Name: 마우스의 모델링 스트로크 : 말초 중간 대뇌 동맥의 영구 응고 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 학습하세요 마우스에서 말초 중간 대뇌 동맥의 영구 응고를 통한 뇌졸중 모델링 방법을. 전기응고 기법을 사용하여 피질 경색을 유도하고, 실린더 테스트로 감각운동 결손을 평가하며, 크레실 바이올렛 염색으로 경색 부피를 분석합니다.

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이 작품은 독일 연구 재단 &quot;시스템 신경과 뮌헨의 클러스터 (시너지 효과)&quot;의 우수 클러스터와 AL의 다임러 - 벤츠 재단에 의해 투자되었다

윤리 문 이 비디오에보고 된 실험은 실험 동물 및 프로토콜의 사용에 대한 국가 가이드 라인을 독일 정부위원회 (R​​egierung 폰 Oberbayern, 뮌헨, 독일)에 의해 승인되었습니다에 따라 실시되었다. 십주 이전, 남성 C57BL/6J 마우스는이 연구에 사용됩니다. 동물은 12 시간의 명암주기 기간 및 지역 정부위원회에 의해 승인. 진통과 진정 작용 프로토콜이 설명되어 있습니다 펠렛 음식과 물을 임의로에 대한 액세스를 제어 온도 (22 ± 2 ℃)에서 보관되었지만 다를 수 있습니다 다른 실험실에서 사용되는 프로토콜에서. 1. 물질의 제조 및 계기 <ol><li> 따뜻한 작업 영역을 유지하고 마취 동안 마우스 체온 (37 ° C)를 유지하기 위해 열 담요를 연결한다. </li><li> 준비 멸균 가위, 집게와 면화, dexpanth에놀 눈 연고 및 봉합사. 수화 동작 영역을 유지하기 위해 (바늘없이) 생리 식염수와 주사기를 준비합니다. 마취 가스 (70 % N 2 O + 30 % O 2 + 이소 플루 란)를 준비합니다. </li><li> 복강 진통제를 주입 : Metamizol 200 ㎎ / ㎏, Carprofen 4 ㎎ / ㎏과 Buprenorphin 0.1 ㎎ / ㎏을. </li><li> 몸의 자연스러운 움직임까지 마취하는 4 %의 이소 플루 란 유량 유도 챔버에 마우스를 놓고 vibrissae이 중지됩니다. </li><li> 마취 마스크로 코와 측면 위치에 마우스를 이동하고 감소 후, 약 다른 분 동안 4 %에서 이소 플루 란의 농도를 유지하며 approx.1.5 %로 적절한 마취를 유지하기 위해. </li><li> 두 눈에 dexpanthenol 눈 연고를 적용합니다. </li></ol> 2. 말초 MCAO 모델 <ol><li> 수술 부위저기서의 aseptical 준비 후 작은 동작 가위를 사용하여 귀와 눈 사이에 1cm의 피부 절개를G 피부 소독제. </li><li> 피부를 분리하고 일시적인 근육을 집중. </li><li> 고주파 발생기의 응고 기능, 바이폴라 모드를 선택, 12 W를 선택하고 케이블로 electrocoagulation 집게를 연결합니다. </li><li> 식염수 한 방울을 추가하고 완전히 근육을 제거하지 않고 근육 플랩을 만드는함으로써, 그 꼭대기와 지느러미 부분에있는 두개골에서 임시 근육을 분리 집게를 사용합니다. </li><li> 시간 영역의 주동이의 부분에서, 복고풍 궤도 동 (그림 2A)에 지느러미, 투명 두개골 아래 MCA를 확인합니다. MCA의 분기점 (때문에 해부학 적 정상 변이에) 표시되지 않은 경우 대부분의 주동이의 용기를 식별합니다. </li><li> 그것은 얇고 반투명 텍스처 (그림 2B)가 될 때까지 오른쪽 MCA 가지 위의 드릴로 뼈 중 두개골과 얇은에 식염수를 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 아주 얇은 집게와 동맥 위의 뼈를 철회. </li><li> 바이폴라 모드를 선택 난없음 7 W. 응고에 고주파 발생기는 electrocoagulation과 동맥 근위부와 분기 (그림 2C)에 말초 겸자. 분기 인해 해부학 적 변형으로 볼 수없는 경우, 약의 두 사이트에서 올바르게 식별 MCA 분기 (위 참조)를 응고. 1mm 거리. 그것은 위에서 양쪽 집게로 조심스럽게 동맥을 터치, 응고의 집게와 동맥을 파악 할 필요가 없습니다 것은 충분 적은 기계적 손상을 유도한다. </li><li> 30 초를 기다린 후 부드럽게 인해 자연 개통에있는 혈액의 흐름을 확인하는 무딘 집게로 동맥을 누릅니다. 개통의 경우에는 한 번 electrocoagulation를 반복합니다. </li><li> 버 구멍을 덮고, 그 위치에 시간적인 근육의 위치를​​ 변경합니다. </li><li> 상처를 봉합하고 마취에서 회복 케이지에 반환하기 위해 32 ° C에서 간호 상자에 동물을 배치합니다. 일반적으로는 anesth 복구하는 동물에 대해 5 ~ 10 분 소요ESIA. </li><li> 다섯 번째 수술 날까지 매일 한 후 24 시간 수술 후 진통제 (IP)을 주입하고 : Carprofen 4 ㎎ / ㎏을. </li></ol> 3. 샴 운영 노출 된 혈관을 응고되지 제외 - 두개골과 제거의 숱이 포함 - 상기의 동작과 동일하게 모든 절차를 수행합니다. 4. 실린더 시험 13 <ol><li> 투명 아크릴 유리 실린더에 동물을 배치 (직경 : 8cm, 높이 : 25 cm) 5 분 동안 두 개의 거울과 비디오 테이프의 앞. 최적의 영상 (그림 3A)를 얻기 위해 두 개의 거울 앞에 실린더 중앙에 카메라를 조정합니다. </li><li> 독립 앞다리 사용의 평가를 들어, 전체 후면 중 하나 앞다리와 실린더 벽의 점수 (1) 접촉과 전체 후면 후 바닥에 하나의 앞다리 (2) 방문. 슬로우 모션이나 프레임에 의해-FR을 사용하여 하나의 앞다리 적어도 20 연락처를 계산비디오 랜 클라이언트의 AME 기능 (VLC) 프리웨어 소프트웨어 ( <a href="http://www.videolan.org/vlc">http://www.videolan.org/vlc</a> ). </li><li> 수술 전베이스 라인 분석 : 실험 사이에 1 시간의 휴식 시간에, 마우스에 두 번 테스트를 수행합니다. 앞다리 사용은 좌측면 / 오른쪽 앞다리 독립적 인 사용의 비율로 표시됩니다. </li><li> MCA 응고 후 : 위에 표시된대로 시험 사이에 1 시간의 휴식 시간에, 마우스에 두 번 테스트를 다시 수행합니다. </li></ol> 5. 관류 <ol><li> (자일 라진 및 케타민 각각 16분의 120 ㎎ / kg 체중에 의해 예) 동물을 마취시키다. </li><li> 앙와위에서 동물을 수정하고 중간 컷과 복강을 엽니 다. 입술과 가슴 뼈를 제거합니다. 우심방의 작은 절개를합니다. 좌심실의 관류 캐 뉼러를 삽입하고 천천히 식염수 20 ㎖로 perfuse. </li><li> , 동물의 목을 벨의 두개골을 열고 부드럽게 두개골의 기지에서 뇌를 분리합니다. </li><li&gt; 10 분 -40 ° C 차가운 이소 펜탄에 머리를 고정. 그 후 -80 ℃에서 추가 분석을 할 때까지 이소 펜탄 및 저장소에서 머리를 제거 </li></ol> 6. 경색 용적 <ol><li> 저온 절편 제작 : 슬라이드에 20 μm의 두께 섹션 저온 유지 장치에 직렬마다 400 μm의 머리를 잘라 -20 ℃ 슬라이드를 저장 </li><li> 크레 실 바이올렛 (CV) 염색 : <ol><li> 염색 용액을 제조 : 500 ㎖ H 2 O에서 CV 아세테이트 0.5 g을 혼합 결정이 용해 될 때까지 (60 ° C에서)를 저어 열. 이 솔루션은 식지 어두운 병에 저장합니다. 매일 사용하기 전에 60 ° C와 필터에 재가열. </li><li> 30 분 동안 RT에서 슬라이드를 건조. 이어서 1 분 동안 50 % 에탄올로, 그 후 1 분 및 70 % 에탄올로 한 다음 15 분 동안 95 % 에탄올에 배치하고. </li><li> 증류수를 새로 고침 1 분 동안을에 배치, 2 분 동안 증류수에 슬라이드를 놓습니다. 그 후 (60 ° C) F 염색 용액에 슬라이드를 배치10 분, 1 분 동안 증류수에 그들을 두 번 씻는다. </li><li> 2 분 동안 95 %의 에탄올에 슬라이드를 놓습니다. 그런 다음 100 % 에탄올을 새로 2 분을에 배치, 5 분 동안 100 % 에탄올에 배치합니다. 그 후 설치 매체와 슬라이드를 포함한다. </li><li> 분석 : 슬라이드를 스캔하고 부종을 보정하기 위해 스완슨 방법 (14)에 의해 간접 경색 볼륨을 분석 : (허혈성 지역) = (반대쪽의 피질 영역) - (동측의 비 허혈성 피질 영역) (그림 4A). </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 공개 할 경쟁의 이익이 없다.

