마우스의 모델링 스트로크 : 말초 중간 대뇌 동맥의 영구 응고

본 절차의 전반적인 목표는 마우스의 원위부 중대뇌동맥을 영구적으로 폐색시켜, 주로 피질에 발생하며 크기가 인간의 뇌졸중과 상대적으로 유사한 경색을 유도하는 것입니다. 이를 위해 먼저 수술 전 사지 사용 비대칭성에 대한 기저치를 측정합니다. 다음 단계로는 원위부 중대뇌동맥의 전기응고술을 통해 뇌졸중 유도 수술을 수행합니다.

수술 후, 네 다리의 사용 비대칭성을 점수화하여 국소 감각 운동 결손을 테스트합니다. 마지막 단계는 크레스탈 바이올렛(crestal violet) 염색을 사용하여 경색 부피를 분석하는 것입니다. 결과적으로 생성된 피질 병변은 변동 폭이 적고 중간 정도의 크기를 가지며, 이는 이 기술을 기초 및 중개 뇌졸중 연구를 위한 가치 있는 모델로 만들어 줍니다.

다른 일반적인 뇌졸중 모델과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 사망률이 매우 낮으며, 경색 부피와 위치를 정밀하게 조절할 수 있다는 점입니다. 신피질은 인간 뇌졸중의 대부분을 차지하며 재현성이 매우 높습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 기계적 손상을 최소화하기 위해 두개골을 조심스럽게 제거하는 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다.

둘째로, 원위부 중뇌동맥을 정확하게 식별하고 적절하게 연관시키는 것이 이 모델에서 매우 중요합니다. 먼저, 수술 시작 30분 전에 진통제를 투여하십시오. 마우스용 가열 패드를 켜고 수술을 위해 37 °C로 설정하십시오.

다음으로 70% nitrogen, 30% oxygen 및 isoflurane으로 구성된 마취 가스가 준비되었는지 확인하십시오. 그런 다음 유도 챔버 내에서 마우스가 움직임을 멈출 때까지 4% isoflurane에 노출시킵니다. 이후 마우스를 가열 패드 위에 위치시키고 4% isoflurane을 1분 더 투여합니다.

1분 후, isof fluorine 속도를 1.5%로 변경하십시오. 이제 발가락 꼬집기 테스트로 마우스가 충분히 마취되었는지 확인하고, 마취가 확인되면 가위를 사용하여 눈에 dafan ethanol을 도포하십시오. 귀와 눈 사이를 1cm 절개하여 수술을 시작하십시오. 피부를 분리하고 측두근을 확인하십시오.

이제 고주파 발생기에서 기능을 응고(coagulation)로, 모드를 양극(bipolar)으로, 출력을 12 watts로 설정하고 포셉을 연결합니다. 준비 단계에서 노출된 측두근에 식염수를 한 방울 떨어뜨립니다. 그런 다음 전기응고 포셉을 사용하여 측두근의 정점 및 말단 부분을 두개골에서 분리합니다.

그 결과로 근육 플랩이 느슨해집니다. 이제 투명한 두개골 아래에서 중대뇌동맥 또는 MCA를 확인하십시오. 이는 전두측두엽 부위의 앞쪽, 안와뒤정맥동의 등쪽에 위치합니다.

드릴을 사용하여 이 동맥 바로 위의 뼈가 얇아져 뚫릴 때까지 깎아냅니다. 드릴링하는 동안 식염수를 사용하여 두개골을 습윤한 상태로 유지하십시오. 이제 매우 미세한 핀셋을 사용하여 뼈를 조심스럽게 제거함으로써 MCA 분지를 노출시킵니다.

고주파 발생기를 7W로 설정하십시오. 이제 전기응고 집게를 사용하여 동맥을 잡지 말고 가볍게 접촉시켜 응고시킵니다. 분지점의 근위측과 원위측 모두에서 동맥을 응고시키십시오. MCA 분지가 없는 해부학적 변이가 있는 경우에는, 동맥의 가능한 근위측 지점 두 곳을 응고시키며, 응고 후 두 지점 사이의 간격은 약 1mm가 되도록 합니다.

30초 동안 기다린 후, 뭉툭한 포셉으로 동맥을 부드럽게 터치합니다. 그다음, 근육을 원래 위치로 옮겨 버홀(bur hole)을 덮어줍니다. 상처 부위를 봉합하고, 동물을 32°C의 회복 상자에 넣어 마취에서 깨어나게 한 뒤 케이지로 돌려보냅니다.

일반적으로 동물이 마취에서 회복되는 데는 5~10분이 소요됩니다. 실린더 테스트는 한쪽 사지를 다른 쪽보다 더 많이 사용하는지 확인하는 시험입니다. 동물을 직각으로 배치된 두 개의 거울이 측면에 있는 투명 아크릴 유리 실린더 안에 넣으십시오.

실린더 반대편에 있는 두 거울의 정점 맞은편에서 동물을 5분 동안 촬영하십시오. 각 시험이 끝난 후, 실린더와 테이블 상판을 60% ethanol로 닦아내십시오. 이후, 프레임별 분석을 수행하십시오.

완전히 일어선 상태에서 한쪽 앞발이 실린더에 닿는 횟수와 한쪽 앞발로 착지하는 횟수를 세어 분석 결과를 측정합니다. 완전 기립 점수 측정 후, 시험당 최소 20회의 한쪽 앞발 접촉이 확인되면 뇌를 20 µm 두께의 절편으로 연속 동결 절편화하며, 각 절편은 400 µm 간격으로 채취합니다. 절편을 슬라이드에 수집하여 -20 °C에서 보관합니다.

본 절편 제작 프로토콜을 사용하면, 뇌 한 개에서 경색 부위를 포함하는 모든 절편을 하나의 슬라이드에 배치할 수 있습니다. 표준 크레실 바이올렛(cresyl violet) 프로토콜을 사용하여 절편을 염색함으로써 각 뇌 절편의 경색 조직 부위를 구분합니다. 이후 슬라이드를 마운트하고 스캔한 뒤, 부종 분석을 위해 Swanson 방법을 사용하여 분석할 수 있습니다.

MCA 폐쇄 수술로 인한 교정 사망률은 주로 지주막하 출혈 또는 마취 오류로 인해 5% 미만이었다. 해당 기간 동안 사망 사례는 없었다. PA 사용을 위한 이번 분석에서, 뇌졸중 유도 후 실린더 테스트를 사용하여 비대칭성을 측정하였으며, MCA 폐쇄 전의 기저치와 비교한 결과, 24시간 시점에서 유의미한 사지 비대칭이 검출되었고 이는 뇌졸중 발생 후 첫 일주일 동안 부분적으로 회복되었다.

크리스탈 바이올렛 염색을 통해 측정된 뇌경색 유도 모델의 평균 경색 부피는 15.4 cubic millimeters였으며, 이는 뇌 반구 하나의 약 12%에 해당합니다. 이 모델의 표준 편차는 매우 낮게 나타났습니다. 또한, 경색 발생 위치의 변동성 또한 최소 수준이었습니다.

제대로 수행된다면, 이 작업은 시작 후 10분 이내에 완료될 수 있습니다. 시연된 실린더 테스트와 크리스탈 바이올렛 염색 외에도, 다른 확립된 행동 테스트 및 조직학적 방법을 사용하여 결과를 추가로 특성화하고 구체적인 연구 질문을 해결할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 마우스의 영구적 원위부 MCA 폐쇄를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

방법의 재현성을 유지하기 위해 표준 작업 지침서(SOP)와 상세한 기록물 사용을 강력히 권장합니다.