 핀치와 관련된 호흡에 변화가없는 것을 관찰함으로써 절차 내내 매 50-10 분을 모니터해야한다. 마취는 이소 플루 란으로 유도하고 또한 이소 플루 란과 절차를 통해 유지된다. 0.05-0.1 밀리그램의 부 프레 노르 핀 투여 량의 선제 사전 절차 용량 / kg 피하 매 6-12 시간은 ADJ로 절차와 관련된 통증을 방지하는데 사용될 수있다Carprofen에 unct. </li><li> 각막 건조를 방지하기 위해 마취의 마우스 다음 유도의 눈 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 모피는 신중하게 의도 열망 사이트의 면적보다 약 150 % 더 큰 피부의 영역에서 잘립니다. 느슨한 모피는 촉촉한 거즈 패드로 제거됩니다. 절차를 수행하는 동안 저체온증을 방지하기 위해 순환 온수 패드 또는 다른 안전한 온도 조절 장치로 통제 된 표면에서 마우스를 보관하십시오. </li><li> (포비돈 요오드 (베타 딘) 또는 클로르헥시딘 (Nolvasan) 스크럽 70 % 이소 프로필 알코올이나 70 % 에탄올을 적신 거즈 스폰지 하나와 교류) 교류 수술의 세 가지 세트로 포부를 받게 될 것이다 대퇴골을 포함하는 전체 다리를 소독. </li><li> BM을 흡입하기 전에 멸균 인산 완충 생리 식염수 (PBS)으로 :; : 0.5 ㎖ 투베르쿨린 주사기 (27.5 G 게이지 0.5 cc의 볼륨)을 적 십니다. PBS의 200 ~ 500 ㎕ 씩 주사기를 입력하고 즉시 PBS를 추방. 이 절차 2-3t를 반복IME를. </li><li> 반지 손가락 또는 다섯 번째 손가락 하나와 경골을 눌러 대퇴골에서 경골의 굴곡을 유지합니다. 적절한 마취 비행기가 달성되었는지 확인합니다. 주사기는 엄지와 집게 손가락을 사용하여 유지된다. 이는 관절 구가 노광 될 수 있도록하고 바늘의 삽입을 용이하게한다. </li><li> 바늘이 대퇴골 두 관절 구 사이에 단단히 박혀되도록 주사기를 적시 한 후, 슬개를 통해 바늘을 삽입합니다. 엄지 손가락과 집게 손가락으로 대퇴골 골단 부근 골간을 유지함으로써, 바늘이 쉽게 대퇴골의 샤프트에 삽입된다. </li><li> 이 대퇴골 축과 평행이되도​​록 외측으로 상향 바늘 스위블. 이 작업은 대퇴골 축에서 골수 내용의 검색을 용이하게한다. </li><li> 대퇴 골수 구멍으로 천천히 누르면서 시계 반대 방향으로 바늘을 시계 방향으로 돌려. 온화 싸이 이동하여 바늘의 정확한 위치 확인옆으로 ringe. </li><li> 앞뒤로 BM 캐비티 내에서 바늘을 이동하는 동안 부드럽게, 부정 압력을 생성, 다시 바늘 플런저를 잡아 당깁니다. 주 : 흡입 된 BM의 부피는 일반적으로 0.4-0.8 × 106 단핵 세포에 상당 약 5 μL 것이다. 성공 열망은 주사기의 기지에있는 바늘의 위쪽에있는 혈액의 모양을 시각적으로 확인 될 것이다. 피가 주사기에서 볼 경우 그것은 작은 뼈 또는 조직 조각이 바늘에 걸린 가능성이 높습니다. 이것은 (이것은 주사기 BM 흡입 전에 PBS로 채워져해야 하나의 이유이다) PBS에 상하 플런저를 이동함으로써 바늘로부터 제거 될 수있다. 조직이 주사기로부터 빠질 수없는 경우, 새로운 바늘과 주사기 (다시 PBS의 200-500 μL와 주사기를 젖은 상태) 사용. </li><li> BM이 성공적으로 대퇴골에서 흡입되면, 대퇴골 및 마우스에서 바늘과 주사기를 제거합니다. </li><li> 의 미세 튜브 홍보에 흡입 된 BM 이동PBS 500 μL와 efilled. 대부분의 응용 프로그램, BM 세포는 추가 처리를 가능하면 때까지 얼음에 보관해야합니다. </li><li> 절차의 완료 후, 5 ㎎ / ㎏ 피하 carprofen으로 진통을 관리 할 수​​ 있습니다. 그 후 마취에서 마우스를 제거하고 완전히 회복 될 때까지 가열 패드에 배치합니다. 참고 : 만약 제대로 흡입 절차에 따라 경험 합병증이나 고통이 없어야합니다. </li><li> 주택 지역에 마우스를 반환하기 전에, 그들은 음식과 물을 ambulate 및 도달 할 수 있는지. 다음 24 시간에 고통이나 감염 후 절차의 징후 쥐를 관찰합니다. 증상은 다음을 포함한다 : 지속적인 출혈, 빈혈, 혼수를. 이러한 징후는 포스트 절차를 보이는 경우, 동물 (들) 안락사한다. 주 : BM 흡입 / 샘플링을 반복 할 수 있지만 반복 절차는 동일 다리 반복 외상을 방지하기 위해 대향 대퇴골을 수행하여야한다. FR에 대한 가능한 약간의 정보가있다equency 그 BM 열망을 수행 할 수 있습니다. 대퇴 골수 흡입은 일반적으로 더 자주 매 2 주 이상 반복되지 않습니다. </li></ol> 으로 발음 BM 세포의 세포 내용의 2. 평가 <ol><li> 4 O를 C 또는 RT에서 5 분 300 XG에서 원심 분리하여 미세 원심 분리 튜브에 BM 열망과 장소에서 검색 펠렛 세포. </li><li> 뜨는을 대기음 후 ACK 적혈구 세포 용해 버퍼 ( &quot;암모늄, 염화 칼륨,&quot;용해 버퍼) 500 μL에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 10 분 동안 적혈구 용해 완충액에 세포를 부화 후 PBS 1 ㎖를 추가하고 4 입출력 C 또는 RT에서 5 분 동안 300 XG에 다시 혼합물을 스핀 다운. 참고 : 적혈구 용해 펠릿 지금 BM 단핵 세포로 구성되어 있습니다. 이들은 FACS 염색, 세포 계수, 이식, cytospin 분석 및 / 또는 기타 사용 (희생 생쥐에서 수확 BM 세포를 사용하는 것처럼)에 재현 탁 할 수있다. </li></ol>

