Name: MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 빠른 확인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 29 s
Description: 배우세요 MALDI-TOF 질량 분석을 이용한 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 신속한 동정 방법입니다. 원심분리와 포름산 추출 단계를 통해 임상 미생물학에서 조기 진단이 가능합니다.

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<html> &quot;긍정적&quot;으로 1. 혈액 문화 묽은 수프 깃발 <ol><li> 지속적인 모니터링 배양 장에서 신호 혈액 배양 병을 제거하고 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 참고 : 병이 유해 미생물을 포함 할 수 있으며, 보편적 인 조치가 될 필요가있다. 때문에 샘플링 전염성 에어로졸의 위험, 모든 샘플링 절차는 바이오 안전성 클래스 II 층류 캐비닛에서 수행해야합니다. </li></ol> 2. 그램 얼룩은 준비가되어 있습니다 <ol><li> 지역 기관 프로토콜에 따라 신호 혈액 배양액에서 그람 염색을 준비합니다. 참고 : 그람 음성균이 현미경에서 확인하는 경우 혈액 배양액은 다음의 방법에 따라 처리됩니다. 그람 양성균이 확인 될 때, 유전자 식별 및 저항 마커를 대상으로 다른 분자 방법은 (이 문서에 언급되지 않음) 국물 (13)에 적용된다. </li></ol>혈청 분리 관에 신고 된 혈액 문화 국물의 전자 &quot;&gt; 3. 전송 <ol><li> 조심스럽게 2 배를 반전시켜 혈액 배양 병을 섞는다. </li><li> 생물 안전 캐비닛 내에서 안전 혈액 이송 장치에 10 ML의 주사기를 연결합니다. </li><li> 혈액 배양 병에 피 전사 장치를 부착하고 주사기로 배양액 5 ㎖를 철회. 혈청 분리 관에 흡입 된 BC 국물을 전송합니다. </li></ol> 혈액 배양액 4. 집중 <ol><li> 적혈구의 큰 볼륨을 제거 15 분 동안 1,250 XG에서 혈청 분리 튜브를 원심 분리기. </li><li> 대기음 즉시 젤 / 액체 인터페이스 위의 버피 코트의 약 1 ㎖를 남겨주의하면서 멸균 전송 피펫을 사용하여 상층 액을 버린다. 주 : 호기성 병 겔 / 유체 인터페이스는 불투명 백색으로 나타나는 튜브의 바닥에 적혈구의 명확한 분리를 보여준다. 반면에, 언제젤 /​​ 유체 인터페이스로 인해 용해 적혈구의 구성 요소가 뜨는에 남은 것에 깊은 붉은 색으로 표시되는 용해성 혐기성 혈액 배양 국물에 적용. </li></ol> 5. 원심 분리 세척 단계를 반복 <ol><li> 부드럽게 멸균 피펫 젤 인터페이스 위 버피 코트 유체의 마지막 1 ㎖를 혼합 한 후 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 전체 볼륨을 전송합니다. 30 초 동안 288 XG에 새로운 튜브를 원심 분리기. </li><li> 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 플라스틱 일회용 1 ㎖ 전송 피펫을 사용하여 상층 액을 전송하고 펠릿으로 튜브를 폐기하십시오. 참고 :주의는 펠릿의 전송을 방지하기 위해 촬영이 단계에서 중요하다. 이 상등액 색소 남아 펠릿 항상 명확하게 볼 수없는 등 혐기성 BC 병에서 처리되는 시료에 특히 중요하다. </li></ol> 잔여 세포의 6. 용해 </p&gt; <ol><li> 원심 분리기 1 분 후 대기음 (및 폐기)에 대한 18,407 XG에 시료 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 작은 잔류 액을 남길 수있는 뾰족한 전송 피펫을 사용하여 상층 액. </li><li> 아래로 피펫 팅에 의해 멸균 DNA 분해 효소 및 RNAse가없는 물 1 ㎖에 잔류 펠렛을 Resuspend. 참고 : 일부 작가가 아닌 실행 가능한 박테리아를 렌더링하는 펠렛을 재현 탁 멸균 물 대신 알코올 용액을 사용하는 방법을 설명했다. </li><li> 1 분 동안 18,407 XG에서 재현 탁 솔루션을 원심 분리기. </li></ol> 세균 단백질의 7. 추출 <ol><li> 기음과 다시 가능한 한 많은 액체가 제거되었는지 보장 좋은 팁 피펫으로 흡입을 사용하여 상층 액을 버린다. </li><li> 10 ㎕의 포름산 (70 % V / V)의 펠렛을 재현 탁. 주 : 피부와 접촉하면 흡입하거나 경우 개미산이 몸에 영향을 줄 수 있습니다. 솔루션을 준비하거나 조작하는 경우는 R입니다직원이 개인 보호 장비뿐만 아니라 연기 캐비닛을 사용하는 것이 ecommended. </li><li> 동질적인 재현 탁 솔루션을 보장하기 위해 피펫을 사용하여 잘 섞는다. 물리적으로 펠렛을 방해하기 위해 피펫 팁을 사용하여 더욱 균질 한 용액을 보장하기 위해 필요할 수있다. </li></ol> MALDI-TOF의 8. 준비 표적 판 <ol><li> 대상 지점 당 제조 된 현탁액을 2 μL 깨끗한 MALDI-TOF의 표적 판을 접종. 실패 읽고 가끔 문제를 극복하기 위해 각 샘플에 대한 3 대상 사이트를 준비합니다. </li><li> MALDI-TOF 대상 플레​​이트가 건조하도록 허용합니다. 