Name: 인간 배아 줄기 세포에 표적으로 아연 손가락 핵산 분해 효소 향상된 유전자 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 배우세요 아연 손가락 핵산 분해 효소를 이용해 인간 배아 줄기 세포에서 PITX3 유전자 좌위에 효율적으로 표적 유전자를 도입하는 방법을. 이 기술은 중추신경계 발달 연구에 활용됩니다.

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이 프로토콜에 설명 된 작품은 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM)와 공동 제휴의 일환으로 빅토리아 정부에서 자금을 지원에 의해 가능하게되었다.

모든 과정은 무균 층류 후드에서 수행된다. 달리 지정하지 않는 한 모든 미디어 및 솔루션은 37 ° C 평형을하고 있습니다. 형질에 대한 (이 프로토콜에 사용되는 인간 배아 줄기 및 hiPSCs, WA-09) 인간의 PSC를 1. 확장 참고 : 마트 리겔 또는 Geltrex에 인간 배아 줄기을 확장 할 필요가 없습니다. 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)에 확장 된 인간 배아 줄기는 MEF 제거 단계 다음 일렉트로 또는 nucleofection 사용할 수 있습니다 (2.8 절 참조). <ol><li> 1 × 100mm 요리와 MEF 미디어 cm 2 당 2.0 × 10 4 세포에서 DR4 MEFs의 1 개 75cm2 플라스크를 준비 / V 젤라틴 w 0.1 %로 사전 코팅 요리에 (표 1 참조). 주 : CF1, BLK6 또는 MF1 MEFs를 사용할 수있다, 그러나, 예를 들면, DR410, 항생제 내성 MEF 라인을 사용하는 것이 권장된다. </li><li> 다음날, 100mm 접시 위에 통로 인간 배아 줄기 섹션 1.1에서 준비 MEFs가 미리 도금. 이 ASPI을 수행하려면문화 요리에 환율이 hESC의 미디어,의 Ca2 + /의 Mg2 + - 무료 행크스 &#39;균형 염 용액 (HBSS)와 인간 배아 줄기를 씻어, 37 ° C / 5 % CO 2에서 가습 배양기에서 디스 파제 (해당 볼륨에 대한 표 2 참조)과 장소를 추가 할 수 있습니다. MEFs를 제거하는 HBSS로 2 회 - 3 ~ 5 분 배양 후, 부드럽게 흡인 디스 파제와 한을 씻는다. 부드럽게 배양 접시의 표면에서 식민지를 다쳤고, hESC의 미디어 (표 3 참조) 셀 스크레이퍼를 사용하여, 5 ml의 피펫을 추가합니다. </li><li> 15 ㎖의 원심 분리 관에 배양 접시에서 서스펜션의 식민지 조각을 수집합니다. hESC의 미디어와 15 ML 튜브로 전송 헹구고 배양 접시. 단일 세포 또는 작은 조각으로 대단히 짧은 시간을 휴식하지 않도록주의하십시오. </li><li> 식민지 조각을 펠렛 160 XG에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 기음 뜨는. 식민지 조각 펠릿을 풀어 손가락으로 15 ML 튜브의 바닥을 누릅니다. 분할 비율에 따라 hESC의 미디어에 부드럽게 재현 탁 식민지 조각 (normall4 일 : 8 적합한) 나중에 일 사이에 비율을 분할합니다. 효율성을 replating 영향을 미칠 것이 아니라 단일 세포 또는 작은 조각으로 대단히 짧은 렌더링하지 않도록 각별히주의해야합니다. </li><li> MEFs가 HBSS로 1 배 세척에 hESC의 조각을 replating 이전. 천천히 요리 MEFs가 사전에 도금 hESC의 매체에 hESC의 단편을 함유하는 세포 현탁액의 적당량 (표 2 참조) 추가한다. </li><li> 인큐베이터에있는 선반에 배양 접시를 놓고 고르게 식민지 조각을 배포 좌우로 앞뒤로 및 측면 천천히 이동합니다. </li><li> 매일 hESC의 미디어를 교체합니다. </li><li> MEFs (MEF-CM)에서 에어컨 미디어를 준비하기 위해 씻어 75cm 2 플라스크 MEFs HBSS로 1 개에 사전 도금. hESC의 미디어를 추가합니다. 24 시간을 따라 미디어를 조절하고 신선한 hESC의 미디어로 교체 수집합니다. 