라이브 쥐의 대퇴부 골수 흡인

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 쥐의 대퇴골 공간에서 골수 조혈 세포 내용물을 안전하게 흡인하는 것입니다. 이것은 첫 번째 결혼식, PBS가 있는 투베르큘린 주사기에 의해 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 마우스의 다리를 골수 채취를 위한 최적의 각도로 조심스럽게 배열합니다.

그런 다음 조혈 세포를 대퇴골 골수 공간에서 흡인하고 적혈구를 고갈시킵니다. 궁극적으로 골수 함량의 성공적인 흡인은 유세포 분석 및 세포학적 분석을 통해 시각화할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 매우 재능 있는 기술자인 젊은 Rock Chung이 될 것입니다.

기존 골수 적출과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 통해 골수의 조혈 세포의 일부를 회수하는 동시에 동물을 살아 있게 하여 지속적인 관찰 및 연속 분석을 수행할 수 있다는 것입니다. F, 발가락 꼬집기로 진정 확인 후 마취된 마우스의 눈에 안과 연고를 도포하여 각막 건조를 방지하고 다리를 면도하여 피부를 노출시킵니다. 그런 다음 클로르헥시딘 소독제로 해당 부위를 문지른 다음 알코올 면봉으로 피부를 무균 수술로 준비합니다.

이 과정을 세 번 완료하고 개봉하지 않은 신선한 멸균 주사기와 바늘이 각 동물에 사용됩니다. 적절한 마취 평면에 도달했는지 확인합니다. 다음으로 0.5 밀리리터의 투베르큘린 주사기를 멸균 PBS와 함께 적신 다음 흡입하고 즉시 200-500 밀리리터의 식염수를 2-3 회 말소합니다.

그런 다음 한 손의 마지막 두 손가락 중 하나를 사용하여 경골을 대퇴골에서 부드럽게 구부려 대퇴골의 과두 공간을 쉽게 노출하고 바늘을 삽입할 수 있도록 합니다. 이제 슬개골 힘줄을 통해 바늘을 삽입하여 대퇴골의 두 과두 사이에 단단히 고정되도록 합니다. 다른 손의 엄지와 검지를 사용하여 골단을 대퇴골 골단 가까이에 잡고 바늘을 뼈 축에 쉽게 삽입할 수 있도록 합니다.

주사기에 혈액이 보이지 않으면 작은 뼈나 조직 조각이 바늘에 끼어 있을 가능성이 있습니다. 이것은 PBS에서 플런저를 위아래로 움직여 바늘에서 제거할 수 있습니다. 주사기에서 조직을 제거할 수 없는 경우 새 바늘과 주사기를 사용하십시오.

다시 말하지만, 200-500 마이크로 리터의 PBS로 주사기를 적십니다. 그런 다음 바늘을 시계 방향과 시계 반대 방향으로 돌리면서 대퇴골 축과 평행이 되도록 과두 공간에 밀어 넣습니다. 대퇴골 축에서 골수 내용물을 쉽게 회수할 수 있도록 합니다.

바늘을 시계 방향과 시계 반대 방향으로 돌리면서 대퇴골 골수강으로 천천히 밀어 넣습니다. 주사기를 옆으로 부드럽게 움직여 바늘의 올바른 위치를 확인합니다. 그런 다음 바늘 플런저를 부드럽게 뒤로 당겨 바늘을 골수 강 내에서 앞뒤로 움직이면서 음압을 생성합니다.

성공적인 흡인은 주사기 바닥의 바늘 상단에 혈액이 나타나는 것으로 확인됩니다. 대퇴골에서 골수가 성공적으로 흡인되면 뼈에서 바늘을 제거하고 흡인된 골수를 얼음 위에 500마이크로리터의 PBS가 미리 채워진 마이크로 퓨지로 옮깁니다. 진통제를 투여한 후, 쥐를 주거 지역으로 되돌리기 전에 쥐가 열 램프 아래에서 회복되도록 합니다.

그들이 걸어 다닐 수 있고 음식과 물에 접근할 수 있는지 확인하십시오. 그런 다음 쥐를 우리로 되돌리고 다음 24시간 동안 시술 후 동물에게 고통이나 감염의 징후가 있는지 관찰합니다. 그 동안, 골수 세포를 스핀다운하고 PBS를 조심스럽게 흡인하고 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

10분 후 500마이크로리터의 적혈구 용해 완충액에서 1ml의 PBS로 세포를 세척합니다. 펠릿에는 실험 분석에 사용할 수 있는 단핵 세포의 골수가 들어 있습니다. 이 첫 번째 그림은 대퇴골 골수 흡인 또는 기존 골수 수확을 사용하여 형태학적 및 유세포 분석을 통해 벌크 세포와 조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 유사한 유형과 비율을 관찰할 수 있는 방법을 보여줍니다.

여기에서는 계통 음성, SKA 1개, 양성 C, 키트 양성 및 골수성 전구 세포 하위 집단의 비율을 3개의 독립적인 흡인 및 기존 골수 수확에서 총 살아있는 세포의 빈도로 보여줍니다. 이러한 데이터는 대퇴 흡인에 의해 채취한 골수에서 혈통 음성 SKA one, 양성 C 키트 양성 및 골수성 전구 하위 집단이 기존 골수 수확에 비해 감소했음을 보여줍니다. 이 차이는 인구에 대해 통계적으로 유의하지 않았습니다.

그러나 계통 음성 ska one 양성 cki 양성 세포를 분류한 후 메틸셀룰로오스에서 생체 외 배양을 수행하면 대퇴골수 흡인에 의해 얻어지는 유사한 콜로니 수와 세포 유형이 생성됩니다. 기존의 골수 채취와 마찬가지로 두 배양에서 관찰 및 열거된 집락 유형에는 과립구, 적혈구, 단핵구 및 거핵구 집락 형성 단위, 과립구 및 단핵구 집락 형성 단위 및 적혈구 파열 형성 단위가 포함됩니다. 이 기술은 이 절차에 따라 적절하게 수행되면 마우스당 10분 안에 완료할 수 있습니다.

대퇴골 내 골수 주사와 같은 다른 방법을 수행하여 인간 조혈 세포에서 면역이 저하된 마우스에 대한 이종 이식의 효과는 무엇입니까?