<ol><li>Sundberg, R., Hodgson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+of+bone+marrow+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aspiration of bone marrow in laboratory animals.</a> Blood. 4, 557-561 (1949).</li>
<li>Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+technique+for+intrafemoral+injection+and+bone+marrow+sampling+in+mouse+transplant+models%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models.</a> Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).</li>
<li>Warner, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+cooperating+genetic+events+in+the+leukemic+transformation+of+normal+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells.</a> Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).</li>
<li>Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-initiating+cells+in+human+T-lymphoblastic+leukemia+exhibit+glucocorticoid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance.</a> Blood. 116, 5268-5279 (2010).</li>
<li>Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+isolation%2C+and+stimulation+of+quiescent+primitive+leukemic+progenitor+cells+from+patients+with+acute+myeloid+leukemia+%28AML%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML).</a> Blood. 101, 3142-3149 (2003).</li>
<li>Nolta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gold+standard+improves%3A+a+better+assay+for+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The gold standard improves: a better assay for HSCs.</a> Blood. 106, 1141-1142 (2005).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Purton, L., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).</li>
<li>Dykstra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+propagation+of+distinct+hematopoietic+differentiation+programs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo.</a> Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).</li>
<li>Jordan, C., Lemischka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+systemic+analysis+of+long-term+hematopoiesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse.</a> Genes & development. 4, 220-232 (1990).</li>
<li>Challen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt3a+is+essential+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Nature genetics. 44, 23-31 (2012).</li>
<li>Hess, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+based+on+CD133+and+high+aldehyde+dehydrogenase+activity+isolates+long-term+reconstituting+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells.</a> Blood. 107, 2162-2169 (2006).</li>
<li>Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+myeloerythroid+repopulation+after+intrafemoral+transplantation+of+NOD-SCID+mice+reveals+a+new+class+of+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells.</a> Nat Med. 9, 959-963 (2003).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

