마우스의 피부와 모낭 패터닝 및 감각 축삭 형태학의 분석에의 응용의 평면 마운트 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 시료를 물리적으로 절단하지 않고 모낭 및 신경 말단과 같은 피부 구조를 전체적으로 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 등, 뒷발, 꼬리를 포함한 다양한 신체 부위에서 피부를 채취합니다. 두 번째 단계는 채취한 피부 시료를 평평하게 펴고 세척하는 것입니다.

다음으로 피부 시료를 적절한 방법으로 고정합니다. 마지막 단계는 피부 시료에 대해 면역 염색 또는 조직 화학 염색을 수행하는 것입니다. 최종적으로 해부 현미경 또는 공초점 현미경을 이용한 이미징을 통해 다양한 피부 구조의 기하학적 형태를 시각화합니다.

표피 호르몬 마운트 준비법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 신체 어느 부위의 피부에도 적용할 수 있으며, 표피를 진피로부터 분리할 필요가 없다는 점입니다. 이 방법은 식물 세포 극성 연구의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 피부의 2차원적 기하학적 구조와 모낭의 독특한 배치는 이 과정을 연구하기에 피부를 이상적인 시스템으로 만들기 때문에, 이 방법은 식물 세포 극성에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 상부 형태의 개별 작용을 직접 시각화하여 체성감각 뉴런 유형을 정의하는 것과 같은 피부 발달의 다른 측면을 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다.

발이나 꼬리와 같은 일부 부위의 피부 박리는 습득하기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요하며, 주름과 과도한 신장을 방지하면서 피부를 완벽하게 펼치는 것이 중요합니다. 본 시연에서는 isof fluorine 흡입법으로 안락사시킨 P three 마우스에서 등 쪽 피부를 수집합니다. 메스를 사용하여 꼬리 기저부부터 각 옆구리를 따라 수평으로 절개하며, 각 사지 기저부의 등 쪽을 지나 귀의 외측을 거쳐 코 끝에서 마무리합니다.

장갑을 낀 손가락으로 피부를 잡아 포셉에 의해 집히지 않도록 주의하며, 후방에서 전방 방향으로 진행하여 하부 조직으로부터 피부를 부드럽게 벗겨냅니다. 귀 높이의 피부를 먼저 벗길 때는 가위로 귀를 잘라내고, 이 부위는 피부가 찢어지기 쉬우므로 특히 천천히 진행하십시오. 이 단계부터는 피부의 안쪽 면이 위를 향하도록 배치합니다.

피부 주변부를 따라 약 20개의 곤충 핀을 일정한 간격으로 꽂아 S Guard에 고정합니다. 이때 피부가 과도하게 늘어나지 않도록 주의하십시오. 각도 조절 핀셋이나 곡선 핀셋을 사용하여 피부 위에 PBS 10 to 20 milliliters를 덮어줍니다.

피부와 연결된 지방 및 결합 조직을 절제하여 제거합니다. 포셉이 피부를 관통할 위험을 최소화하기 위해 포셉의 뾰족한 끝부분을 수평으로 향하게 합니다. 면봉을 피부 표면 위로 부드럽게 굴려 피부 아래에 갇힌 기포를 모두 배출시킵니다.

다음 단계는 핀 피부를 고정하는 것입니다. 멜라닌 이미징이나 알칼리성 인산분해효소 조직화학 염색에 피부를 사용할 경우, 10 cm 배양 접시당 갓 조제한 4% PFA PBS 또는 10% buffered formalin 20 mL를 첨가합니다. 면역 염색이나 형질전환 케라틴인 KRT 17 GFP를 시각화하는 데 피부를 사용할 경우, 10 cm 배양 접시당 갓 조제한 2% PFA PBS 20 mL를 첨가하고 저온실에서 밤새 천천히 회전시키며 고정합니다. 다음 날, PBS로 10분 이상 세척합니다.