건조 속도는 플레이트에 걸쳐 공기 유동을 극대화하기 위해 흄 후드의 가장자리에 판을 배치함으로써 증가 될 수있다. </li><li> 매트릭스 용액 1 μL (10 밀리그램 / 밀리리터 α-시아 노 -4 - 히드 록 시신 남산 (HCCA), 50 % 아세토 니트릴, 2.5 % 트리 플루오로 아세트산)으로 각각 건조 스폿 오버레이. 참고 :이 콘타에 와서 경우 ​​흡입하거나 경우 매트릭스 솔루션은 몸에 영향을 미칠 수피부 CT. 준비하거나 솔루션을 조작 할 때 그것은 직원이 개인 보호 장비뿐만 아니라 연기 캐비닛을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> MALDI-TOF의 표적 판은 전술 한 바와 같이 연기 찬장의 가장자리에 건조하도록 허용합니다. 균일 한 준비가 접시에 목표 지점을 각각 채워 확인합니다. </li></ol> 질량 분석기에 9. 장소 MALDI-TOF 표적 판 <ol><li> MALDI-TOF 질량 분석기에 MALDI-TOF 대상 플레​​이트를 삽입합니다. 판 스프링이 장착 된 플레이트와 같은 높이 앉아되어 있는지 확인합니다. 참고 : 모든 대상 지점이 건조 될 때까지 표적 판을 삽입하지 않습니다. </li><li> 고무 씰이 필요한 진공 상태를 생성 할 수 있도록 보풀, 먼지와 머리카락 청소 해주십시오. </li><li> MALDI-TOF 단계 뚜껑을 닫은 후 기기 전면의 &quot;IN / OUT&quot;버튼을 누릅니다. 뚜껑은 지금 잠그고 필요한 진공이 생성 될 수 있습니다. </li></ol> 10. MALDI-TOF MS Spectra 취득 <ol><li> MALDI Biotyping 및 FlexControl 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 타이핑 소프트웨어 내에서 &quot;파일&quot;이라는 제목의 드롭 다운 메뉴에서 &quot;새 분류&quot;를 선택합니다. 프로젝트의 이름을 누른 다음 &quot;새&quot;를 선택합니다. 타이핑 소프트웨어에서 설치를 완료하려면 &quot;다음&quot;을 선택합니다. </li><li> 제어 소프트웨어 창에서 표적 판의 화면의 그래픽을 확인합니다. 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 접종 장소 위로 마우스를 이동하여 사용중인 MALDI-TOF 목표 지점을 선택합니다. </li><li> 선택된 대상 위치의 아무 곳이나 클릭 한 다음 드롭 다운 메뉴에서 &quot;분석 물을 추가&quot;를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 사용합니다. </li><li> 대상 지점의 각각에 대해 &quot;ID&quot;열 혈액 문화 식별 정보를 추가하고 &quot;다음&quot;완료되면 클릭합니다. </li><li> 상업 &quot;분류법&quot;스펙트럼 데이터베이스를 선택하고 &quot;다음&quot;을 선택합니다. 참고 보ratories 참조 스펙트럼의 개수를 증가시키는 실내 또는 상용 데이터베이스 추가로 이용할 수있다. </li><li> &quot;마침&quot;을 클릭하고 MALDI-TOF MS는 스펙트럼을 생성하기 시작합니다. 참고 : MALDI-TOF 설정 제조의 설정 (선형 긍정적 인 모드, 60 Hz에서 레이저 주파수, 20 kV의 가속 전압 16.7 kV의의 IS2 전압, 170 나노초 추출 지연 및 2,000-20,137 M / Z 범위)에 따라했다. </li><li> MALDI 제어 소프트웨어가 피크를 생성하는 데 실패하는 경우에, 스펙트럼의 설명서 취득 (방법은 설명하지) 수행 될 수있다. </li></ol> MALDI-TOF MS 점수의 11. 포스트 분석의 해석 <ol><li> 스펙트럼 획득 및 분석이 완료되면, 각 대상에 대한 식별 목록을 확장 타이핑 소프트웨어를 종 식별 옆에있는 &quot;+&quot;버튼을 선택합니다. </li><li> 상위 5가 비슷한 경우주의, 상위 5 식별을 공부한다. 점수가 동일한 대상의 ≥ 1.7과 불협화음의 상위 5 세대자리가 혼합 된 배양액의 가능성을 제기했다. 참고 : MALDI-TOF 기술이 혼합 된 배양액의 검출별로 감도를 가지고 있습니다. 배양액은 혼합 된 종을 포함한다 예를 들어, 높은 신뢰 점수 혼합 종 중 단 하나를 위해 식별 될 수있다. </li><li> 점수 ≥ 2.0, 목표 지점에서 가장 높은 경기를 언급 할 때 종을보고합니다. </li><li> 목표 지점에 가장 높은 점수가 1.7 ≥하지만 &lt;2.0 만 세대를보고됩니다. 상위 5 식별의 추가 조건이 조화 된 경우, 다음 종 수준으로보고합니다. </li></ol> MALDI-TOF 표적 판 12. 제거 <ol><li> 모든 스펙트럼은 MALDI-TOF 시스템의 &quot;IN / OUT&quot;버튼을 눌러 완료되면. </li><li> MALDI-TOF 표적 판 소켓을 열고 MALDI-TOF 대상 플레​​이트를 제거합니다. </li><li> 재사용 가능한 MALDI-TOF 대상 플레​​이트, 알코올을 사용하여 깨끗한 모든 대상 지점을 사용하여 깨끗하고 건조되면 RT에 MALDI-TOF 판을 저장하는 경우. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