직렬 BM 열망은 인간의 혈액 학적 장애의 임상 연구에 중요한 일상적인 절차입니다. 긴 실험을 통하여 세포의 구성 및 BM의 성분의 특성에 마우스에서 BM의 유사한 일련의 샘플링을 수행 할 수있는 능력 역시 매우 중요합니다. 이 절차는 마우스를 희생하지 않고 또한 말초 혈액의 내용이 BM에 거주하는 세포의 반사되지 않을 수 인스턴스에서 BM있는 추가적인 세포 유형의 존재를 검출하기위한 HSPC의 특성화에 유용하다. 직렬 BM 열망은 인간 세포의 존재, 예를 들어 3 면역 억제 마우스에 이종 이식 모니터링이 나중에 목적을 위해 매우 효과적으로 사용되어왔다. 0.4-0.8 × 106 세포는 일반적으로 각 BM 흡인으로 검색되는 것을 감안할 때, 이러한 세포는 세포 학적 분석 (도 1a)을 포함한 다수의 목적, 디아 위해 이용 될 수있다영지 유동 세포 계측법 (도 1b), 세포 (도 1c)의 배양 등 정...

모든 혈액 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)에서 유래합니다. 동물을 희생할 필요 없이 생쥐와 남성의 대다수 HSC 부위인 골수(BM)에 접근할 수 있는 절차는 조혈의 원인을 연속적으로 모니터링할 수 있는 자원을 제공합니다. 여기에 설명된 절차의 전반적인 목표는 마우스의 희생을 통해 BM 세포의 기존 수확에 의해 회수될 세포를 대표하는 물질을 제공하는 살아있는 마우스의 대퇴골에서 BM 세포의 샘플링을 위한 상세한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 기존의 BM 세포 수확에 비해 이 절차의 장점은 이 절차가 마우스의 희생을 필요로 하지 않으므로 시간이 지남에 따라 마우스의 골수 구획에 대한 종단 연구가 가능하다는 것입니다. 
이 쥐 골수 흡인 절차는 많은 연구에서 사용되어 왔으며 이전에 설명되었습니다 (Sundberg et al. 역사적 검토를 위해1), 이 기술을 설명하는 공식적인 단계별 절차는 이전에 발표되지 않았습니다. 이 프로토콜은 외인성으로 마우스에 도입된 세포의 BM에 있는 생착 평가 (예를 들어2,3의 경우 이종 이식 연구에서 수행됨), 말초 혈액의 그것과 비교하기 위한 BM의 키메라 분석(결과가 반드시 일치하지는 않는 경우), 조혈 줄기 및 전구 세포와 같이 골수에서 일반적으로 풍부하게 하는 특정 세포 유형의 풍부함을 모니터링하는 등의 목적으로 BM의 일상적인 연속 샘플링을 가능하게 합니다. 및 생체 외 배양 및/또는 이식을 위한 BM 세포 회수. 또한, 말초 혈액에서 질병이 뚜렷하지 않을 수 있는 시점에서 흡인이 혈액 질환 부담을 평가하는 데 도움이 되기 때문에 골수 함량 평가는 혈액 질환의 쥐 모델에서 매우 유용할 수 있습니다3-5. 또한, 이 기술은 치료 연구에서 투여된 약물에 대한 골수 내 혈액 질환의 반응을 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 따라서 여기에 설명된 절차는 마우스에 대한 희생이나 해를 입히지 않고 세포학적 분석, 유세포 분석, 체외 배양 및/또는 생체 내 이식 연구를 위해 마우스의 골수 조혈 세포에 액세스하고자 하는 조사자에게 이상적입니다. 
여기에 설명된 BM 샘플링 프로토콜은 골수강에 직접 재료를 대퇴골 내 주입하는 데 사용되는 기술과 매우 유사합니다3,6. 가장 큰 차이점은 이 프로토콜은 대퇴골 내 주사와 같이 골수 공간 내에 물질을 직접 주입하는 것과는 대조적으로 골수에서 세포를 제거하는 절차를 자세히 설명한다는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>둔감한 혈청 알부민</td><td>PAA</td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 완충액</td> 1 L.에서 <td>수제</td><td></td><td>. pH를 조정하십시오 7.2 ~ 7.4 및 0.22 &mu로 무균 여과기; m 진공 필터.</td></tr><tr><td>8.3 g 염화 암모늄</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>1 g 중탄산 칼</td>륨 <td>Fisher Scientific</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l 0.5 M EDTA pH 8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15-842</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 투베르쿨린 주사기 27.5 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>멸균 세포 여과기 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Attane</td><td>NDC:66794-014-25</td><td></td></tr><tr><td>무툼 