소위 &quot;응고 모델&quot;- 본 프로토콜은 두개 electrocoagulation에 의해 말단, 영구 MCAO의 실험 스트로크 모델에 대해 설명합니다. 이 모델은 실험적 한편 스트로크 연구 (12)에서 가장 자주 사용되는 동물 모델 중 하나가되고있다. 다른 국소 뇌 허혈 모델에 비해,이 비디오에 제시된 응고 모델은 훈련 과학자에 의해 수행 약 10 분의 짧은 동작 시간의 장점을 갖는다. 따라서, 간단한 마취 시간이 신경 보호 및 뇌졸중 결과에 마취제의 영향이 15 잘 알려져 있기 때문에 실험 뇌졸중 모델의 유리한 특징이다이 모델에서 달성 될 수있다. 또한, 이전에 카 마이클 등. (11)에 의해 설명 된대로, 우리는 말단 영구 MCA 응고 후 결과 경색 볼륨 및 현지화 인간의 대부분의 허혈성 뇌 병변에 해당하는 확증뇌의 크기에 비례하여 스트로크. 인간의 스트로크는 이전 개체군 연구 및 임상 이미징 실험 16-18에 기초하여, 반구의 약 5-15 %의 병변 크기가 주로 작고, 10 % 미만에서 발생 압축 뇌부종 광범위한 스트로크 병변 달리 임상은 19 스트로크. 따라서, 제시된 모델에 의해 달성되는 반구의 약 12​​ %의 MCA 영토 뇌졸중 병변은 병진 관련 행정 볼륨으로 간주 될 수있다. 그러나, 다른 마우스 균주 또는 사용 마취 프로토콜 얻어진 병변 공간 (20)에 영향을 미칠 수 있음을 고려해야한다. 이 모델에서 뇌졸중 유도 후 관찰 기간 동안 사망은 거의 없을 것입니다. 제외 기준에 도달하기 때문에 5 % 미만의 전체 사망률 때문에 anesthesiological 합병증 희생의 작동 중에 사망의 주로 구성되어 있습니다. 낮은 V를 보증하기 위해운전 중 1) 모든 지주막 하 출혈이 모델과 우수한 재현성의 ariability, 우리는 다음과 제외 기준을 제안합니다. 2) 운영 시간 이상 15 분 이상. 일시적으로 만 MCAO와 electrocoagulation 두 가지 시도 후 MCA의 3) 개통. 또한, 동물은 고통, 불편 또는 질병의 동작을 제어 할 수 MCAO (기본 생리 학적 행동, 모피 모양과 체중) 후 매일 검사 할 필요가있다. 몇 가지 조치 레이저 스페 클 측정, 자기 공명 영상, 행동 검사 또는 조직 학적 분석 등 행정 결과의 분석을 위해 구현 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 행동 분석 및 경색 볼륨 분석을위한 예시적인 방법을 제공합니다. 초점 뇌 허혈 후 행동 분석을위한 여러 가지 시험을 개발하고 실험적인 행정 연구에 사용되어왔다. 이전에이 뇌졸중 모델 (21, 22)의 우리에 우리 그룹에서 사용하는 감각의 장애에 적합한 테스트로타로드 테스트 23 재, 스티커 레이블 테스트 (24), 코너 테스트 (25)이 비디오에서 보여줍니다 실린더 시험 13. 실린더 테스트는 지속적으로 말초 영구 MCAO 후 급성 단계에서 모터의 비대칭 성을 묘사하고 또한 연속이 운동 기능의 회복 감지합니다. 명백한 이점에도 불구하고,이 뇌졸중 모델의 몇 가지 제한 사항이 고려되어야한다. 첫째, 두개골의 공술 (Trepanation)은 수술 상처, 시간적 근육이나 뇌 자체의 세균 감염은 우리 자신에 의해 발견 된 적이 있지만함으로써, 뇌의 요정 운영 감염에 대한 잠재적 인 접근을 생산, 동맥 응고하기 위해 필요 또는이 모​​델을 사용하여 다른 사람에 의해 기록. 더욱이, 제조 및 응고 중에 외피에 기계적 데미지는 배제 할 수 있지만, 신중한 드릴링 및 제거 두개골, 수술 부위의 일정한 가습 최소 지점에 의해 제한 될 수있다<html> cessary electrocoagulation (제외 기준 참조). 도 2에 도시 된 바와 같이 MCA의 코스가 C57BL / 6 마우스의 대부분에서 발견되지만, 우리 모델의 가변성을 최소화하는 용기 코스의 정상 변이에 진행 방법을 설명하는 프로토콜. 또한, 우리는 다수의 사용 제안 (분기의 경우 3, MCA의 분기가없는 2) 폐쇄 사이트는 우리의 경험에서이 모델의 변화를위한 중요한 요소이다 MCA의 부분 개통의 위험을 최소화 할 수 있습니다. 행동 검사의 점에서는, 단지 사소한 행동 결손은 전술 행동 검사에서 검출 될 수 있고, 재생 기능은 뇌졸중 후 첫 주 이내에 관찰 될 수있다. 따라서, 높은 감도와 숙련에 도달 테스트 (27)와 같은 질적 테스트 매개 변수를 사용하여 고급 테스트 시스템은이 모델에서 장기 기능적 결과를 감지하는 것이 더 적합 할 수 있습니다. ontent &quot;&gt; 마지막으로 인해으로 인해 자연 혈전 용해 또는 치료 28 뇌졸중 환자의 상당 비율에서 관찰 된 기능입니다 더 재관류를 얻을 수 없습니다 MCA의 영구 응고. 그러나, 전술 한 바와 혈전 색 전성 뇌졸중 모델 (26)는 제공 대뇌 피질의 뇌 허혈 재관류 무료 스트로크 모델에 대한 옵션. 이와 함께, 높은 재현성으로 인해 최소한의 사망률과 인간의 행정에 관하여 대등 한 관계 경색 볼륨 및 현지화 가능한 장기 관찰 &quot;응고 모델을&quot;구별 기본 및 병진 뇌졸중 연구를위한 귀중한 모델로.