후 원심 분리 단계가 분리 된 구성 요소를 리믹스하지 충분한주의 수행 혈액 배양액에 MALDI-TOF MS를 적용 할 때 그것은 중요합니다. 그것은 MALDI-TOF 스펙트럼을 간섭 스파이크를 생성 할 수있다 헤모글로빈 등 혈액 배양 성분 및 인간 세포 단백질을 제거하는 것이 특히 중요하다. MS는 종 ≥ 2.0의 점수를 잘라 속 식별을위한 ≥ 1.7 추천 제조 있지만, 다른 보고서는 BC 국물 10,12,14-18에 적용 할 때 구현 될 수있다 낮은 로그 점수 (≥ 1.4 ≥ 1.6에이 범위)를 제안했습니다. 임상 미생물학 실험실에서 낮은 MS 식별 점수의 구현은 해당 지역의 규제 및 검증 절차에 따라 고려되어야한다. 때때로별로 스펙트럼은 두 일치하지 않는이 방법에 의해 생성 된, 또는 L로보고됩니다신뢰 점수 아야. 각각의 분리에 대해 중복 또는 세중 반점을 수행하면 하나의 자리가 실패 할 때 실험을 반...

때문에 세균에 혈류 감염 (BSI)를 가진 환자는 6-48 % 1에 이르기까지 높은 병원 내 사망률을 계속합니다. 적절한 경험적 항생제의 납품은 생존을 촉진하고 심한 패혈증 환자의 하위 집합으로, 적절한 치료에 대한 각각의 시간 지연은 생존 2,3 감소하는 상관 관계. 따라서, 임상 실험의 주요 목적은 신속하게 탐지, 식별 및 임상 의사 결정을 통보하기 위해 혈액 배양에서 세균의 존재를 전달하는 것입니다. 그것은 미생물 연구소는 최근 그람 염색 4를보고하고시 항생제 치료에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 입증되었습니다, 관찰 연구는 것을 보여 주었다 비행 질량 분석의 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 (MALDI-TOF MS) 혈액 배양액에서 직접 수행 그람 음성 박테리아 5에 의한 BSI의 3 분의 1 이상에 처방에 영향을 미친다. 6,7의 식별을위한 효과적인 실험실 도구되었다. 이 기술은 지금은 잘 확립되어 고체 미디어 6,8에 고립 된 미생물의 신속하고 정확한 식별을위한 많은 실험실에 통합되었습니다. 혈액 배양하기 때문에 저렴한 비용으로 미생물의 이전 신분을 취득 할 수있는 잠재력을 모두 임상 및 실험실 관리자에게 미생물의 항소에 대해 &quot;긍정적 인&quot;신호를했다 (BC) 국물에 MALDI-TOF MS의 직접적인 응용 프로그램입니다. 까지 그람 음성 박테리아를 성공적으로 식별의 보고서를 식별 표준 표현형 문화 기반의 방법과 비교했을 때 혈액 배양액에 MALDI-TOF MS의 직접적인 응용 프로그램의 임상 적 유용성이 관찰 감도의 넓은 범위에 의해 제한되었습니다 47-98.9 % 9-11. 감도 편차 가능성BC 국물 구성, 초기 세균 농도, 시료 전처리 방법의 변화뿐만 아니라 연구의 인구 9에서 발생하는 그람 음성균의 배열에 관한 것이다. 이러한 다른 발행 프로토콜과 비교하여 여기에서 제시된 방법은 에탄올, 염화 암모늄 또는 추가 (비 행렬) 아세토 니트릴의 사용을 피한다. 따라서 세균 펠릿 전위 표현형 감수성 테스트 방법은 배양액에 이러한 유기체에 직접 적용 할 수 있도록 허용하는 (단백질 추출 시점까지) 실행 가능한 남아있을 것이다. 또한, 제시된 방법은 저렴한 안정적이고 시간 12 &#39;손&#39;최소한의 혈액 배양 그람 염색 결과의 25 분 내에서 사용할 수있는 박테리아 식별과 빠른 것으로 나타났다. 이 방법은 그람 B를 식별하는 양성 혈액 배양액에 직접 적용 포름산 추출을 이용하는 간단한 사내 스핀 용해 프로토콜MALDI-TOF MS 기술 acteria.

