Name: 복족류 연체 동물의 달걀 누워에 남성 액세서리 글 랜드 제품의 효과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 19 s
Description: 학습하세요 Lymnaea stagnalis의 정액 단백질이 알 낳기 행동에 미치는 영향을 연구하는 방법을. 이 실험은 수태동체의 성선택 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

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우리는 기술 지원을, 음성 해설에 대한 CM Popelier, S. Ypenburg와 C. 레베을 MR HELMUS 감사합니다. 이 연구는 재정적으로 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO), 예술과 과학의 왕립 네덜란드 아카데미 (KNAW) 및 일본 학생 지원기구 (JASSO)에 의해 지원된다. 이 책은 JMK에 NWO의 오픈 액세스 부여에 의해 지원되었다.

1. 사육 시설 <ol><li> VU 대학에서 같은 실험실 문화에서 Lymnaea stagnalis (L.)의 성인 표본을 얻습니다. </li><li> 지속적인 물 교환이 사육 시설 (molluscarium) 및 실험 탱크, 모두 20 ° C의 낮은 구리 물을 유지한다. </li><li> 12 시간 : 12 시간에 빛 / 어둠주기를 설정합니다. </li><li> 번식, 성인 달팽이 무농약 상추 임의로 먹이 TetraPhyll (물고기) 조각으로 젊은 청소년을 공급. 24 시간 시간 내에 배치됩니다 알 덩어리에서 시작하여, 연령에 따라 별도의 탱크에있는 달팽이를 유지한다. </li><li> 달팽이는 그들이 효과를 방지하기 위해, 반환되지 않습니다 사육 탱크에서 제거되면 약간 다른 조건에서뿐만 아니라 pseudoreplication을 방지하기 위해 유지 된 것으로. </li></ol> 2. 해부 <ol><li> 1 주 동안 달팽이를 분리하고, 그쪽을 보장하기 위해, 무제한 사료를 먹이t은 전체 정자와 정액 매장이있다. </li><li> 스테레오 현미경, 핀 해부 접시, 작은 외과 용 가위, 및 미세 집게, 50 mM의 MgCl2를 솔루션, 주사 바늘 (0.3 mm X 13mm)과 종이 수건으로 가득 10 ML의 주사기를 준비합니다. </li><li> MgCl2를보기 (31.6 ± 2.1 mm 젖은 무게 0.55 g ± 2.89의 껍질 길이가 성인 달팽이에 대한 일반적으로 3 ㎖ 이상) 2 용액을 주입하여 달팽이를 안락사. 45 ° 각도로 주사 바늘로 다리를 관통하고 달팽이 완화 및 (초 이내) 확장 남을 때까지 부드럽게 지속적으로 압력을 적용하여 주입. 주사 바늘을 제거하고 달팽이가 (촉수 철수 반사가없는 여부를 확인하여, 예를 들어) 안락사 여부를 확인합니다. </li><li> 조심스럽게 굵은 집게를 사용하여 곡률 다음 껍질을 제거합니다. 반쯤, 부드럽게 집게로 긁어 쉘에서 columellar 근육을 분리합니다. 부드럽게 t 트위스트그는 쉘의 권선 방향 다음, 껍질 밖으로 달팽이. </li><li> 해부 접시에 달팽이를 놓고 다리의 뒤쪽 끝을 아래로 고정. 그런 다음 머리를 핀을 배치하고 절개를 용이하게하기 위해 달팽이에 약간의 긴장을 뒀다. </li><li> 나중에 해부에 대한 기준점이 될 여성 gonopore을 집중. </li><li> 외과 용 가위 및 미세 집게를 사용하여, 단지 맨틀의 가장자리에서, 첫 번째 절개를하고 여성 gonopore으로 잘라. 가위 &#39;블레이드 중 하나가 몸 벽에서 강요하면, 본체 만의 벽, 내부 장기의 것도, 절단 될 수 있도록 살짝 들어 올립니다. 머리쪽으로 gonopore 위 절단 계속 직선으로 잘라. </li><li> 전립선 (후방)과 정낭 (전방)을 집중. 주의 깊게을 해부하고 얼음에 보관하십시오. 정액 및 / 또는 정자를 포함하는 테스트 솔루션을 만들기 위해 이들을 사용합니다. 