미세 구조의 분석을위한 효모 엔도 좀의 시스템 Nanogold 라벨링

다음 실험의 전반적인 목적은 효모인 Saccharomyces cei의 엔도솜 구획을 초미세 구조 수준에서 시각화하는 것입니다. 이는 양전하를 띤 나노 금 입자의 엔도사이토시스 섭취가 일어나는 효모 스페로플라스트(Spheroplast)를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 샘플을 고정하고 절단하여 세포의 초박 절편 냉동 섹션을 얻습니다.

다음으로, 냉동 절편을 은 증폭 반응에 처리합니다. 엔도사이토시스된 양전하 나노 금 입자를 확대하여 시각화함으로써, 본 절차의 특이적 표지를 바탕으로 서로 다른 효모 엔도솜 구획의 형태를 보여주는 결과를 얻습니다. 절편의 ImmunoGold 표지와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 전자현미경 표본 제작 시 제대로 작동하지 않는 경우가 많은 항체에 의존하지 않는다는 점입니다.

이 방법은 효모 *Saccharomyces cerevisiae*의 리소좀 시스템에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 다른 효모 및 포유류 세포와 같은 다른 진핵생물 모델에도 적용 가능합니다. 구형 원형질체(Spheroplast)를 준비할 효모를 다음 날의 실험 설계에 따라 결정된 적절한 배지 10밀리리터에서 30도로 하룻밤 동안 배양합니다. 600나노미터에서 배양액의 광학 밀도를 측정한 후, 동일한 배양 배지를 사용하여 세포를 OD 600 기준 0.2에서 0.4가 되도록 희석합니다.

OD 600이 1에서 2가 될 때까지 세포를 대수 성장기까지 배양한 후, OD 600 상당의 세포 10배 분량을 50밀리리터 튜브에 옮기고 2100 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 100 millimolar PBS 및 10 millimolar DTT 5밀리리터에 재현탁하여 30 °C에서 10분 동안 배양합니다. 원심분리를 통해 세포를 회수합니다.

상층액을 버린 후, 1 M sorbitol과 5 mg의 lytic enzyme이 포함된 배지 5 mL에 세포를 현탁합니다. 혼합물을 30 °C에서 부드럽게 흔들어주며 30분 동안 배양합니다. 세포 현탁액을 300 Gs에서 5분 동안 원심분리하여 Sphero plats에 해당하는 펠릿 분획을 수집합니다.

상층액을 버리고 1 M sorbitol이 포함된 얼음처럼 차가운 배지 960 µL에 구상체(spheroplasts)를 재현탁합니다. 이 혼합물을 얼음처럼 차가운 2 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 나노 골드 흡수 절차를 시작하려면, 피펫을 사용하여 구상체와 양전하를 띤 나노 골드 입자를 부드럽게 혼합하십시오.

40 µL의 물에 현탁하여 재부유시킵니다. 혼합물의 최종 부피는 1 mL가 되어야 합니다. 얻어진 세포 현탁액을 얼음 위에 15분 동안 둡니다.

현탁액을 실온으로 옮기고, 내포 작용(endocytosis)을 통해 나노 금이 내부로 유입되도록 필요한 시간 동안 배양합니다. 원하는 수준의 나노 금 흡수가 완료되면, 1 M sorbitol이 포함된 2배 농도의 고정액 1 mL를 세포 현탁액에 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 튜브를 실온에서 30분 동안 유지합니다.

PHE plast와 현탁액 상태를 유지하기 위해 30분 동안 마이크로 원심분리 튜브를 수동으로 여러 번 천천히 반전시킵니다. 다음으로 1700 Gs에서 25초 동안 두 번 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 1 M sorbitol이 포함된 표준 농도의 신선한 고정액 1 mL를 첨가합니다. 천천히 회전하는 휠 위에서 실온으로 2시간 동안 배양합니다. 이후 세포는 본 절차를 시작하기 전 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 처리 및 저온 절편 제작 과정을 거칩니다. 은 증강 키트를 냉동고에서 꺼내 37 °C 인큐베이터에서 해동합니다. 해동된 키트를 사용 전까지 암실에 미리 배치한 24 °C 벤치 인큐베이터에 둡니다.

