재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서 트리코더마 reesei 담배 식물에서

다음 실험의 전반적인 목표는 담배에서 표적 단백질을 일시적으로 발현하여 짧은 시간 내에 식물 기반 효소 발현의 실현 가능성에 대한 아이디어를 얻는 것입니다. 이러한 일시적인 발현은 관심 유전자를 통합하는 벡터를 포함하는 agrobacterium tumor fain의 균주를 담뱃잎에 침투시킴으로써 달성되며, 배양 후 침투한 식물 잎을 수확하고 단백질 추출물을 부분적으로 정제하여 작동하는 효소 용액을 얻습니다. 다음으로 효소에 대한 식물 기반 발현의 영향을 평가하고 효소 활성을 확인하기 위해 단백질 분석이 수행됩니다.

웨스턴 블로팅(western blotting), zy 및 기질 분해 분석을 기반으로 단백질 크기, 가능한 당화(glycosylation) 효과 및 효소 활성을 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 이 방법은 식물 바이오매스 전환에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 담배에서 일시적으로 발현된 후 효소의 활성에 대한 통찰력을 제공할 수도 있습니다. 주사기로 인해 잎이 쉽게 손상되기 때문에 침투 단계를 배우기가 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요하며, 저는 멸균 상태에서 실험을 수행할 것입니다.

agrobacterium toan의 단일 콜로니를 10밀리리터를 함유한 삼각 플라스크로 옮깁니다. 항생제가 함유된 효모 추출물 육수. 그런 다음 접종한 육수를 섭씨 26도에서 180RPM으로 36-40시간 동안 배양한 다음 각 배양액 200마이크로리터에 효모 추출물 육수 20ml에 이전과 동일한 항생제를 접종하고 36-40시간 후에 동일한 조건으로 배양합니다.

pH 5.6에서 2마이크로리터의 아세토페논, 100마이크로리터의 40% 포도당 용액 및 200마이크로리터의 1몰 MES 완충액으로 배양을 유도하고 밤새 계속 배양합니다. 이제 온실에서 식물을 가져 와서 피펫 팁을 사용하여 식물 상단에서 세 번째에서 다섯 번째 잎의 AB 축 쪽을 긁어 침투를 용이하게합니다. 그런 다음 주사기에 침투 매체를 채우고 이전에 만든 흠집 중 하나에 놓습니다.

axio 잎 쪽에 손가락으로 주사기를 대고 배지를 정맥 잎 영역에 조심스럽게 주입합니다. TR 세포를 표현하는 잎 부분의 형광을 시각화하기 위해 5:00 AM 체리는 녹색 빛을 방출하는 휴대용 광원으로 식물을 비춥니다. 빨간색 필터를 통해 볼 때 TR 셀 5:00 AM 체리의 형광이 선명하게 보입니다.

발현된 단백질을 추출하기 위해 P track ERTR cell five A를 포함하는 AUM이 침투한 담배 잎을 선택하여 1g 조각으로 자릅니다. 다음으로, 사전 냉각 모르타르에 넣고 샘플에 적절한 양의 액체 질소를 첨가합니다. 유봉을 사용하여 잎을 가루로 갈아줍니다.

대조군을 얻기 위해 침투되지 않은 담뱃잎으로 이 과정을 반복합니다.amp레. 그런 다음 1 밀리몰 페닐 메틸 수엔 플루오라이드를 함유한 PBS 2 밀리리터를 분쇄 잎 물질에 첨가하고 대부분의 잎 물질이 현탁액이 될 때까지 혼합합니다. 15, 000 GS에 4 섭씨 온도에 20 분 동안 추출물을 원심 분리하십시오.

그런 다음 S natin을 함유 한 단백질을 섭씨 55도에서 10 분 동안 배양하여 부분적으로 정제 된 TR 세포 5 A를 버리고 실온에서 10 분 더 휴지시킵니다. 그런 다음 실온에서 15, 000 GS에서 10분 동안 SNAT를 원심분리합니다. 펠릿을 버리고 snat이 함유된 단백질을 모두에게 사용하십시오.