<table><tbody><tr><td>BACTEC 플러스 에어로빅/F 미디</td><td>엄 Becton Dickinson; BD, 프랭클린 레이크, 뉴저지, 미국</td><td>442192</td><td></td></tr><tr><td>BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium</td><td>Becton Dickinson; BD, 프랭클린 레이크, 뉴저지, 미국</td><td>442265</td><td></td></tr><tr><td>BACTEC Peds Plus Medium</td><td>Becton Dickinson; BD, 프랭클린 레이크, 뉴저지, 미국</td><td>442194</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer - 혈액 전달 장치</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>364880</td><td>바늘 찔림 부상의 위험을 줄이는 일회용 샘플링 장치</td></tr><tr><td>Vacutainer SST 5.0 ml, Advance plus</td><td>Becton Dickinson; BD, 프랭클린 레이크, 뉴저지, 미국</td><td>367954</td><td>세럼 분리 튜브</td></tr><tr><td>주사기 10ml</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>302143</td><td></td></tr><tr><td>이송 피펫</td><td>Samco, USA</td><td>222-20S</td><td></td></tr><tr><td>이송 피펫 (파인 팁)</td><td>Samco, USA</td><td>232-20S</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브(2.0 ml)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>0030.120.094</td><td></td></tr><tr><td>멸균수(DNAse 및 RNAse 없음)</td><td>Life Technologies, Carlsbad, California, USA</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>매트릭스 솔루션&nbsp;</td><td>Bruker Daltonics, 독일 브레멘</td><td>285074</td><td>10 mg/ml &알파;-시아노-4-하이드록시신남산, 50% 아세토니트릴, 2.5% 트리플루오로아세트산</td></tr><tr><td>Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS</td><td>Bruker Daltonics, 독일</td><td></td> 브레멘 <td>BioTyper 3.1(Build 65) 및 FlexControl 3.3(Build 99) 소프트웨어 활용</td></tr></tbody></table>

maldi-tof 질량 분석기를 사용하여 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 빠른 확인

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

임상 미생물학 연구소의 중요한 역할은 혈류 감염을 일으키는 박테리아의 신속한 식별을 제공하는 것이다. 전통적인 인식은 성숙 고체 한천에 식민지 후 사용할 수있는 식별 신호 혈액 배양액의 하위 문화가 필요합니다. MALDI-TOF MS는 고체 매체에 식민지에 적용 임상 관련 세균의 대부분의 식별을위한 믿을 수있는 빠른 방법입니다. 이 박테리아의 종 식별을 가속화하고 임상 관리를 개선하기 위해 잠재력을 가지고 직접 혈액 배양액에 MALDI-TOF MS의 응용 프로그램이 매력적인 방법입니다. 그러나 극복해야 할 중요한 문제는 제거하지 않을 경우, MS 스펙트럼을 방해 부족하거나 낮은 차별 식별 점수가 발생할 수 있습니다, 혈액 배양 검체에 포함 된 간섭 수지, 단백질과 헤모글로빈의 사전 분석을 제거합니다. 또한 그것은 bacter을 집중하는 것이 필요하다아이오와는 충분한 품질의 스펙트럼을 개발할 수 있습니다. 제시된 방법은 농도, 정화, 및 신호 혈액 배양액에서 박테리아의 조기 발견을 허용 그람 음성 박테리아의 추출을 설명합니다.