십이일 최대 매일 반복합니다. 필요할 때까지 4 ° C에서 MEF-CM을 저장합니다. </li></ol> 형질에 대한 인간의 ESCS의 2 준비 <ol><li> 인간 배아 줄기의 성장을 관찰매일 현미경. 식민지 40~50% 합류, 판 cm 2 당 2.0 × 10 5 MEFs와 3 × 100mm 요리 될 때. </li><li> 식민지가 60이 될 때 - 70 %의 합류 그들은 형질 전환 할 준비가 된 것입니다. 차별화 된 식민지 또는 식민지 코어를 제거하여 &#39;신랑&#39;식민지. 참고 : 우리는 높은 형질을 믿고 세포가 로그 위상 성장에있을 때 목표로 효율성이 발생, 그것은 인간 배아 줄기는 ≥ 70 % 포화 상태에 도달하기 전에 일렉트로이 실시하는 것이 좋습니다. </li><li> HBSS와 hESC의 식민지를 씻고 Accutase를 추가합니다. 참고 : ROCK 억제제에 미리 치료 인간 배아 줄기 필요가 없습니다 Y-27632 단계 2.7시 Y-27632와 함께 배양 할 때 충분한 억제가 발생합니다 </li><li> 37 ° C / 5 현미경으로 볼 때 식민지 단일 셀을 렌더링 할 때까지 %의 CO 2시 20 분 - 10 알을 품다. 1 ML의 피펫 씹다 세포. </li><li> 40 μm의 셀 straine를 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 hESC의 미디어와 필터를 추가세포 덩어리를 제거하려면 r. </li><li> 5 분 동안 160 XG에 원심 분리기. 신선한 hESC의 미디어에 재현 탁 세포 펠렛 및 잔여 Accutase 솔루션을 제거하는 반복합니다. </li><li> 10 μM Y-27632 및 100mm 접시에 총 세포 현탁액을 전송이 젤라틴으로 코팅 된 사전이 포함 hESC의 미디어에 재현 탁 세포. </li><li> 30 분의 최소 37 ° C / 5 % CO 2에서 품어. </li><li> 이 시간 동안 MEFs는 젤라틴 코팅 접시에 부착됩니다. 신선한 15 ML의 원심 분리기 튜브에 1 ㎖의 피펫을 사용하여 비 부착 인간 배아 줄기를 수집하고 혈구를 사용하여 셀 밀도를 결정한다. </li></ol> 인간 배아 줄기의 3 일렉트로 <ol><li> 0.22 μm의 필터 및 추가 10 NG / ml의 재조합 인간 섬유 아세포 성장 인자 2 (rhFGF2)를 사용하여 필터 CM-MEF 매체. </li><li> 5 분 동안 160 XG에서 새로운 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기 섹션 2.9에서 7.5 × 106 인간 배아 줄기을 전송합니다. </li><li> 지수 전자 업계를위한 선택 프로그램 : electroporator를 설정이 시간 동안250 V, 용량 : ctroporation는 다음과 같은 매개 변수, 전압 설정 500 μF, 그리고 저항 : ∞-. </li><li> 뜨는을 기음과 얼음처럼 차가운 0.22 μm의 여과 HBSS의 0.8 ml의 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 멸균 0.4 cm의 일렉트로 큐벳에 솔루션을 전송합니다. </li><li> TV-hPITX3 앞으로 타겟팅 구조 (30 μg DNA)를 추가하고 200 μL 피펫으로 가볍게 섞는다. 5 분 동안 얼음 위에서 배양한다. 이 시간 동안 PITX3 ZFN의 mRNA 한 나누어지는 제거하고 얼음에 해동. 전기 천공 큐벳에 DNA / 세포 혼합물에 전송에게 ZFN의 mRNA의 7.5 μl를 해동합니다. 200 μL 피펫으로 가볍게 섞는다. 주 : 타겟팅되는 궤적은 효율에 기여 타겟팅 주요 요인이다. 이러한 PITX3 같은 유전자 침묵, ESCS 표현하지 유전자가 어려운 궤적 인코딩은 종래의 상 동성 재조합 (6)을 대상으로하여. 따라서,이 프로토콜은 사용자 DNA 이중 가닥을 유도하기 위해 B 인간 PITX3 궤적 위해 활용한다 ZFNs 설계reak. </li><li> electroporator의 화면 지침에 따라 Electroporate. </li><li> 200 μL 피펫 10ml로 hESC의 매체를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 전기 천공 큐벳에서 컨텐츠를 전송할 사용. hESC의 매체의 200 ㎕의 15 ML 튜브 각 시간과 전송 두 번 큐벳을 씻으십시오. 