Name: 마우스 도파민 뉴런의 차 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 배우세요 태아 마우스 중뇌에서 도파민 뉴런 1차 배양을 생성하는 방법을. 효소 및 기계적 분해 후 면역형광 염색으로 뉴런 확인이 가능하며, 파킨슨병 연구에 필수적인 기술입니다.

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CNRS 및 INSERM의 보조금으로 지원됩니다. 총리는 Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009)의 지원을 인정합니다. SC는 Fondation de France의 지원을 인정합니다.

이 작품에 사용 된 마우스는 보살핌과 유럽 연합위원회의 가이드 라인을 실험 동물의 사용에 대한 (609분의 86 / EU)에 따라 처리 하였다. 필요 솔루션의 1 준비 <ol><li> 주식 솔루션 <ol><li> 10 배 폴리-L 오르니 틴 (PLO) 해결책 : PLO 브롬화 수소 산염 10 ㎎을 무게 (분자량 = 30,000-70,000) 및 멸균 물 70 ㎖에 녹인다. -20 ° C에서 0.2 μm의 주사기 필터, 나누어지는 솔루션을 사용하고, 가게를 필터링합니다. </li><li> 30 % 포도당 해결책 : 30 D (+)의 g을 달아 - 포도당을 100 ml의 총 부피에 멸균 물에 용해. 4 ° C에서 필터, 나누어지는 및 저장. </li><li> 5X 둘 베코 변형 이글 배지에 (DMEM) / 영양 혼합물 햄 F-12 : DMEM / 햄 F-12 분말 6g를 달아, 100 ml의 총 부피를 멸균 수에 용해. 4 ° C에서 필터, 나누어지는 및 저장. </li><li> 7.5 % 중탄산 나트륨 (탄산 수소 나트륨) Soluti에 : 탄산 수소 나트륨 7.5 g을 계량하고 100 ㎖의 총 부피로 멸균 수에 용해. 4 ° C에서 필터, 나누어지는 및 저장. </li><li> 1 M HEPES 용액 : HEPES 23.8 g을 달아 100 ml의 총 부피를 멸균 수에 용해. 4 ° C에서 필터, 나누어지는 및 저장. </li><li> 70 % (v / v) 에탄올 : 멸균 수 30 ㎖의 무수 에탄올 70 ㎖에 희석. </li></ol></li><li> 포도당과 항생제 (PBS-GAB)와 인산염 완충 생리 식염수 : 10 30 % 포도당의 수용액 및 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 500 mL에 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 5 ㎖를 추가합니다. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 비활성화 된 소 태아 혈청 (IFBS가) : 4 ° C에서 하룻밤 소 혈청을 해동 30 분 동안 56 ° C에서 비활성화. -20 ° C에서 50 ML로 나누어지는 및 저장. </li><li> 문화 미디엄 : 멸균에서 5 배 DMEM / F12 햄의 연속 40 ML, 1 1 M HEPES ml의 2 ML 200 mm의 L-글루타민, 페니실린 - 스트렙토 마이신 (streptomycin) 2 ㎖, 4 ㎖의 30 %의 포도당을 혼합ND 180 ml의 최종 부피로 7.5 %의 NaHCO3 3 ㎖. 필터 및 당일 사용. </li><li> 호르몬 믹스 <ol><li> 문화 매체의 180 ML를 준비합니다. 이 매체에 아포 트랜스페린의 200 mg을 녹인다. </li><li> 인슐린을 50mg 칭량하고, 0.1 M 염산 2 ㎖에 녹이고. 부드럽게 혼합하면서 멸균 물을 천천히 8 ML을 추가합니다. 배지에서이 솔루션을 희석. </li><li> 퓨 트레 염산염 19.3 mg의 밖으로 달아 멸균 수 10ml에 용해. 호르몬 믹스로 10 ml의 솔루션을 추가합니다. </li><li> 멸균 수에 3 mM의 아 셀렌 산 나트륨 용액 및 무수 에탄올에 2 mM의 프로게스테론 솔루션을 준비합니다. 호르몬 믹스 각 솔루션의 20 μl를 추가합니다. </li><li> -20 ° C에서 호르몬 믹스, 나누어지는 10 ML에 저장을 필터링합니다. </li></ol></li></ol> 문화 접시와 인스트루먼트의 2 준비 <ol><li> 문화 판의 FBS 코팅 : 해부 전에 날, 배지 180 ㎖의 준비를합니다. 10 ML을 추가배지 90 mL에 IFBS. 추가 300 μL / 웰의 배지 / 폴리-D-라이신 - 예비 코팅 된 24 웰 플레이트에 10 % IFBS. 37 ° C에서 밤새 품어. 4 ° C에서 (로와 IFBS없이) 남은 용지를 보관하십시오. </li><li> 악기와 파스퇴르 피펫을 소독. 클래스 II 층류 후드 및 CO 2 배양기뿐만 아니라 재료 표에 나열된 장비를 수집합니다. </li></ol> 마우스 중뇌의 3 해부 <ol><li> (제도적 지침에 따라) E13.5 임신 마우스를 희생. 70 % 에탄올로 마우스의 복부를 청소하고 복부 벽을 엽니 다. 섬세 가위를 사용하여 열, 자궁 뿔을 수집 자궁 뿔에서 각 배아를 해부하고, 양막을 제거합니다. 멸균 PBS-GAB를 포함하는 100mm 배양 접시에있는 배아를 놓고 집게를 사용하여 3 연속 동일 화장실에서 송금을 씻는다. 해부를 들어, 60mm 멸균 페트리 접시에 세에 의해 배아를 놓습니다. </li><li> mov 인실체 현미경을 이용하여 최종 페트리 접시를 전자. 배아를 참수하지 마십시오. Vannas 가위를 사용하여 뇌를 절제. <ol><li> 조심스럽게 제거하고 fore-와 후뇌 지역을 폐기합니다. 주동이의 측면으로, 지협 지역에서 꼬리 쪽 인하, 시상 지역에 가까운 잘라 우수한 둔덕을 제거합니다. </li><li> 복부 중뇌가 분리되면, 신중 초 미세 집게를 사용하여 수막을 제거합니다. PBS-GAB 가득 멸균 13 ML 튜브에, 수막없이 해부 세그먼트를 수집합니다. </li></ol></li><li> 70 % 에탄올로 철저하게 mesencephala를 포함하는 튜브를 청소하고 후드를 가져옵니다. </li></ol> 4 셀 해리 <ol><li> 세척은 멸균 PBS-GAB로 3 배 mesencephala. 뇌 조각이 각 세척 사이에 정착 조직을 방해하지 않도록 할 수 있습니다. 