Name: 공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T21:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 학습하세요 공초점 현미경을 이용하여 고립된 폐포 대식세포가 Aspergillus 포자의 성장을 제어하는 능력을 평가하는 방법을. 이 기법은 면역학 및 미생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 알레르기의 국립 연구소와 전염병 부여 R01AI079253 (BHS까지)에 의해 지원되었다에게 국립 암 연구소 암 센터 지원 그랜트 CA016056 로즈웰 파크 암 연구소에.

이 연구에서 동물에 수행 된 모든 절차는 로스웰 파크 암 연구소의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 연방의 모든 상태, 준수, 보건 규정의 국립 연구소했다. 1. 생체 내 대 식세포 라벨링 참고 : PHK26은 (IV) 정맥 투여시 혈액 순환 및 조직에 모두 식세포에 의해 흡수 될 친 유성 염료입니다. PKH26는 대식구의 수확 후 조작의 양을 최소화하는 생체 표지에 사용 하였다. PKH-26은 안정적으로 장기간에 걸쳐 폐포 대 식세포의 축적의 장점이 있습니다. 십일 투여 후 기다리는 PKH26 8, 9 만 폐포 대 식세포 안정적으로 레이블을 떠나 순환의 모든 레이블 세포의 정리를 할 수 있습니다. PKH26는 여기 (551 NM) 및 방출 (567 nm의) 특성 호환이 빨간색 형광 색소입니다로다 민 또는 피코 에리 트린 탐지 시스템과. 모든 라벨 절차는 생존 능력의 손실을 포함, 유물을 소개 할 수있다. 우리는 다른 마우스 유전자형에서 대 식세포의 표시에 대해 동일한 방법을 사용하기 때문에, (예를 들어, WT 대 NADPH 산화 효소 결핍),이 유물의 효과가 균일하다. <ol><li> PKH26의 원액 (에탄올에 1 × 10 -3 M) 제조업체에서 제공하는 희석제 C에서 1:5 희석. </li><li> 각 마우스의 1 / 2 ml의 인슐린 주사기 (29 G x 1 / 2 &quot;)에 희석 PKH26의 부하 100 μL. </li><li> 수확하기 최소 10 일 전에 정맥 주사 (꼬리 정맥 또는 복고풍 궤도 중 하나)에 의해 마우스로 관리 할 수​​ 있습니다. </li></ol> 폐포 2. 수확 폐포 대 식세포 (BAL) 실험에 사용하는 마우스의 수는 달라질 수있다. 비자극 마우스로부터 전형적인 수율은 3-5 × 105 폐포의 대 식세포의 범위이고, 그러나이 숫자는 BAS 크게 달라질 수이러한 세척을 수행하는 사람의 마우스, 경험의 크기 및 세척액과 폐로부터 회수 볼륨 instillations의 수와 같은 요인에 ED. 이 프로토콜에서 폐 세척을 반복 1 ㎖의 lavages와 함께 세포 수율을 향상하는 데 도움이 폐쇄 흉강으로 수행된다. <ol><li> 멸균 용액을 유지하기 위해 무균 조건을 사용 AVERTIN 마취제 치사량 (12.5 mg)을 복강 내 (IP)을 투여하여 마우스를 안락사. </li><li> 70 % 에탄올로 철저하게 마우스 스프레이. </li><li> 흉부 (그림 1A)를 노출 동물의 두개골 끝으로부터 피부를 제거합니다. <ol><li> 다만 다이어프램 아래 피부에 작은 상처를 확인합니다. </li><li> 컷에 손가락을 삽입하고 멀리 동물 (그림 1A)의 두개골 끝에서 피부를 잡아 당깁니다. </li><li> 목의 복부 측면 (그림 1A)를 확장, 머리에 약간 밀어. </li></ol></li><li> 흉곽을 통해 작은 구멍을 잘라흉부의 오른쪽에 폐를 수축하고 또한 다음 단계에서 폐의 시각화를 허용합니다. </li><li> 기관을 찾아 조심스럽게 주위 조직을 멀리 해부하다. <ol><li> 곡선 집게로 침샘, sternohyoid 근육과 후두 등을 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 곡선 집게로 들어 올려 가위로 기본 고리 연골 구조를 드러내기도 (외막)를 덮고있는 얇은 조직을 절개. </li></ol></li><li> 기관에 카테터를 삽입합니다. <ol><li> 곡선 집게를 사용하여 기관 (에 지느러미) 뒤에 봉합을 배치하고 개방을 통해 10 cm 길이를 당깁니다. </li><li> 윤상 (연골의 농축 링) 위에 시작하는 것은 신중 기관은 흉골 뒤​​에 사라지는 중지 기관의 아래 22 G 카테터를 안내합니다. </li><li> 단단히 아늑한 적합을위한 기관 및 카테터 주위 봉합을 묶어. 