가있을 것 &quot;점액 같은&quot;파편에 부정적인 세포 생존에 영향을 미칠 용해 세포에서 DNA와 단백질로 구성. 이 파편을 제거하기 위해 5 분 동안 160 XG에 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 대기음 부드럽게 풀어 세포 펠렛을 누릅니다. 10 μM Y-27632을 포함 MEF-CM 보충 30 ㎖에 다시 일시 중지하고 MEFs와 예비 도금 3 × 100mm 요리에 replate. </li><li> 매일 미디어를 변경합니다. 2 일에, Y-27632는 회수 될 수 있고 세포는 hESC의 미디어 만 재배. </li><li> 2-3일 후 인간 배아 줄기는 50-70% 합류해야한다. 이 시점에서 항생제 선택 (예를 들어, 0.5 μg / ㎖의 퓨로 마이신)를 시작합니다. </li><li> 셀프 유지매일 신선한 hESC의 / 퓨로 마이신 미디어를 추가하여 ection. ~ 칠일 후에 작은 콜로니를 볼 수 있어야합니다. 항생제 내성 MEFs를 사용하지 않는 경우는 MEFs cm 당 2 부가 1.0 × 104 세포를 첨가하여 보충 할 수있다. </li></ol> 4 따기 형질 전환 hESC의 클론 <ol><li> 약 14 - (식민지 ~ 1mm 직경에 도달 한) 선택 다음 21 일 확장과 심사에 대 한 번호판을 준비합니다. 5 시간의 최소 4 ° C에서 마트 리젤 또는 Geltrex의 분취 량을 해동하여 시작합니다. 제조업체의 지침에 따라 희석하고 3 × 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 75 μl를 추가합니다. cm 2 당 2.0 × 10 4 세포에 MEFs을 도금 3 × 48 - 웰 플레이트를 준비합니다. 37 ° C / 5 % CO 2에서 두 판 O / N을 품어. </li><li> 다음날 격자를 절단하여 2 ml의 피펫의 끝에서 21 G 바늘을 사용하여 16-25 개로 콜로니 해부. </li><li> 기음 96 - 웰 플레이트에서 마트 리젤과 supplem로 교체ented CM-MEF 미디어. 48 - 웰 플레이트 한 HBSS와 x와 hESC의 미디어를 추가 씻으 MEFs. </li><li> 200 μL 피펫을 사용하여 부드럽게 확장을 위해 48 웰 플레이트에 해부 식민지의 3 분의 전송할 수 있습니다. 보충 CM-MEF 매체를 함유 대응 96 웰 플레이트로 해부 콜로니의 다른 2/3 옮긴다. </li><li> 매일 미디어를 변경하여 두 판을 유지 (MEFs를 포함하는 48 웰 플레이트에 96 웰 마트 리겔 코팅 플레이트와 hESC의 미디어를 CM-MEF 매체를 보완, 모두 0.5 μg / ml의 퓨로 마이신으로 보충). </li><li> 96 - 웰 플레이트가 100 % 합류 된 후 초기 PCR을 통해 화면까지 확대. </li></ol> (5) 검사 및 긍정적 인 클론의 확장 <ol><li> 게놈 DNA (11에 따라 방법을) 준비 반전 판에서 모든 미디어를 제거하려면 다음 종이 타월에시킨다. </li><li> RT PBS (100 μL / 웰 각 세척), 단계 5.1로 반전하고 오와 각 웰에 두 번 씻어. -80 ° C의 F에서 장소 판또는 1-2 시간이 세포 용해에 도움 (플레이트는 다음과 같이 무한정에 저장 될 수 있습니다.) </li><li> 세포가 Sarcosyl 용해 버퍼를 만들 C -80 °에있는 동안 (표 4 참조) (50 μL / 웰). 각 웰에 5 다음 실온에서 분 피펫 용해 버퍼 세포, 따뜻한 판을 용해합니다. 습도를 만들 촉촉한 종이 타월을 포함하는 밀봉 용기에 테이프, 장소, 각 판의 가장자리를 밀봉하고, 60 ° C에서 O / N을 배양한다. </li><li> 배양 후, -20 ° C 무수 에탄올 10 ㎖에 500의 NaCl 150 μl를 추가 잘 혼합하고, 각 웰에 100 μl를 추가 (참고 : NaCl을 추가 할 때 에탄올 흐린 갈 것입니다). 