마지막 세척 후, 37 ° C에서 15 분 동안 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 3 ㎖에 뇌 세그먼트를 가능한 한 신중하게 많은 솔루션을 제거하고 배양이 창업 보육 센터 CO. </li><li> 불 닦으 파스퇴르 피펫은 비 - 연마 된 유리 피펫의 끝과 같은 뉴런의 생존을 최대화하고 날카로운 해리 단계에서 세포에 손상을 줄 수있다. 그것을 불을 연마하는 동안 약간 선단 직경 파스퇴르 피펫 (0.5 mm)을 줄일 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 최대한 트립신 / EDTA 용액을 제거하고 배지 10 ml의 / 10 %를 추가 IFBS. 워시 뇌 세그먼트는 배양 배지 / 10 % IFBS와 배. </li><li> 불 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 배양 배지 / 10 % IFBS의 6 ㎖에 mesencephala의 분해를 시작합니다. 씹다 배 후 새로운 무균 13 ㎖의 튜브에서 매체를 수집 청크 정착 할 수 있도록, (기포를 방지). </li><li> , 배지 6 ㎖에 추가하면 이전 단계를 반복하고 13 ㎖의 동일 관에 해리 된 세포를 포함하는 배지를 수집한다. </li><li> 5 분 동안 160g에서 원심 분리기 세포. 뜨는을 취소하고 보충 된 배지에서 세포를 재현 탁10 % 호르몬 믹스. </li></ol> 5 셀 도금 <ol><li> Malassez 세포에 세포 현탁액을 카운트하고 600,000 세포 / ml의 농도로 매체의 볼륨을 조정한다. 약 1,700,000 세포는 하나의 마우스 중뇌에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 24 웰 플레이트에서 코팅 매체를 FBS 함유를 제거하고 각 웰에 세포 현탁액 1 ㎖에 추가 할 (600,000 세포 / 웰, TH + 세포 2-4 %). </li><li> 37 ° C에서 접시를 품어 5 % CO 95분의 2 % 대기. 어떤 매체 변화는 필요하지 않습니다. 도파민 신경 세포는 체외에서 약 5-7일 (도파민 수송의 일관성있는 표현) 후 성숙. 매체 교체없이 십오일에 문화까지 세포를 보관하십시오. </li></ol> (6) 면역 형광 프로토콜 <ol><li> Coverslips는 청소 <ol><li> 해부 전날, 페트리 접시에 1 M 염산 10 ㎖를 추가합니다. 액체 12-15 유리 커버 슬립의 표면에 올려 놓고 15 분을 기다립니다. </li><li> 커버를 싱크액체로 미끄러 15 분 동안 기다립니다. </li><li> 염산을 제거하고 물로 배를 씻는다. </li><li> 한 번 순수 에탄올로 신속하게 된 커버를 세척 후 접시에 순수 에탄올을 추가하고 30 분 동안 기다립니다. </li><li> 후드, 에탄올 세정 된 커버를 제거하고 멸균 집게를 사용하여 12 - 웰 세포 배양 접시에 한 웰당 커버 슬립을 추가한다. </li><li> 세척 멸균 물 (1 ㎖ / 웰)로 두 번 된 커버. 그런 다음, 멸균 PBS로 한번 씻어. </li></ol></li><li> Coverslips는의 코팅 <ol><li> PBS를 제거하고 500 μL / 2 배 PLO의도 (PBS에 희석)를 추가합니다. CO 2 배양기에서 37 ° C에서 4 시간 동안 품어. </li><li> PLO의 솔루션을 제거하고 멸균 PBS로 3 회 씻는다. </li><li> PBS를 제거하고 500 μL / 웰의 20 % IFBS / 1g / ㎖ 라미닌을 추가합니다. CO 2 배양기에서 37 ° C에서 밤새 품어. </li></ol></li><li> 면역 형광의 셀 도금 <ol><li> 12 - 웰 플레이트에서 코팅 매체를 제거합니다. </li><li> 900,0 추가00 세포 / 웰이 ml의 부피와 배양기에서 37 ° C에서 세포를 성장. 세포는 중간 교체없이 십오일에 문화까지 유지 될 수있다. </li></ol></li><li> 면역 염색 <ol><li> 12 - 웰 플레이트에서 매체를 제거하고 잘 DMEM이 37 ° C로 예열 / 500 ㎕를 씻어. </li><li> / 잘 DMEM 500 ㎕를 37 ° C로 예열 추가, 부드럽게 160 μL / 웰 8 % 파라 포름 알데히드 (PFA, 2 % 최종 농도)를 추가하고 37 ° C에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> PFA를 제거하고 PBS로 3 배 세척 / 0.1 M 글리신을 10 분 동안. </li><li> , PBS를 제거 300 μL / 웰의 PBS / 0.05 % 트리톤 X-100 / 20 % 염소 혈청을 추가하고, 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 매체를 제거 300 μL / 웰의 PBS에 희석 차 항체 / 0.05 % 트리톤 X-100 / 1 % 염소 혈청을 추가하고 실온에서 2 시간 동안 배양한다. 도파민 성 신경 세포 배양의 특성의 검출에 사용될 수있는 일차 항체 재료 표에 나타내었다. 유지일 잘 차 항체없이 다른 차 항체의 배경에 대해 평가합니다. </li><li> 배지를 제거하고 PBS로 3 배 세척 / 0.2 % 젤라틴을 10 분 동안. </li><li> 매체 분리 300 μL / 웰의 PBS에 희석 차 항체 / 0.05 % 트리톤 X-100 / 1 % 염소 혈청을 추가하고 어두운 곳에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 사용 된 차 항체는 재료 표에 표시됩니다. </li><li> 배지를 제거하고 PBS로 3 배 세척 / 0.2 % 젤라틴을 10 분 동안. </li><li> 매체 제거하고 PBS로 3 회 씻는다. </li><li> 다운 VECTASHIELD의 드롭 유리 슬라이드 셀 측 커버 슬립을 장착. 다음 4 ℃에서 보관, 설치 매체 건조 수 있도록 실온에서 밤새 슬라이드를 유지합니다. </li><li> 공 초점 현미경 표면 형광에 장착 된 위상차 현미경을 사용하여 이미지를 획득. 대표 이미지는 라이카 SP2 UV 공 초점 현미경으로 획득 하였다. </li></ol></li></ol>