바늘</td><td>Stemcell Technologies</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 바늘 23 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 주사기 Luer-Lok 팁</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>비조직 배양 처리 플레이트, 6 웰</td><td>Becton Dickinson</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm 5 ml 튜브&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352054</td><td>FACS 염색</td></tr><tr><td>12 x 75 mm 5 ml 튜브(세포 여과기 캡 포함</td>) <td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>FACS 염색</td></tr><tr><td>NK1.1 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108723</td><td></td></tr><tr><td>CD11b APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>101225</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103223</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>100222</tr><tr><td>Ly-6G 및 Ly-6C(Gr-1) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108423</td><td></td></tr><tr><td>Ter119 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>302217</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>317417</td><td></td></tr><tr><td>CD117(c-KIT) PE</td><td>BioLegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6A/E(Sca-1) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>122513</tr><tr><td>CD34 APC</td><td>Biolegend</td><td>128612</td><td></td></tr><tr><td>CD16/32 e450</td><td>eBioscience</td><td>48-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>STEMCELLTECHNOLOGIES</td><td>3434</td><td>메토셀룰로오스 배양용</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Crescent Chemical 회사</td><td>C11045850</td><td>1회 투여량(5mg/kg)&nbsp;</td></tr><tr><td>유세포 분석기, LSRFortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puralube vet 연고 (멸균 바셀린 안과 연고)</td><td>Dechra-US</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

라이브 쥐의 대퇴부 골수 흡인

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

골수(BM)의 세포 구성에 대한 연속 샘플링은 임상 혈액학에 중요한 일상적인 절차입니다. 이 프로토콜은 BM에 존재하는 세포의 연속 특성화를 허용하는 살아있는 마우스의 유사한 절차에 대한 자세한 단계별 기술 절차를 설명합니다. 이 절차는 예를 들어 이종 이식 연구에서 수행되는 것처럼 마우스의 BM 내에서 외인성으로 투여된 세포의 존재를 감지하는 것을 목표로 하는 연구를 용이하게 합니다. 또한, 이 절차는 마우스를 희생하지 않고 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)와 같은 BM이 풍부한 세포의 검색 및 특성화를 가능하게 합니다. 말초 혈액의 세포 구성이 반드시 골수에 존재하는 줄기 및 전구 세포의 비율과 유형을 반영하는 것은 아니라는 점을 감안할 때, 생쥐를 제거하지 않고 이 구획에 접근할 수 있는 절차는 매우 도움이 됩니다. 골수 세포의 세포학적 분석, 조혈 줄기/전구 격실의 유세포 분석 특성화, 기존 골수 수확과 비교하여 대퇴골 BM 흡인으로 얻은 분류된 HSPC의 배양을 위해 대퇴골 골수 흡인의 사용이 여기에 설명되어 있습니다.

