Name: 재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서 트리코더마 reesei 담배 식물에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: 배우세요 담배 식물에서 재조합 셀룰라아제 TrCel5A의 일시적 발현 방법을 통해 식물 기반 효소 생산 가능성을 평가하고 효소 활성을 분석하는 기술을 익히세요.

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이 작품은 BMBF Forschungsinitiative에 의해 지원되었다 &quot;BioEnergie 2021 - Forschung 모피 Nutzung 폰 Biomasse 다이&quot;과학을 촉진하기 위해 독일 연방 정부 및 주 정부의 우수 이니셔티브 재정 지원을 통해 우수 &quot;바이오 매스에서 맞춤형 연료&quot;의 클러스터 독일 대학의 연구.

야생형 N.의 tabacum 식물 1. 성장 <ol><li> N. 성장 tabacum L. 이력서. 토양에 쁘띠 하바나 SR1 식물, 발아 일반 화분 용 흙으로 가득 적절한 냄비에 담배 씨앗을 배치합니다. 이주 후, 각각의 화분에 모종을 전송합니다. 상수 22 ° C (어두운 기간) 또는 25 ° C (빛 기간)과 온실에서 식물과 70 %의 상대 습도를 품어. 8분의 16 시간 빛 / 어둠주기에 조명을 제공합니다 (예 : 필립스 IP65 400 W 램프, 180 μmol · 초 -1 · m -2, λ = 400 ~ 700 nm의) 매일 물. </li></ol> TrCel5A 및 TrCel5A - mCherry 단백질의 2. 일시적 발현 <ol><li> 멸균 조건에서 Agarobacterium 튜메 파시 엔스의 단일 콜로니 (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RifR) pTRAkc-ER-TrCel5A 또는 pTRAkc-ER-TrCel5A - mCherry 10 ㎖의 효모 추출물을 함유하는 삼각 플라스크로 전송 중 하나를 포함을 선택선택을위한 국물 (YEB, 제조업체의 사양에 따라 준비) 중간 및 카나마이신 (50 ㎎ / ㎖), 리팜피신 (50 ㎎ / ㎖) 및 카르 베니 실린 (100 ㎎ / ㎖). 26 ° C에서 36 ~ 40 시간, 180 rpm으로 배양한다. 참고 : 단백질 발현에 적합한 구조의 디자인은이 글의 범위를 벗어나지 만, 지침, 맥클레인 등 13 먼로와 Pellham (14)의 방법은 구조 설계에 따라 할 수있다.. </li><li> 위에서 언급 한 항생제 농도 YEB 20 ㎖를 접종하고 이전과 같은 조건에서 배양 각 문화의 200 μl를 가져 가라. </li><li> 36-40 시간 후, 2 μL의 acetosyringon (200 μM 최종 농도), 100 ㎕의 40 % (w / v)의 포도당 용액 1 M MES 버퍼 산도 5.6의 200 μL.을 추가하여 문화를 preinduce 밤새 품어. </li><li> 배 침투 버퍼 (100g / L의 자당, 3.6 g / L의 포도당, 8.6 g / L 무라 시게와 스쿡 기초 염 100 ㎖를 준비,)의 수산화 칼륨을 사용하여 pH를 5.6로 조정합니다. </li><li> 이 OD 5-6의 (600)에 도달 할 때까지 1시 5분 희석와 문화의 OD 600을 측정합니다. OD 600에서 30 ㎖의 침투 매체에 필요한 문화의 볼륨을 계산합니다. 배 침투 버퍼의 15 ML을 추가하고 30 ㎖까지 버퍼를 만들기 위해 탈 H 2 O를 추가합니다. </li><li> 온실에서 식물을 타고 침투를 용이하게하기 위해 정상에서 5 번째 잎에 닉에 제 3의 배축면을 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 침투를 용이하게하기 위해 대화명에 잎의 배축면을 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 침투 매체와 주사기를 입력하고 이전에 만든 닉 중 하나에 (바늘없이)에 넣어. 향축 잎면에 손가락으로 주사기를 지원합니다. interveinal 잎 영역의 조직으로주의 깊게 매체를 누릅니다. 참고 : 침윤 후, 상술 한 바와 동일한 조건 하에서 식물을 온실에서 재배. 또한, untr의 동일한 비율을 유지침투 식물과 같은 조건에서 컨트롤로들 어갈, 비 일시적 발현 식물 (NTEPs). </li></ol> 식물 잎의 TrCel5A - mCherry 식 3. 평가 <ol><li> 4-6일 후, A. 침투와 식물을 온실에서 pTRAkc-ER-TrCel5A - mCherry을 포함하는 형광 분석을위한 어두운 방에 배치 튜메 파시 엔스. </li><li> 빨간색 필터 (620-750 nm의)와 515 nm에서 녹색 빛을 방출 휴대용 광원을 사용 TrCel5A - mCherry, 빛 식물을 표현 잎 부분에서 형광을 시각화합니다. 참고 : 깊이에서 식물의 잎에서 단백질 발현의 특성은 빛과 형광 현미경 아래 vibratome 및 검사에 얇은 절편 잎에 의해 달성 될 수있다. 이를 위해 아래의 단계를 따릅니다 : <ol><li> 침투 잎에서 약 5 × 5 ㎜ 크기의 작은 부분을 잘라 아가로 오스 50 mM의 인산염 완충액 (pH 5.7)에 녹인 4 %에이를 포함 할 수 있습니다. </li><li> 절단vibratome를 사용하여 임베디드 잎에서 80 ~ 90 ㎛의 크기의 섹션. 버퍼 또는 커버 슬립 커버와 상기 한 바와 같은 파장 필터를 사용하여 형광 검출기로 10 배 배율의 현미경을 사용하여 검사, 현미경 슬라이드에 배치합니다. </li></ol></li></ol> 담배 잎에서 4. TrCel5A 추출 <ol><li> A. 