생리 Lymnaea의 염을 사용하여오프라인 (5.83 밀리몰 / L 염화칼슘 2 · 2H 2 O, 3.76 밀리몰 / L MgCl2를 2 · 6H 2 O, 42.69 밀리몰 / L의 NaCl, 37.53 밀리몰 / L의 KCl) 캐리어 매체로. </li><li> 전립선의 루멘뿐만 아니라 정낭의 정자에 존재하는 정액을 수집합니다. 그 후, 부드럽게 내용을 표현하고 집게로 장기 조직을 제거하여 별도의 유리 병에 식염수에 모두를 일시 중지합니다. 얼음에 보관하고 같은 날에 사용합니다. 나중에, 다른 치료 솔루션을 만들려면 다음 현탁액을 혼합한다. </li></ol> 3. 질내 주입 <ol><li> 질내 주입 절차를 시작하기 전에, (쉘의 선단에 맞게 제) 실리콘 쉘 주형을 준비하고, 1mm 주사기, 1mm의 직경을 10-12 센티미터의 실리콘 튜브 (주사 바늘을 무디게 0.3 mm X 13mm ), 굵은 집게와 날카로운 주사 바늘 장착 된 50 mM의 MgCl2를 용액으로 채워져 같은 10 ML의 주사기. </li><li> 어떤 치료의 정액 (또는 개별 정액 단백질)에 추가하는 데 필요한 정자를 수집; 생물학적으로 관련 복용량은 전립선 및 사출 당 정낭의 1 / 3에 해당. 참고 : 대표 결과 섹션 (그림 1)에서 세 가지 다른 치료와 실험의 결과가 표시됩니다 : 컨트롤 형 (전달 매체, 즉, 생리 식염수), Ovipostatin (확인 된 정액 단백질의 하나)와 Ovipostatin를 정자와 함께 제공합니다. 또한, 다른 종의 생물학 관련 용량을 추정하기 위해, 최근에 성관계 16 성적으로 격리 남아 개인이 개인의 전립선의 무게의 차이를 결정합니다. </li><li> 제조 된 시험 용액 각각 1 ㎖ 주사기를 준비합니다. 하나의 솔루션으로 각 주사기를 입력하고 내부에 기포가 없는지 확인합니다. </li><li> 각각의 주사기에 무딘 주사 바늘을 장착한다. </li><li> 주사는 1을 사용하십시오10cm의 최소 길이 mm 직경의 실리콘 튜브. </li><li> 조심스럽게 튜브를 관통하지 않도록하고, 주사 바늘을 통해 실리콘 튜브 슬라이드, 조심스럽게 주사기에 압력을 적용하여 튜브에서 공기를 제거합니다. </li><li> 포인트 2.3과 동일한 프로토콜을 수행하여 달팽이를 마취시키다. 이 시간은 50 mM의 MgCl2를 이상 2 ~ 3 ㎖를 주입하지 않도록하십시오. </li><li> 안정적인 위치를 유지하기 위해 쉘 금형 달팽이를 놓습니다. </li><li> (이 위치는 또한 민물 달팽이의 다른 종에 적용) 분명히 오른쪽 촉수와 남성 gonopore에 동물, 전방의 오른쪽에 흰 반점으로 보이는 여성 gonopore을 찾습니다. 방해받지 않고 접근 할 수 있는지 확인하십시오. </li><li> 실리콘 튜브의 끝을 잡고 부드럽게 여성 gonopore에 실리콘 튜브의 약 2 ~ 4 mm의 삽입 집게를 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 주사기에 압력을 적용하고 시험 용액 0.03 ㎖를 주입. 반 분을 기다립니다튜브를 제거하기 전에 여성 기관으로 확산 관 내의 압력을 허용하기 UTE. </li><li> 이 모니터링 할 수있는 그것의 분리 용기에 처리 달팽이를 반환하고 실험 탱크에 진정을 복구 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 생물 검정 <ol><li> 식별을 위해 각 달팽이 레이블과 껍질의 길이를 측정합니다. 후자는 생식 출력을 정량화 할 때 관련 크기의 좋은 지표입니다. </li><li> 실험 탱크 내의 물을 교환 할 수 있도록 천공 된 460 ml의 용기에 고립 된 각각의 달팽이를 유지합니다. 이는 효율적인 물 교환을 허용하기 위해 물 흐름의 방향이 뚫린, 오른쪽 방향으로 모든 컨테이너를 배치하는 것이 중요하다. </li><li> 생물 검정시, 양상추의 표준화 된 양을 정기적으로 달팽이를 공급. 상추를 잘라 라운드, 금속 주먹을 사용합니다. 