라이브 C57/B6 마우스의 대퇴골 BM 흡입은 희생 후의 같은 종래의 마우스 BM 수확 하였다 BM 단핵 세포를 수득하는 데에 이용 하였다. 이 방법에 의해 얻어진 BM 단핵 세포이어서, BM 세포 (1) 세포 학적 분석에 의해 분석 (2) 조혈 줄기 / 전구 세포의 상대적인 주파수 (HSPCs)를 결정하고, 소트 HSPCs (3) 체외 배양 하였다. 후자의 실험, 혈통 부정적인 SCA1 + C-KIT에서 + (LSK) 세포는 BM 흡인에 의해뿐만 아니라 기존의 BM 수확 단핵 세포에서 분류되었다. 각각의 방법에 의해 얻어진 150 LSK 세포는 다음 기술 중복 7 일 동안 골수 - 적혈구 사이토 카인을 포함하는 메틸 반 고체 미디어 도금했다. 그림 1에 나타낸 데이터, B는 대량 세포와 HSPCs의 유사한 유형 및 비율이 형태 학적으로 볼 대퇴 BM 흡인 또는 기존의 BM 수확 중 하나를 사용하여 유세포 분석 흐름되었다는 것을 보여줍니다.<...

이 프로토콜은 마우스를 희생하지 않고 대퇴골수(BM)를 연속적으로 샘플링하는 절차를 설명합니다. 이 절차는 시간 경과에 따른 마우스의 BM 구성에 대한 종단 연구를 용이하게 하고 생체 외 및 이식 연구를 위해 BM 내 세포에 대한 직렬 액세스를 제공합니다.