감염된 식물에서 1g의 대략적인 무게에 담배 잎에서 조각을 잘라 pTRAkc-ER-TrCel5A 및 액체 질소로 미리 냉각 박격포 위치를 포함하는 튜메 파시 엔스. 샘플에 액체 질소의 적절한 금액을 추가합니다. 갈기는 예비 냉각 유를 사용하여 분말로 떠난다. </li><li> 지상 잎 물질에 1mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드를 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS) 2 ㎖를 추가하고 잎 물질의 대부분은 현탁액이 될 때까지 혼합한다. 4 ° C에서 20 분 동안 15,000 XG에 단백질 함유 상층 액을 원심 분리기 추출물. </li><li> 원심FUGE 4 ° C에서 20 분 동안 15,000 XG에 추출하고 펠렛을 방해하지 않도록주의하고 단백질 함유 상층 액을. 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 부분적으로 10 분 동안 55 ° C에서 단백질 함유 상층 액을 배양하여 TrCel5A을 정화. RT에서 10 분 동안 15,000 XG에서 원심 분리 한 후, 추가로 실온에서 10 분 동안 휴식을 허용한다. 제어 샘플을 얻기 위해 비 침투 식물에 대한 부분 정제 과정을 반복합니다. 다음의 모든 실험이 샘플을 사용합니다. 참고 : 단백질 솔루션은 최대 3 개월까지 1 주일 또는 -20 ° C에서 11 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 제어 샘플을 얻기 위해 비 침투 식물의 부분적인 정화 과정을 반복합니다. 다음의 모든 실험이 샘플을 사용합니다. 참고 : 단백질 솔루션은 최대 3 개월까지 1 주일 또는 -20 ° C에서 11 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 5. SDS-PAGE, 웨스턴 블로 팅 및 TrCel5A - mCherry &lt;의 아조-CMC Zymography/ P&gt; <ol><li> 구매 또는 설치 방법 15에 따라 (W / V) SDS-PAGE 젤 12 %를 준비합니다. </li><li> 1.5 % (w / v) 용액을 수득 물에 녹여 CMC. CMC-SDS-PAGE 젤을 만들려면 (w / v) CMC + 12 % (W / V 0.1 %의 결과로, 10 ㎖ SDS-PAGE 젤 혼합 용액에 물 1 ㎖에 1.5 % CMC 1 ㎖를 대체 ) SDS-PAGE 젤 혼합. 일반적으로 젤을 붓는다. 주 : (직접 사전 겔 용액을 제조하는 과정을 반복) 기존의 해결에서 CMC가 완전히 40 ° C로 교반 및 가열의 조합에 의해 용해되는 것을 확신합니다. </li><li> 설치 방법 (12)에 따라, SDS의 존재에 끓여 샘플을 변성. 양성 대조군으로서, T.로부터 시판 셀룰라아제 혼합물의 1:500 희석을 사용 이러한 T.로 reesei, reesei ATCC 26921. 음성 대조군으로 비 침투 잎 (NTEPs)에서 유사하게 제조 단백질 용액을 사용합니다. </li><li> 일반 프로토콜 15에 따라 전기 영동을 수행,염료 전면 겔의 하단에 도달하면 예를 들면 정지 전기로 50 분 ~ 200 V를 사용합니다. </li><li> 0.1 %를 사용한 한 SDS-PAGE 겔을 염색 (w / v) 쿠마시 브릴리언트 블루 및 메탄올 / 빙초산 혼합물을 사용한 destain. 참고 : 빠른 염색과 destaining 부드럽게 염색을 가열하고 10 분 후 destaining 솔루션을 변경, 따뜻하게 (그러나 비등) 먼저 염색을하고 destaining 솔루션 15 초 ~를위한 전자 레인지를 사용하여 즉, 솔루션을 destaining하여 수행 할 수 있습니다 또는 냉각하고, 새로운 destaining 용액으로 반복하면. </li><li> 설립 프로토콜 (16, 17)를 사용하여 하나의 SDS-PAGE 젤 웨스턴 블로 팅을 수행합니다. (보조), 알칼리 인산 분해 효소에 접합 된 그의 태그 (주) 및 폴리 클로 날 염소 항 - 토끼 항체 Fc 영역에 대한 다 클론 토끼 항체 : 다음과 같은 항체를 사용합니다. 참고 : 2 차 항체는 nitroblue의 테트라를 사용하여 시각화를 가능하게 선택해야윰 chloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39;- indolyphosphate의 P-톨루이딘 소금 (NBT / BCIP), 18 설명한대로. </li><li> 0.15 %에 접힘에 젤 단백질 (W / V) 실온에서 β-사이클로 덱스트린, 20 mM의 인산 구연산 버퍼, 산도 6.5, 1.5 %에 젤을 배양하여 (w / v) CMC SDS-PAGE 젤을 수행 부드러운 15 분 19 진탕. </li><li> β-사이클로 덱스트린 솔루션을 취소하고 잠시 H 2 O와 젤을 씻어 추가로 15 분 동안 50mM의 아세트산 나트륨 완충액 (pH 4.8)에서 RT에서 배양한다. 50 ℃에서 20 분 동안 30 mM의 아세트산 나트륨 완충액 pH를 4.8에서 젤을 배양하여 접힘 0.15 % CMC SDS-PAGE 젤을 사용하여 CMC의 zymography를 수행 </li><li> (w / v) CMC SDS-PAGE 겔 50 ℃에서 20 분 동안 30 밀리미터 아세트산 나트륨 완충액 (pH 4.8)에 젤을 배양하여 접힘 0.15 %를 사용하여 CMC의 zymography를 수행 </li><li> 0.1 %를 사용하여 10 분 동안 젤을 얼룩 W / 30 분 콩고 레드 솔루션 destain V 또는 명확한 밴드가 1 M 나를 사용하여 관찰 될 때까지CL. 