가열판을 암실에 두고 최종 온도 24 °C까지 가열합니다. 가열판 상단을 벤치 코트 표면 보호기로 덮고, 광택이 나는 면이 위로 오게 한 뒤 테이프로 고정합니다. 표면 보호기 위에 파라필름을 올리고, 어둠 속에서도 시각적으로 확인할 수 있도록 검은색 마커로 가장자리를 표시합니다.

표면 보호기 상단에 온도계를 테이프로 고정하십시오. 가열판의 온도를 모니터링하며 온도를 서서히 조절하십시오. 24 °C가 아니면, 2차 증류수가 담긴 50 mL 튜브를 배치하십시오.

인큐베이터 내부에서, 37°C로 예열된 2회 증류수를 작은 페트리 접시에 채웁니다. cryo section이 부착된 니켈 그리드 2개를 시료 면이 아래로 향하도록 하여 물속에 30분 동안 둡니다. 30분 후, 두 번째 페트리 접시에 예열된 2회 증류수를 채우고 동일한 니켈 그리드 2개를 다시 30분 동안 물속에 둡니다.

가열판 위에 고정된 파퓸(parfum) 위에 24 °C의 2중 증류수를 여러 방울 떨어뜨린 후, 그리드의 시료 면이 아래로 향하게 하여 다시 세척합니다. 은 증폭 반응 후 세척에 사용할 2중 증류수 9방울이 파퓸 위에 추가로 준비되어 있는지 확인하십시오. 이 단계에서 암실의 모든 전등은 꺼야 하며, 적색등만 켜두어야 합니다.

다만, 촬영 목적으로만 조명은 켜진 상태로 유지합니다. 본 시연에서는 24 °C 인큐베이터에서 실버 강화 키트의 a 및 B 용액을 꺼내 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 A 용액 6방울을 넣은 후, B 용액 6방울을 추가하고 유리 파스퇴르 피펫으로 기포가 생기지 않게 주의하며 잘 섞어줍니다. 용액을 볼텍싱합니다.

a 및 B 용액을 24 °C 인큐베이터에 잠시 넣어두고 C 용액을 꺼냅니다. AB 혼합물에 C 용액 6방울을 추가합니다. 파스퇴르 피펫으로 다시 혼합한 후 볼텍싱하며, 이때 기포가 생기지 않도록 주의합니다.

이 최종 혼합물을 즉시 사용하십시오. 깨끗한 비자성 핀셋을 사용하여 파라폼 위에 방울을 떨어뜨립니다. 혼합물 위에 그리드를 배치하십시오.

이 과정은 은 증강 반응입니다. 실험에서 원하는 증강 정도에 따라 그리드를 6분에서 15분 동안 둡니다. 혼합물에서 그리드를 꺼내어 24 °C의 Perfil 위에 놓인 6방울의 2중 증류수를 빠르게 차례대로 통과시키며, 마지막 3회 세척 과정을 수행합니다.

물 한 방울당 7분 동안 그리드를 그대로 둡니다. 실제 실험을 수행하는 경우, 세척이 완료되면 조명을 다시 켭니다. 이어서, EM 조사를 위해 ImmunoGold 표지 또는 막 염색을 통해 결과를 시각화합니다.

은 강화 나노 골드를 사용하여 다양한 유형의 효모 엔도솜 구획을 표지하고 전자 현미경으로 시각화할 수 있습니다. 나노 골드를 5분 동안 흡수시키면 세포막과 더불어, 엔도솜 소포일 가능성이 있는 단일 소포 및 초기 엔도솜일 가능성이 매우 높은 관상 구조와 같은 초기 엔도솜 구획이 표지됩니다. 나노 골드와 함께 30분 동안 배양하면 후기 엔도솜 또는 다소포체(multivesicular bodies)가 표지됩니다.

면역 전자 현미경 절차와 본 나노 금-은 증폭 프로토콜을 결합했을 때의 해상력은 제시된 소기관, 특히 다소포체의 내부 소포의 형태적 보존 상태와 품질을 통해 강조됩니다. 은 증폭법을 사용하기 전, 은 입자의 크기와 균일성을 모두 확보하기 위해 필요한 최적의 배양 시간을 결정하는 예비 실험을 수행해야 합니다. 본 절차는 다음과 같습니다.

특정 단백질이 세포막 하부 구획의 특정 위치에 존재하는지와 같은 질문에 답하기 위해 면역 표지법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.