탭 판 부드럽게 믹스 (안 피펫을) 및 RT에서 30 분의 최소 떠나. 이 시간 동안 용액은 맑은 꺼지고 DNA가 침전된다. </li><li> 다음 각 웰에 70 % 에탄올 150 μl를 추가 단계 5.1에서와 같이 솔루션을 제거합니다. 부드럽게 접시 전환 및 이전시킨다. 이 단계 더 배를 반복합니다. 참고 : 때문에 침전 된 DNA 자연스럽게 adhE 유전자조직 배양 플라스틱에 입술은 이러한 세척 단계 동안에서 이탈하지 않습니다.) </li><li> 최종 세척 후 최고 속도로 간단히 원심 분리 판은 적어도 30 분 동안 실온에서 각 웰 후 자연 건조의 하단 (또는 37 ° C)에 DNA를 집중합니다. </li><li> 40 추가 - 50 μL의 T0.1E (pH8.0)을 1 시간 동안 65 ° C에서 각 웰과 장소 플레이트 또는 TE (pH8.0) (표 5 참조) 또는 4 ° CO / N PCR을 위해 사용하기 전에. 부드럽게 플레이트의 측면을 활용하여 DNA를 재현 탁. 다시 중단 DNA / 10 ㎕의 PCR 반응의 1-2 μl를 사용합니다. </li><li> 이 hPITX3의 L 팔 세대와 긴 템플릿 PCR 시스템을 확장 사용. F 및 hPITX3의 L 팔 GFP의 R 프라이머는 58 ° C에서 어닐링, 45 초 연장, 35 사이클에서 클론의 초기 검사를 수행합니다. </li><li> 1 % 아가 로스 젤 Hyperladder의 1킬로바이트와 Electrophorese 샘플은 45 분 동안 100 V에서 GelRed 및 UV 조명을 통해 긍정적 인 클론을 감지 함유. </li><li> expa에서 게놈 DNA를 소화하여 PCR 긍정적 인 클론의 유효성을 검사남부 오 점에 벡터 동성 팔을 HindIII 및 혼성화 프로브 5 &#39;와 3&#39;와 nded 클론 (아래 참조) (이전에 하나의 설명 참조). 프로브는 프라이머 쌍 hPITX3 5 &#39;프로브 F와 R, 및 hPITX3 3&#39;프로브 F와 R,를 EcoRI으로 절단하며, 일반적인 클로닝 벡터에 라이 게이션을 사용하여 PCR에 의해 생성됩니다. </li><li> 양성 클론의 수에 따라, MEFs (2 cm 당 2.0 × 104 세포)와 전도금하여 6 - 웰 플레이트의 웰 (2)을 준비한다. </li><li> 그 다음날은 1 시간의 최소 10 μM Y-27632와 함께 48 웰 플레이트에 긍정적 인 클론을 전처리. </li><li> HBSS에 긍정적 인 클론을 씻고 Accutase의 300 μl를 추가합니다. </li><li> 식민지 단일 셀을 렌더링 할 때, hESC의 미디어 1 ㎖를 추가하고 15 ML 튜브에 수집합니다. </li><li> 매일 미디어를 변경합니다. 일이에, Y-27632 철회 할 수 있으며, 세포는 hESC의 미디어에서 성장. </li><li> 80 % 합류, 계대하고 깔깔 나머지 동결 - 콜로니 70되면뉴욕 조각. </li></ol>

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</ol>

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리포터 세포주의 생성은, 추적 시각화하고 인간 배아 줄기 유래의 이종 집단으로부터 관심 세포를 분리하기위한 강력한 수단을 제공한다. 그러나, 기존의 상동 재조합을 통해 표적 유전자는 인간의 ESCS 3 매우 비효율적 인 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜에서는 ZFNs 함께 널리 타겟팅 벡터를 이용하여 인간 배아 줄기에서 엑손 PITX3 궤적 중 하나에 RP를 도입하는 비교적 간단한 기술을 설명한다. 우리 손에서 유전자 표적 시스템 (즉, 이전에 6 출판 유사) 제대로 대상 PITX3 궤적을 포함 퓨로 마이신 내성 클론의 19 %로, 효율적입니다. 유전자 타겟팅을 용이하게하기 위해 ZFNs 사용에 제한이 집에서 처음부터 ZFNs 설계에 어려움이있다. 따라서,이 프로토콜에서 우리는 사용자 정의 취득 비용이 많이들 수 있습니다 시판 ZFNs를 디자인했다. &amp; # 사용160; 최근 TALEN 시스템 <s...