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

이 절차의 전체적인 목표는 살아있는 마우스의 대퇴골 골수 공간에서 골수 조혈 세포 성분을 안전하게 흡인하는 것입니다. 우선 투베르쿨린 주사기에 PBS를 채워 준비함으로써 이를 수행합니다. 두 번째 단계에서는 골수 추출에 최적화된 각도로 마우스의 다리를 조심스럽게 배치합니다.그런 다음 대퇴골 골수강에서 조혈 세포를 흡인하고 적혈구를 제거합니다. 최종적으로, 골수 성분이 성공적으로 흡인되었는지는 유세포 분석 및 세포학적 분석을 통해 시각적으로 확인할 수 있습니다. 이번 시연은 저희 실험실의 매우 유능한 기술자인 Rock Chung 님이 진행하시겠습니다.기존의 골수 채취 방식과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 동물을 살려두어 지속적인 관찰과 연속 분석이 가능하게 하면서 골수 조혈 세포의 일부를 회수할 수 있다는 점입니다. F, 발가락 꼬집기로 진정 상태를 확인한 후, 마취된 마우스의 눈에 안연고를 도포하여 각막 건조를 방지하고 다리 털을 밀어 피부를 노출시킵니다. 그 후 클로르헥시딘 소독제로 해당 부위를 문지르고 알코올 솜으로 닦아내어 피부의 무균 수술 준비를 수행합니다.이 과정은 총 3회 반복하며, 각 동물마다 개봉하지 않은 새로운 멸균 주사기와 바늘을 사용합니다. 적절한 마취 단계에 도달했는지 확인하십시오. 다음으로, 0.5 milliliter 투베르쿨린 주사기에 멸균 PBS를 적신 후, 식염수를 200 to 500 milliliters 흡입하고 즉시 배출하는 과정을 2~3회 반복합니다.그다음, 한쪽 손의 마지막 두 손가락 중 하나를 사용하여 경골(tibia)을 대퇴골(femur)로부터 부드럽게 구부려 대퇴골의 과간 공간(condylar space)을 노출시키고 바늘 삽입을 용이하게 합니다. 이제 바늘을 슬개건(patellar tendon)을 통해 삽입하여 대퇴골의 두 과(condyles) 사이에 단단히 고정시킵니다. 다른 쪽 손의 엄지와 검지를 사용하여 대퇴골의 골간(diaphysis)을 골단(epiphysis)에 가깝게 잡아 바늘이 뼈의 간부(shaft)로 쉽게 삽입될 수 있도록 합니다.주사기에 혈액이 보이지 않는다면, 작은 뼈나 조직 조각이 바늘에 걸려 있을 가능성이 높습니다. PBS 내에서 플런저를 위아래로 움직여 바늘에서 이를 제거할 수 있습니다. 조직이 주사기에서 제거되지 않을 경우, 새 바늘과 주사기를 사용하십시오.다시 200에서 500 µL의 PBS로 주사기를 적십니다. 그런 다음, 바늘을 대퇴골 간(shaft of the femur)과 평행이 되도록 과상돌기 공간(condylar space)에 밀착시킨 상태에서 시계 방향과 반시계 방향으로 회전시킵니다. 이는 대퇴골 간으로부터 골수 내용을 더 쉽게 회수하기 위함입니다.바늘을 시계 방향과 반시계 방향으로 회전시키면서 대퇴골 골수강 내로 천천히 밀어 넣습니다. 주사기를 옆으로 살짝 움직여 바늘이 정확한 위치에 있는지 확인합니다. 그다지 바늘 플런저를 천천히 뒤로 당겨 음압을 형성하면서, 골수강 내에서 바늘을 앞뒤로 움직입니다.주사기 하단의 바늘 끝부분에 혈액이 나타나면 흡인이 성공적으로 이루어진 것입니다. 대퇴골에서 골수를 성공적으로 흡인한 후, 바늘을 뼈에서 제거하고 흡인된 골수를 얼음 위에 둔 500 µL의 PBS가 미리 채워진 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 진통제를 투여한 후, 생쥐를 보온 램프 아래에서 회복시킨 다음 사육 구역으로 돌려보냅니다.마우스가 보행할 수 있고 먹이와 물에 접근할 수 있는지 확인하십시오. 그 후 마우스를 케이지로 돌려보내고, 시술 후 24시간 동안 괴로움이나 감염 징후가 있는지 관찰하십시오. 그동안 골수 세포를 원심 분리하고, PBS를 조심스럽게 흡입하여 제거한 뒤 펠릿을 재현탁하십시오.적혈구 용해 버퍼 500 µL에서 10분 후, 1 mL의 PBS로 세포를 세척합니다. 펠릿에는 실험 분석에 사용할 수 있는 골수 단핵 세포가 포함되어 있습니다. 이 초기 수치들은 대퇴골 골수 흡인법 또는 전통적인 골수 채취법 중 어느 쪽을 사용하더라도, 형태학적 분석과 유세포 분석을 통해 벌크 세포 및 조혈 줄기 및 전구 세포의 유사한 유형과 비율을 관찰할 수 있음을 보여줍니다.여기 총 생존 세포 대비 lineage 음성 SKA1 양성 C kit 양성 및 골수성 전구세포 하위 집단의 비율을 세 차례의 독립적인 흡인 및 일반적인 골수 채취 결과로 나타내었습니다. 이 데이터는 일반적인 골수 채취와 비교하여 대퇴골 흡인으로 수집된 골수에서 lineage 음성 SKA1 양성 C kit 양성 및 골수성 전구세포 하위 집단이 감소했음을 보여줍니다. 이러한 차이는 해당 집단에 대해 통계적으로 유의하지 않았습니다.하지만 lineage 음성, ska one 양성, cki 양성 세포를 분리하여 Methylcellulose에서 ex vivo 배양하면 대퇴골 골수 흡인을 통해 얻은 것과 유사한 수의 콜로니와 세포 유형을 얻을 수 있습니다. 일반적인 골수 채취와 마찬가지로, 두 배양법 모두에서 관찰 및 수치화된 콜로니 유형에는 과립구, 적혈구, 단핵구 및 거핵구 콜로니 형성 단위, 과립구 및 단핵구 콜로니 형성 단위, 그리고 적혈구 burst 형성 단위 One master가 포함됩니다. 이 절차를 올바르게 수행한다면 마리당 10분 이내에 완료할 수 있습니다.면역결핍 마우스에 이식된 인간 조혈 세포의 제노그라프트(xenograft) 효과는 무엇인가와 같은 추가적인 의문점을 해결하기 위해 대퇴골 내 골수 주입과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

femoral-bone-marrow-aspiration-in-live-mice

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

동물 모델은 자주 뼈에 암 전이를 공부하는 활용하고 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 뼈 전이 연구에 대한 종양 접종의 일반적인 두 가지 방법을 설명하고 간략하게이 모델을 모니터링하고 정량화하기 위해 이용 분석의 일부를 설명합니다.