추가 분석. 또한 대조군 샘플을 얻기 위해 침투하지 않은 식물에 대해 부분 정제 프로세스를 수행합니다. 이 절차에서 에틸 셀룰로오스와 물을 혼합하여 1.5 % 용액을 얻고 용해 될 때까지 교반하면서 배양합니다.

A-C-M-C-S-D-S 페이지 젤을 만들기 위하여는, 10 밀리리터 SDS 페이지 젤 혼합 해결책에 있는 물의 1 밀리리터를 1.5%CMC의 1 밀리리터를 대용하고 젤을 일반적으로 다음에 따르고, SDS의 면전에서 그(것)들을 비등해서 표본을 변성시키십시오. 염료 전면이 겔 바닥에 도달할 때까지 200볼트에서 50분 동안 전기영동을 수행합니다. 지금 점 15%C-M-C-S-D-S 페이지 젤에 다시 접히는 젤 단백질에서 실행하십시오.

pH 6.5에서 20 밀리몰 인산염 구연산염 완충액에 1.5% 베타 사이클로덱스트린을 사용합니다. 이 용액에 담긴 겔을 실온에서 15분 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 베타 사이클로덱스트린 용액을 버리고 pH 4.8의 50밀리몰 아세트산 나트륨 완충액에 실온에서 배양한 물로 겔을 15분 더 간단히 세척합니다.

그런 다음 다시 접힌 점 15%C-M-C-S-D-S 페이지 겔을 사용하여 섭씨 50도에서 20분 동안 30밀리몰의 아세트산 나트륨 버퍼에 겔을 배양하여 CMC zy를 수행합니다. CMC가 분해된 위치를 시각화하려면 0.1% 콩고 적색 용액을 사용하여 10분 동안 겔을 염색하고 1몰 염화나트륨을 사용하여 30분 동안 또는 끝에서 투명한 띠가 관찰될 때까지 0.3% 아세트산으로 겔을 세척합니다. 분석을 실행하기 직전에 보다 선명한 이미징을 위해 4개의 MUC 2 X 작업 용액 피펫 100마이크로리터의 4개의 MUC 작업 용액을 96 웰 플레이트의 별도 웰에 준비합니다.

그런 다음 각 시료 100마이크로리터를 적절한 웰에 추가하고 360나노미터의 여기 파장과 465나노미터의 방출 파장을 사용하여 각 시료를 삼중으로 실행합니다. 형광 분광법을 통해 4개의 뮤 형광의 0분 시점을 결정합니다. 다음으로, 접착 뚜껑으로 덮인 플레이트를 섭씨 50도에서 20분 동안 배양합니다.

그런 다음 얼려 반응을 멈추십시오. 그런 다음 0분 시점과 동일한 매개변수를 사용하여 종점 mu 형광을 측정합니다. 20분의 형광 값에서 0분의 형광 값을 빼서 분석을 실행하기 직전의 효소 활성으로 인한 형광의 변화를 확인합니다.

A-O-C-M-C two X 작업 솔루션을 준비합니다. 그런 다음 50마이크로리터의 샘플과 50마이크로리터의 작업 용액을 1.5밀리리터 튜브에 결합합니다. 다음으로, 섭씨 50도에서 20분 동안 샘플을 배양합니다.

250마이크로리터의 침전 용액을 첨가하여 반응을 중지합니다. 그 후, 각 샘플을 10초 동안 격렬하게 소용돌이하여 샘플과 침전 용액의 완전한 혼합을 보장합니다. 그런 다음 샘플을 실온에서 10분 동안 배양하고 다시 와류로 가열한 후 1000Gs에서 10분 동안 원심분리합니다.