현재 배아 줄기 세포 (ESC) 분화 프로토콜은 특히 특정 신경 표현형의 유도와 관련하여, 이종 세포 집단에서 발생. 배양이 원하는 세포 표현형, 다른 신경 세포가 포함되지만 이에 따라, 비 - 신경 세포와 분화되지 않은 세포 유형은 종종 하나 존재한다. 이러한 특성은 ESC의 적용 세포 대체 요법에 사용하기위한 시험 관내 및 질병 모델링 셀 소스를 유도 제한한다. 유전자 리포터 세포주 시각화 추적 관심 셀을 분리하는 수단을 제공하는, 리포터 단백질 (RP)의 발현은 내인성 발현을 재현 한한다. 유전자 코딩 영역의 바로 상류 프로모터의 사용은 유전자 조 기자를 유도하는 데 사용될 수 있지만, 이러한 구조는 내인성 유전자 발현을 제어하는​​ 조절 요소 정확한 부족하다. 대조적으로, 상 동성 재조합이 구비기회는 RP의 고품질 표현을 보장합니다. 과거에, 관심있는 특정 유전자좌에 상 동성 재조합을 위해 설계된 벡터를 표적으로하는 DNA 1,2 전달하는 수단으로 전기 천공을 사용하여 마우스 ESCS (mESCs)에서의 RP를 대상으로 사용되어왔다. 그러나 종래의 상 동성 재조합을 통해 리포터 세포주의 생성 인간 ESCS (인간 배아 줄기) 매우 비효율적이다, 따라서 전용 (3에서 검토)의 경우 소수의 문서화되었다. 징크 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs)로 통칭 사이트 특정 징크 핑거 모티프와 FOK I 클레아의 융합을 포함하는 엔지니어링 키메라 단백질을 사용하여 DNA 이중 가닥 나누기 소정 게놈 유전자좌에 도입 될 수있다. DNA 이중 가닥 브레이크 양측 상 동성을 가진 DNA 벡터가 추가 될 때, 사이트는 게놈 DNA 공여체 서열의 혼입을 허용, 상동 재조합에 의해 복구 될 수있다. 이 기술은 유용 F를 증명했다인간 일차 전지 4,5와 인간 배아 줄기 6,7 모두에서 게놈 편집. 보다 최근의 작업들이 이용했다 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 (TALENs), 공장에서 사용 전사 인자는 부위 - 특이 적 뉴 클레아 제 (9)의 설계에 도움 8 병원체. 다음의 프로토콜에서는 인간 뇌하수체 메오 3 (PITX3)에 대한 궤적 ZFNs 함께 상동 타겟팅 벡터 (6)를 함유 EGFP의 일렉트로 hESC의 리포터 세포주의 생성을 보여준다. 2~3주에 대한 항생제의 선택에 따라, 제대로 통합 된 DNA를 가진 인간 배아 줄기 수동으로 집어 확장 및 PCR을 통해 처음 상영하고,이어서 남부 블로 팅에 의해 검증 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>마우스 배아 섬유아세포(DR4)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6004G</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드 없음(HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1683</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기 - 40 &mu; m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>33 밀리미터 - 0.22 &mu; m 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>rhFGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BioRad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>0.4cm 전기천공법 큐벳</td><td>BioRad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>Human TV-hPITX3-forward targeting construct</td><td>Addgene</td><td>31942</td><td></td></tr><tr><td>ZFN Kit; Human PITX3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CKOZFN1050-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 적격, 열 불활성화, 미국 원산지(FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>펜/연쇄상구균</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 변형 독수리 배지/영양 혼합물 F-12(DMEM/F12)</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 혈청 