선명한 영상을위한 0.3 % (V / V) 아세트산 젤을 씻으십시오. </li></ol> TrCel5A 6. 4 MUC 활동 분석 <ol><li> 50 %에서 10 mM의 4-MUC (v / v) 메탄올의 스톡 용액을 준비하고, 그것을 실온에서 어두운 곳에서 보관 </li><li> 직전에 분석을, 4-MUC 배 일 1 ㎜ 4-MUC로 구성된 솔루션, 60 MM의 아세트산 나트륨, 산도 4.8을 준비하고 있습니다. </li><li> (inducibly 표현 또는 TrCel5A없이) 잎 단백질의 100 μL, T. 100 ㎕를 시판 셀룰라아제의 혼합물을 포함하는 샘플에서이 테스트를 수행 reesei의 1:1,000, 및 순수한 H 2 O였다. 세중의 각 샘플을 실행합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트의 별도의 우물에 4 MUC 작업 솔루션의 피펫 100 μL는, 각 샘플의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 360 ㎚의 여기 파장 및 465 ㎚의 방출 파장을 이용한 형광 분광법을 통해 4-MU 형광 0 분 평가시기를 결정한다. </li><li> 20 접시를 품어50 ° C에서 분, 증발을 방지하기 위해 접착제 뚜껑으로 덮여있다. 냉동 (또는 ㎕의 0.15 M 글리신, pH가 10.0, 별도의 플레이트에 샘플 100 μl를 (100)를 결합하여)에 의해 반응을 중지합니다. </li><li> 360 ㎚의 여기 파장 및 465 ㎚의 방출 파장을 이용한 형광 분광법을 통한 4-MU 형광의 종점을 결정한다. 형광 값의 변화를 얻기 위해 엔드 포인트 (20 분) 평가시기에서 0 분을 뺍니다. </li></ol> TrCel5A 7. 아조-카르복시 메틸 셀룰로오스 활동 분석 <ol><li> 1.5 %의 재고를 준비 (w / v) RT에서 저장되고, 아조 - CMC 18 mM의 아연 아세테이트, 0.5 M 아세트산 나트륨, pH를 5 ~ 80 % 에탄올 (v / v), 룸에서 상점을 함유 침전 용액 온도. </li><li> 직전에 분석에 1 %로 구성 아조-CMC 배 작업 솔루션, (W / V) 아조-CMC (H 2 O의)와 60 mM의 나트륨 아세테이트, 산도 4.8을 준비하고 있습니다. </li><li> 샘플의 50 μL와 작품의 50 μl를 결합1.5 ML 튜브에 용액을 주입. </li><li> (일시적으로 표현하거나 TrCel5A없이) 잎 단백질의 50 μl를 포함하는 테스트 샘플; T.로부터 시판 셀룰라아제 혼합물의 100 μL reesei는 1:1,000 희석; 순수한 H 2 O 세중 실행 시료와 표준. </li><li> 50 ℃에서 20 분 동안 샘플을 품어 침전 용액 250 μl를 첨가하여 반응을 정지. 소용돌이 적극적으로 10 초 동안 각각의 샘플 솔루션이 완전히 결합 된 보장합니다. </li><li> 다시 10 분 후 소용돌이 RT에서 샘플을 품어. 10 분 1,000 XG에 원심 분리기 샘플. 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 96 - 웰 플레이트에 각 시료의 상층 액 200 μl를 제거합니다. </li><li> 590 ㎚의 파장에서 흡수 분광법을 이용하여 분석. </li></ol> TrCel5A 8. PAHBAH 분석 <ol><li> 여과지의 원형 (~ 5.5 mm 직경)을 잘라 구멍 펀치를 사용합니다. 100 ㎕의 60 mM의 NaAc, 산도 4.8, 1 추가샘플 (inducibly 표현하거나 TrCel5A없이) 잎의 단백질을 포함하는 하나 또는 상업적 T. 00 μL reesei 셀룰라아제 혼합물, 1:1,000 희석하고, 300 rpm으로 흔들어으로 50 ° C에서 20 시간 동안 필터 종이 서클 품어. 종이 필터와 함께 배양 각 샘플의 경우, 개별 샘플 - 컨트롤과 같은 종이 필터없이 중복 솔루션을 품어. </li><li> RT에서 5 100 ㎖의 용액의 총 염산 집중 ML 및 저장소의 추가와 H 2 O에 PAHBAH을 용해하여 330 밀리미터 P-하이드 록시 벤조산 하이 드라 지드 (PAHBAH) 솔루션을 준비합니다. 참고 : 최상의 결과를 H 2 O 100 ml의 볼륨을하기 전에 해산을하는 데 도움이 온도에서 교반 PAHBAH 슬러리, 즉 30 ㎖의 작은 부피에 염산을 추가하여 달성된다 </li><li> RT에서 50 mM의 시트르산 나트륨, 10mM의 염화칼슘 및 500 mM의 수산화 나트륨 및 판매자를 함유 PAHBAH 용액 B를 준비한다. </li><li> IMMEDiately 전에 분석에 사용할 때까지 (4 시간 내에서 사용되는) 얼음에 10 ㎖의 완충 용액, 상점에 1 ㎖의 PAHBAH 시약의 1.5 배의 작업 솔루션을 준비합니다. </li><li> 내열성 0.2 또는 0.5 ML 튜브에 샘플을 준비합니다. 종이 필터 (단계 8.1) H 2 O 45 μL와 PAHBAH 작업 용액 100 μL와 함께 배양 각 솔루션의 5 μL를 결합합니다. 샘플 컨트롤 (종이 필터없이 배양하는 샘플)는 같은 농도 (5 ㎕의 샘플, 45 μL의 H 2 O, 100 μL의 PAHBAH 작업 용액)에서 실행해야합니다. 또한 0과 포도당 0.2 g / L를 포함하는 5 기준 (5 μL), 순수한 H 2 O를 테스트 세중 실행 시료와 표준. </li><li> 100 ° C에서 정확히 10 분 동안 샘플을 품어 후 정확히 10 분 동안 실온에서 냉각. 410 nm의 파장에서 96 웰 플레이트와 분석 광학적 피펫 솔루션을 제공합니다. 최종 얻기 위해 샘플에서 (종이 필터없이 배양) 개별 샘플 컨트롤을 빼기값. </li></ol>