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이 프로토콜은 마우스 배아 도파민 성 신경 세포를 검출하는 면역 형광 절차에서 중간 뇌 신경 세포의 일차 배양을 준비하기 위해 필요한 절차 및 시약을 제공한다. 절차의 중요한 단계는 배아의 박리 및 회수 뇌 절편 기계적 해리이다. 고품질 해부 악기 해부 기술을 마스터하는 데 도움이됩니다. DA 뉴런 중뇌의 작은 부분을 구성한다. 따라서, 복부 중뇌의 오른쪽 부분을 수집하는 DA 뉴런 2-4 % 함유 배양을 수득하는 것이 필수적이다. 기계 해리는 신중하고 조심스럽게 수행해야합니다. 문화가 아닌 해리 뉴런의 클러스터를 포함하는 경우, 하나 또는 두 개 더 분쇄 단계를 추가합니다. 이 프로토콜은 신경 세포 배양 용 무 혈청 배지를 사용합니다. 그러나, 혈청으로 코팅하여 세포의 부착을 향상시키기 위해 필요하다. 산이 대체 호르몬 믹스,음, 신경 세포의 성장을 허용 및 신경교 세​​포의 생존과 증식을 최소화하기 위해 정의된다. 따라서, 비 신경 세포 (GFAP-염색을 사용하여 정량) ...