카테터에서 바늘을 제거합니다. </li></ol></li><li> 4 방향 코크를 조립합니다. <ol><li> 기입하나 6 ㎖를 DPBS, 1 % FBS 주사기와 그림 (b)에 나타낸 바와 같이 4 방향 꼭지에 연결합니다. </li><li> 4 방향 꼭지 (그림 1B)에 표시된 위치에 빈 6 ML의 주사기를 연결합니다. </li><li> 카테터에 4 방향 꼭지 (그림 1B)에 열린 포트를 연결합니다. 기관에서 도관을 제거하지 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> 폐에서 세척 유체를 수집합니다. 참고 : 수사는 조직 손상의 가능성을 최소화하기 위해 세척 유체의 하부 볼륨을 사용하도록 선택할 수있다. 그것은 동일한 방식 일관 모든 마우스 그룹에 적용하는 것이 중요하다. <ol><li> 그래서 빈 주사기가 닫혀 꼭지의 핸들을 돌려 천천히 폐를 팽창시키는 ~ 1 ㎖의 DPBS, 1 % FBS를 주입. 2.4 단계에있는 구멍 컷을 통해 폐의 팽창을 준수하십시오. </li><li> 폐를 overinflate하지 않도록주의하십시오. </li><li> 전체 주사기를 닫을 수 있도록 마개의 핸들을 돌려 조심스럽게 독감 철회<html> 폐의 ID입니다. </li><li> 폐 단계 1.4의 홀 가공을 통해 폐의 관찰합니다. 카테터는 좋은 무승부를 얻기 위해 약간 앞뒤로 이동해야 할 수 있습니다. 기관 내에서 카테터를 유지하기 위해 특별한 예방 조치를 취할. </li><li> 반복 FBS 1 %를 주입하고 폐 단종 된 모든 DPBS까지 2.8.1-2.8.4 5 배의 단계를 반복합니다. 참고 : 폐 유체의 복구가 주입 액의 100 %되지 않습니다. </li></ol></li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 세척 유체 빈 주사기. 상온에서 전지를 보관하십시오. </li><li> 실온에서 5 분 300 XG에 원심 분리하여 펠렛은 세포 상층 액을 붓는다. 원하는 경우에 사이토 카인 분석을 위해 저장 될 수 있습니다. </li><li> 10 % FBS와 1 ~ 5 ㎖의 RPMI 1640 세포를 재현 탁하고 혈구를 계산합니다. 비자극 마우스에서는 BAL 의해 수확 된 세포의&gt; 95 %는 세포 검사에 의해 확인 될 수있는 대 식세포가 될 것으로 예상된다. </li></ol> 3. 배양 및 수확 버섯 &quot;&gt;이 프로토콜에 사용되는 아스 페르 길 루스 푸 미가 투스의 수명주기의 모든 단계에 걸쳐 GFP를 표현 :. 포자, germlings 및 균사이 곰팡이 균주 박사 마고 무어, 사이먼 프레이저 대학, 버나비, BC, 캐나다에 의해 제공되었다. <ol><li> 클로람페니콜 (0.05 g / L) 및 겐타 마이신 (0.5 g / L)와 기울기 한천 사부로 뇌 심장 주입 (BHI)에 GFP를 표현 아스 페르 길 루스 푸 미가 투스 균주의 플레이트 생포. </li><li> 느슨하게 실온에서 7~10일에 덮인 어둠 속에서 품어. </li><li> DPBS 0.01 % 트윈 20 10 ㎖로 세척 경사에 의해 수확 생포. 살짝 느슨하게 stripette와 곰팡이를 다 쳤어요. 수율을 높이기 위해 경사를 여러 번 씻어. </li><li> 50 ML 원뿔에 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 포자 현탁액을 전달합니다. </li><li> 10 분 동안 400 XG에서 원심 분리하여 펠렛의 생포. </li><li> 을 Resuspend 50 ㎖의 DPBS에서 생포 및 혈구를 사용하여 계산합니다. </li><li> DPBS로 두 번 세척하고 원하는 집중 한에 희석록해. </li></ol> 4. 