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</ol>

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셀룰라아제의 재조합 발현으로 인해보다 효율적인 바이오 연료 생산 시스템 1에 대한 욕구에 큰 관심 분야입니다. 식물은 경제 수확 기술과 대규모 바이오 연료 생산을위한 매우 바람직한 특성 인자가 가수 분해 방법 등의 기능과 함께, 성공 셀룰라아제 생산을위한 많은 가능성을 제공합니다. 또한, 단백질을 제조하기위한 다른 언어 버전의 사용이 필요한 경우, 번역 후 변형 (20)에게 허용한다. 분명한 혜택을 제공하는 동시에, 셀룰라아제의 구성 적 표현을 가능하게하는 식물을 바꾸거나, 성공하지 않을 수도 있습니다 시간이 소요되는 방법입니다. 그러한 단백질 발현 유도 및 발현 메카니즘의 격리 같은 기술은 식물에서 성공적인 셀룰라아제 생산의 가능성을 증가하지만 이들은 여전히​​ 확립 수개월 간다. 여기서, 일시적 발현 방법은 특정 셀룰라아제의 가능성을 설명하기 위해 설명된다며칠 내에 공장 시스템을 통해 생산된다. <p class="jove_con...

<html> 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스 액체 연료로의 전환의 저하는 화석 연료에 대한 의존도를 줄일 수있는 방법으로 구상하고있다. 경제성 매스 처리 시스템을 확립 한 가지 중요한 장애물은 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스 (1)의 효소 적 분해에있다. 식물 발현 시스템은 산업 규모에 효소의 생산을위한 큰 잠재력을 보여줍니다. 그들은 수천 년 동안왔다으로 수확 식물 경제적 볼륨에 농업 시스템이 이미 설치되어 있습니다. 식물에서 셀룰라아제의자가 가수 분해에 의한 생산은 2의 용이성 및 식물 세포벽 하나의 소화성을 증가시켜 하부 효소 수준의 사용을 최대화하기위한 전위와 같은 요인들에 바람직하다. 마지막으로, 식물 시스템은 식물 세포의 특정 영역에 대한 재조합 단백질의 타겟팅을 허용하고 세 posttranslationally 필요한 효소를 수정할 수있다. &quot;ve_content&gt; 된 담배 (담배)은 매우 일반적으로 인해 빠른 성장과 바이오 매스 축적 기능 4, 식물의 이종 단백질 발현 연구를위한 모델 생물로 사용됩니다. 재조합 단백질의 일시적 발현은 현지화으로 유연성을 유지하고, 따라서 선택된 단백질, 즉 셀룰라아제의 번역 후 변형 동안에, 짧은 시간 기간 5에서 단백질 생산을 가능하게하는 기술이다. 또한 식물에서 더 표현 전략을위한 기반을 마련하면서는 기본적인 분석을위한 셀룰라아제 (들)의 생산을 가능하게한다. 이러한 일시적 발현 전략을 사용하여, 진균 숙주 트리코더마 reesei (Hypocrea의 jecorina)로부터 유도 된 글리코 하이드 롤라 가족 05 Cel5A, 6 endoglucanase은 (이하 TrCel5A라고 함) 제조된다. TrCel5A는 기본적으로 당화 된 42 kDa의 단백질과 유압에 매우 활성화되어셀룰로오스 사슬 7을 roylzing. 여기에 설명 된 일시적 발현 기술은 식물 아그로 박테리아는 적절한 발현 벡터에 대한 관심의 유전자를 운반 남긴다 침윤, 비교적 널리 사용되는 시스템에 기초한다. 란타 식 성공의 신속한 분석을 허용하기 위해 TrCel5A 또한 mCherry 원래 Discosoma SP에 유래 모노머 형광 단백질과 융합 단백질로서 발현 될 수있다. 단백질에 융합 된 추가적인 여섯 히스티딘 (그의 태그)와, 8 DsRed를 C-말단 (TrCel5A - mCherry). 이종 융합 단백질, TrCel5A - mCherry의 표현 따라서 mCherry 분산을 검토하는 녹색 빛을 사용하여 식물 성장에서 모니터링 할 수 있습니다. 원하는 경우, 식물 재료의 얇은 부분은 단백질의 특정 지역화를 확립 녹색광 현미경으로 관찰 할 수있다. 이 작품, 신호 전송 용앉아 펩티드는 소포체 9 이종 단백질의 수출을 집중하기 위해, 구조에 통합되었다. 셀룰라아제 활성 시험의 수가 실행될 수 TrCel5A 포함한 식물 발현 셀룰라아제의 활성을 분석한다. 전체 수용성 식물 단백질 추출 후 TrCel5A 부분적 열 배양 기술을 이용하여 정제 할 수있다. 단백질의 크기는 웨스턴 블로 팅 다음 SDS-PAGE를 사용하여 설정됩니다. 용해도 10 : (CMC 카르복시 메틸 셀룰로오스를 만드는) Zymography는 기판, 카르복시 메틸화왔다 예 셀룰로오스 대 활성을 분석하기 위해 사용될 수있다. 셀룰라아제 및 글루코시다 활동 (: 4-MUC 결합) β-D-cellobioside과 관련된 형광 물질 4 - 메틸 움 (4-MU)를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. endoglucanase 활동을 평가하는 또 다른 방법은 아조-D와 연결되었습니다 CMC의 분광 분석을 포함너희 (Remazolbrilliant 블루 R) 11. 또, endoglucanases 및 셀룰라아제의 범위 모두의 단백질 활성은 P-하이드 록시 벤조산 하이 드라 자이드 (PAHBAH) 분석으로서 12 설탕 분석 시험의 사용에 의해 모니터링 될 수있다. 이러한 기술은 또한 표현 셀룰라아제의 활성을 규명하고 정량화 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>4-methylumbelliferyl &beta;-D-cellobioside</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M6018</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>ROTH</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>아세토시링온(농축)</td><td>ROTH</td><td>6003</td><td></td></tr><tr><td>항생제 - 카나마이신</td><td>ROTH</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>항생제 - 리팜피신</td><td>ROTH</td><td>4163</td><td></td></tr><tr><td>항생제 - 카르베니실린</td><td>ROTH</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>항체 - rabbit anti His(6) pAb</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-382</td><td></td></tr><tr><td>항체 - goat anti rabbit AP, FC pAb</td><td>DIANOVA</td><td>111-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Azo-carboxymethyl cellulose</td><td>MEGAZYME</td><td>S-ACMC</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-cyclodextrin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C4805</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>카르복시메틸 셀룰로오스</td><td>ROTH</td><td>3333.1</td><td></td></tr><tr><td>Trichoderma reesei ATCC 26921</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C2730</td><td></td></tr><tr><td>콩고 레드</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>75768</td><td></td></tr><tr><td>Coomasie brilliant blue G 250</td><td>ROTH</td><td>9598.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glucose</td><td>ROTH</td><td>8337</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>ROTH</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>여과지 - Rotilabo 압지</td><td>ROTH</td><td>CL67</td><td></td></tr><tr><td>NBT / BCIP</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72091</td><td></td></tr><tr><td>MES 버퍼</td><td>ROTH</td><td>4256</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>ROTH</td><td>8388</td><td></td></tr><tr><td>구연산 나트륨</td><td>ROTH</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>도데 실황산 나트륨</td><td>SERVA</td><td>20765</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>ROTH</td><td>6771</td><td></td></tr><tr><td>토양, 클래식 클래식&nbsp;</td><td>PATZER GMBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광계 - Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S-5390</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxy benzhydrazide&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H9882</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>ROTH</td><td>1058</td><td></td></tr><tr><td>UV 광원 - BLAK RAY</td><td>UVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>진동 - VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

재조합 셀룰라아제 cel5a의 표현에서<em&gt; 트리코더마 reesei</em&gt; 담배 식물에서

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

셀룰로오스 분해 효소, 셀룰라아제는 연구와 산업의 이익 모두 대상입니다. 그러한 균사 구축 진균류 및 혐기성 세균과 같은 어려운 배양 생물, 이러한 효소의 우세는,이 분야에서 재조합 기술의 사용을 재촉하고있다. 식물 발현 방법은 효소 및 기타 산업적으로 유용한 단백질의 대규모 생산을위한 바람직한 시스템이다. 여기서,는 담배 tabacum에서 곰팡이 endoglucanase, 트리코더마 reesei Cel5A의 일시적 발현을위한 방법이 설명되어 있습니다. 성공적인 단백질 발현은 mCherry 효소 융합 단백질을 사용하여 형광 모니터링 도시된다. 또한 기본적인 테스트 세트는 일시적 발현 T.의 활성을 조사하는 데 사용 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, zymography뿐만 아니라 형광 염료 계 기질 분해 분석법 등 reesei Cel5A. 여기에 설명 된 시스템은 활성 세포를 생산하는 데 사용될 수있다짧은 시간주기에서 ulase, 구성 적 또는 유도 성 발현 시스템을 통해 식물에 추가 생산 잠재력을 평가하도록.