생성 MALDI-TOF MS 스펙트럼은 스펙트럼의 통합 참조 데이터베이스에 비교된다. 로그 점수는 가능성 속 수준으로 식별 (그림 1)과 종의 가능성이 식별 ≥ 2.0 (그림에 필요한 점수 ≥ 1.7의 권고와 시험 분리 및 참조 데이터베이스 분리 사이의 일치의 신뢰에 대한 할당 2). 타이핑 소프트웨어에 의해 일치하는 점수 ≥ 1.7와 제 5 식별 (그림 1) 12 일치 종 수준으로보고. 3이 경우 대장균과 세라의 혼합 종의 혈액 배양액을 분석 한 결과를 보여줍니다 그림 마르세 센스. 상위 5 일치 스펙트럼 불일치 있습니다합니다. 그것은 이전에 혼합 장군은 혼합 된 배양액 (12)의 약 30 %가이 방법에 의해 식별 될 것으로 증명되었다. 그것은 혼합 국물이 가능하다는 것을 인...

단기 (MALDI-TOF) 질량 분석 (MS) 직접 혈액 배양액 행의 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 애플리케이션은 박테리아의 식별을 촉진. 제출 방법은 직접 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 식별을위한 신속하고 신뢰할 수있는 방법입니다.

MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 빠른 확인

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

이 절차의 전반적인 목적은 maloff 기술을 사용하여 혈액 배양액에서 그람 음성 균을 직접 확인하는 것입니다. 이를 위해 양성 혈액 배양액 5 mL를 혈청 분리 튜브에 옮긴 후 원심분리합니다. 원심분리 후, 박테리아가 포함된 액체층을 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 저속으로 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 고속으로 원심분리합니다.결과물로 얻은 펠렛을 포름산에 재현탁하고 MALDI 분석을 통해 존재하는 박테리아 종을 확인합니다. 전통적인 배양법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 그람 음성균을 더 빠르게 식별할 수 있다는 점입니다. 균혈증 진단은 임상의가 처방하는 항균제의 선택에 영향을 미치므로, 이 기술의 함의는 임상 미생물학 분야까지 확장됩니다.본 절차의 시연은 우리 부서에서 이 작업을 정기적으로 수행하는 기술자인 Leonardo Bascu가 진행하겠습니다. 일반적으로 발열성 질환 상황에서 임상 직원의 판단에 따라 수집된 호기성 또는 혐기성 혈액 배양 병은 박테리아 성장을 지속적으로 모니터링하는 자동화 장비에서 배양됩니다. 혈액 배양 병에서 성장 증거가 나타나면, 장비가 해당 신호가 발생한 병을 식별합니다.신호가 발생한 혈액 배양 병을 인큐베이터에서 꺼내어 이 절차를 시작하십시오. 이를 생물안전작업대(biological safety cabinet)에 배치하십시오. 해당 기관의 프로토콜에 따라 신호가 발생한 혈액 배양액으로 그람 염색을 준비하고, 그람 음성균이 확인되면 현미경으로 검사하십시오.여기에 설명된 방법에 따라 배양액을 처리하십시오. 그람 양성균이 확인되면 대체 신속 분자 진단법을 사용할 수 있습니다. 혈액 배양병을 2~3회 뒤집어 섞어줍니다.그 다음 생물안전작업대 내에서 진행합니다. 10 mL 주사기를 안전 혈액 전송 장치에 연결합니다. 혈액 전송 장치를 혈액 배양 병에 연결하고, 배지 5 mL를 주사기로 뽑아냅니다.흡입한 혈액 배양액을 혈청 분리 튜브에 넣고 1,250 ×g에서 15분 동안 원심 분리하여 적혈구를 제거합니다. 원심 분리 후, 호기성 병의 혈액 배양액은 적혈구가 튜브 바닥으로 명확하게 분리되며 겔 액체 인터페이스가 불투명한 흰색으로 나타납니다. 반면, 용해성 혐기성 혈액 배양액의 혈액 배양액은 겔 액체 인터페이스에서 진한 붉은색으로 나타납니다.두 가지 흡입 방식 모두 용해된 적혈구 성분이 상층액에 부유 상태로 남아 있으므로, 멸균 전송 피펫을 사용하여 상층액을 제거하되 젤 액체 계면 바로 위의 버피코트(buffy coat)를 약 1mL 남기도록 주의하십시오. 