이 프로토콜에서 19.6 cm 2의 상추 디스크는 근사하는 데 사용됩니다그들은 최대한 하루에 먹을 수있는 마운트. </li><li> 주걱의 평평한면을 사용하여 산란 량을 수집하고 용기 벽에서 계란 질량을 다 쳤어요. 계란 질량을 수집하기 위해 숟가락면을 사용합니다. 주 : 다만 배치 된 불투명 한 계란 대중이 (가 누워 후 몇 시간 이내에 투명하게)를 사용하여 스캔을 할 수 없습니다. 그들은 일주일에 2 ~ 3 알의 질량을 생성하기 때문에이 프로토콜의 모델 종, Lymnaea의 stagnalis는 매일 계란 대중을 확인합니다. 이것은 다른 종에 차이가 있습니다. </li><li> 스캐너 드라이버를 포함 (랩탑) 컴퓨터, 플랫 베드 스캐너, 표준 밀리미터 스케일, 주걱, 플레이트 및 유리 타일을 전송하여, 디지털 수집 달걀 질량 스캔. </li><li> 전송 접시에 각각의 산란 량을 놓고 접시가 가득 될 때까지 반복합니다. 그 후, 계란 대중 종이 타월 건조 줘봐 및 전송 접시에와 같은 순서로 유리 타일에 전송할 수 있습니다. </li><li> (거꾸로 각 타일을 돌려계란 대중은 유리 타일에 충실) 조심스럽게 바로 밀리미터 규모에서 평판 스캐너에 배치됩니다. 그들은 모두 같은 초점 평면 내에서 표시되도록 균등하게 계란을 배포 할, 계란 대중을 평평하게하기 위해 압력을 조금을 적용합니다. 모든 계란이 동일하게 평평 것을 보장하기 위해 두 개의 가장자리 테이프의 표준화 된 양의 타일을 장착한다. </li><li> 스캐너 설정을 조정합니다. 그것은, 그것의 최대 해상도를 조정 미리보기 스캔을하기 위해선, 작업 영역을 자르기, 밝기 및 대비를 조정하는 것이 중요합니다. 계란 대중을 스캔합니다. </li><li> 추가 개발 및 부화에 대한 자신의 레이블 20 ㎖ 유리 병에 각 산란 량을 놓습니다. </li><li> 제대로 산소를 유지하기 위해 매일 튜브를 부화에 물을 새로 고칩니다. 다음과 같은 순서로 갓 부화 한 번호와 크기에 따라이 작업을 수행합니다 : (더 파묻혀) 오프 쏟아져 없음 / 경사 분리 (부화의 시작) 범람하고 피펫 (많은 새끼)와 물을 추출. </li></ol> &lt;P 클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. 계란을 측정 및 계산 <ol><li> 자유롭게 이용 가능한 이미지 분석 소프트웨어 ImageJ에 (NIH, 미국)과 셀 카운터 플러그인을 설치합니다. </li><li> 오픈 ImageJ에 등으로 데이터를 전송하기 위해 스프레드 시트 프로그램. 그런 ImageJ에 달걀 대중의 스캔 한 사진을 엽니 다. </li><li> 밀리미터 규모로 이동 줌 도구를 사용하여 배율을 설정합니다. 확대 화면을 채우기 위해 1mm의 창을 조정합니다. 1mm를 나타내는 두 줄 사이의 줄 도구를 사용하여 선을 그립니다. 분석으로 이동 및 크기를 설정합니다. 팝업 메뉴에서 측정 된 길이 옵션은 1로 알려진 거리를 조정하고 길이의 단위 mm로, 표시됩니다. 상자 글로벌를 확인하고 창을 닫습니다. </li><li> 분석로 이동하여 원하는 측정 (길이, 폭, 둘레)를 설정하고, 지역과의 Feret의 직경 (길이 및 폭)을 선택하여 측정을 설정합니다. 확인하고 이미지 분석을 계속하려면 확인을 클릭합니다. </li><li> 계란을 측정하기 위해, ZO측정해야 할 제 산란 량의 달걀에서 OM. 800%의 줌을 권장합니다. 그런 다음, 타원형 도구는 정확히 알, 프레스 Ctrl 키를 주위에 타원을 그린 사용하여 + D (두 번 같은 알을 측정 방지하기 위해) 이미지에 경계선을 그립니다. 그런 다음 타원형 (길이, 폭, 둘레)의 특성의 측정을 기록 CTRL + M을 누르면; 팝업 화면이 측정 값을 표시 열립니다. 주 : 계란을 측정 할 수있는 타원형 도구를 사용하여 모든 종에 적용되지 않습니다. 비 균일의 모양의 달걀 종, 대신 손으로 선택 항목을 사용합니다. </li><li> 필요한만큼의 계란을 측정하고. XLS 워크 시트 등의 조치를 저장합니다. 