도파민, 필수적인 뇌의 신경 전달 물질 1,2 중 하나는, 주로 중뇌 도파민 (DA) 신경 세포에 의해 방출된다. DA 신경 세포의 대부분은 중뇌 2-6의 복부 부분에 상주. mesostriatal, mesolimbic 및 mesocortical 경로 2,5 : 도식적으로, 중뇌 DA 뉴런은 해부학 적 및 기능적으로 세에서 별개의 프로젝션 시스템을 나눌 수 있습니다. 전두엽 피질에 투사 도파민 경로는 인식이 연루되는 반면, 흑질 선조체 경로는 mesolimbic 경로 보강, 동기 부여, 학습에 중요한 역할을, 모터 동작에 참여하고있다. DA 뉴런은 정신 분열증, 주의력 결핍, 하이퍼 활동 장애, 파킨슨 병 (PD) 2,4 등 여러 가지 인간의 신경 질환에 참여하고 있습니다. PD는 흑질 접속 DA 신경 세포의 진행성 및 퇴행성 선택적 특징선조체에 갈 거예요의 compacta (SNC). PD의 운동 증상의 책임이있는 선조체 (striatum)에서 심각한 도파민 고갈에 nigro - 선조체 DA 뉴런 결과의 손실 (운동 완만, 휴식 진동, 강성) 7. 특발성 PD의 초기 원인은 확립되지 않았으며, 현재 치료 선조체 도파민 수준을 복원하는 목표 만 증상이다. 대부분의 처방 약은 L-도파 (레보도파), 도파민의 자연 전구 물질이다. 레보도파의 투여가 일정 시간 동안 도파민 손실을 보상하지만, 모터 후 합병증 (운동 이상증의 온 / 오프 상태) 장기간 치료 8,9 일어난다. 도파민 뉴런과 PD에 대한 연구가 진행되어 일정 강렬한 노력은 세포 이식, 유전자 치료, 또는 신경 보호제 10,11에 기반 치료법을 개발하기 위해 이루어지고있다. 단, 중요한 문제가 아닌 해명 남아 극단적 vulnerab의 원인이 무엇DA 뉴런의 ility? 답변의 일부는 DA 신경의 활성에서 찾을 수있다. 전기적 활동 및 DA 신경 세포의 흥분성의 감소는 12 퇴화하는 그들의 성향을 확대 할 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, PD의 병인의 복잡성 DA에 관여하는 메커니즘 신경 세포가 13 ~ 15 변성을 식별하기 위해 추가 연구가 필요합니다. 차 문화는 DA 신경 세포의 특성 16 ~ 19을 공부하고 신경 보호제 20-24의 평가를 위해 다양한 스트레스에 이러한 뉴런에 도전 특히 적합하다. 쥐 배양 모델은 대부분 쥐 배아 중뇌의 박리가 용이​​ 한, 마우스와 비교하고, 뉴런의 더 많은 양이 쥐에서 얻을 수있다 사용된다. 그러나, 병 (25)의 형질 전환 마우스 모델의 생성은 마우스에서 26-29 차 배양 용 신경학 커뮤니티의 관심을 상당히 증가하고있다. 홍보 문화 있지만신생아 동물로부터 epared은 뉴런 분화하는 능력을 유지 한 경우, 포스트 - 유사 분열 단계 (중뇌 신경 용 E13.5)에서 배아을 준비하는 것이 좋다, 사용될 수있다. 다음 프로토콜은 준비하기가 가장 어려운 마우스 배아 (E13.5)에서 차 문화에 고립 된 중뇌의 신경 세포를 제공합니다. 특히, 우리는 더 나은 재현성 위해 무 혈청 배지를 사용하는 프로토콜을 제공한다. 배양 제제 (해부 및 기계적 해리)에 두 개의 가장 중요한 단계는 신중 연관된 비디오에 설명 될 것이다.