다음으로, 멸균 피펫을 사용하여 젤 계면 위의 마지막 1mL 버피코트 액체를 부드럽게 혼합한 후, 전체 부피를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 새 튜브를 288 ×g에서 30초 동안 원심분리하고, 일회용 플라스틱 1mL 전송 피펫을 사용하십시오.상층액을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 펠렛이 포함된 튜브는 폐기하십시오. 이 단계에서 펠렛이 함께 옮겨지지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 이는 혐기성 혈액 배양 검체에서 상층액에 색소가 남아 있어 펠렛이 항상 명확하게 보이지 않기 때문에 특히 중요합니다.시료를 18,407 ×g에서 1분 동안 원심분리한 다음, 정밀 팁 트랜스퍼 피펫을 사용하여 펠렛을 건드리지 않고 잔류 액체가 최대한 남지 않도록 상청액을 흡입하여 제거합니다. 1 mL의 멸균된 DNA 및 RNA free water를 가하고, 피펫팅하여 잔류 펠렛을 재현탁합니다. 재현탁된 용액을 18,407 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 미세 팁 피펫을 사용하여 상층액을 흡입하여 제거합니다. 이때 가능한 한 많은 액체를 제거하도록 주의하십시오. 펠렛을 10 µL의 70% formic acid에 재현탁합니다.펠렛의 크기가 큰 경우, 포름산의 부피를 50~100% 증가시켜야 할 수 있습니다. 필요에 따라 피펫을 사용하여 잘 혼합하여 균질한 용액을 만들고, 피펫 팁을 이용해 펠렛을 물리적으로 분쇄하십시오. 이렇게 만들어진 용액에는 혈액 배양액에서 분리된 고농도의 박테리아가 포함되어 있으며, 인간 세포와 혈액 배양 병 수지(resin) 성분은 상대적으로 제거된 상태입니다. 피펫을 사용하여 준비된 현탁액 2 µL를 깨끗한 MALDI-TOF 타겟 플레이트의 각 타겟 스팟에 접종하십시오. 간혹 발생하는 판독 실패 문제를 해결하기 위해 각 샘플당 3개의 타겟 사이트를 준비하십시오.플레이트를 흄 후드의 가장자리에 놓아 공기 흐름을 극대화하여 빠르게 건조시킨 후, 건조된 각 스팟 위에 매트릭스 용액 1 µL를 도포합니다. MALDI 타겟 플레이트가 흄 후드 가장자리에서 건조되도록 둡니다. 이전 단계와 마찬가지로, 플레이트의 각 타겟 스팟이 균일하게 준비되었는지 확인하십시오.타겟 플레이트를 말로프(maloff) 질량 분석기에 삽입합니다. 플레이트가 스프링 하중 플레이트와 평평하게 맞닿아 있는지 확인하십시오. 모든 타겟 스팟이 완전히 마를 때까지 타겟 플레이트를 삽입하지 마십시오.고무 씰에 보풀, 먼지, 머리카락이 없는지 확인하십시오. 이는 필요한 진공 조건을 형성하는 데 필요합니다. 다음으로, maloff 스테이지 덮개를 닫은 후 기기 전면에 있는 in-out 버튼을 누르십시오.덮개가 잠기고 진공 상태가 됩니다. typ 소프트웨어 내에서 maldi typ 및 flex 제어 소프트웨어를 엽니다. 파일(file)이라는 드롭다운 메뉴에서 새로운 분류(new classification)를 선택하고, 프로젝트 이름을 지정한 다음, 새로 만들기(new)를 선택합니다.다음(next)을 선택하십시오. flex 제어 소프트웨어 창 내에서 설정을 완료하려면, 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태로 화면상의 타겟 플레이트 그래픽을 식별하십시오. 마우스를 접종된 지점 위로 이동하여 사용 중인 타겟 지점들을 강조 표시하십시오.선택한 타겟 위치의 임의의 지점을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음, 드롭다운 메뉴에서 분석물 추가(add analytes)를 선택하십시오. 각 타겟 스팟에 대해 ID 열에 혈액 배양 동정 세부 정보를 추가하고 다음(next)을 클릭하십시오. 완료되면 Commercial Taxonomy 스펙트럼 데이터베이스를 선택하고 다음(next)을 선택하십시오. 