뼈 전이의 모델

이 비디오는 백혈병과 같은 혈액 질환이 있는 환자의 전체 BM 결함을 조사하기 위해 마우스의 뒷다리에서 신선한 전체 골수를 분리하는 자세한 프로토콜을 설명합니다.

쥐 뒷다리에서 채취한 골수

단핵구는 선천성 면역의 핵심 조절자이며 말초 단핵 식세포 시스템의 재생과 염증의 경우에 중요한 역할을 합니다. 이 원고는 단핵구 동원 메커니즘을 연구하기 위해 마우스 칼바리아 골수를 실시간으로 이미징하는 절차를 설명합니다.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

골수의 조직학적 데이터를 정량적으로 분석하는 전략을 제시합니다. 조직 절편에서 형광 표지된 세포에 대한 컨포칼 현미경 검사는 자동으로 분석되는 2차원 이미지를 생성합니다. 다양한 세포 유형의 공동 국소화 분석을 시뮬레이션된 이미지의 데이터와 비교하여 세포 상호 작용에 대한 정량적 정보를 제공합니다.

조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

이 프로토콜은 생체 내에서 대퇴골수에서 세포의 움직임을 추적하는 데 사용할 수 있는 새로운 쥐 대퇴골 창 챔버 모델을 설명합니다. 생체 내 다광자 형광 현미경은 시간이 지남에 따라 대퇴골수의 세 가지 구성 요소(혈관 구조, 콜라겐 매트릭스 및 호중구)를 이미지화하는 데 사용됩니다.

대한 대퇴골 창 회의소 모델<em&gt; 생체</em쥐의 골수에서&gt; 셀 추적

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

Murine 닫힌된 대 퇴 골절 모델 골절 치유를 공부 하는 강력한 플랫폼 이며 뼈 재생을 촉진 하는 새로운 치료 전략. 이 수술 프로토콜의 목표는 일방적인 폐쇄 대 퇴 골절 대 퇴 골을 안정화 하는 intramedullary 강철 막대를 사용 하 여 마우스에 생성.

마우스에 닫힌된 대 퇴 골절의 발생: 뼈 치유 연구 모델

여기서, 우리는 호중구 계보 세포의 고차원 질량 세포측정 (비행 시간, CyTOF에 의한 세포 측정) 분석을 위해 마우스 또는 인간으로부터 분리 된 신선한 골수 (BM)를 처리하는 프로토콜을 제시한다.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

우리는 골수 이식의 세 가지 방법을 설명 (BMT): 총 몸 조사와 BMT, 차폐 조사와 BMT, 그리고 마우스 모델에서 클로날 조혈의 연구를위한 사전 컨디셔닝 (입양 BMT)와 BMT 방법.

클로날 조혈을 연구하기 위해 마우스에 있는 골수 이식 절차

이 프로토콜은 쥐 이종 이식 모델에서 유전자 편집 세포를 포함한 몇 가지 조혈 또는 백혈병 줄기 세포의 대퇴 내 주사를 설명하며, 이를 통해 세포의 빠르고 안전한 이식뿐만 아니라 골수의 연속 분석도 가능합니다.

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 집단을 분리하고 특성화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 질병 진행에 따라 내피 및 중간엽 기질 세포를 포함한 비조혈 골수 틈새의 변화를 식별합니다.

골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 골수 미세환경 집단 식별

학습하세요 생쥐 대퇴부 골수 흡인법으로 반복 채취가 가능한 비살상적 방법입니다. 이 기술은 조혈세포 분석과 장기 연구에 활용되며 흐름 세포측정법으로 결과를 검증합니다.

라이브 쥐의 대퇴부 골수 흡인

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