<table><tbody><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Lonza</td><td>14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5g/L 포도당, L-글루타</td>민 <td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 트립신-EDTA(1x), 페놀 레드</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민, 200mM 용액</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>25030123</tr><tr><td>둘베코' s 인산염 완충 식염수</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>둘베코 의 변형된 독수리' s 중간/영양소 혼합물 F-12 햄</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>D0547</td><td>파우더</td></tr><tr><td>라미닌 - 트리스 버퍼 NaCl</td><td>시그마-알드리치</td>에서 1 mg/ml;<td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴 하이드로브로마이드</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>돼지 췌장에서 추출한 인슐린</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>I5523</td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrin 인간</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine dihydrochloride</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>아셀렌산나트륨</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>H4034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>G7126</td><td>물 속의 원액 1M</td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>G9391</td><td>스톡 용액 2% (w/v) in water</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 16% 수중</td><td>전자 현미경 과학</td><td>RT 15710-S</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨(NaHCO3)</td><td>Merck Millipore</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-포도당, 일수화물</td><td>Merck Millipore</td><td>4074-2</td><td></td></tr><tr><td>염산 - c(HCl) = 1 mol/L(1 N) Titripur</td><td>Merck Millipore</td><td>109057</td><td></td></tr><tr><td>멸균수 - Aqua B. Braun</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute NORMAPUR 분석 시약</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>멸균 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>82050-566</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 일반 유리 - Wilhem Ulbrich GdbR.</td><td>VWR</td><td>612-2297</td><td></td></tr><tr><td>카운팅 챔버 Malassez</td><td>VWR</td><td>631-0975</td><td></td></tr><tr><td>Supor Membrane이 있는 혈청 Acrodisc 주사기 필터, 멸균, GF/0.2 &micro; m, 37 mm</td><td>PALL Life science</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위 - 곧고 날카로우며 14.5cm 길이의</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td>복벽을 열려면</td></tr><tr><td>가위 - 곧고 뾰족하며 섬세하고 10cm 길이</td><td>MORIA</td><td>4877A</td><td>자궁벽을 열려면</td></tr><tr><td>집게 - 곡선, 일반, 톱니 모양의 턱 1mm</td><td>MORIA</td><td>2183</td><td>배아</td></tr><tr><td>를 조작하려면Vannas 가위 - 곡선, 뾰족한, 7mm 블레이드</td><td>MORIA</td><td>MC50</td><td>중뇌를 꺼내</td></tr>려면 <tr><td>울트라 파인 집게 - 곡선, 섬세한, 13cm 길이의</td><td>MORIA</td><td>9987</td><td>수막을 제거하려면</td></tr><tr><td>BD BioCoat Poly-D-Lysine 24웰 멀티웰 플레이트</td><td>BD Bioscience</td><td>356414</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 12웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑이 있는 평평한 바닥</td><td>BD Bioscience</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost 현미경 슬라이드, 접지 가장자리 90&ordm;</td><td>멘젤-GL&Auml; SER</td><td>AG00008032E</td><td></td></tr><tr><td>Precision 커버 안경 두께 No. 1.5H 원형 18 mm &Oslash;</td><td>MARIENFELD</td><td>117580</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) 항체</td><td>Chemicon Millipore</td><td>AB5622</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) 항체, 클론 1G10.2</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB5406</td><td>1/400</td></tr><tr><td>Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) 항체, 클론 DAT-Nt&nbsp;</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB369</td><td>1/500</td></tr><tr><td>단클론 마우스 안티-5-HT 항체</td><td></td><td></td><td>1/8,000 - Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)</td></tr><tr><td>염소 혈청, 뉴질랜드 Origin</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 염소 안티-래빗 IgG (H+L) 항체</td><td>Life Technologies</td><td>A-31556</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG (H + L) 항체</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 염소 안티 랫 IgG (H + L) 항체</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>A-11007</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>VECTASHIELD HardSet 마운팅 중간</td><td>벡터 연구소</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Carl Zeiss 현미경</td><td>Stemi-2000C</td><td></td></tr><tr><td>분젠 버너 FIREBOY</td><td>폭스바겐</td><td>451-0136</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