대체품(KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산&nbsp; (네아)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-메르캅토에탄올</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine 나트륨 염 용액(사르코실) (30%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61747</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e9884?lang=en&amp; region=US">E9884</a></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K solution (20 mg/ml)</td><td>Bioline Australia</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>Expand Long Template PCR System</td><td>Roche Australia</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 L arm gen. F(프라이머): 5' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3'</td><td>GeneWorks, 호주</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 L 암 GFP R(프라이머): 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3'</td><td>GeneWorks, 호주</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperLadder 1 kb&nbsp;</td><td>Bioline Australia</td><td>BIO-33025</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Jomar Bioscience, 호주</td><td>41003</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 배아 줄기 세포에 표적으로 아연 손가락 핵산 분해 효소 향상된 유전자

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

현재 인간 배아 줄기 세포 (ESC) 분화 프로토콜을 하나의 주요 제한은 이종 세포 집단의 생성이다. 이러한 배양 관심의 세포를 포함 할뿐만 아니라 미분화 ESCS 비 신경 유도체 및 다른 신경 세포 아형로 오염된다. 이것은 시험 관내에서 이러한 약물 발견 또는 세포 대체 요법에 대한 시험 관내 모델로서 생체 애플리케이션에서의 사용을 제한한다. 이것을 극복하기 위해, 시각화 트랙과 관심 셀을 분리하는 수단을 제공 리포터 세포주는 설계 될 수있다. 종래의 상 동성 재조합은 매우 비효율적이다 통해 그러나, 인간 배아 줄기 세포에 이것을 달성한다. 이 프로토콜과 함께 뇌하수체의 호 메오 박스 (homeobox) 인간 배아 줄기 세포에서 삼 (PITX3) 궤적 사이트 별 이중 가닥 DNA 나누기를 소개 맞춤 설계된 아연 핑거 뉴 클레아 제를 사용하는 대상에 대해 설명PITX3 - EGFP - 특정 DNA 기증자 벡터입니다. PITX3 리포터 세포주의 발생에 이어, 그 다음 그러한 체외 파킨슨 병 모델링 또는 세포 대체 요법으로 연구에 사용하기 위해 발행 프로토콜을 사용하여 구별 될 수있다.

PITX3와 함께 사용자 정의 설계 PITX3 아연 손가락 쌍의 공동 일렉트로에 따라 - EGFP - 특정 DNA 기증자 벡터, 이후 퓨로 마이신 선택, 양 hESC의 클론은 처음 게놈 PCR 검사 (그림 1)를 통해 검출되었다. 이러한 PCR 5 긍정적 인 클론 '및 3'특정 프로브의 남부 오 하이브리드는 19 %의 효율로, PITX3 궤적 (그림 2)의 한 엑손하는 정확한 타겟팅을 확인했다. 도 3에 도시 된 이미지는 면역 발행 PA6 간질 세포 분화 프로토콜 12,13을 이용하여 분화를 다음 PITX3 프로모터에 의해 구동 EGFP 발현을 보여준다. EGFP의 공동 현지화는 같은 FOXA2 (적색) (그림 3A)과 티로신 수산화 효소 (TH, 빨간색)으로 중뇌 도파민 신경 세포의 마커를 관찰 할 수있다 (...

리포터 세포주 시각화 추적 이종 집단의 관심의 세포를 분리 할 수​​있는 수단을 제공한다. 그러나, 유전자 - 표적 인간 배아 줄기 세포에서 종래의 상동 재조합을 사용하여 매우 비효율적이다. 여기서, 우리는 아연 핑거 클레아 향상된 상동 재조합을 사용하여 EGFP CNS 중뇌 특정 전사 인자 PITX3 궤적 타겟팅 기술한다.