연구소에서는 참조 스펙트럼의 수를 늘리기 위해 추가적인 자체 데이터베이스나 상용 데이터베이스를 사용할 수 있습니다. 마침(finish)을 클릭하면 MALDI TOF MS가 스펙트럼 생성을 시작합니다.Flex Control 소프트웨어를 통해 MALDI-TOF 스펙트럼을 수동으로 획득함으로써 때때로 더 높은 MALDI-TOF 점수를 얻을 수 있습니다. 스펙트럼 획득 후 스테레오타이핑 소프트웨어에서 분석이 완료되면, 종 식별(species identification) 옆의 플러스(+) 버튼을 선택하십시오. 각 타겟의 식별 목록을 확장하여 상위 5개 식별 결과가 서로 유사한지 확인하며 검토하십시오.동일한 표적 지점에 대해 상위 5개 속(genre)이 서로 일치하지 않고 점수가 1.7 이상인 경우, 여러 종이 혼합되어 있을 가능성이 있습니다. OV 기술은 혼합 종 검출에 대한 민감도가 낮다는 점에 유의하십시오. 표적 지점 리포트에서 가장 높은 일치 점수가 2.0 이상인 경우에는 해당 종을 보고하십시오. 표적 지점의 최고 점수가 1.7 이상 2.0 미만인 경우에는 해당 유전자를 보고하십시오.상위 5개 식별 결과의 추가 기준이 일치하는 경우에만 종 수준으로 보고하십시오. 모든 스펙트럼 분석이 완료되면 MALDI 장비의 in-out 버튼을 누르고 타겟 플레이트 수납함을 열어 플레이트를 꺼냅니다. 재사용 가능한 MALDI TOF 타겟 플레이트를 사용하는 경우, 알코올로 모든 타겟 지점을 세척하고, 세척 및 건조가 완료되면 MALDI 플레이트를 실온에서 보관하십시오. 혈액 배양액에서 그람 음성균을 식별하기 위해 스핀 세척 사이클을 이용하여 박테리아를 농축 및 분리하였으며, 이후 MALDI TOF 질량 분석법으로 분석하였습니다.여기에 제시된 비디오 논문에서 설명하는 바와 같이, 로그 점수가 1.86인 eureka coli의 MALDI TOF MS 생성 스펙트럼입니다. 오른쪽에 있는 것은 타이핑 소프트웨어에 의해 식별된 상위 5개의 일치 항목입니다. 해당 종이 1.861의 점수와 함께 re coli로 일관되게 보고되었음을 확인하십시오.상위 5개 일치 항목이 e coli이므로, 종 수준까지의 동정이 신뢰할 수 있는 것으로 간주됩니다. 여기서 pseudomonas aerogen에 대해 생성된 MALDI-TOF MS 스펙트럼을 보여줍니다. 로그 점수는 2.216이며, 오른쪽에는 타이핑 소프트웨어에 의해 식별된 상위 5개 일치 항목이 표시되어 있습니다.해당 종이 2.216의 높은 점수로 pseudomonas aerogen으로 일관되게 보고되었음에 유의하십시오. 이 식별 결과는 종 수준에서 신뢰할 수 있는 것으로 간주됩니다. esia coli와 SIO marsens가 포함된 혼합 혈액 배양액에 대해 MALDI-TOF MS로 생성된 스펙트럼이 여기 오른쪽에 표시되어 있으며, 타이핑 소프트웨어에 의한 상위 5가지 일치 항목은 Reiki coli와 SIO marsan 모두를 보고하고 있습니다.상위 5개의 일치하는 스펙트럼 내에서 확인되었습니다. 이 혼합 유전자는 혼합 배지 배양물의 약 3분의 1에서만 식별되었습니다. 이 표는 이 방법의 검증 연구에서 발표된 이전 결과를 요약한 것으로, 단일 미생물 배지의 91.8%가 1.7 미만의 MALDI score를 기록하였으며, 속(genus)과 종(species)에 대해 각각 100% 및 97%의 일치도를 보였습니다.이 영상을 시청한 후, MALDI-TOF를 이용한 동정을 위해 양성 혈액 배양 병을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 방법을 따르면, 세균 동정을 위해 준비한 것과 동일한 펠렛을 사용하여 자동화한 감수성 테스트를 위한 더욱 표준화된 접종물을 준비할 수 있습니다. 예를 들어, 이 기술을 통해 실험실은 임상의에게 조기 진단 결과를 제공함으로써 환자 관리에 영향을 미칠 수 있는 가능성을 제공합니다.혈액 배양 병을 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 혈액 배양 병을 조작할 때는 항상 생물 안전 작업대를 포함한 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