도파민 뉴런은 뇌 신경 세포의 총 수의 1 % 미만을 나타낸다. 신경이 적은 양의은 모터 제어, 동기 부여, 및 작업 메모리 중요 뇌 기능을 조절한다. 흑질 선조체 도파민 뉴런 선택적 파킨슨 병 (PD)에 퇴화. 이 진보적 인 신경 세포의 손실은 명백하게 병리의 모터 증상 (운동 완만, 휴식 진전, 근육 강도)와 연결되어 있습니다. 도파민 신경 세포의 변성을 담당하는 주요 에이전트는 아직 알 수 없습니다. 그러나 이러한 신경 세포는 다양한 조건에서 매우 취약한 것으로 나타납니다. 차 문화는 속성과 도파민 신경 세포의 특성을 조사하기 위해 가장 중요한 모델 중 하나를 구성한다. 이러한 문화는 중지하거나 신경 세포의 변성을 느리게하기 위해 PD 병리를 모방 다양한 스트레스 에이전트 및 신경 보호 화합물을 제공 할 수 있습니다. GENER왔다 PD의 수많은 형질 전환 마우스 모델지난 10 년간 나타나는데 더 도파민 신경 세포 배양에 대한 연구자들의 관심이 증가했다. 여기서, 비디오 프로토콜은 배아 마우스 뇌의 섬세한 절개에 초점을 맞추고있다. 복부 중뇌의 정확한 절제 후속 연구를 할 수 있도록 도파민 세포에서 충분히 풍부한 신경의 문화를 얻기 위해 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 배아 형질 전환 마우스 실현 면역 형광 염색, 정량 PCR, 둘째 메신저 정량화, 또는 신경 세포의 죽음 / 생존 평가에 적합하다 할 수 있습니다.

중뇌 문화 단계의 그림 흐름도 그림 1에 나타나있다. 간단히, 임신 스위스 마우스에서 E13.5 배아를 수집 한 후, 복부 중뇌가 전체 배아 해부한다. 고립 된 뇌 조각이 연속적으로 소화 효소 및 기계적 분리에 제출됩니다. 해리 된 세포를 미리 코팅 된 12 - 또는 24 - 웰 플레이트에서 배양 배지에 재현 탁시키고, 도금, 원심 분리에 의해 펠렛 화한다. 세포는 중간 교체없이 십오일까지 유지됩니다. 3.2 단계에 해당하는 복부 중뇌 해부의 상세한 흐름도는 그림 2에 나타나있다. 빨간색 점선 라인 E13.5 마우스 뇌의 개략도에 3 주 절단 선을 표시 (. Prestoz 등에서 30 적응) 및 절단 단계가 도시되어있다. VIT 1, 4, 7 일 후에 문화의 위상 대비 이미지RO (DIV)를 <st...

