형성 초점 : 세포 기반 분석은 유전자의 발암 성 가능성을 파악하기 위해

이 절차의 전반적인 목표는 유전자의 발암 가능성을 결정하기 위해 레트로바이러스를 사용하여 마우스 섬유아세포 세포주에서 초점 형성 분석을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 관심 유전자의 염기서열을 레트로바이러스 벡터로 클로닝함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 바이러스 벡터와 PLA e 패키징 셀을 사용하여 레트로바이러스 입자를 생산하는 것입니다.

다음으로, 관심 유전자의 변형 가능성을 평가하기 위해 레트로바이러스를 사용하여 NIH 3 T 3 마우스 섬유아세포 세포를 감염시킵니다. 마지막 단계는 NIH 3개의 T 3 세포가 2-3주 동안 분열하도록 한 다음 결정 바이올렛 염색을 수행하여 형성된 병소의 수를 정량화하는 것입니다. 궁극적으로, 초점 형성 분석은 관심 유전자의 과발현이 마우스 섬유아세포 세포에서 밀도 독립적 성장을 유도하기에 충분한지 여부를 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법은 유전자의 발암 가능성 스크리닝과 같은 암 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 바이러스 벡터를 만듭니다. 그런 다음 섭씨 37도의 수조에서 플랫 E 세포를 빠르게 해동한 다음 15밀리리터 원추형 튜브로 옮겨 동결된 세포에서 플랫 E 배양을 확립합니다.

15ml 원추형 튜브에 9ml의 PLA E 배지를 천천히 추가합니다. 튜브를 180배 G로 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 10ml의 plat E 배지로 세포를 재현탁하고 10cm 배양 접시로 옮깁니다.

그런 다음 섭씨 37도의 5%CO2 인큐베이터에서 세포가 80에서 90% Confluent 사이가 될 때까지 배양합니다. 먼저 배지를 흡인하여 세포 분할을 수행 한 다음 PBS로 세포를 한 번 세척 한 후 0.05 % tripsin EDTA를 2 밀리리터 첨가하고 실온에서 1 분 동안 배양하고 손가락 탭으로 세포를 분리합니다. 그런 다음 10ml의 plat E 배지를 추가하고 세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮깁니다.

이전과 같이 튜브를 원심분리하고 10ml의 plat E 배지로 세포를 재현탁합니다. 다음 종자, 항생제 없이 plat E 배지를 사용하여 10cm 배양 접시당 200만 개의 세포를 사용하고 세포를 하룻밤 동안 배양하도록 합니다. 다음 날, 300마이크로리터의 옵티멈을 1.5ml 마이크로 튜브에 넣습니다.

Optum을 사용하여 준비된 튜브에 27마이크로리터의 폴리에틸렌 아민을 추가합니다. 손가락으로 가볍게 두드려 부드럽게 섞고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 볼텍싱(vortexing)으로 부드럽게 혼합된 튜브에 9마이크로그램의 트랜스펙션 등급 플라스미드 DNA를 추가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.

그런 다음 하룻밤 동안 배양하기 전에 혼합물을 플랫 E 접시에 적가적으로 첨가하십시오. 다음 날, 형질주입 시약이 포함된 배지를 흡인하고 10ml의 새로운 plat E 배지를 첨가한 후 세포를 인큐베이터로 되돌려 NIH three T three 배양물을 확립합니다. 먼저 섭씨 37도의 수조에서 세포를 빠르게 해동하고 15ml 튜브로 옮깁니다.

9 밀리리터의 NIH 3, T 3 배지를 세포에 천천히 첨가하고 튜브를 180 배 G에서 5 분 동안 원심 분리 한 다음 snat을 버립니다. 그런 다음 10ml의 NIH 3, T 3 배지로 세포를 재현탁하고 10cm 배양 접시로 옮깁니다. 섭씨 37도의 5%CO2 인큐베이터에서 세포를 배양하여 자발적 형질전환의 빈도가 증가함에 따라 세포를 융합 상태로 유지합니다.

배양이 유창성에 도달하면 한 번 성장한 씨앗 10 곱 5 nih, 3 T 3 세포 10 센티미터 접시 당 다음 날 감염을 위해 밤새 배양합니다. 다음 날, 10ml 일회용 주사기를 사용하여 plat E 접시에서 레트로바이러스 상등액을 채취하고 0.45미크론 공극 크기의 나일론 멤브레인 필터를 통해 여과한 다음 15ml 튜브로 옮깁니다. 세포를 인큐베이터로 되돌리기 전에 10ml의 신선한 plat E 배지를 세포에 추가합니다.

그런 다음 감염될 NIH 3 T 3 세포 접시의 배지를 흡인하고 여과된 상등액을 함유한 일반 NI H 3, T 3 배지 5mL 및 바이러스 5ml를 추가합니다. 다음으로 접시에 폴리 브레인을 추가합니다. 밀리리터당 6마이크로그램의 농도를 추가합니다.

두 번째 감염을 위해 감염 단계를 반복하기 전에 밤새 세포를 배양합니다. 감염 후 바이러스를 교체하고 배지를 일반 IH 3 T 3 배지로 포함하십시오. IH 3 T 3 세포가 2 내지 3 동안 성장하도록 허용하고, 결정 바이올렛 염색에 필요한 배지를 대체한다.

NIH three T three medium을 흡입하고 얼음 위에 접시를 놓습니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 접시를 두 번 씻으십시오. 얼음처럼 차가운 메탄올로 10분 동안 세포를 고정합니다.

그런 다음 얼음에서 접시를 제거하고 메탄올을 흡인합니다. 25% 메탄올로 만든 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액 3ml를 넣고 실온에서 5분 동안 접시를 배양합니다. 배양 후, 크리스털 바이올렛 용액을 흡인하고 헹굼 시 색이 벗겨지지 않을 때까지 Milli Q 물로 접시를 조심스럽게 헹굽니다.

접시를 벤치 위에서 밤새 뚜껑을 덮지 않고 말리십시오. 접시가 마르면 자를 사용하여 초점을 측정하고 직경이 5mm보다 큰 기록을 계산합니다. 숫자 MXD 3은 MAD 계열의 비정형 구성원인 기본 나선 루프 나선 류신 지퍼 전사 인자로, 음성 대조군 및 양성 대조군과 비교할 때 발암에 관여하는 것으로 보고되었습니다.

MXD 3가 과발현된 NIH 3 T 3 접시는 초점이 현저히 적었습니다. 데이터는 유의성을 결정하기 위해 여러 실험에서 수집되었으며 이 분석에서 동일한 추세가 관찰되었습니다. 결과는 MXD 3가 이 절차에 따라 종양 유전자로 기능하지 않음을 시사합니다.

유전자 조합을 사용한 초점 형성 분석, 연질 오거 증식의 성장 및 세포주기 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 종양 발생 발병기전에서 관심 유전자의 역할을 평가하기 위한 추가 질문에 답할 수 있습니다.