재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서

다음 실험의 전반적인 목표는 담배 식물에서 표적 단백질을 일시적으로 발현시켜 단기간 내 식물 기반 효소 발현의 가능성을 확인하는 것입니다. 이러한 일시적 발현은 관심 유전자가 삽입된 벡터를 포함하는 agrobacterium tumor fain 균주를 담배 잎에 침투시켜 수행됩니다. 배양 후, 침투시킨 식물 잎을 수확하고 단백질 추출물을 부분적으로 정제하여 활성 효소 용액을 얻습니다. 그 다음으로, 식물 기반 발현이 효소에 미치는 영향을 평가하고 효소 활성을 검증하기 위해 단백질 분석을 수행합니다.

웨스턴 블로팅, zymography 및 기질 분해 분석을 통해 단백질 크기, 가능한 당화 효과 및 효소 활성을 보여주는 결과를 얻었습니다. 이 방법은 식물 바이오매스 전환에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 담배에서 일시적으로 발현된 효소의 활성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 주사기로 인해 잎이 쉽게 손상될 수 있어 침투 단계를 익히기가 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요하며, 모든 실험은 무균 조건에서 수행될 것입니다.

agrobacterium의 단일 콜로니를 항생제가 포함된 10 milliliters의 효모 추출물 배지(Yeast extract broth)가 들어 있는 삼각 플라스크로 옮깁니다. 그 후 접종된 배지를 26 °C에서 180 RPM으로 흔들어주며 36~40시간 동안 배양합니다. 다음으로, 각 배양액 200 microliters를 이전과 동일한 항생제가 포함된 20 milliliters의 효모 추출물 배지에 접종하고, 동일한 조건에서 36~40시간 동안 배양합니다.

2 µL의 acetophenone, 100 µL의 40% glucose 용액, 그리고 pH 5.6의 1 M MES 버퍼 200 µL를 사용하여 배양물을 유도하고 하룻밤 동안 계속 배양합니다. 이제 온실에서 식물을 꺼내 피펫 팁으로 식물 상단에서 세 번째에서 다섯 번째 잎의 AB 축 방향 측면을 살짝 흠집 내어 침투가 용이하게 합니다. 그런 다음 주사기에 침투 배지를 채우고 이전에 만든 흠집 중 하나에 배치합니다.

손가락으로 axio 잎 쪽의 주사기를 지지하고 정맥 잎 구역에 배지를 조심스럽게 주입합니다. TR cell 5:00 AM cherry를 발현하는 잎 단면의 형광을 시각화하려면, 녹색광을 방출하는 휴대용 광원으로 식물을 비춥니다. 적색 필터를 통해 관찰하면 TR cell 5:00 AM cherry의 형광이 뚜렷하게 보입니다.

발현된 단백질을 추출하려면, AUM containing P track ERTR cell five A가 침투된 담배 잎을 선택하여 1g 크기로 자릅니다. 그 다음, 이를 미리 냉각시킨 막자사발에 넣고 샘플에 적절한 양의 액체 질소를 추가합니다. 막자로 잎을 갈아 분말로 만듭니다.

비침투 담배 잎으로 동일한 과정을 반복하여 대조군 샘플을 얻습니다. 그 다음, 1 mM phenyl methyl suen fluoride가 포함된 PBS 2 mL를 분쇄된 잎 조직에 첨가하고, 대부분의 잎 조직이 현탁될 때까지 혼합합니다. 추출물을 4 °C에서 15,000 ×g로 20분 동안 원심 분리합니다.

그런 다음 펠릿을 제거하고, 단백질이 포함된 SNAT를 55 °C에서 10분 동안 배양한 후 실온에서 10분간 방치하여 부분적으로 정제된 TR cell five A를 준비합니다. 이어서 SNAT를 실온에서 15,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 제거하고 단백질이 포함된 SNAT 상층액을 모든 실험에 사용합니다.

추가 분석. 대조군 샘플을 얻기 위해 침윤시키지 않은 식물에 대해서도 부분 정제 과정을 수행하십시오. 이 과정에서는 에틸 셀룰로오스와 물을 혼합하여 1.5% 용액을 만들고, 완전히 용해될 때까지 교반하며 배양하십시오.

A-C-M-C-S-D-S 페이지 겔을 제작하려면, 10 mL의 SDS 페이지 겔 혼합 용액에서 물 1 mL를 1.5% CMC 1 mL로 대체한 후 평소와 동일하게 겔을 붓습니다. 다음으로, SDS가 포함된 상태에서 샘플을 가열하여 변성시킵니다. 염색약 전선이 겔 바닥에 도달할 때까지 200 V에서 50분 동안 전기영동을 수행합니다. 이제 해당 15% C-M-C-S-D-S 페이지 겔 상에서 겔 내 단백질 리폴딩을 수행합니다.

pH 6.5의 20 millimolar 인산 시트르산 완충액에 1.5% beta cyclodextrin을 사용하여 제조합니다. 젤을 이 용액에 넣고 실온에서 부드럽게 흔들어주며 15분 동안 배양합니다. beta cyclodextrin 용액을 제거하고 젤을 물로 짧게 세척한 후, pH 4.8의 50 millimolar 아세트산 나트륨 완충액에서 실온으로 15분 동안 더 배양합니다.