도파민 뉴런은 뇌에서 중요한 조절 역할을 합니다. 그들의 손실은 파킨슨병과 관련이 있습니다. 이 비디오에서는 배아 마우스 중뇌에서 중심 도파민 뉴런의 1차 배양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이러한 배양은 다양한 스트레스에 대한 이러한 뉴런의 극도의 취약성을 연구하는 데 유용합니다.

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 배아 마우스 뇌로부터 도파민 작동성 뉴런의 일차 배양물을 생성하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 마우스 E 13.5 배아를 수집함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 배아 마우스의 뇌를 해부하여 중뇌를 분리하는 것입니다.다음으로, 수집된 중뇌에 효소적 및 기계적 해리를 적용합니다. 마지막 단계는 해리된 신경세포를 플레이팅하는 것입니다. 최종적으로, 면역형광 염색을 통해 배양물 내 도파민성 신경세포의 존재를 확인합니다.이 방법은 조현병, 주의력 결핍 과잉 행동 장애 및 파킨슨병과 같은 신경 및 정신 질환 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 박리 및 세포 해리 단계는 정밀한 제스처와 구조의 해부학적 식별이 필요하여 학습하기 어려우므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 절차 시연은 본 연구 그룹의 연구원이 수행할 것입니다. 이 절차를 시작하려면, E 13.5 임신 마우스를 희생시킨 후 복부를 70% ethanol로 소독하십시오.다음으로, 복벽을 절개하고 자궁각을 수집합니다. 각 자궁각에서 배아를 박리하여 꺼내고 양막을 제거합니다. 그런 다음 배아를 멸균된 P-B-S-G-A-B가 담긴 100 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다.세 번의 동일한 세척액에 차례로 옮겨 세척합니다. 그 후, 해부를 위해 배아를 60 mm 멸균 페트리 접시에 옮깁니다. 페트리 접시를 실체 현미경 아래에 놓습니다.다음으로, Vanna 가위를 사용하여 뇌를 절제합니다. 네 개의 뇌 영역과 후뇌 영역을 조심스럽게 제거하여 폐기합니다. 머리 쪽(rostral side)의 시상 영역 근처에서 한 번 절개하고, 꼬리 쪽(caudal side)의 ssus 영역에서 다시 한 번 절개합니다.그런 다음 상구(superior colliculus)를 제거합니다. 복측 중뇌가 분리되면 수막을 조심스럽게 제거합니다. 초미세 핀셋을 사용하여 수막이 제거된 절단 세그먼트들을 PBS-GAB이 채워진 13 milliliter 멸균 튜브에 수집합니다. 중뇌가 들어있는 튜브의 외부를 70% ethanol로 철저히 세척합니다.그런 다음, 이 단계에서 샘플을 후드 아래에 둡니다. 중뇌를 멸균된 P-B-S-G-A-B로 3회 세척합니다. 각 세척 단계 사이에 뇌 조각들이 가라앉도록 기다리며, 마지막 세척 후에는 조직이 흐트러지지 않도록 주의합니다.용액을 가능한 한 조심스럽게 최대한 제거한 후, 이산화탄소

primary-culture-of-mouse-dopaminergic-neurons

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

기본 dissociated midbrain의 도파민 세포 문화는 도파민 뉴런의 presynaptic 특성의 연구 수 있습니다. 그들은 실시간 도파민 릴리스 속도론 및 단백질 / mRNA 도파민 exocytosis의 규제 수준을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 당신이 쥐 neonates에서 이러한 문화를 생성하는 방법을 보여줍니다.

쥐 Neonates에서 기본 Dissociated Midbrain의 도파민 세포 문화

이 프로토콜은 electroporation과 문화 마우스 hippocampal 및 대뇌 피질의 뉴런을 통해 transfect, 해부하다하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 장기 문화가 synaptogenesis 및 돌기 척추 분석 연구에 사용할 수 있지만 단기 문화는 축삭의 파생물과지도의 연구에 사용할 수 있습니다.