뇌졸중은 사망의 세 번째 가장 일반적인 원인과 선진국 1 취득 성인 장애의 하나의 주요 이유입니다. 약 15 %가 뇌출혈이 기인하는 동안이 급성 신경 질환의 약 80 %가 뇌 혈류의 방해로 인한 뇌의 국소 빈혈에 의해 발생된다. 지속적인 연구에도 불구하고, 조직 플라스 미노 겐 활성제의 정맥 내 투여는 지금까지 만 사용할 수 뇌졸중 환자의 소수에 의한 3,4 발병 뇌졸중 후 4.5 시간의 짧은 승인 시간 창에 허혈성 뇌졸중에 대한 승인 된 약물 치료입니다. 제대로 뇌, 혈관 및 행정 동안 조직 병리 생리 학적 메커니즘 사이의 복잡한 상호 작용을 모델링 할 수있는 체외 모델이 없기 때문에, 동물 모델은 전임상 뇌졸중 연구를위한 필수적입니다. 따라서, 몇개의 허혈성 뇌졸중 모델 VARI 개발되었다종의 ety. 가장 일반적으로 사용되는 뇌졸중 모델 중 하나는 봉합 필라멘트 일시적 경동맥 내로 도입하고 첨단이 혈액 흐름의 정지로 인해, 중간 대뇌 동맥 (MCA)의 기점을 폐색 할 때까지 전송된다 &quot;필라멘트 모델&quot;이며 및 피질과 장기간 폐쇄의 경우도 대뇌 피질의 영역 5,6의 후속 뇌 경색. 허혈성 뇌졸중의 photothrombotic 모델에서 조사 된 대뇌 피질의 선박의 광화학 폐색은 작은 로컬 접하는 병변 7의 결과 감광제 주입 후에 이루어집니다. lenticulostriatal 동맥의 MCA의 말단의 영구 폐쇄는 동맥, 그것의 과도 압축 결찰에 의해 또는 영구적 응고 8,9에 의해 달성 될 수있다. 이 모델의 MCA의 폐색이 lentic 말초 때문에이 모델의 결과 경색은 주로 신피질 (10)에 영향을 미치는기저핵을 공급 ulostriatal 동맥. 인간 뇌졸중 병변의 대다수는 중대 뇌동맥의 영역에 위치되기 때문에, 일반적인 스트로크 모델 모두의 MCA 폐색 또는 분기 (11) 중 하나를 닮은. MCA는 뇌로의 혈액 공급을 제공하는 주요 동맥 중 하나이고; 그것은 측면 고랑을 따라 내 경동맥, 노선에서 발생 어디 그 다음 기저핵과 전두엽, 두정엽 및 기본 모터와 감각 피질을 포함한 측두엽의 측면 표면에 나뭇 가지와 프로젝트. 오른쪽 MCA 왼쪽은 전방 대뇌 동맥에 연결되어 후방 윌리스의 서클 (그림 1)을 생성, 후부 대뇌 동맥에 연결하는 동맥을, 통신됩니다. 앞서 카 마이클 등. (11)에 의해보고, 원심 중간 대뇌 아르에 의해 모델링 경색생쥐 TERY 폐색 (MCAO) 모델함으로써 대뇌 피질의 MCA 영토 11, 12에 위치한 인간의 뇌졸중 병변의 대부분을 흉내 낸, 반구의 약 15 %를 포함한다. 1981 년, 타무라 등 알. 쥐 8 영구, 두개 MCAO 응고 모델을 설명했다. 그러나, 타무라 의해 기술 모델은 동맥의 분기점보다 선단을 우회하기 위해 MCA의 근위 폐색 참여. 따라서, 일본어 &quot;타무라 모델은&quot;6 &quot;필라멘트 모델」에 의해 얻어지는 병변 유사한뿐만 아니라 피질뿐만 아니라 선조체 병변을 유도한다. 여기, 우리는 생쥐의 두개 electrocoagulation에 의해 영구 원심 MCAO 모델을 설명합니다. 또한, 우리는이 모델에서 뇌졸중의 결과를 분석하기 위해 관련 조직 학적 및 기능적 방법을보고합니다. 모든 방법을 개발하고 우리의 실험실에서 사용되는 표준 운영 절차에 기초한다.