양성 혈액 배양에서 빠른 박테리아 펠렛 제제는 MALDI-TOF에 의해 식별, 그람 염색, 항생제 감수성 시험 및 PCR-기반 테스트와 같은 애플리케이션을위한 샘플로서 이용 될 수있다. 결과는 급속 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 개선하기 위해 임상에 통신 될 수있다.

빠른 세균의 식별 및 항생제 감수성 테스트를위한 혈액 문화 펠렛의 제조

이 작업은 MALDI-TOF MS를 사용하여 박테리아를 신속하게 식별하기 위한 절차를 자세히 설명합니다. 식별 절차에는 스펙트럼 수집, 데이터베이스 구축 및 후속 분석이 포함됩니다. 유사성 계수 기반 방법과 바이오마커 기반 방법의 두 가지 식별 방법이 제시됩니다.

MALDI-TOF 질량 분석 및 사용자 지정 데이터베이스의 사용은 고유 동굴 환경 (Kartchner 동굴, AZ, USA)에 토착 박테리아의 특성을

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS) 및 분자 기술(16S rRNA 유전자 염기서열 분석)을 통해 일상적인 진단에서 희귀 박테리아 병원체를 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 제공하는 두 기술의 조합에 있습니다.

16S rRNA의 유전자 시퀀싱과 MALDI-TOF MS에 의해 희귀 세균성 병원체의 식별

질량 분석 기반 phyloproteomics (MSPP)는 캄 필로 박터 jejuni와 SSP의 모음을 입력하는 데 사용되었다. doylei는 multilocus 시퀀스 입력 (MLST)에 비해 변형 수준에서 분리합니다.

의 하위 유형<em&gt; 캄 필로 박터 jejuni와</em&gt; SSP.<em&gt; doylei</em&gt;은 질량 분석 기반 PhyloProteomics를 사용하여 분리 (MSPP)

IDBac는 박테리아 식민지에서 긁어낸 세포 물질에 수집된 손상되지 않은 단백질과 특수 대사 산물 스펙트럼의 데이터를 통합하는 오픈 소스 질량 분석 기반 생물 정보학 파이프라인입니다. 이 파이프라인을 통해 연구원들은 수백 에서 수천 개의 세균 식민지를 분류학 그룹으로 신속하게 구성하고 전문 대사 산물 생산을 기반으로 이를 더욱 차별화 할 수 있습니다.

미생물 단백질 및 특수 대사 산물 데이터 분석을 위한 오픈 소스 MALDI TOF-MS IDBac 파이프라인 사용

여기서 우리는 MALDI-TOF-TOF 탠덤 질량 분광법 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 사내에서 개발된 단백질을 신속히 서열화한 병원성 박테리아에 의해 생성되는 단백질의 신속한 식별을 위한 프로토콜을 제시합니다. 메타안정 단백질 이온 단편 때문에 아파르트산 효과 및 이러한 특이성은 단백질 식별을 위해 이용된다.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 이미징 질량 분석법을 통해 한천 기반 박테리아 거대 콜로니 분석을 위한 새로운 샘플 준비 방법이 시연됩니다.

감염 중 한천 및 조직에서 자란 박테리아 집락의 이미징 질량 분석 분석을 통한 미생물 협력 조사

EUCAST는 자동 혈액 배양을 위한 직접 항균제 감수성 검사(AST) 프로토콜을 개발했습니다. 그러나 질량 분석 기반 미생물 식별에 대한 의존성은 자동화된 미생물 식별 시스템에서 직접 접종 준비 프로토콜을 사용하여 제거할 수 있습니다. 이 접근 방식은 검체 채취 후 24시간 이내에 AST 보고서를 제공할 수 있습니다.

질량 분석법 없이 EUCAST RAST 방법을 용이하게 하기 위해 자동 미생물 식별 시스템을 사용한 직접 미생물 식별

이 프로토콜은 배양체학과 MALDI-TOF MS를 결합하여 유제품의 미생물 구성을 신속하고 비용 효율적으로 평가할 수 있습니다. 기존 배양 방법보다 짧은 처리 시간으로 16S rRNA 시퀀싱에 필적하는 분류 결과를 제공합니다.

MALDI 접근법 을 통한 박테리아 단백질체학 프로파일링을 이용한 낙농장의 미생물 안전성 평가

현장 하이브리드화 분석에서 형광 펩타이드 핵산 (PNA 물고기)를 사용하여 긍정적인 혈액 배양에서 Enterococcus faecalis와 다른 Enterococcus 종의 직접 확인을위한 신속한 프로토콜.

의 식별을위한 1.5 시간 절차 Enterococcus</em직접 혈액 배양에서> 종

배우세요 MALDI-TOF 질량 분석을 이용한 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 신속한 동정 방법입니다. 원심분리와 포름산 추출 단계를 통해 임상 미생물학에서 조기 진단이 가능합니다.

MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 빠른 확인

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