TrCel5A 및 TrCel5A-mCherry는 일시적 발현 시스템 (도 1a 및도 1b)를 사용하여 담배 식물에서 성공적으로 발현되었다. TrCel5A - mCherry 융합 단백질의 발현 패턴의 시험은 건강한 나뭇잎 녹색 빛 (그림 1D)에서 널리 단백질 발현을 보였다 (그림 1C)를 공개했다. 총 수용성 단백질의 추출이 포함 된 잎을 가지고 담배 공장에서 수행 된 일시적 TrCel5A 단백질을 발현하고 SDS-PAGE가 존재 (그림 2A, 레인 1)이었다 단백질의 큰 다양성을 보여 주었다. 식물 및 NTEPs 유래의 전체 가용성 단백질 샘플을 발현 TrCel5A에서 전체 가용성 단백질 샘플을, 55 ℃에서 10 분 동안 배양시켰다 다른 많은 (기본 담배) 단백질이이 온도에서 안정되지 동안 TrCel5A는 55 ° C에서 안정과 활성 상태로 유지됩니다....

담배 식물은 일시적 발현 시스템을 통해, 진균 셀룰라아제, TrCel5A을 제조 하였다. 발현은 형광 융합 단백질을 사용하여 모니터링 할 수 있고, 단백질 활성은 사후 발현 분석되었다.

재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서<em&gt; 트리코더마 reesei</em&gt; 담배 식물에서