<table><tbody><tr><td>카메라 Canon Eos 500D</td><td>Canon</td><td></td><td>Optics: 18-55 mm; 30 fps; 640 x 480 비디오 기능</td></tr><tr><td>Mirror</td><td>Kristallform</td><td>2677089</td><td>30 x 30 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>투명 아크릴 유리 실린더</td><td>H& S Kunststofftechnik</td><td></td><td>지름: 8 cm,&nbsp; 높이: 25 cm</td></tr><tr><td>난방 담요</td><td>FHC DC 온도 컨트롤러</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파인 가위</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>메이요 가위</td><td>FST</td><td>1410-15</td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td>FST</td><td>11616-15</td><td></td></tr><tr><td>면</td><td>NOBA Verbondmitel Danz</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>식염수</td><td>Braun</td><td>131321</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen pommade</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbot</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>Drager</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td>용 마취 시스템;<td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>전기 수술 장치</td><td>ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgieger&auml; t</td><td></td><td></td></tr><tr><td>드릴</td><td>Proxxon</td><td>D-34343</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylacine</td><td>Albrecht</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5ml 주사기&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>브라운</tr><tr><td>인산염 완충 식염수 PH: 7.4</td><td>Apotheke Innestadt Uni Munchen</td><td>P32799</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Fluka</td><td>59070</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마 생명 과학</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 70%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>521005</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 96%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>522078</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 99%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>ETO-5000-99-1</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histokit 장착 매체</td><td>Roth</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6J 마우스</td><td>찰스 리버</td><td>000664</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스의 모델링 스트로크 : 말초 중간 대뇌 동맥의 영구 응고

