상상 속의 세포 부착 분자의 특성에 대한 비드 집계 분석 실험

이 절차의 전반적인 목표는 인간 IgG의 FC 영역에 대한 ecto 도메인 단편의 융합을 암호화하는 플라스미드가 HEC 2 93 세포로 형질 주입되는 이 결과를 달성하기 위해 동성애자 접착을 매개하는 단백질 ecto 도메인의 능력을 테스트하는 것입니다. 분비된 Odin FC 융합 단백질은 단백질 G에 접합된 마그네틱 비드에 포착되며, 세척 후 코팅된 비드가 용액에서 상호 작용할 수 있습니다. 그런 다음 코팅된 비드를 이미지화하여 응집 정도를 평가하고 마지막으로 간단한 이미지 분석을 사용하여 정량화한 결과 데이터는 단백질 언더스터디가 동성애성 접착을 매개할 수 있는지 여부를 나타냅니다.

세포 응집 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 빠르고 간단하며 선택한 단백질의 접착 활성을 직접 테스트한다는 것입니다. 이 기술을 시연하는 것은 실험실의 선임 과학자인 Michelle Eman 박사가 맡을 것입니다. transfection 2-3일 전에 ECFC에서 NCA를 위해 배양된 세포를 준비하여 이 절차를 시작합니다.

EDTA에서 0.05% 트립을 사용하여 배양 접시에서 HEC 2 93 세포를 분리합니다. 각 조건에 대해 100mm 접시 2개를 준비합니다. 세포를 1에서 5로 나눈 다음 배양합니다.

성장 배지를 보충했습니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 넣고 60-80%가 합류할 때까지 세포를 배양합니다. transfection 당일에는 lipo와 같은 시약을 사용하여 FC 융합을 인코딩하는 플라스미드를 도입합니다.

transfection 후, transfection 다음 날 24시간 동안 세포를 prewarm, pent strep이 있고 소 태아 혈청이 없는 DMEM을 섭씨 37도까지 인큐베이터에 되돌립니다. 각 접시를 10 밀리리터의 가난된 배지로 두 번 헹구고, 배양 후 1시간 동안 접시를 37°C 인큐베이터에 다시 헹구고, 총 3회 세척을 위해 소 태아 혈청 없이 10 밀리리터의 DMEM으로 배양 접시를 한 번 더 헹구고, 그런 다음 배지를 수집하기 전에 또 다른 48시간 동안 섭씨 37도에서 형질주입된 세포를 배양합니다. transfection 4일 후, 혈청학 피펫을 사용하여 각 한 쌍의 배양 접시에서 배지를 채취하여 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 5분당 500Gs로 배지를 원심분리하여 스핀 후 세포 파편을 펠릿화하고 각 50ml 원추형 튜브의 배지를 30ml 주사기에 붓고 0.45미크론 주사기를 통해 여과합니다. 원심 농축기로 필터링합니다. 농축된 배양 배지의 부피가 약 500마이크로리터로 줄어들 때까지 원심 필터를 돌립니다.

약 15분 정도 걸립니다. 모든 배양 배지가 추가되고 농축될 때까지 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에서 1.5 마이크로 리터의 단백질 G 마그네틱 비드에서 1 밀리리터의 얼음 저온 결합 완충액에 대해 각 샘플.

이 절차에서 가장 어려운 부분은 비드 응집입니다. 성공을 보장하려면 절차를 정확히 따라야 합니다. 구슬을 빨리 관찰하되 너무 가혹하지 마십시오.

튜브 측면에서 건조되거나 자석에 너무 오래 남아 있으면 안 됩니다. 튜브를 자석에 놓고 피펫을 사용하여 버퍼를 흡입합니다. 그런 다음 농축 배양 배지를 단백질 G 자성 비드에 즉시 첨가하십시오.

튜브를 섭씨 4도에서 2시간 동안 회전시킵니다. 튜브를 자석에 놓고 매체를 빠르게 제거합니다. 1ml의 얼음 차가운 결합 버퍼로 비드를 두 번 세척한 다음 300마이크로리터의 바인딩 버퍼에 비드를 다시 현탁시킵니다.

재현탁된 비드를 각 튜브에 150마이크로리터가 있는 두 개의 튜브로 나눕니다. 그런 다음 칼슘 및 칼슘 없음 상태에 대해 각각 1.5 마이크로 리터의 염화칼슘 또는 EDTA를 추가합니다. 각 조건에서 100마이크로리터를 함몰부로 이동합니다.

투과광 현미경을 사용하여 잘 미끄러집니다. 원하는 각 시점의 각 실험에 대해 5개의 시야에서 이미지를 수집합니다. 이미지 J 또는 유사한 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다.

드롭다운 메뉴에서 이미지 J에 있는 5개의 이미지 데이터 세트 중 하나를 엽니다. 화면 맨 위에서 파일을 선택합니다. 그런 다음 가져오기를 선택한 다음 이미지 시퀀스를 선택합니다.

이미지 파일이 포함된 폴더를 찾은 다음 이미지 스택으로 엽니다. 그런 다음 드롭다운 메뉴 표시줄에서 이미지를 클릭한 다음 속성을 선택합니다. 거기에서 속성 창을 엽니다.

이미지 단위를 픽셀로 변경하고 픽셀 너비와 픽셀 높이를 1.0으로 설정합니다. 이미지를 다시 클릭하고 adjust then threshold를 선택하여 임계값 창을 열고 슬라이더를 사용하여 이미지 임계값을 조정합니다. 구슬에 기여하는 픽셀을 포함하고 작은 입자를 제외합니다.

이미지 스택의 모든 이미지에 임계값을 적용합니다. 다음으로 화면 상단의 드롭다운 메뉴 모음에서 선택합니다. 분석을 클릭합니다.

그런 다음 측정 설정을 선택하고 화면 맨 위에 있는 영역 및 스택 위치 선택 확인란을 사용하여 측정 대화 상자를 엽니다. analyze(분석)를 클릭한 다음 analyze particles(입자 분석)를 선택합니다. 이렇게 하면 입자의 크기와 입자가 식별된 이미지를 포함하여 식별된 입자 목록이 생성됩니다.

각 실험 및 각 실험 조건에 대해 이 과정을 반복하여 제브라피시와 카데린의 칼슘 의존성 접착 능력을 확인합니다. HEC 2, 9, 3 세포를 NCAT herrin OD 도메인으로 형질주입하고, 2개의 fc를 융합하고, 다음 칼슘 의존성 비드 응집 세포를 이미지화하고 분석했으며, 이러한 이미지에서 볼 수 있는 바와 같이 이 비디오에 설명된 대로 분석했습니다. 칼슘이 없는 경우 비드는 응집되는 경향이 거의 또는 전혀 나타나지 않으며 칼슘이 있는 동안 시간이 지남에 따라 응집체 크기가 증가하지 않습니다.

그러나 여기서 NCAT와 ECFC로 코팅된 비트는 접착력의 반정량적 측정으로 시간이 지남에 따라 골재 크기가 증가하는 강력한 응집체를 보여줍니다. 응집체의 평균 크기를 결정하기 위해 세 가지 실험에서 투과된 광 이미지를 분석했습니다. 이 플롯에서 볼 수 있듯이, 칼슘이 있는 경우와 칼슘이 없는 경우 ncoer ECFC 코팅 비드의 응집은 15분 간격으로 측정되었습니다.

한 시간 동안 이러한 데이터는 제브라피시 n cadherin의 ecto domain이 칼슘 의존성 호모호이닉 접착을 매개한다는 것을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 접착력이 관심 단백질의 고유한 생화학적 특성인지 여부를 테스트하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.