선택적으로, 직접 워크 시트에 데이터를 복사합니다. </li><li> 그 후 카운터 창을 사용하여, 산란 량에서 계란을 계산하고 수동으로 워크 시트에 수를 넣어. </li><li> 대안 적으로, 셀 카운터 플러그인의 도움으로 산란 량 당 개별적인 계란 센다. 이를 위해, 플러그인로 이동다음, 분석 및 셀 카운터를 선택합니다. 셀 카운터 창은 &#39;초기화&#39;상자를 눌러 &#39;원본을 유지&#39;를 확인 나타납니다. 새 카운터 창 도구 모음에서 십자선 도구를 선택하고 셀 카운터 메뉴의 카운터 형식을 선택 나타납니다. 셀 카운터 창에서 개별적인 계란 클릭함으로써 개별적인 계란 횟수. 셀 카운터 메뉴에서 카운터 형식 옆의 총 수를 관찰합니다. 스프레드 시트에 수동으로 번호를 복사하거나 결과를 눌러 결과를 얻을 수 있습니다. </li><li> 필요한 경우, 카운터 형식을 추가하여 하나의 계산 이벤트 내에서 여러 계란 질량을 계산합니다. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

제시된 프로토콜은 정액 방법과 생물학적으로 의미있는 방식으로이 문제를 테스트하는 방법을 수집하는 방법을 보여줍니다. 여기에서이 절차는 전립선 추출물을 사용하여 도시되어 있지만, 단일 정제 정액 단백질의 효과도 같은 방법으로 시험 할 수있다. 분명히, 이러한 테스트에서 프로 시저 및 / 또는 캐리어 매체는 질문 14,16의 파라미터에 영향을주지 않도록하는 적절한 컨트롤 (모의먼트)을 포함하는 것이 중요하다. 이 방법을 사용하면, 이미 계란 14,16 누워있는 환원을 매개 단일 정액 단백질, 즉 Ovipostatin이 있다는 것을 보였다. 전립선에서 생산하고 정자와 함께 짝짓기하는 동안 전송이 단백질은, 동시 자웅 동체의 첫 번째 완전히 특성화 된 정액 성분을 나타내며, 지금까지 알려진 단백질에 대한 유사성을 표시하지 않습니다. 발견이 Oviposta주석받는 사람에 계란 대량 생산은 정액의 물질이 13 ~ 15 누워 계란에 영향을 미칠 수 있음을 나타내는 이전 작업을 확증 줄일 수 있습니다. 생물학적으로 관련 금액을 전송하여 (3.2 16 참조), 하나의 설득력은 계란에서 관찰 된 감소 누워 (그림 1) 중재 정액 단백질, 그리고 정자의 존재 자체라는 것을 입증 할 수 있습니다. 자연 교배를 통해 정액의 반복 영수증 계란 15 당 투자를 증가 시킨다는 것을 감안할 때, 지금은 달걀 누워의 다른 매개 변수를 정량화 관련성이 높은됩니다. 제시된 프로토콜은 지금 수행하는 데 필요한 방법을 제공합니다. 영향을받는 사람 (16)에 의해 규정 된 계란의 성공을 부화에 Ovipostatin의 발견되었지만,이 단백질과 협력하여 행동 다른 정액 단백질이있을 수 있습니다. 따라서, 이러한 맥락에서 정량화 할 필요가 매개 변수 - 다음 주파수와 계란 번호를 누워에이 - 계란의 크기, hatc 포함힝 시간, 갓 부화 한 개발과 갓 부화 한 크기. 또, 예컨대 정자 저장 및 사용뿐만 아니라, 여성 및 남성 기능 14, 17 향해 생식 자원의 할당으로 달걀 누워 이외 여성 프로세스에 영향을보고하는 것이 가능하다. 분명히, 제시된 방법은 Lymnaea stagnalis과 다른 신선한 물 달팽이 모두, 이러한 후속 문제를 해결하는 수단이다. 결론적으로, 정액 단백질을 전송이 프로토콜 쇼를 사용하여 실험이 동시에 나온 것에받는 사람의 여성의 생식 성능에 영향을 미칠 수 있습니다. 몇 가지 연구는이 문제를 해결 한 것을 감안할 때, 그것은 훨씬 더 일반적인 현재 과학 문헌에 반영되는 것보다 내부에서 나온 것 일구 될 가능성이 높습니다. 하나는 사전 교미 메이트 선택과 정자 경쟁이 나온 것 14 일에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다 것을 알게 특히 어떤 highlighTS 같은 남성 소품 동맥 단백질의 전위는 성적이 시스템을 선택한다. 마지막으로,이 연구는 별도 -이 영향을받는 종 용으로 정액 단백질이 동시에 자웅 동체에 대한 동등한 중요성의 것을 개발 개념을 지원하는 데 도움이됩니다.