곰팡이 도전과 공 초점 현미경 숙주 방어 식세포 NADPH 산화 효소의 역할을 조사하기 위해, 포식 누룩 곰팡이 포자의 성장을 제어하기위한 세 가지 유전자형 생쥐로부터 격리 폐포 대 식세포의 능력을 평가 하였다. 이 연구에 사용 된 유전자형은 다음과 같습니다; 자연적으로 발생하는 Ncf1 돌연변이 (Ncf1 그들에게 NADPH 산화 효소의 결핍을 떠나 P47의 phox, 식세포의 NADPH 산화 효소의 필수 구성 요소)에 대한 인코딩, 3) Ncf1 * / 1) 야생형 마우스, 2) Ncf1 * / * MN-마우스 * + Mn이 형질 전환 마우스 NADPH 옥시 다제 활성은 단핵구 / 대 식세포 인구 (10, 11)에서 재구성 된 (MN은 인간 CD68 프로모터의 제어하에 야생형 Ncf1 은닉 유전자를 나타낸다.) 공 초점 현미경은 최고의 인해 존재로이 분석에 적합그리고 슬라이드에 비 포식 분생 포자의 성장. 공 초점 현미경은 Z 축 내 개인 비행기의 시각화를 허용하고, 대식 세포 내부보다는 주위에 성장하는 곰팡이 사이에 차별화를 가능하게 할 것이다. 모든 공 촛점 이미지는 63X 기름 침지 렌즈를 사용하여 획득된다. Z-스택은 2.5의 전자 줌 배율로 획득됩니다. Z-스택의 두께는, 필드의 상단 및 하단을 찾을 DAPI 및 명 시야 이미지를 사용하여 결정된다. Z-스택은 ~ 1 μm의 두께 (14)로부터 개별 조각 24 μm의였다. 대식 세포의 정량, 1X 전자 줌의 단일 스캔은 유전자형 당 10 필드를 수행 하였다. 본래 식세포 각각 PKH26 및 멤브레인과 핵의 DAPI 염색에 근거 확인되었다. 분생 포자는 FITC 표현과 시야 이미지를 기반으로 확인되었다. <ol><li> 불임의 coverslips와 접시를 준비합니다 <ol><li> 생물 안전 캐비닛에서 70 % 에타의 22 X 22mm 유리 커버 슬립을 흡수5 ~ 10 분 동안 L. </li><li> 멸균 PBS에 커버 슬립을 씻어. </li><li> 멸균 집게를 사용하여 부드럽게 멸균 단독으로 포장 된 6 - 웰 플레이트의 각 웰의 바닥에 하나의 커버 슬립을 배치합니다. </li></ol></li><li> 씨 ~ 1 × 10 6 PKH26 각 커버 슬립에 폐포 RPMI 1640 300 μL에 현탁 식세포, 10 % FBS를 표시 수확. 정확한 수는 수확 수율에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 대식 세포는 밤새 5 % CO 2와 37 ° C에서 배양하여 부착 할 수 있습니다. </li><li> 다음 날 아침, ~ 1 × 10 7 GFP - 표현 A.에게 추가 미가 투스의 포자는 100 ㎕의 예열 (37 ℃) RPMI 1640, 10 % FBS에서 일시 중단. </li><li> 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에 플레이트를 반환합니다. </li><li> 세포를 4 ℃의 실온에서 하룻밤 2 시간의 최소 고정되어야한다 같은 각각 2 %, 포름 알데히드의 양 아니라 (최종 농도 1 %의 포름 알데히드)을 추가하여 3, 7, 14 시간 수정 세포에서. 장소 플레이트4 ° C 하룻밤에 이른 시점. 최종 시점 (14 시간)의 경우, 실온에서 2 시간 동안 세포를 고정한다. </li><li> 고정 후, 부드럽게 집게를 사용하여 커버 슬립을 제거하고 DPBS에 헹군다. </li><li> 접힌 킴 와이프에 커버 슬립의 가장자리를 배치하여 여분의 액체를 제거합니다. </li><li> 유리 현미경 슬라이드에 DAPI와 6 μL 형광 설치 매체를 적용합니다. </li><li> 슬라이드 커버 슬립 중 하나 가장자리를 놓고 부드럽게 장착 매체로 아래로 셀 측에 놓습니다. 매체를 장착하면 확산 커버 슬립 아래도 층을 형성 할 것이다. 커버 슬립에 누를 필요가 없습니다. </li><li> 명확한 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 공기 건조 할 수 있습니다. </li><li> 상점은 공 초점 현미경으로 분석 할 준비가 될 때까지 실온에서 (빛으로부터 보호) 슬라이드 상자에 슬라이드를 준비했다. </li></ol>