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 이를 위해 맞춤형으로 설계된 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하여 인간 배아 줄기 세포의 관심 위치에 대한 이식 유전자를 효율적으로 표적화하는 것입니다. 인간 배아 줄기 세포 또는 HSC는 전기천공을 위한 충분한 물질을 생성하도록 팽창된 다음 소화되어 단일 세포를 생성합니다. 다음으로, 두 개의 맞춤형 설계 아연 핑거 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA는 선형화된 EGFP 공여체 염기서열과 함께 HSC로 동시 전기천공된 다음 세포를 새로운 마우스 배아, 섬유아세포 또는 MEF에 도금합니다.전기천공된 아연 핑거 뉴클레아제는 세포의 pit X three locus의 첫 번째 엑손으로의 이중 가닥 차단을 도입합니다. 그런 다음 DNA 이중선 가닥 브레이크 부위 서열과 상동성을 가진 표적 팔에 의해 측면에 있는 EFGP 공여체 염기서열이 14일에서 21일 후에 세포 분열 중에 통합됩니다. 개별 HESC 콜로니의 1/3은 matrigel 코팅된 96 웰 플레이트의 각 웰에 계파되고 다른 2/3는 신선한 ME Fs.When을 포함하는 48웰 플레이트의 해당 웰로 옮겨집니다. 96 웰 플레이트의 세포가 공동 유창성에 도달할 때, PCR에 의해 기증자 서열의 통합을 위해 스크리닝됩니다.그런 다음 올바른 적분을 확인하기 위해 서던 블로팅을 수행합니다. 양성 클론이 확인되면 팽창한 다음 추가 사용을 위해 동결합니다. 기존의 상동 재조합과 같은 기존 방법론에 비해 이 기술의 주요 장점은 아연 핑거가 미리 결정된 DNA 이중 가닥 절단을 생성하여 인간 배아 줄기 세포의 유전자 자리를 미리 결정하기 위해 전이유전자를 효율적으로 표적화하는 것을 용이하게 한다는 것입니다.여기서는 인간 줄기세포의 pit X three locus에 트랜스 유전자를 도입하지만, 이 방법은 리포터 세포주를 사용하는 것이 유리한 다른 시스템에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 동반 문헌에 설명된 대로 transfection을 위한 인간 배아 줄기세포 또는 HSC를 확장하여 시작합니다. 군체가 60-70% 합류하면 조직 배양 플레이트를 해부 현미경에 놓습니다.2mil 리터 피펫 끝에 있는 21 게이지 바늘을 사용하여 차별화된 콜로니 또는 콜로니 코어를 제거하여 콜로니를 정리합니다. 다음으로 HESC 콜로니를 세척하여 배지를 흡인합니다. 그런 다음 HBSS 5ml를 넣고 2분 동안 배양합니다.배양 흡인 후, HBSS는 5ml의 아큐테인을 첨가하고 현미경으로 본 바와 같이 집락이 단일 세포가 될 때까지 섭씨 37도, 5%CO2에서 10-20분 동안 배양합니다. 1 밀리리터 피펫을 사용하여 세포를 트라이 합니다. 그런 다음 10ml의 HESC 매체를 추가하고 40미크론 셀 스트레이너를 사용하여 15ml 원추형 튜브에 여과합니다.세포 덩어리를 제거하려면 160배 중력에서 5분 동안 흐름을 원심분리하십시오. 스핀 Resus 후, 신선한 HESC 매체의 5 밀리리터에 세포 펠렛을 현탁시키고 다시 스핀하여 잔류 Accutane 용액을 제거합니다. 10 마이크로몰 Y 2 7 6 3 2를 포함하는 HESC 배지에 세포를 재현탁시키고 최소 30분 동안 섭씨 37도, 5%CO2 배양된 젤라틴으로 사전 코팅된 100mm 접시로 옮깁니다.이 시간 동안 MEF는 젤라틴 코팅 접시에 부착됩니다. 