양도시, 정자는 일반적으로 남성 액​​세서리 분비에 의해 생산 정액 함께 제공됩니다. 어떤 사정의 구성 요소가 영양과 활성화 정자 1에 역할을하는 동안, 다른 사람은 정자 기증자 2-4 수정의 성공을 높이기 위해 여성의 생리에 영향을 미친다. 종은 매우 불규칙하고 효율적인 정자 저장 및 정자 소화가있을 때 이러한 효과는 특히, 성적 선택을 통해 선택됩니다. 이러한 조건에서, 정자 기증자 계란 5의 수정에 크게 경쟁. 남성의 수정 성공을위한 정액 물질의 중요성에 대한 풍부한 상호 연관 증거가 있지만, 직접 증거가 더 드문 몇 가지 연구는 생리 학적 변화 및 / 또는 6 관련 물질의 세부 사항에 파 놓은 광산있다. 종에서 별도의 남녀 (즉, 남성과 여성, gonochorists)와 몇 가지 잘 조사 모델의 시험편이 있습니다그것은 정액의 성분과 그 효과에 관해서 에스. 예를 들면 과일 파리, 초파리 6, 말라리아 모기, 아노 펠 레스 gambiae 7 및 빨간 가루 딱정벌레, Tribolium의 castaneum 8 있습니다. 그것이 재생이 모드는 동물계 9 공통하더라도 (즉, 개인이 동시에 기능적 암수이다) 동시에 자웅 동체이다 종에 관해서 이러한 정액 연구는 훨씬 더 희소하다. 액세서리 선 물질의 전송의 가장 주목할만한 자웅 동체 예는 아마도 물질이 피하 주사 11, 12, 즉,하지를 통해 정자 기증자에 의해 전송되는 토지 달팽이 2,10, 소위 사랑의 다트의 촬영입니다 정자와 함께. 그러나 자신의 정자와 함께 남성 액​​세서리 선 제품을 전송 많은 동시 자웅 동체가있다예 여기에 사용되는 모델 종으로, 큰 연못 Lymnaea stagnalis 달팽이. 이전 연구는 이미 정액의 영수증이 종의 여성의 생식 출력 13 ~ 15에 영향을 미치는 것을 보여 주었다, 그리고 참여 정액 단백질 중 일부는 16, 17을 확인되었습니다. Koene 등 16에보고 된 방법의 확장이 프로토콜의 전반적인 목표는 복족류 연체 동물의 알 누워 다양한 매개 변수에 대한 정액 단백질의 효과를 테스트하는 것입니다. 이것은 전립선 (즉, 정액 생산하는 남성 액세서리 선) 표준화 된 실험실 문화에서 성적으로 고립 된 기증자의 달팽이를의 해부하여 수행됩니다. 둘째, 기증자의 정자는 정낭에서 수집 및 다른 치료 솔루션이 만들어집니다. ,이어서, 시험 달팽이 마취 및 질내 예컨대 시험 용액 (주입혼자 전립선 추출물, 정자와 전립선 추출물, 혼자 정자, 단독으로 전달 매체). 이 시험 달팽이는 다음 달걀 누워을​​ 기록, 표준 조건 하에서, 주에 다음과 같은 일에 대해 모니터링된다. 계란 대중은 디지털 계산 및 다양한 파라미터를 측정하기위한 검사, 수집하고 부화에 대한 개별 유리 병에 배치됩니다. 약 2 주 후, 새끼는 계산과 디지털 스캔됩니다. 계란 질량체와 새끼 양의 모든 스캔은 다음 자유로이 사용할 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석된다. 이 프로토콜에 대한 큰 연못 달팽이, Lymnaea의 stagnalis의 실험실 균주 암스테르담 VU 대학에서 사육하는 데 사용됩니다. 이 종은 성적 선택과 자웅 동체의 재생에 대한 질문을 조사하기위한 모델 시스템 역할을합니다. 동물의 비교적 큰 크기는 실험적으로 매우 액세스 할 수 있습니다. 또한, 때문에 많은 B의 모델 종으로 사용됩니다iological 분야는 우리는 이미 이러한 동물의 기본적인 생물학에 대해 많이 알고있다. 이 방법은 일반적으로 정액 단백질을 통해 매개되는 성적 선택의 과정에 대한 질문을 연구하는 데 도움이 될 것입니다. 이러한 동시 나온 것 때문에 또, 그들이 남녀가 16,17 분리되는 종의 관광과 같은 단백질이 유사 및 / 또는 다른 방식으로 동작하는지 여부를 해결하는 것이 가능하다.

<table><tbody><tr><td>생선 먹이 플레이크</td><td>TetraPhyll</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소형 수술용 가위</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>굵고 미세한 집게</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10ml 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사 바늘(0.3mm x 13mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mM MgCl2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5.83mmol/L CaCl2&#183; 2H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.76 mmol/L MgCl2&#183; 6H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>42.69mmol/L NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37.53mmol/L KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2액형 실리콘</td><td>실가드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1mm 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜브(직경 1mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>무딘 주사 바늘(0.3mm x 13mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>튜브</td><td>: Eppendorff</td><td></td><td></td></tr><tr><td>460ml 천공 용기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>금속 잎 펀처 (19.6cm2)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>주걱 / 숟가락</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(노트북) 컴퓨터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>평판 스캐너</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>밀리미터 스케일</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>전사 플레이트</td><td></td><td></td><td></td>:</tr><tr><td>유리 타일</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>20ml 유리 바이알</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

복족류 연체 동물의 달걀 누워에 남성 액​​세서리 글 랜드 제품의 효과

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

내부적으로 동물을 시비에서 정액 유체는 일반적으로 함께 정액이나 사정을 형성, 정자에 추가됩니다. 영양 및 활성화 정자 외에, 정액의 구성 요소는 또한 정자 기증자의 수정의 성공을 증가시키기 위해 여성의 생리에 영향을 미칠 수있다. 많은 연구가 별도의 남녀와 종과 같은 효과를보고 있지만, 몇 가지 연구를 동시에 자웅 동체 동물이 해결했다. 이 비디오 프로토콜은 모델 생물로 동시에 자웅 동체 민물 달팽이, 큰 연못 달팽이 Lymnaea의 stagnalis를 사용하여, 복족류에있는 정액의 효과를 연구 할 수있는 방법을 제시한다. 프로 시저가 완료 전립선 추출물을 사용하여 도시되어 있지만, 각 구성 요소 정액의 (즉, 단백질, 펩티드 및 다른 화합물)를 동일한 방식으로 시험 될 수있다. 달걀 누워에 사정 구성 요소의 영수증의 효과 달걀 누워 주파수의 정량화 될 수있다이러한 각각의 계란 대중 내에서 계란 번호와 같은 여성의 생식 성능의 미묘한 추정하고있다. 결과는 정액 단백질은 성적 선택에 대한 자신의 중요성을 강조,이 동시 자웅 동체의 여성의 생식 출력에 영향을 미치는 것으로 나타났다.