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

뇌졸중은 사망의 세 번째 가장 흔한 원인 및 개발 국가에서 획득 한 성인 장애의 주요 원인입니다. 만 매우 제한된 치료 적 옵션은 급성기 뇌졸중 환자의 작은 비율을 사용할 수 있습니다. 현재 연구가 집중적으로 새로운 치료 전략을 검색하고, 더 많은 환자가 오랜 시간 창에서 치료 적 개입을받을 수 있기 때문에 점점 뇌졸중 후 아 급성 및 만성 단계에 초점을 맞추고있다. 이러한 지연 메커니즘은 뇌졸중 후 염증, 혈관, 신경 가소성 및 재생 등의 중요한 병태 생리 학적 경로를 포함한다. 이러한 메커니즘을 분석하고이어서 새로운 약물 표적을 평가하기 위해 임상 관련성 넘는 사망과 재현성 실험 뇌졸중 모델은 이후 돕고있다. 또한, 마우스는 초점 스트로크 병변 유도 할 수있는 형질 전환 모델의 광범위한 스펙트럼은되는 작은 포유류사용할 수 있습니다. 따라서, 우리는 여기에 두개의 마우스 모델, lenticulostriatal 동맥, 소위 &quot;응고 모델&quot;의 electrocoagulation의 말단을 통해 중대 뇌동맥의 영구 응고를 설명합니다. 이 모델의 결과 경색은 주로 피질에 위치하고 있습니다; 뇌의 크기와 관련하여 상대적인 경색 량은 인간 스트로크의 대다수에 대응한다. 더욱이, 모델은 낮은 재현성 및 사망률의 상술 기준을 충족. 이 비디오에서 우리는 &quot;응고 모델&quot;뇌졸중 유도 수술 방법을 설명하고 조직 학적 및 기능적 분석 도구를보고합니다.