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

다음 실험의 전반적인 목표는 담배 식물에서 표적 단백질을 일시적으로 발현시켜 단기간 내 식물 기반 효소 발현의 가능성을 확인하는 것입니다. 이러한 일시적 발현은 관심 유전자가 삽입된 벡터를 포함하는 agrobacterium tumor fain 균주를 담배 잎에 침투시켜 수행됩니다. 배양 후, 침투시킨 식물 잎을 수확하고 단백질 추출물을 부분적으로 정제하여 활성 효소 용액을 얻습니다. 그 다음으로, 식물 기반 발현이 효소에 미치는 영향을 평가하고 효소 활성을 검증하기 위해 단백질 분석을 수행합니다.웨스턴 블로팅, zymography 및 기질 분해 분석을 통해 단백질 크기, 가능한 당화 효과 및 효소 활성을 보여주는 결과를 얻었습니다. 이 방법은 식물 바이오매스 전환에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 담배에서 일시적으로 발현된 효소의 활성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 주사기로 인해 잎이 쉽게 손상될 수 있어 침투 단계를 익히기가 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요하며, 모든 실험은 무균 조건에서 수행될 것입니다.agrobacterium의 단일 콜로니를 항생제가 포함된 10 milliliters의 효모 추출물 배지(Yeast extract broth)가 들어 있는 삼각 플라스크로 옮깁니다. 그 후 접종된 배지를 26 °C에서 180 RPM으로 흔들어주며 36~40시간 동안 배양합니다. 다음으로, 각 배양액 200 microliters를 이전과 동일한 항생제가 포함된 20 milliliters의 효모 추출물 배지에 접종하고, 동일한 조건에서 36~40시간 동안 배양합니다.2 µL의 acetophenone, 100 µL의 40% glucose 용액, 그리고 pH 5.6의 1 M MES 버퍼 200 µL를 사용하여 배양물을 유도하고 하룻밤 동안 계속 배양합니다. 이제 온실에서 식물을 꺼내 피펫 팁으로 식물 상단에서 세 번째에서 다섯 번째 잎의 AB 축 방향 측면을 살짝 흠집 내어 침투가 용이하게 합니다. 그런 다음 주사기에 침투 배지를 채우고 이전에 만든 흠집 중 하나에 배치합니다.손가락으로 axio 잎 쪽의 주사기를 지지하고 정맥 잎 구역에 배지를 조심스럽게 주입합니다. TR cell 5:00 AM cherry를 발현하는 잎 단면의 형광을 시각화하려면, 녹색광을 방출하는 휴대용 광원으로 식물을 비춥니다. 적색 필터를 통해 관찰하면 TR cell 5:00 AM cherry의 형광이 뚜렷하게 보입니다.발현된 단백질을 추출하려면, AUM containing P track ERTR cell five A가 침투된 담배 잎을 선택하여 1g 크기로 자릅니다. 그 다음, 이를 미리 냉각시킨 막자사발에 넣고 샘플에 적절한 양의 액체 질소를 추가합니다. 막자로 잎을 갈아 분말로 만듭니다.비침투 담배 잎으로 동일한 과정을 반복하여 대조군 샘플을 얻습니다. 그 다음, 1 mM phenyl methyl suen fluoride가 포함된 PBS 2 mL를 분쇄된 잎 조직에 첨가하고, 대부분의 잎 조직이 현탁될 때까지 혼합합니다. 추출물을 4 °C에서 15,000 ×g로 20분 동안 원심 분리합니다.그런 다음 펠릿을 제거하고, 단백질이 포함된 SNAT를 55 °C에서 10분 동안 배양한 후 실온에서 10분간 방치하여 부분적으로 정제된 TR cell five A를 준비합니다. 이어서 SNAT를 실온에서 15,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 제거하고 단백질이 포함된 SNAT 상층액을 모든 실험에 사용합니다.추가 분석. 대조군 샘플을 얻기 위해 침윤시키지 않은 식물에 대해서도 부분 정제 과정을 수행하십시오. 이 과정에서는 에틸 셀룰로오스와 물을 혼합하여 1.5% 용액을 만들고, 완전히 용해될 때까지 교반하며 배양하십시오.A-C-M-C-S-D-S 페이지 겔을 제작하려면, 10 mL의 SDS 페이지 겔 혼합 용액에서 물 1 mL를 1.5% CMC 1 mL로 대체한 후 평소와 동일하게 겔을 붓습니다. 다음으로, SDS가 포함된 상태에서 샘플을 가열하여 변성시킵니다. 염색약 전선이 겔 바닥에 도달할 때까지 200 V에서 50분 동안 전기영동을 수행합니다. 이제 해당 15% C-M-C-S-D-S 페이지 겔 상에서 겔 내 단백질 리폴딩을 수행합니다.pH 6.5의 20 millimolar 인산 시트르산 완충액에 1.5% beta cyclodextrin을 사용하여 제조합니다. 젤을 이 용액에 넣고 실온에서 부드럽게 흔들어주며 15분 동안 배양합니다. beta cyclodextrin 용액을 제거하고 젤을 물로 짧게 세척한 후, pH 4.8의 50 millimolar 아세트산 나트륨 완충액에서 실온으로 15분 동안 더 배양합니다.그 다음, 겔을 30 millimolar sodium acetate buffer에 넣고 50 degrees Celsius에서 20분 동안 배양하여 refolded point 15%C-M-C-S-D-S page gel을 이용해 CMC zy를 수행합니다. CMC가 분해된 위치를 시각화하기 위해 0.1% Congo red solution을 사용하여 겔을 10분 동안 염색하고, 1 molar sodium chloride를 사용하여 30분 동안 또는 투명한 밴드가 관찰될 때까지 탈색한 후, 마지막으로 0.3% acetic acid로 겔을 세척합니다. 