그림 1은 제어 물질 (생리 식염수) 하나의 질내 주입 한 후 알을 낳고 동물의 비율을 보여줍니다, Ovipostatin, 또는 Ovipostatin 정자와 함께 제공합니다. N은 각 치료 = 15; . 정보 및 통계를 Koene 등 16 참조 (출처 :. Koene 등 2010 PLoS 하나의 그림 3 참조). <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1. Lymnaea stagnalis의 계란 대량 생산에 Ovipostatin의 효과. 그래프 제어 물질 (생리 식염수) 하나의 질내 주입 한 후 알을 낳고 동물의 비율을 보여줍니다, Ovipostatin, 또는 Ovipostatin 정자와 함께 제공합니다. N은 각 치료 = 15; Koene 등을 참조하십시오. 2010 정보 및 통계. Koene 등의 허가를 다시 인쇄 2010 PLoS 하나 5 :. E10117.

이 비디오 프로토콜은 자웅동체 민물 달팽이 Lymnaea stagnalis를 사용하여 복족류에서 정액의 영향을 연구하는 방법을 보여줍니다.

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 정액 단백질이 동시 자웅동체 종의 산란 행동에 미치는 영향을 규명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 표준화된 실험실 배양액에서 개체를 분리한 후 표적 기관을 해부합니다. 그 다음으로 정자를 수집하고 처리 용액을 제조합니다.그 후, 달팽이를 인공 수정시킵니다. 그런 다음 생물학적 분석(bio assay)을 수행합니다. 표준 조건 하에서 알 덩어리를 수집하고 스캔한 뒤, 부화를 위해 개별 BS에 넣습니다.몇 주 후, 부화한 개체들을 계수하고 스캔하며, 이후 모든 사진을 무료 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 정액 단백질을 통해 매개되는 성 선택 과정에 관한 의문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기서는 동시 자웅동체(simultaneous hermaphrodites)를 관찰하므로, 이러한 과정이 단성 종에서와 유사하게 또는 다르게 작동하는지 여부도 다룰 수 있습니다.본 프로토콜에서는 암스테르담 VU 대학교에서 사육 중인 대형 IL in les를 사용하였습니다. 우리는 성 선택 및 번식에 관한 문제를 연구하기 위해 이 종을 이용합니다. 자웅동체(Hermaphrodites)의 경우 체구 크기가 상대적으로 커서 실험적으로 접근하기 매우 용이합니다.또한, 이 동물들은 다양한 생물학 분야에서 모델 종으로 사용되기 때문에, 우리는 이들의 기초 생물학에 대해 많은 것을 알고 있습니다. 제 이름은 Yumi이며, 생태과학과에서 박사 과정을 밟고 있습니다.대학 전 과정에서 다음의 프로토콜들을 시연하겠습니다. 시작하겠습니다. 신뢰할 수 있는 바이오에세이를 수행하기 위해, 잠재 변수를 배제하고자 일반적으로 실험실 배양물을 가장 많이 사용합니다.저구리 수질은 20°C로 유지되며, 명암 주기는 12시간씩 교대로 설정합니다. VU 대학의 실험실 배양은 지속적인 수질 교환이 이루어지는 번식 시설 수조에서 유지됩니다. 표준 조건하에서 성체 달팽이에게는 마음껏 상추를 급이하며, 연령대에 따라 분류하여 관리합니다.달팽이를 사육 시설에서 꺼낸 후에는 사용 중인 것으로 간주되며, 다시 사육 탱크로 돌려보낼 수 없습니다. 절차를 시작하기 전, 실체 현미경, 핀이 꽂힌 해부판, 소형 수술 가위, 핀셋, 염화마그네슘 용액이 채워진 주사기, 그리고 종이 타월이 필요합니다. 달팽이를 안락사시키기 위해 주사 바늘을 45도 각도로 발 부분에 찔러 넣고, 달팽이가 이완되어 확장된 상태로 유지될 때까지 지속적으로 천천히 압력을 가합니다. 주사 바늘을 제거하고 달팽이가 완전히 안락사되었는지 확인하십시오.다음으로 핀셋을 사용하여 껍질을 조심스럽게 제거합니다. 껍질의 곡선을 따라 절반 정도 부드럽게 긁어내어 외투막 근육을 껍질에서 분리합니다. 그런 다음 껍질의 나선 방향을 따라 달팽이를 껍질에서 부드럽게 비틀어 꺼냅니다.