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

이 문서는 성숙 oligodendrocytes (OLs)를 생산하는 차별화 기본 문화에 murine oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)의 풍부한 인구를 유도하는 방법을 설명합니다. 또한,이 보고서는 생산 기술에 대해 설명합니다 murine 마우스 등의 루트 신경절의 뉴런 (DRGNs)의 neurite 침대에 마우스 OPCs을 심는 공동 문화 myelinating.

포스트 - 나탈 Murine 조직의 공동 문화를 Myelinating 풍부한 Oligodendrocyte 문화와 Oligodendrocyte / 신경 세포의 유도

이 비디오는 쥐의 배아 뇌 조직에서 도파민 뉴런을 배양하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 과정에는 단백질 분해 효소로 중뇌를 치료하고, 세포를 분리하고, 세포의 성장과 장기적인 생존을 위해 항생제가 함유된 영양이 풍부한 배지의 폴리머 코팅된 커버슬립에서 배양하는 것이 포함됩니다.

Culturing and Maintaining Dopaminergic Neurons from Mouse Embryonic Brain Tissue

이 비디오는 마우스 배아의 중뇌에서 도파민 뉴런을 분리하고 배양하는 과정을 보여줍니다. 고립된 복부 중뇌 바닥은 효소를 사용하여 해리됩니다. 생성된 도파민 뉴런은 수확되어 다중 웰 플레이트 내부의 마이크로 섬으로 전달됩니다. 세포는 마이크로 아일랜드 내부의 고밀도로 세포를 유지하기 위해 도파민 뉴런 배지로 배양됩니다.

1차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런의 분리 및 배양

이 비디오는 알파-시누클레인 미리 형성된 섬유로 전처리된 배아 마우스 도파민 뉴런에서 알파-시누클레인 축적을 정량화하는 과정을 보여줍니다. 면역 형광을 사용하여 알파-시누클레인 응집체를 포함하는 도파민 뉴런을 고정, 염색 및 정량화하는 단계를 설명합니다.

Primary Embryonic Mouse Dopamine Neurons에서 알파-시누클레인 축적 연구

여기서 우리는 subventricular 영역과 개인 성인 쥐의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서, 부착 단층 또는 neurosphere를 하나로서, 신경 전구 세포 배양의 동시 발생에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

파킨슨병 동안 중뇌 도파민성 뉴런의 퇴화 원인은 완전히 이해되지 않았습니다. 세포 배양 시스템은 이러한 뉴런의 신경 생리학적 특성을 연구하는 데 필수적인 도구를 제공합니다. 여기에서는 신경퇴행의 체외 모델링에 활용할 수 있는 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

파킨슨 병 (PD)에서 Substantia 그라 (SNC) 도파민 신경 세포는 운동 기능 장애로 이어지는, 퇴화. 여기에서 우리는 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-서열을 사용하여 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다.

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

생체 외에서 가능한 한 적절 하 게 생체 외 조건에서 반영 하는 실험을 실시 하는 것은 쉬운 일이 아니다. 1 차적인 세포 배양물의 사용은 전체 유기체에 있는 세포 생물학을 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 제공된 프로토콜은 배아 마우스 소뇌 뉴런을 성공적으로 성장시키고 배양하는 방법을 간략하게 설명한다.

배아 마우스 소뇌에서 분리 된 뉴런의 기본 문화

여기서, 우리는 1 차 마우스 도파민 뉴런에 신경 α-synuclein 축적을 연구하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런의 인광α-시뉴클레인 골재는 미리 형성된 α-시뉴클레인 피브릴로 유도된다. 면역형으로 표지된 세포와 편견없는 이미지 분석의 자동화된 이미징은 α-synuclein 축적을 억제하는 약물의 중간-고처리량 스크리닝에 적합한 강력한 프로토콜을 만듭니다.

1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시뉴클레인 축적 연구

배우세요 태아 마우스 중뇌에서 도파민 뉴런 1차 배양을 생성하는 방법을. 효소 및 기계적 분해 후 면역형광 염색으로 뉴런 확인이 가능하며, 파킨슨병 연구에 필수적인 기술입니다.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

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