분석을 실행하기 직전에 더 선명한 이미징을 얻으려면, 4 MUC 2 X 작동 용액을 준비하여 96 well plate의 개별 웰에 4 MUC 작동 용액 100 microliters를 피펫으로 분주합니다.그런 다음, 각 샘플 100 µL를 해당 웰에 넣고, 들뜸 파장 360 nm와 방출 파장 465 nm를 사용하여 각 샘플을 3회 반복 측정합니다. 형광 분광법을 통해 0분 시점의 형광 값을 측정합니다. 다음으로, 접착식 리드로 덮은 플레이트를 50 °C에서 20분 동안 배양합니다.그 다음, 급속 냉동하여 반응을 중단시킵니다. 이후 0분 시점과 동일한 파라미터를 사용하여 최종 형광 값을 측정합니다. 20분 시점의 형광 값에서 0분 시점의 형광 값을 빼서, 분석을 수행하기 직전 효소 활성으로 인해 발생한 형광 변화량을 결정합니다.A-O-C-M-C 2X 작동 용액을 준비합니다. 그런 다음 1.5 mL 튜브에 시료 50 µL와 작동 용액 50 µL를 혼합합니다. 이어서 시료를 50 °C에서 20분 동안 배양합니다.침전액 250 µL를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 이어서, 각 시료를 10초 동안 강하게 볼텍싱하여 시료와 침전액이 완전히 섞이도록 합니다. 그 후 시료를 상온에서 10분 동안 배양하고 다시 볼텍싱한 다음, 1000 Gs에서 10분 동안 원심분리합니다.그 후, 각 샘플의 SNAT 200 µL를 교반하지 않고 96웰 플레이트로 옮깁니다. 펠렛의 효소 활성은 가용화된 염료의 농도가 높을수록 높게 나타납니다. 이를 590 nm 파장에서 흡광 분광법으로 측정하십시오.본 단계에서는 거름종이 원판을 1.5 또는 2 mL 튜브에 넣습니다. 거름종이 원판에 60 mM sodium acetate 100 µL와 시료 100 µL를 첨가하고, 50 °C에서 300 RPM으로 흔들어주며 20시간 동안 배양합니다.또한, 분석을 수행하기 직전에 거름종이가 없는 개별 시료를 대조군으로 함께 배양하십시오. PABA 용액 A 1 mL와 PABA 용액 B 9 mL를 포함하는 1.5 x PABA 작동 용액을 준비합니다. 사용 전까지 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 0.5 mL 내열 튜브에 시료를 준비합니다.시료는 45 µL의 물, 거름종이와 함께 배양한 각 용액 5 µL, 그리고 PABA 작업 용액 100 µL로 구성됩니다. 그 후, 동일한 방식으로 준비한 시료 대조군과 5개의 표준물을 주입합니다. 그런 다음 시료, 대조군 및 표준물을 100 °C에서 정확히 10분 동안 배양하고, 상온에서 다시 10분 동안 냉각합니다.용액 100 µL를 96-웰 플레이트에 분주하고 분광광도계를 사용하여 410 nm 파장에서 분석합니다. 여과지 시료 값에서 개별 시료의 대조군 값을 빼서 방출된 환원당의 양을 결정합니다. 다음은 발현 카세트와 담배 식물의 단백질 발현을 보여주는 이미지입니다.이는 일반 광원 아래와 적색 필터가 장착된 녹색 광원 아래에서 침윤된 담배 잎의 모습이며, 여기서 적색으로 표시된 TR cell 5:00 AM cherry의 발현이 명확하게 보입니다. SDS page 겔, western lot 및 CMC zy는 T cell five A의 크기와 활성을 보여줍니다. 총 수용성 단백질을 분리하였으며, 이를 쿠마시 블루(kumasi blue) 염색으로 시각화할 수 있습니다. T cell five A의 hist tag 영역에 대한 Western blotting을 통해 단백질 크기를 확인하였으며, 추가적으로 CMC에 대한 셀룰라아제(cellulase) 활성을 콩고 레드(Congo red)로 염색된 xenograft로 보여줍니다. 여기서 볼 수 있는 것은 TR cell five A가 일시적으로 발현된 담배 식물 잎의 총 수용성 단백질이며, 열 침전 정제 전후의 상태를 보여줍니다. TR cell five A는 가장 크게 보이는 밴드이며, western lot과 CMC sigraph에서도 확인됩니다.또한 Tcell five A가 포함되지 않은 담배 식물의 총 가용성 단백질을 열 침전 후 확인하였으며, 상용화된 tresa cellulase 혼합물의 단백질도 확인하였습니다. 이 그림은 TR cell five A의 효소 활성 정량 결과를 보여줍니다. TR cell five A를 four MUC Azo CMC 또는 여과지와 함께 배양하였으며, 기질 분해 정도는 fluoro four four mu azo 염료의 방출량이나 PBA의 색 변화를 통한 환원당 정량을 통해 측정하였습니다. 이 절차 외에도, 단백질 타겟팅과 같은 다른 방법들을 사용하여 단백질 국소화가 효소의 안정성과 활성에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 추가적인 정보를 얻을 수 있습니다.본 영상을 통해 담배 식물에서 단백질을 일시적으로 발현시키는 방법과 셀룰로오스 바이오매스 전환을 위한 효소 활성 평가 방법에 대해 명확히 이해하셨을 것입니다.