이제 달팽이를 껍질에서 분리했으므로 껍질은 폐기해도 됩니다. 그 다음, 달팽이를 해부 접시에 놓고 발의 뒷부분에 핀을 꽂아 고정합니다. 이어서 머리 부분에 핀을 꽂습니다.달팽이에 약간의 긴장을 준 상태에서 핀을 플레이트에 고정합니다. 이제 달팽이를 해부할 준비가 되었습니다. 실체 현미경의 조명을 켜고 현미경을 조정합니다.첫 절개를 하기 전에 암컷 생식공(female pore)의 위치를 파악하는 것이 중요합니다. 이는 나중에 기준점으로 활용됩니다. 외투막(mantle) 가장자리 바로 아래에 첫 절개를 가하고 암컷 생식공 쪽으로 절개하십시오.두개골 구멍(bonno pore) 주변을 돌아 머리 방향으로 절개합니다. 이때 다른 장기를 건드리지 않고 피부만 직선으로 절개하도록 주의하십시오. 본 연구에서는 정액과 정자를 각각 얻기 위해 전립선과 정낭을 적출하겠습니다.정자와 정액 저장량이 최대가 되도록 하려면, 달팽이를 일주일 동안 격리하고 자유롭게 먹이를 공급해야 합니다. 해부 방법은 이전에 설명한 것과 동일합니다. 정낭은 동물의 후방에 위치합니다.다음으로, 전립선을 식염수에 현탁시킨 후 얼음에 둡니다. 이후, 이를 처리 용액과 혼합합니다.질 내 주입 전, 수집된 정자를 정액 또는 적절한 용량의 개별 단백질에 첨가합니다. 이 인공 수정 기술을 위해서는 테스트 용액이 담긴 1 mL 주사기가 필요합니다. 주사기에 주입용 바늘을 장착하고, 주입 시 주사기 내에 기포가 남아 있지 않은지 확인하십시오. 실리콘 튜브를 조심스럽게 사용하며, 주입 바늘 위로 실리콘 튜브를 밀어 넣으십시오.튜브가 뚫려 있는지 확인하고 튜브 내부의 공기를 제거합니다. 주입 전, 달팽이를 진정시켜야 합니다. 이 과정은 2장에서 설명한 것과 동일한 프로토콜을 따릅니다.달팽이에게 50 µM 염화마그네슘 용액 2~3 mL를 투여합니다. 달팽이가 적절히 진정되어 이완되면, 안정적인 자세를 유지할 수 있도록 몰드에 놓습니다. 그다음, 미세 핀셋으로 실리콘 튜브의 끝부분을 잡고 암컷 생식공(female pore) 안으로 부드럽게 밀어 넣습니다.그런 다음 주사기를 부드럽게 눌러 정해진 양의 테스트 용액을 조심스럽게 주입합니다. 튜브 내의 압력이 암컷 기관으로 퍼질 때까지 30초 동안 기다립니다. 그 후 튜브를 조심스럽게 제거하고 달팽이를 각각의 전용 용기에 넣습니다.모든 달팽이의 인공 수정이 완료되었습니다. 이제 달팽이들을 실험 수조로 옮기고 생물학적 분석(bioassay)을 시작할 수 있습니다. 달팽이들은 몇 시간 후에 진정 상태에서 회복될 것입니다. 생물학적 분석.성 선택 연구를 위해, 생물학적 분석(biosa)을 시작하기 전 보통 2주간의 실험 기간이 필요합니다. 모든 개체를 각각 개별 용기에 넣고 라벨을 부착하는 것이 중요합니다. 그런 다음, 각 달팽이의 패각 길이를 측정하십시오.이는 성적 행동에 영향을 미칠 수 있는 달팽이의 크기를 나타내는 좋은 지표가 됩니다. 그 후, 달팽이를 실험 수조에 넣습니다. 이 수조는 번식 시설과 동일한 표준 조건으로 유지됩니다.1장에서 논의한 바와 같이, 용기의 입구가 수조 내의 물 흐름 방향과 일치하도록 올바른 방향으로 배치하는 것이 중요합니다. 생물 검정(bioassay) 과정 동안 달팽이에게 정기적으로 먹이를 급여해야 합니다. 금속 홀 펀치를 사용하여 표준량의 상추 디스크를 절단합니다.충분한 투여량은 이틀에 한 번 두 개의 디스크를 사용하는 것입니다. 모델 종인 lumia stauss의 경우, 이틀마다 달팽이의 알 덩어리 형성 여부를 확인해야 합니다. 이렇게 형성된 알 덩어리는 측정을 위해 수집됩니다.알 스캔을 위해 스캐너 드라이버가 설치된 노트북, 평판 스캐너, 표준 밀리미터 자, 알 덩어리용 스푼, 전송 플레이트, 그리고 알 덩어리 위에 놓을 유리판이 필요합니다. 먼저, 스푼을 사용하여 용기 벽면에서 알 덩어리를 긁어냅니다. 불투명한 알 덩어리는 막 산란된 것이므로 사용할 수 없습니다.이 측정 단계에서는 전송 플레이트에 알 덩어리를 놓고 플레이트가 가득 찰 때까지 이 과정을 반복합니다. 그 후, 전송 플레이트에 담긴 순서와 동일하게 알 덩어리를 유리 타일에 옮깁니다. 