때문에 짧은 마취 시간과 적당한 뇌 손상으로, 약 10 분 자신의 케이지로 전송 한 후 모든 동물은 자유롭게 케이지의 이동과 한배 새끼와 상호 작용하는, 깨어. MCAO 수술 중에 사망률은 주로 실수 지주막 하 출혈 또는 잘못 마취의 결과로, 5 % 미만이었다. 뇌졸중 유도 후 7 일간의 관찰 기간 동안 사망 동물의 약 1 ~ 2 % 만 매우 드물게 발생합니다. 이 보고서의 10 마리의 동작 시리즈 모든 동물은 그들 중 누구도 인해 제외 기준에 제외 할 수 없었다, 운영 및 7 일간의 관찰 기간을 살아 남았다. MCA 응고 후 행동 적자는 실린더 테스트 13 분석 앞발 사용 비대칭에 의해 평가되었다. 이 시험에서, 독립적 인 좌우 앞발 사용의 비율은 뇌졸중 유도 후 지시 된 시점에서 측정 한 24을 수득 기준선 값이 비교MCAO (그림 3B) 전에 시간. 동물 실린더 테스트 24 시간의 결합 벽​​ 탐사 사지 사용 비대칭에 큰 변화를 발표 (1.72 ± 0.326, P &lt;0.05), 3 일 (1.36 ± 0.17, P &lt;0.05) MCAO 후. 비가 일주일 관측 시간 동안 개선되지만, 모터 비대칭 칠일 MCAO 후에 여전히 유의 하였다 (1.35 ± 0.29, p &lt;0.05) 기준선 값과 비교. 우리는 크레 실 바이올렛 7 일 뇌졸중 유도 (그림 4B) 후 시리얼 코로나 뇌의 부분을 염색하여 경색 용적을 수행 하였다. 평균 경색 볼륨함으로써 뇌의 반구 (그림 4C)의 12 %를 대표하는, 15.4 mm 3이었다. 이러한 뇌졸중 모델의 변동은 약 10 %의 표준 편차를 가진 매우 낮다. 병변 지역은 피질 하 구조의 사소한 애정과 체성 감각과 운동 피질을 포함한다. 또한, 경색의 현지화회로도 분포도 (그림 4D)에서와 같이 지역은 최소한의 변동성이 높은 예측이다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1. 윌리스의 원의 도식 표현. 윌리스의 동맥 서클은 내 경동맥 (ICA)에서 분기뿐만 아니라에 의해 중간 대뇌 동맥 (MCA) 및 전방 대뇌 동맥 (ACA)에 의해 형성된다 뇌동맥 (PCA) 및 동맥 연통 후부 (PComA)를 후부. MCA는 대뇌 피질로는 가지 측면 고랑으로 실행됩니다. 운동 피질과 체성 감각 피질의 부분의 대부분을 공급 지배적 인 MCA 지점이 영구적으로 입증 된 모델 (아 코마 = 앞쪽에 통신 동맥에 폐색되고, BA는 = 기저 동맥;의 sucA는 우수한 cerebel을 =고맙다 동맥). <img alt="그림 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig2highres.jpg" width="400" /> 그림 2. 시간 근육과 MCA 폐색의 개략도 제거 후 경 두개보기. (A) 시간 근육을 제거한 후 대뇌 동맥 (8-12주 된 생쥐) 부분적으로 반투명 마우스 두개골을 통해 볼 수 있습니다. 지배적 인 MCA 분기 시간적 뷰의 주동이의 부분뿐만 아니라 꼬리 부분에 MCA와 PCA에서 분기 더 피질 동맥에서 확인 할 수있다. 분기와의 주된 변화의 지배적 인 MCA 분기 (B) 개략도 측면 시간 피질에 버 구멍을 드릴링과 두개골을 제거한 후. (C) 블랙 사각형 분기의 근위 및 원위 측면에서 MCA 응고 사이트를 나타냅니다. 행동 적자의 그림 3. 분석. (A) 실린더 테스트 셋업 : 마우스는 수직 실린더에 배치되며, 미러는 비디오 카메라를 사용하여 움직임의 모두를 등록하기 위해 뒤에 배치되는 (B) 앞다리 사용 비대칭 실린더 테스트를 사용하여 분석 하였다.. 독립 앞다리 사용의 오른쪽 / 왼쪽 비는 MCAO 전에 뇌졸중 유도 후 지정된 시간 지점에서 24 시간을 계산 하였다. = 10 N, * P &lt;지정된 시점과 기준 (제어) 값의 0.05. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg" width="500" /> 그림 4. 원심 MCAO 후 경색 분석 및 경색의 결과 부피. 크레 보라색 염색 관상 브라 (A) 대표 이미지칠일 MCAO 후 섹션. 노란 선은 반대쪽 (오른쪽) 피질의 선택을 표시하고 빨간색 선은 동측 뇌의 비 경색 (염색) 피질을 선택하는 것입니다. 왼쪽 반구의 창백한 영역은 경색 조직의 영역을 보여줍니다. (B) 경색 볼륨 10 두뇌의 분석 (각이 한 개인의 두뇌를 나타내는 점) 24 시간, 3 일 원심 MCA 응고 후 7 일. 수평 빨간색 선. 평균은, 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다 나타냅니다 (C) 대표 크레 실 바이올렛마다 400 μm의 7에서 일 MCA 응고 후 스테인드 코로나 뇌 섹션. (D) 7 일 MCAO 후 경색 뇌 조직의 도식 유통. 각 슬라이드는 브레 그마와 관련하여 특정 섹션 (. :; 옥스포드 대학 출판부의 허가에 의해 Liesz 등, 뇌, 2011 수정 된 이미지에서)에서 경색 분포의 누적 정보 (표시된 색상으로 구분)를 보여줍니다. &lt;HREF = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg&quot;대상 = &quot;_blank&quot;는&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

중대 뇌동맥 폐색 (MCAO)의 다양한 쥐 모델은 널리 실험 뇌 연구에 사용됩니다. 여기서 우리는 인간의 허혈성 뇌졸중의 대다수에 의해 부과 된 손상에 해당하는 크기의 일관성있는 대뇌 피질의 경색을 생산 두개 영구 원심 MCAO의 모델을 보여줍니다.