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우리의 곰팡이 endoglucanase 활동을위한 화면으로 저렴한 비용, 높은 처리량 방법을...

에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

식물은 현재의 표현 패러다임을보다 더 확장 가능한 비용 효율적이고 안전 상업적 규모에 제약 단백질의 생산을위한 새로운 시스템을 제공합니다. 본 연구에서는, 우리는 포함하는 대상 유전자를 소개하는 간단하고 편리하면서도 확장 가능한 접근...

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

아그로 박테리아는 (담배 모자이크 바이러스 계는) 백신 항원과 치료 단백질을 생산하기 위해 신속하고 경제적 인 방식 발사 벡터를 들고있는 진공 침투에 근거 된 담배 식물에서 과도 단백질 생산. 우리는 절차를 간소화하고, 세균의 배양 조건을 최적화 호스트 종을 선택하고 RNA 침묵 억제를 공동 도입하여 대상 축적을 개선.

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

우리는 식물에서 단일 클론 항체와 리포터 단백질의 과도 발현 유전자 조절 요소, 식물의 성장과 발달 파라미터 및 배양 조건의 영향을 결정하고 모델링하는 데 사용될 수있는 실험 방법의 설계를 설명한다.

사례 연구로 담배에 과도 단백질 발현 : 실험 접근의 디자인을 사용하여 복잡한 시스템의 특성

이 작품은 선택적으로 바이오 래드 유전자 총을 사용하여 정량, 식물의 세포 내 소기관을 대상으로하기위한 새로운 방법을 설명합니다.

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

이 연구에서는 서로 다른 생산 플랫폼에서 표적 인간 재조합 단백질의 발현을 비교했습니다. 우리는 전통적인 발효기 기반 배양과 식물에 초점을 맞추고, 각 시스템의 설정을 설명하고, 보고된 결과를 기반으로 각 플랫폼의 고유한 한계와 장점을 강조했습니다.

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

세포 이하 수준에서 신호 이벤트는 발달 및 환경 단서에 의해 동적으로 조절됩니다. 여기에서는 담배 일시적 발현 시스템을 사용하여 동적 단백질-단백질 상호 작용을 모니터링하고 식물 세포에서 신호 전달의 공간적 조직을 공개하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

공동 기존 방법의 어려움을 극복 하기 위해 공장에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하기 위한 새로운 방법을 개발 했습니다. 그것은 단백질 공동 식 달성 하기 위해 카세트를 표현 하는 여러 기능적으로 독립적인 단백질을 포함 하는 단일 식 플라스 미드를 사용 하 여 활용 합니다.

식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

Nicotiana benthamiana 잎에서 생 합성 효소의 일시적인 분리 식 생 공급 2, 3-oxidosqualene 새로운 고부가가치 보관 제품의 생산으로의 착륙 장이 있습니다. 여기는 triterpenes 그리고이 강력한 식물 기반 플랫폼을 활용 하 여 아날로그의 빠른 (5 일) 대리점 규모 생산을 위한 상세한 프로토콜을 설명.

Nicotiana Benthamiana 에 과도 식 보관 생산 대리점 규모에 대 한 나뭇잎

여기, 선물이 곤충 세포 및 잠재 단백질 식 시스템 단백질 결정 화에 대 한 분 비 하는 식물 단백질의 대량 생산에 활용에 대 한 프로토콜. 잠재 식 벡터 GP67 또는 곤충 hemolin 신호 펩 티 드 식물 곤충 세포에서 단백질 분 비 식에 대 한 수정 되었습니다.

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

배우세요 담배 식물에서 재조합 셀룰라아제 TrCel5A의 일시적 발현 방법을 통해 식물 기반 효소 생산 가능성을 평가하고 효소 활성을 분석하는 기술을 익히세요.

재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서

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