알 덩어리가 유리 타일에 붙으면, 타일을 뒤집어 저울 바로 아래에 있는 플랫베드 스캐너 위에 조심스럽게 놓으십시오.그 다음 플레이트에 압력을 가하여 알 덩어리를 짓누릅니다. 이렇게 하면 모든 알이 평평하게 펴져 균일하게 스캔될 수 있습니다. 스캔 전, 최상의 결과를 위해 설정을 조정하는 것이 권장됩니다.스캔 시, 우선 미리보기 스캔을 위해 해상도를 최대값으로 조정하는 것이 중요합니다. 이후 작업 영역을 잘라내고, 최종 스캔을 하기 전에 밝기와 대비를 조정합니다. 스캔 후, 알 덩어리들은 성숙 및 부화를 위해 각각 라벨이 부착된 바이알(Vial)에 담깁니다. 이 바이알의 물은 산소 수치를 적절하게 유지하기 위해 이틀마다 교체해 줍니다.더 많은 달팽이가 부화함에 따라, 물을 교체하기 위해 서로 다른 기술을 사용해야 합니다. 가장 권장되는 순서는 처음에는 붓거나 넘치게 하는 방식(overflowing)을 사용하고, 나중에는 피펫으로 물을 빨아들이는 것입니다. ImageJ 스프레드시트 프로그램에서 데이터를 기록하고 사진을 가져오려면, 먼저 확대 도구를 사용하여 밀리미터 스케일로 이동하십시오.화면을 확대하고 1mm가 화면에 가득 차도록 창을 조정합니다. 선 도구를 사용하여 두 표시선 사이에 선을 긋습니다. 그다음, 'analyze'로 이동하여 'set scale'을 설정합니다.팝업 메뉴에서 Measured length(측정 길이)를 기지의 거리 1로 조정하고 unit of(단위)를 millimeters(밀리미터)로 설정합니다. global(전역) 확인란을 체크하고 창을 닫습니다. 이제 스케일 설정이 완료되었으므로, 첫 번째 난괴 쪽으로 최대 800%까지 확대합니다. 타원형 도구를 사용하여 알의 둘레를 그립니다.D를 눌러 둘레를 그립니다. 이는 동일한 알을 두 번 측정하는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. M을 눌러 둘레를 측정하십시오.충분한 데이터가 수집되면 팝업 창이 나타납니다. 데이터 창은 엑셀 파일로 저장할 수 있습니다. 데이터는 워크시트로 직접 복사할 수도 있습니다.팝업 창에 원하는 측정값이 표시되지 않는 경우, 이를 조정하여 분석할 수 있습니다. 설정된 측정값과 더불어, 셀 카운터(cell counter) 플러그인을 사용하여 난괴당 개별 알의 수를 세는 것도 가능합니다. 플러그인(plugins) 메뉴로 이동하십시오.그 다음 분석(analyze) 및 세포 계수기(cell counter)를 선택합니다. 세포 계수기 창이 나타나면 'keep original' 상자를 체크하고 initialize를 누릅니다.새 카운터 창이 나타났습니다. 툴바에서 cross here 도구를 선택하십시오. 그런 다음 셀 카운터 메뉴에서 카운터 유형을 선택하십시오.셀 카운터 창을 클릭하여 알을 계수합니다. 총 계수 수는 셀 카운터 메뉴의 카운터 유형 옆에서 확인할 수 있습니다. 셀 카운터를 사용하여 여러 개의 알 덩어리를 계수할 수 있습니다.필요에 따라 카운터 유형을 추가하거나 제거할 수 있습니다. 이 숫자를 스프레드시트에 수동으로 복사하거나 results를 누르면 모든 결과가 표시되는 창이 나타납니다. 본 방법을 통해 정액 단백질을 수집하는 방법과 이를 유의미하게 테스트하는 방법을 제시하였습니다.우리는 전립선 전체 추출물을 사용하여 이를 입증하였으나, 물론 개별 정액 단백질 또한 동일한 방식으로 테스트할 수 있습니다. 또한, 다른 프로세스와 산란에 대해 살펴보는 것도 가능합니다. 우리 실험 결과에 따르면, avios statin이라고 불리는 단정액 단백질 하나가 산란 감소를 매개한다는 것이 밝혀졌습니다.또한, 정액의 전달이 크기 또는 포스트의 수를 증가시킨다는 것을 확인하였습니다. Statin은 동시 자웅동체에서 완전히 특성이 규명된 최초의 정액 단백질입니다. 정액의 효과는 성별이 구분된 종에서 자주 보고되어 왔으나, 본 연구 결과는 정액이 자웅동체에서도 동일하게 중요하다는 점을 강조합니다.

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