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

본 절차의 전반적인 목표는 마우스의 원위부 중대뇌동맥을 영구적으로 폐색시켜, 주로 피질에 발생하며 크기가 인간의 뇌졸중과 상대적으로 유사한 경색을 유도하는 것입니다. 이를 위해 먼저 수술 전 사지 사용 비대칭성에 대한 기저치를 측정합니다. 다음 단계로는 원위부 중대뇌동맥의 전기응고술을 통해 뇌졸중 유도 수술을 수행합니다.수술 후, 네 다리의 사용 비대칭성을 점수화하여 국소 감각 운동 결손을 테스트합니다. 마지막 단계는 크레스탈 바이올렛(crestal violet) 염색을 사용하여 경색 부피를 분석하는 것입니다. 결과적으로 생성된 피질 병변은 변동 폭이 적고 중간 정도의 크기를 가지며, 이는 이 기술을 기초 및 중개 뇌졸중 연구를 위한 가치 있는 모델로 만들어 줍니다.다른 일반적인 뇌졸중 모델과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 사망률이 매우 낮으며, 경색 부피와 위치를 정밀하게 조절할 수 있다는 점입니다. 신피질은 인간 뇌졸중의 대부분을 차지하며 재현성이 매우 높습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 기계적 손상을 최소화하기 위해 두개골을 조심스럽게 제거하는 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다.둘째로, 원위부 중뇌동맥을 정확하게 식별하고 적절하게 연관시키는 것이 이 모델에서 매우 중요합니다. 먼저, 수술 시작 30분 전에 진통제를 투여하십시오. 마우스용 가열 패드를 켜고 수술을 위해 37 °C로 설정하십시오.다음으로 70% nitrogen, 30% oxygen 및 isoflurane으로 구성된 마취 가스가 준비되었는지 확인하십시오. 그런 다음 유도 챔버 내에서 마우스가 움직임을 멈출 때까지 4% isoflurane에 노출시킵니다. 이후 마우스를 가열 패드 위에 위치시키고 4% isoflurane을 1분 더 투여합니다.1분 후, isof fluorine 속도를 1.5%로 변경하십시오. 이제 발가락 꼬집기 테스트로 마우스가 충분히 마취되었는지 확인하고, 마취가 확인되면 가위를 사용하여 눈에 dafan ethanol을 도포하십시오. 귀와 눈 사이를 1cm 절개하여 수술을 시작하십시오. 피부를 분리하고 측두근을 확인하십시오.이제 고주파 발생기에서 기능을 응고(coagulation)로, 모드를 양극(bipolar)으로, 출력을 12 watts로 설정하고 포셉을 연결합니다. 준비 단계에서 노출된 측두근에 식염수를 한 방울 떨어뜨립니다. 그런 다음 전기응고 포셉을 사용하여 측두근의 정점 및 말단 부분을 두개골에서 분리합니다.그 결과로 근육 플랩이 느슨해집니다. 이제 투명한 두개골 아래에서 중대뇌동맥 또는 MCA를 확인하십시오. 이는 전두측두엽 부위의 앞쪽, 안와뒤정맥동의 등쪽에 위치합니다.드릴을 사용하여 이 동맥 바로 위의 뼈가 얇아져 뚫릴 때까지 깎아냅니다. 드릴링하는 동안 식염수를 사용하여 두개골을 습윤한 상태로 유지하십시오. 이제 매우 미세한 핀셋을 사용하여 뼈를 조심스럽게 제거함으로써 MCA 분지를 노출시킵니다.고주파 발생기를 7W로 설정하십시오. 이제 전기응고 집게를 사용하여 동맥을 잡지 말고 가볍게 접촉시켜 응고시킵니다. 분지점의 근위측과 원위측 모두에서 동맥을 응고시키십시오. MCA 분지가 없는 해부학적 변이가 있는 경우에는, 동맥의 가능한 근위측 지점 두 곳을 응고시키며, 응고 후 두 지점 사이의 간격은 약 1mm가 되도록 합니다.30초 동안 기다린 후, 뭉툭한 포셉으로 동맥을 부드럽게 터치합니다. 그다음, 근육을 원래 위치로 옮겨 버홀(bur hole)을 덮어줍니다. 상처 부위를 봉합하고, 동물을 32°C의 회복 상자에 넣어 마취에서 깨어나게 한 뒤 케이지로 돌려보냅니다.일반적으로 동물이 마취에서 회복되는 데는 5~10분이 소요됩니다. 실린더 테스트는 한쪽 사지를 다른 쪽보다 더 많이 사용하는지 확인하는 시험입니다. 동물을 직각으로 배치된 두 개의 거울이 측면에 있는 투명 아크릴 유리 실린더 안에 넣으십시오.실린더 반대편에 있는 두 거울의 정점 맞은편에서 동물을 5분 동안 촬영하십시오. 각 시험이 끝난 후, 실린더와 테이블 상판을 60% ethanol로 닦아내십시오. 이후, 프레임별 분석을 수행하십시오.완전히 일어선 상태에서 한쪽 앞발이 실린더에 닿는 횟수와 한쪽 앞발로 착지하는 횟수를 세어 분석 결과를 측정합니다. 완전 기립 점수 측정 후, 시험당 최소 20회의 한쪽 앞발 접촉이 확인되면 뇌를 20 µm 두께의 절편으로 연속 동결 절편화하며, 각 절편은 400 µm 간격으로 채취합니다. 절편을 슬라이드에 수집하여 -20 °C에서 보관합니다.본 절편 제작 프로토콜을 사용하면, 뇌 한 개에서 경색 부위를 포함하는 모든 절편을 하나의 슬라이드에 배치할 수 있습니다. 표준 크레실 바이올렛(cresyl violet) 프로토콜을 사용하여 절편을 염색함으로써 각 뇌 절편의 경색 조직 부위를 구분합니다. 이후 슬라이드를 마운트하고 스캔한 뒤, 부종 분석을 위해 Swanson 방법을 사용하여 분석할 수 있습니다.MCA 폐쇄 수술로 인한 교정 사망률은 주로 지주막하 출혈 또는 마취 오류로 인해 5% 미만이었다. 해당 기간 동안 사망 사례는 없었다. PA 사용을 위한 이번 분석에서, 뇌졸중 유도 후 실린더 테스트를 사용하여 비대칭성을 측정하였으며, MCA 폐쇄 전의 기저치와 비교한 결과, 24시간 시점에서 유의미한 사지 비대칭이 검출되었고 이는 뇌졸중 발생 후 첫 일주일 동안 부분적으로 회복되었다.크리스탈 바이올렛 염색을 통해 측정된 뇌경색 유도 모델의 평균 경색 부피는 15.4 cubic millimeters였으며, 이는 뇌 반구 하나의 약 12%에 해당합니다. 이 모델의 표준 편차는 매우 낮게 나타났습니다. 또한, 경색 발생 위치의 변동성 또한 최소 수준이었습니다.제대로 수행된다면, 이 작업은 시작 후 10분 이내에 완료될 수 있습니다. 시연된 실린더 테스트와 크리스탈 바이올렛 염색 외에도, 다른 확립된 행동 테스트 및 조직학적 방법을 사용하여 결과를 추가로 특성화하고 구체적인 연구 질문을 해결할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 마우스의 영구적 원위부 MCA 폐쇄를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.방법의 재현성을 유지하기 위해 표준 작업 지침서(SOP)와 상세한 기록물 사용을 강력히 권장합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

중간 대뇌 동맥의 폐색 Filamentous은 생쥐에서 허혈성 뇌졸중 공부를위한 일반적인 모델입니다.