알칼리성 인산분해효소 조직화학법의 절차는 이 비디오에서 시연되지 않습니다. 멜라닌 이미징의 경우, 실온에서 완만한 수평 회전을 가하며 각 단계당 하루씩 단계별 에탄올 시리즈를 통해 피부를 탈수시킵니다. 3일 후, 100% ethanol에 담긴 탈수된 피부에서 잔류 결합 조직을 제거합니다.

곤충 핀을 제거하고 피부를 지름 10 centimeter 유리 접시에 옮깁니다. 이 절차를 성공적으로 수행하려면 피부 시료를 손상되지 않은 하나의 조각으로 채취하여 완전히 평평하게 펴야 합니다. 피부가 말리는 것을 방지하고 평평하게 유지하기 위해 피부 위에 유리 현미경 슬라이드 두 장을 올려둡니다.

벤조일 벤조에이트 및 벤조일 알코올(BBBA) 20 milliliters를 첨가하면 향후 몇 시간 동안 조직이 빠르게 경화됩니다. BBBA가 피부 위로 씻겨 내려갈 수 있도록 슬라이드를 피부에서 몇 초 동안 들어 올립니다. 모낭 패턴 분석을 위한 발 피부는 일반적으로 P1에서 P8 사이의 동물에서 적출합니다. 안락사 후, 발목 관절 윗부분에서 발을 절단하고 발바닥을 통해 복측 표면을 따라 직선으로 한 번 절개합니다.

근위부에서 원위부 방향으로 진행하며 하부 조직으로부터 피부를 부드럽게 벗겨냅니다. 피부를 분리하기 위해 손가락 부분을 절단하고, 피부의 내측 표면이 위를 향하도록 하여 고정판에 핀으로 고정합니다. 발에는 결합 조직이 매우 적게 분포되어 있습니다.

피부 형질전환. KRT 17 GFP 피부가 멜라닌 이미징을 위한 준비가 되었습니다. 앞서 등 피부에 대해 시연한 것과 동일하게 피부를 고정하고 처리하십시오. P 21 동물을 안락사시킨 후, 제모제를 사용하여 털을 제거하십시오.

장갑을 낀 손가락과 엄지로 피부 표면에 젤을 도포하고 10분 동안 기다립니다. 수돗물로 피부 표면을 씻어냅니다. 그 후, 앞서 설명한 대로 발 피부를 절개하여 S 가드에 핀으로 고정합니다.

상온에서 1% PFA PBS로 30분 동안 고정한 후 PBS로 세척합니다. 꼬리 피부를 준비하려면, 꼬리 기저부를 따라 원형으로 절개한 다음 꼬리 복면을 따라 길이 방향으로 세로 절개를 넣습니다. 한 쌍의 핀셋으로 꼬리뼈 또는 결합 조직의 끝부분을 단단히 잡고, 다른 핀셋으로 피부를 잡아 꼬리 끝부분부터 피부를 벗겨냅니다.

멜라닌 분포와 모낭 방향을 분석하기 위해 꼬리 피부를 SIL 가드에 고정합니다. 고정 전 피지선 분석을 위해 배부 피부와 동일한 방식으로 피부를 고정하고 처리합니다. 꼬리 피부를 약 0.5~1cm 길이의 여러 세그먼트로 자른 후, 5mM EDTA가 포함된 PBS에서 37°C로 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날 진피와 표피의 접착력을 약화시키기 위해, 표피를 진피로부터 조심스럽게 벗겨냅니다. 표피 인터페이스를 S 가드까지 핀으로 고정한 후, 실온에서 4% PFA PBS에 1시간 동안 고정합니다. 이후 표피를 PBS로 세척하고 프로토콜 본문에 기술된 대로 oil red O로 염색합니다.

유리 슬라이드 아래로 평평하게 펴져 BBBA에 잠긴 채 유리 접시에 담겨 있는 발 등쪽 또는 꼬리 피부를 촬영하기 위해 실체 현미경을 사용합니다. 이 방법은 현미경의 BBBA 오염을 최소화합니다. 시야 전체의 빛 강도 공간 변화를 최소화하기 위해 접시 하단에서 조명을 비춥니다.