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함께 생체 진균 챌린지와 대 식세포의 항균 활성의 생체 외 분석을 위해 이러한 접근법을 사용하여, 우리는 이전 식세포의 NADPH 산화 효소는 A. 방어에서 중요한 역할을한다는 것을 입증 미가 투스 4. 고립 된 폐포 대 식세포의 사용은 생체 내에서 아스 페르 길 루스에 대한 방어 다른 면역 세포 (예를 들어, 호중구 모집)의 부재에서 자신의 항진균 활성에 초점을 우리를 할 수 있습니다. 다양한 시각화 전략은 생체 내 및 생체 외 (ex vivo)에서 대식구 항진균 활성을 평가하는데 사용되었다. 루터 등., 인간의 (폐 이식 환자에서 수확) 및 마우스 AMS (12) 아스 페르 길 루스 포자의 식균 작용을 연구하기 위해 공 초점 현미경을 사용했다. Geunes - 보이어 등. 식균 작용 다음 <...

폐포 대 식세포는 흡입 미생물 처음 나올 줄 식세포의 세포입니다. 대 식세포는 병원체 인식 수용체에 의해 아스 페르 길 루스 모티브를 인식 섭취 및 흡입 포자 (분생 포자)의 성장을 제한하고 염증 반응을 시작합니다. 식세포의 NADPH 산화 효소는 슈퍼 옥사이드 음이온 및 다운 스트림 활성 산소 중간체 (로아)에 산소 분자를 변환합니다. 만성 육아 종성 질환 (CGD)는 심각한 세균 및 곰팡이 감염에 의해 과도한 염증 반응이 특징 NADPH 산화 효소의 유전 질환이다. NADPH 산화 효소가 중요하지만 호중구 매개 숙주 방어 - 1 (3), 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 중요성은 잘 정의되어 있지 않습니다. 이전 연구는 호중구가 주로 균사의 단계 5를 대상으로하는 반면 폐포 대 식세포가 섭취 및 아스 페르 길 루스 포자를 죽이는 것으로 나타났습니다. 그러나, 충돌 resul가 있었다A.의 성장을 억제하는 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 역할에 같은 TS 미가 투스는 6, 7, 포자. 이 방법의 목적은 A.에 대한 숙주 방어를 매개로 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 특정 역할을 묘사했다 미가 투스 포자. 우리는 폐포 대 식세포에서 NADPH 산화 효소가 포식 A.의 성장을 제어하는 것을 발견 미가 투스 4 포자. 가장 밀접하게 흡입 곰팡이에 대한 호스트 응답을 모델링하기 위해, 우리는 비자극 마우스에서 바로 희생 다음과 같은 기관지 세척하여 수확 폐포 대 식세포를 사용했습니다. 고립 된 폐포 대 식세포의 사용은 생체 내에서 아스 페르 길 루스에 대한 방어 다른 면역 세포 (예를 들어, 모집 호중구)의 부재에 자신의 항진균 활성에 초점을 할 수있었습니다. 이 방법에서는, 폐포 대 식세포가 수확 후 조작의 양을 최소화하기 위해 수확 전에 생체 내에서 염색 하였다. &lt;/ P&gt; 이 프로토콜의 또 다른 장점은 GFP-발현 A.의 사용이다 미가 투스의 변형. 이 균류는 균사의 단계를 통해 포자 단계에서 GFP를 표현하고 추가 염색에 대한 필요가 없습니다. 더 상세한 이미지를 얻으려면, 우리는 얻은 이미지로부터 3 차원 구조의 재구성을 가능하게 공 초점 현미경을 선택했다. 입체 재건 균사가 대 식세포 또는 통해 주위에 성장보다는 구별 할 수있는 기능을 제공합니다. 분생 포자는 세포 대 세포로 정확하게 구별 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>PKH26 레드 형광 세포 링커 키트, 일반 세포막 라벨링</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromoethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>A-1685</td><td>제작에 사용 AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171</td><td>ACK 적혈구 용해 완충액</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P91444</td><td>ACK 적혈구 용해 완충액</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>제조에 사용 ACK 적혈구 용해 완충액</td></tr><tr><td>22 G x 1.00 inch i.v. 카테터</td><td>BD</td><td>381523</td><td>Insyte Autoguard 날개 달린</td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6ml 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4방향 스톱콕</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-700-077</td><td></td></tr><tr><td>봉합사</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50ml 원추형 원심분리기 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>거즈 스폰지(4인치 정사각형)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 with L-glutamine</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td>열 비활성화</td></tr><tr><td>Hema 3 Stain Set</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants</td><td>BD</td><td>297252</td><td></td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatous tranfesith expressing green fluorescent protein</td><td></td><td></td><td>provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada</td></tr><tr><td>100 &mu; m 세포 스트레이너</td><td>BD Falcon</td><td>64753-00</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>생물 안전 캐비닛 클래스 II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST40 원심 분리기 스윙 버킷 로터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DM1000 광학 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈구 측정기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td></td><td></td><td>37 &deg; C, 5%&nbsp; CO2</sub</td></tr><tr><td>>22 x 22 mm 마이크로 커버 유리</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>유리 커버슬립</td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>10% 중성 버퍼 포르말린</td><td>VWR</td><td>BDH0502-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 마운팅 미디어(DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP2 시스템, 레이저 포인트 스캐너 포함)</td><td></td><td></td><td>DMIRE2 형광 현미경에 장착</td></tr></tbody></table>