마우스의 모델링 스트로크 - 필라멘트 모델 중간 대뇌 동맥 폐색

우리는 비디오 intraluminal monofilament를 사용하여 성인 마우스의 중간 대뇌 동맥 폐색을 생산하는 방법을 보여줍니다. 또한 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화물 (TTC) 염색법에 의해 대뇌 경색의 범위를 평가하는 방법을 보여줍니다.

중간 대뇌 동맥 폐색의 마우스 모델

intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델은 실험 허혈성 뇌졸중 모델 중 가장 자주 사용되는 모델입니다. 여기서 우리는 전체 레이저 도플러 flowmetry의 가이드와 함께 상세하게 모델 및 대표 결과를 보여줄 것입니다.

마우스의 레이저 도플러 Flowmetry 안내와 허혈성 뇌졸중에 대한 중간 대뇌 동맥 Intraluminal 폐색 (MCAO) 모델

중간 대뇌 동맥 (MCA) 내고 동물 모델에 초점 대뇌 국소 빈혈을 연구하는 기술입니다. 이 방법에서는, 중간 대뇌 동맥 craniotomy에 의해 노출 소작된에 의해 출혈도 잡았. 이 방법은 높은 재현성 경색 볼륨과 사용 가능한 다른 방법에 비해 증가 이후 수술 생존 속도를 제공합니다.

마우스에 영구 중간 대뇌 동맥 내고의 응용

쥐 intraluminal 중간 뇌성 가림 모델은 여기서 제공됩니다. 대뇌 경색의 범위는 neurologic 점수와 cresyl 보라색의 착색, TTC의 대안 얼룩, 병렬 많은 관심 마커에서 테스트 큰 이점을 제공함으로써 평가됩니다.

Intraluminal MCAO의 마우스 모델 : Cresyl 보라 착색에 의한 뇌 경색 평가

중간 대뇌 동맥의 Intraluminal 필 라 멘 트 폐색 설치류 실험 뇌졸중의 가장 자주 사용 된 vivo에서 모델입니다. 일반적인 경 동맥 복구를 허용 하는 다른 수술 접근 여기, 일반적인 경 동맥의 reperfusion 및 중간 대뇌 동맥 영역 전체 reperfusion 수 있습니다 수행 됩니다.

쥐에 있는 일반적인 경 동맥 수리 통해 Reperfusion를 허용 하는 중간 대뇌 동맥 폐색

여기에 설명된 광혈증 뇌졸중 모델은 감광성 염료투여 후 레이저 조명을 이용하여 영구 미생물 폐색을 유도하여 손상되지 않은 두개골을 통해 뇌졸중이 생성된다.

마우스에서 뇌졸중 모델링: 포심 피질 병변

중간 대뇌 동맥 폐색의 다른 모델 (MCAo) 실험 적인 뇌졸중 연구에 사용 됩니다. 여기서, 외부 경동맥(ECA)을 통한 과도 MCAo의 실험적인 뇌졸중 모델이 기술되며, 이는 자발적인 혈전 용해 또는 치료로 인해 뇌혈관 혈전이 제거되는 인간의 뇌졸중을 모방하는 것을 목표로 한다.

마우스에서 뇌졸중 모델링: 외부 경동맥을 통한 일시적인 중간 뇌동맥 폐색

이 프로토콜은 중간 크기의 경색과 우수한 생존율을 가진 독특한 마우스 스트로크 모델을 보여줍니다. 이 모델을 통해 전임상 뇌졸중 연구자는 허혈 기간을 연장하고, 노령 마우스를 사용하고, 장기적인 기능적 결과를 평가할 수 있습니다.

늙은 쥐의 뇌졸중 결과를 연구하기 위해 수정된 경두개 중뇌동맥 폐색 모델

이 프로토콜은 중뇌동맥의 내강 내 폐색을 통한 마우스의 일시적인 국소 대뇌 허혈 모델을 설명합니다. 또한 자기 공명 영상 및 행동 테스트를 사용하여 결과 평가의 예를 보여줍니다.

뇌졸중의 일시적인 중뇌동맥 폐색 모델

여기에서는 C57BL/6J 마우스에서 경두개 전기응고를 통해 원위 중뇌동맥 폐색(dMCAO) 모델을 확립하고 후속 신경학적 행동 및 조직병리학적 특징을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

원위 중동맥 폐색 기법을 사용한 마우스의 급성 허혈성 뇌졸중 유도

학습하세요 마우스에서 말초 중간 대뇌 동맥의 영구 응고를 통한 뇌졸중 모델링 방법을. 전기응고 기법을 사용하여 피질 경색을 유도하고, 실린더 테스트로 감각운동 결손을 평가하며, 크레실 바이올렛 염색으로 경색 부피를 분석합니다.

마우스의 모델링 스트로크 : 말초 중간 대뇌 동맥의 영구 응고

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