유리 접시를 해부 현미경의 표준 작업 표면에서 약 10cm 높이로 올리고, 광원 위에 플라스틱 또는 유리 확산판을 배치합니다. 이미징이 완료되면, 피부 조직을 100% ethanol에 다시 넣어 -20°C에서 장기 보관합니다. 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase)로 염색된 피부 조직을 이미징하려면, 소형 단백질 젤용으로 사용되는 두 개의 유리판 사이에 조직을 배치합니다.

플레이트와 피부 사이에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 과도하게 도포된 BBBA는 종이 타월로 조심스럽게 닦아냅니다. 이렇게 플레이트-피부-플레이트 형태로 겹쳐진 샌드위치 구조물을 현미경 스테이지 위에 올립니다.

10배 대물렌즈와 2 µm 또는 5 µm Z-스텝을 사용하여 명시야 또는 DIC 조명을 적용합니다. 기계식 XY 스테이지를 사용하여 XY 이미지 몽타주를 캡처하고, 이를 병합하여 하나의 3차원 그레이스케일 데이터셋을 생성합니다. 다양한 소프트웨어 패키지 중 하나를 사용하여 축삭 수지상 돌기를 반자동으로 추적합니다.

피부 평편 표본(flat mount)의 명시야 이미징을 통해 여기 제시된 단일 피부 감각 수지상 돌기와 그 추적 이미지를 관찰할 수 있습니다. 명시야 이미징은 또한 멜라닌 색소 침착을 기반으로 모낭 패턴을 시각화할 수 있게 합니다. 이 이미지들은 야생형 및 Frizzled 6 결손 마우스의 P1 피부와 Frizzled 6 결손 마우스의 P7 피부를 보여줍니다.

피부 평면 표본의 광학 현미경 이미징을 통해 피지선과 꼬리 부분의 기하학적 구조를 정의할 수 있습니다. Oil Red O로 시각화한 피부에서, frizzled six 결핍 마우스의 피지선은 야생형 등쪽 발에 비해 무질서하게 배열되어 있습니다. KRT 17 GFP로 태그된 케라틴 A GFP를 발현하고 Oil Red O로 염색한 야생형 및 frizzled six 결핍 마우스로부터 채취한 피부입니다.

Red O 염색 결과, 녹아웃 피부 중심부에 모류(hair whirl)가 있음이 확인되었습니다. 피부 평면 표본의 공초점 이미징을 통해 KRT 17 GFP 및 anti GFP 면역 염색으로 시각화된 모낭의 기하학적 구조와 입모근(erector pili)을 정의할 수 있습니다. 안구 근육은 anti smooth muscle actin 면역 염색으로 시각화하였습니다.

Merkel 세포 클러스터는 anti cytokeratin eight 또는 am 1 43 염료 섭취를 통해 시각화하며, 그 중앙의 모낭은 KRT 17 GFP로 시각화합니다. Frizzled six 녹아웃 Merkel 세포 클러스터는 전면을 향해 열려 있는 대신 닫힌 원형을 형성합니다. 일단 숙달되면 적절하게 수행했을 때 해부는 약 30분 내에 완료할 수 있으며, 며칠에서 일주일 이내에 다양한 염색(standings)을 진행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 신체의 다양한 부위에서 피부를 채취하는 방법과 호르몬 형태의 다양한 피부 구조를 시각화하기 위해 이를 염색하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 표준 광학 현미경과 공초점 현미경을 통해 피부 구조의 전층 고해상도 이미지를 수집할 수 있습니다.

파라포름알데히드(paraform aldehyde)와 BBBA를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 유념하십시오. 이러한 용액은 뚜껑이 덮인 용기에 보관하여 증기 흡입을 최소화해야 하며, 피부 접촉을 피해야 합니다. BBBA가 플라스틱에 닿지 않도록 주의하십시오.