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

폐는 숙주 세포가 정기적으로 미생물 및 미생물 제품에 노출되는 인터페이스입니다. 폐포 대 식세포는 흡입 버섯 및 기타 미생물 처음 나올 줄 식세포의 세포입니다. 대 식세포 등 면역 세포는 병원체 인식 수용체에 의해 아스 페르 길 루스 모티브를 인식하고 다운 스트림 염증 반응을 시작합니다. 식세포의 NADPH 산화 효소는 활성 산소 중간체 (로아)을 생성 및 호스트 방어에 중요합니다. NADPH 산화 효소가 중요하지만 호중구 매개 숙주 방어 - 1 (3), 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 중요성은 잘 정의되어 있지 않습니다. 이 연구의 목적은 A.에 대한 숙주 방어를 매개로 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 특정 역할을 묘사했다 미가 투스. 우리는 폐포 대 식세포에서 NADPH 산화 효소가 포식 A.의 성장을 제어하는 것을 발견 미가 투스 4 포자. 여기서, 우리는 마우스의 능력을 평가하는 방법을 서술포식 누룩 곰팡이 포자 (분 생자)의 성장을 제어하기 lveolar 식세포 (AMS). 폐포 대식 세포는 생체 내에서 스테인드 및 10 일 후 기관지 폐포 세척액 (BAL)에 의해 생쥐에서 격리됩니다. 대 식세포는 유리 커버 슬립에 도금되어, 다음 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 A.을 시드 미가 투스 포자. 지정된 시간에, 세포를 고정 및 포식 포자 그대로 식세포의 수는 공 초점 현미경에 의해 평가된다.