그 다음, 겔을 30 millimolar sodium acetate buffer에 넣고 50 degrees Celsius에서 20분 동안 배양하여 refolded point 15%C-M-C-S-D-S page gel을 이용해 CMC zy를 수행합니다. CMC가 분해된 위치를 시각화하기 위해 0.1% Congo red solution을 사용하여 겔을 10분 동안 염색하고, 1 molar sodium chloride를 사용하여 30분 동안 또는 투명한 밴드가 관찰될 때까지 탈색한 후, 마지막으로 0.3% acetic acid로 겔을 세척합니다. 분석을 실행하기 직전에 더 선명한 이미징을 얻으려면, 4 MUC 2 X 작동 용액을 준비하여 96 well plate의 개별 웰에 4 MUC 작동 용액 100 microliters를 피펫으로 분주합니다.

그런 다음, 각 샘플 100 µL를 해당 웰에 넣고, 들뜸 파장 360 nm와 방출 파장 465 nm를 사용하여 각 샘플을 3회 반복 측정합니다. 형광 분광법을 통해 0분 시점의 형광 값을 측정합니다. 다음으로, 접착식 리드로 덮은 플레이트를 50 °C에서 20분 동안 배양합니다.

그 다음, 급속 냉동하여 반응을 중단시킵니다. 이후 0분 시점과 동일한 파라미터를 사용하여 최종 형광 값을 측정합니다. 20분 시점의 형광 값에서 0분 시점의 형광 값을 빼서, 분석을 수행하기 직전 효소 활성으로 인해 발생한 형광 변화량을 결정합니다.

A-O-C-M-C 2X 작동 용액을 준비합니다. 그런 다음 1.5 mL 튜브에 시료 50 µL와 작동 용액 50 µL를 혼합합니다. 이어서 시료를 50 °C에서 20분 동안 배양합니다.

침전액 250 µL를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 이어서, 각 시료를 10초 동안 강하게 볼텍싱하여 시료와 침전액이 완전히 섞이도록 합니다. 그 후 시료를 상온에서 10분 동안 배양하고 다시 볼텍싱한 다음, 1000 Gs에서 10분 동안 원심분리합니다.

그 후, 각 샘플의 SNAT 200 µL를 교반하지 않고 96웰 플레이트로 옮깁니다. 펠렛의 효소 활성은 가용화된 염료의 농도가 높을수록 높게 나타납니다. 이를 590 nm 파장에서 흡광 분광법으로 측정하십시오.

본 단계에서는 거름종이 원판을 1.5 또는 2 mL 튜브에 넣습니다. 거름종이 원판에 60 mM sodium acetate 100 µL와 시료 100 µL를 첨가하고, 50 °C에서 300 RPM으로 흔들어주며 20시간 동안 배양합니다.

또한, 분석을 수행하기 직전에 거름종이가 없는 개별 시료를 대조군으로 함께 배양하십시오. PABA 용액 A 1 mL와 PABA 용액 B 9 mL를 포함하는 1.5 x PABA 작동 용액을 준비합니다. 사용 전까지 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 0.5 mL 내열 튜브에 시료를 준비합니다.

시료는 45 µL의 물, 거름종이와 함께 배양한 각 용액 5 µL, 그리고 PABA 작업 용액 100 µL로 구성됩니다. 그 후, 동일한 방식으로 준비한 시료 대조군과 5개의 표준물을 주입합니다. 그런 다음 시료, 대조군 및 표준물을 100 °C에서 정확히 10분 동안 배양하고, 상온에서 다시 10분 동안 냉각합니다.

용액 100 µL를 96-웰 플레이트에 분주하고 분광광도계를 사용하여 410 nm 파장에서 분석합니다. 여과지 시료 값에서 개별 시료의 대조군 값을 빼서 방출된 환원당의 양을 결정합니다. 다음은 발현 카세트와 담배 식물의 단백질 발현을 보여주는 이미지입니다.

이는 일반 광원 아래와 적색 필터가 장착된 녹색 광원 아래에서 침윤된 담배 잎의 모습이며, 여기서 적색으로 표시된 TR cell 5:00 AM cherry의 발현이 명확하게 보입니다. SDS page 겔, western lot 및 CMC zy는 T cell five A의 크기와 활성을 보여줍니다. 총 수용성 단백질을 분리하였으며, 이를 쿠마시 블루(kumasi blue) 염색으로 시각화할 수 있습니다. T cell five A의 hist tag 영역에 대한 Western blotting을 통해 단백질 크기를 확인하였으며, 추가적으로 CMC에 대한 셀룰라아제(cellulase) 활성을 콩고 레드(Congo red)로 염색된 xenograft로 보여줍니다. 여기서 볼 수 있는 것은 TR cell five A가 일시적으로 발현된 담배 식물 잎의 총 수용성 단백질이며, 열 침전 정제 전후의 상태를 보여줍니다. TR cell five A는 가장 크게 보이는 밴드이며, western lot과 CMC sigraph에서도 확인됩니다.

또한 Tcell five A가 포함되지 않은 담배 식물의 총 가용성 단백질을 열 침전 후 확인하였으며, 상용화된 tresa cellulase 혼합물의 단백질도 확인하였습니다. 이 그림은 TR cell five A의 효소 활성 정량 결과를 보여줍니다. TR cell five A를 four MUC Azo CMC 또는 여과지와 함께 배양하였으며, 기질 분해 정도는 fluoro four four mu azo 염료의 방출량이나 PBA의 색 변화를 통한 환원당 정량을 통해 측정하였습니다. 이 절차 외에도, 단백질 타겟팅과 같은 다른 방법들을 사용하여 단백질 국소화가 효소의 안정성과 활성에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 추가적인 정보를 얻을 수 있습니다.

본 영상을 통해 담배 식물에서 단백질을 일시적으로 발현시키는 방법과 셀룰로오스 바이오매스 전환을 위한 효소 활성 평가 방법에 대해 명확히 이해하셨을 것입니다.