그 후, 각 샘플에서 200마이크로리터의 SNAT를 방해 없이 96웰 플레이트로 이동합니다. 펠릿 효소 활성은 더 높은 수준의 가용화 염료에 의해 나타납니다. 590나노미터의 파장에서 흡수성 분광법을 사용하여 이를 측정합니다.

이 단계에서. 여과지 원을 1.5 또는 2 밀리리터 튜브에 놓습니다. 100마이크로리터의 60밀리몰 아세트산나트륨과 100마이크로리터의 샘플을 여과지 서클에 추가하고 300RPM을 흔들면서 섭씨 50도에서 20시간 동안 배양합니다.

또한, 분석을 실행하기 직전에 여과지가 없는 개별 시료를 대조군으로 배양합니다. 1ml의 PBA 용액 A와 9ml의 PABA 용액 B.Store 이 포함된 1.5 x PABA 작업 용액을 사용할 때까지 얼음 위에 준비합니다. 다음으로, 0.5 millil thermo stable tubes에서 시료를 준비합니다.

샘플은 45마이크로리터의 물, 여과지로 배양된 각 용액 5마이크로리터 및 100마이크로리터의 PABA 작업 솔루션으로 구성됩니다. 그런 다음 동일한 방식으로 준비된 샘플 대조군과 5개의 표준물질을 실행합니다. 그런 다음 섭씨 100도에서 정확히 10분 동안 샘플, 대조군 및 표준물질을 배양하고 실온에서 10분 더 냉각합니다.

용액 100 마이크로 리터를 96 웰 플레이트에 피펫으로 410 나노 미터 파장의 분광 광도계로 분석합니다. 여과지 샘플 값에서 개별 샘플 제어 값을 빼서 방출되는 환원당의 양을 결정합니다. 다음은 담배 식물에서 카세트 발현과 단백질 발현을 보여주는 이미지입니다.

이것은 침투된 담배 잎이 적색 필터와 함께 정상 광선 및 녹색 광 아래에서 나타나는 방식이며, 빨간색으로 표시된 TR 셀 5:00 AM 체리의 발현이 여기에서 명확하게 볼 수 있습니다. T 세포 5 A.The 총 용해성 단백질의 크기와 활성을 보여주는 SDS 페이지 젤 웨스턴 로트 및 CMC zy가 분리되어 T 세포 5 A의 hist 태그 영역에 대한 쿠마시 블루 염색 웨스턴 블로팅으로 시각화 할 수 있습니다 단백질 크기를 확인하고 추가로 CMC에 대한 셀룰라아제 활성은 콩고 빨간색으로 염색 된 이종 이식편에 의해 표시됩니다. 여기에서 볼 수 있는 것은 TR cell 5 A가 열 침전 정제 전후에 일시적으로 발현된 담배 식물 잎의 총 용해성 단백질이며, 여기서 TR cell five A는 가장 큰 가시 띠이며 서쪽 로트 및 CMC 그래프에서도 볼 수 있습니다.

우리는 또한 Tcell five A가 열 침전 후에도 나타나지 않은 담배 식물의 총 용해성 단백질과 상업적으로 이용 가능한 트레사 셀룰라아제 혼합물의 단백질을 볼 수 있습니다. 이 그림은 TR cell five A TR cell five A의 효소 활성을 4개의 MUC Azo CMC 또는 여과지와 함께 배양하고, 기질 열화를 fluoro four mu 아조 염료의 방출에 의해 측정하거나, PBA의 색 변화로 인한 환원당을 정량화하여 측정한 방법을 다음과 같이 하였다. 단백질 표적화와 같은 다른 방법을 사용하여 단백질 국소화가 효소 안정성과 활성에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대한 추가 정보를 제공할 수 있습니다.

이 비디오를 시청했다면 이제 단백질을 담배로 일시적으로 발현하는 방법에 대해 명확하게 이해했을 뿐만 아니라 효소 활성을 평가하는 방법에 대한 좋은 지식을 얻었을 것입니다. 포로 셀룰로오스 바이오매스 전환.