<html> 비자극 생쥐에서 BAL에 의해 폐포 대 식세포를 수집하는 것은 세포 검사를 기반으로&gt; 95 % 순수한 인구가 발생합니다. 3과 7 시간 (그림 2) 시점은 곰팡이 성장의 균사 무대 앞에와 유전자형 사이에서 분생 포자의 식세포의 효율성 비교를 할 수 있습니다. 유전자형이 조직 침습 균사 스테이지 포식 분생 포자의 전이 (도 3)를 억제하는 능력에 대하여 비교 될 수있는 14 시간 시점이다. 본래 식세포는 각각 막과 핵 PKH26 및 DAPI 염색 (도 2 및도 3)에 기초하여 공 초점 현미경에 의해 식별 될 수있다. 분생 포자와 균사는 GFP 표현 (그림 2와 3)에 따라 식별됩니다. iles/ftp_upload/51678/51678fig1.jpg &quot;/&gt; <br ...

공 초점 현미경에 의해 포식 누룩 곰팡이 포자의 성장을 제어하는 절연 쥐 폐포 대식 세포의 능력을 평가하는 방법.

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 대식세포가 ex vivo에서 진균 candia의 성장을 억제하는 능력을 비교하는 것입니다. 이를 위해 먼저 lipophilic dye PKH 26을 사용하여 생체 내(in vivo)에서 폐포 대식세포를 표지합니다. 절차의 두 번째 단계는 기관지 폐포 세척법(bronchoalveolar lavage)을 통해 접종된 마우스로부터 폐포 대식세포를 수확하는 것입니다.세 번째 단계는 GFP 양성 진균 포자를 배양하고 수집하는 것입니다. 마지막 단계는 미리 정해진 시간 간격으로 대식세포에 GFP 양성 candia와 고정 세포를 처리하여 자극을 주는 것입니다. 궁극적으로, 최소한의 ex vivo 세포 조작을 통해 공초점 현미경으로 폐포 대식세포가 식세포 작용을 통해 성장을 제어하는 능력을 확인할 수 있습니다.포자 우선 친유성 염료 P HK 26을 희석액 C(Diluent C)에 1:5 비율로 희석합니다. 염료는 FOC 산성 세포에 의해 흡수됩니다. 희석된 P HK 26 100 µL를 0.5 cc 주사기에 넣고 안와 후방 또는 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사합니다.10일 후 마우스 한 마리당 3~500,000개의 표지된 대식세포를 얻을 수 있을 것으로 예상합니다. 마우스를 안락사시키고 횡격막부터 흉강을 열 준비를 합니다. 폐의 공기를 빼고 나중에 폐의 팽창 상태를 관찰하기 위해 흉곽의 우측에 작은 구멍을 냅니다.다음으로, 주변 조직에서 기관을 찾아 분리합니다. 그런 다음 곡선 핀셋을 사용하여 기관을 덮고 있는 외막을 조심스럽게 제거합니다. 기관이 노출되면 기관 내로 카테터를 삽입합니다.기관을 천자하지 않도록 주의하는 것이 매우 중요합니다. 이 조작을 수행할 때, 10 centimeter 길이의 봉합사를 기관 주위에 루프로 만들어 카테터를 고정하십시오. 그런 다음 카테터에서 바늘을 제거하십시오.다음으로, 6 mL 주사기에 세척액을 채우고 4방향 스톱콕(stop cock)에 연결합니다. 다른 위치에 빈 6 mL 주사기를 연결하고, 개방된 포트를 카테터에 조심스럽게 연결합니다. 장치가 준비되면 스톱콕을 용액이 가득 찬 주사기 쪽으로 열고, 약 1 mL의 용액을 폐로 천천히 주입합니다.다음으로, 스톱콕을 돌려 시린지를 닫고 액체를 흡입합니다. 그런 다음 폐가 수축하는 것을 관찰하면서 대식세포가 풍부한 폐액을 조심스럽게 흡입합니다. 모든 용액이 폐로 주입되고 다시 회수될 때까지 이 과정을 반복합니다.약간의

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기, 우리는 폐에 타고난 면역 세포를 거주하고 polyanhydride의 nanoparticles와 공동으로 문화에 대한 응답으로 자신의 활성화를 검토하고 있습니다 murine 폐포 macrophages를 수확을위한 프로토콜을 설명합니다.

Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화

출처: 바베로, A. M., et.al. 결 핵균 과 면역 수용체 SLAMF1의 상호작용 연구를 위한 형광 분석법. J. Vis. 경험 ( ( (2025)이 영상은 대식세포 수용체와 결핵균 항원 간의 상호작용을 연구하기 위한 형광 기반 분석 방식을 시연합니다. 커버슬립에 있는 형광 표지된 항원은 대식세포 단백질 추출물과 함께 배양하고, 가교 결합, 항체 표지로 하며, 겹치는 형광 신호로 시각화됩니다.

대식세포 수용체와 박테리아 항원의 상호작용을 조사하기 위한 형광 기반 분석

이 비디오는 형광 Aspergillus 리포터 분생포자를 사용하여 인간 호중구의 항진균 활성을 분석하기 위한 라이브 셀 이미징을 보여줍니다. 처음에는 적색 형광과 자홍색 형광이 모두 호중구 내에서 검출되는 반면, 적색 형광은 시간이 지남에 따라 감소하여 분생포자의 분해를 나타내고 호중구의 항진균 활성을 확인합니다.

1차 인간 면역 세포의 항진균 활성에 대한 실시간 평가

우리는 라이브 세포 영상 현미경에 대한 방법을...

곰팡이 병원체 Phagocytosis의 라이브 셀 비디오 현미경

여기에서, 우리는 이미지 세포 계측법은 문화 숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 CFU 열거에 대한 대안으로 사용할 수 있습니다.

숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 이미지 계측법의 사용

여기, 우리는 라이브 셀 비디오 현미경과 함께 형광 아스 페르 길 루스 기자의 분생 포자를 이용하여 실시간으로 주요 인간 면역 세포의 항진균 활성을 평가하고 유동 세포 계측법 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 생성 된 데이터는 진균 작용, 식균 작용, 세포 이동 및 진균 성장 억제로 숙주 세포 - 아스 상호 작용에 대한 통찰력을 제공한다.

에 대한 응답으로 인간의 기본 호중구와 단핵구에 의해 항진균 활성의 라이브 영상<em&gt;를했다. 투스</em

이 통신 격리와 인간에서 치경 대 식 세포의 문화에 대 한 방법론 및 실험적인 목적을 위한 murine 모델에 설명합니다.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

우리는 폐 HIV 저수지를 평가하기 위하여 항레트로바이러스 치료에 만성 HIV 에 감염된 개별에게서 기관지 정맥 세척 액 및 일치한 말초 혈액을 처리하는 방법을 기술합니다. 이러한 방법은 초과민성 중합효소 연쇄 반응에 의한 면역phenotyping 및 HIV DNA/RNA 정량화에 사용될 수 있는 고순도 CD4 T 세포 및 폐포 대식세포의 획득을 초래한다.

기관지 충혈 유체 및 폐포 대식세포 및 CD4+ T 세포 면역체노티핑 및 HIV 저수지 평가를 위한 일치하는 혈액 처리

이 프로토콜은 유세포측정법을 사용하여 인간 1차 식세포에 의한 아스퍼질러스 훈증의 식세포증을 정량적으로 측정하고 단순한 유착에서 백혈구로의 식세포증을 구별하는 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

유세포 측정을 사용하여 인간 백혈구에 의한 아스퍼질러스 훈증 코니디아의 식세포증 측정

우리는 마우스의 기도에서 아스퍼질러스 퓨미가투스 코니디아 (크기 3 μm)의 분포의 정량적 분석을위한 방법을 설명합니다. 또한 이 방법은 다양한 병리학적 상태 모델에서 기도내의 미세입자 및 나노입자 응집 분포의 분석에 사용될 수 있다.

전체 마운트 광학 클리어 마우스 폐에서 아스퍼 질러스 fumigatus Conidia 분포의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 현미경 기반 정량 분석

대식세포에 의한 진균 분생포자의 식세포작용과 관련된 기술은 진균에 대한 면역 반응의 조절을 평가하는 연구에 널리 사용됩니다. 본 논문의 목적은 Trichoderma stromaticum conidia로 자극된 인간 말초혈액 단핵 유래 대식세포의 식균작용 및 제거 능력을 평가하는 방법을 제시하는 것이다.

Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages의 생존력 분석

학습하세요 공초점 현미경을 이용하여 고립된 폐포 대식세포가 Aspergillus 포자의 성장을 제어하는 능력을 평가하는 방법을. 이 기법은 면역학 및 미생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

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