배양 후 1ml 피펫을 사용하여 비부착성 HE SSC를 새로운 15ml 원심분리 튜브에 수집하고 전기천공을 준비하기 위해 혈구 분석기를 사용하여 세포 밀도를 측정합니다. 이 비디오의 이전 섹션에서 준비한 대로 750만 개의 HSC를 새로운 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 160배 중력에서 5분 동안 원심분리기를 사용합니다.스핀 Resus 후 세포 펠릿을 0.8ml의 얼음처럼 차가운 0.22미크론 여과된 HBSS에 현탁시키고 용액을 멸균 0.4cm 전기천공법 수의사에게 전달합니다. 다음으로, 30마이크로그램의 TVH pit X 3개의 전방 표적을 추가합니다. DNA를 구성하고 200마이크로리터 피펫으로 부드럽게 혼합하여 얼음 위에서 3개의 ZFN mRNA를 배양, 해동 및 분취하는 동안 5분 동안 얼음 위에서 배양합니다.해동이 완료되면 7.5마이크로리터를 DNA 세포 혼합물로 옮기고 200마이크로리터 피펫으로 부드럽게 혼합한 전기천공법 Q 수의사로 이동합니다. 전기의 빨간색 버튼을 눌러 세포를 transfection합니다. 그런 다음 200마이크로리터 피펫을 사용하여 Electroporation Q Vet의 내용물을 10mL의 HESC 배지가 들어 있는 15ml 튜브로 옮깁니다.200마이크로리터의 HESC 매체로 Q VET를 두 번 세척하고 동일한 15ml 튜브에 세척 용액을 수집합니다. 용해된 세포에서 DNA와 단백질로 구성된 파편과 같은 점액을 제거합니다. 160배 중력에서 5분 동안 원심분리기.스핀 후 상등액을 흡입하고 세포 펠릿을 부드럽게 두드려 30ml의 Reese 지출을 완화합니다. M-E-F-C-M은 RH FGF 2 및 10 마이크로몰 Y 2 7 6 3 2를 보충하고 MEF를 포함하는 3개의 100mm 접시에 플레이트합니다. 섭씨 37도에서 배양: 5%CO2, 95%O2.2일차에 배지를 매일 교체하고 Y 2 76 32 및 총 셀을 HESC 배지에서만 회수합니다. 2-3일 후, HES CS는 이 시점에서 50-70% confluent가 되어야 합니다. 항생제 선택을 시작합니다.매일 마이신 배지당 신선한 HESC를 추가하여 선택을 유지하십시오. 약 7일 후에는 항생제 내성 MEF를 사용하지 않는 경우 작은 집락이 보일 것입니다. MEF는 제곱센티미터당 네 번째 셀의 10을 1배로 추가하여 보충할 수 있습니다.선택 후 14일에서 21일 사이에 군체가 직경이 약 1mm에 도달했을 때. 3 96의 각 웰에 75마이크로리터의 마트리겔 또는 겔 TRE를 추가하여 확장 및 스크리닝을 위한 플레이트를 준비합니다. 웰 플레이트는 또한 MEF의 3 48 웰 플레이트를 2 회 10에서 평방 센티미터당 4 번째 셀로 준비하고, 두 세트의 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양하고, 다음날 5% CO2를 냅니다.2밀리리터 피펫 끝에 있는 21 게이지 바늘을 사용하여 그리드를 절단하여 HESC 콜로니를 16-25개 조각으로 해부합니다. 다음으로, 96개의 웰 플레이트에서 마트리겔을 흡인하고 R hf, GF 2 및 per mycin이 보충된 CM MEF 배지로 교체합니다. HBSS로 48웰 플레이트의 MEF를 세척한 다음 200마이크로리터 피펫을 사용하여 마이신당 HESC 배지를 추가합니다.절개된 군체의 1/3을 확장을 위해 48웰 플레이트로 부드럽게 옮깁니다. 절개된 집락의 나머지 2/3를 보충된 C-M-M-E-F 배지를 포함하는 해당 90웰 플레이트로 옮깁니다. 이 절차의 가장 어려운 측면은 식민지 조각을 옮기는 것입니다.사전에 전사 및 해부 색상 조각을 연습하는 것이 좋습니다. 항생제가 보충된 매체를 매일 교체하여 두 플레이트를 모두 유지하십시오. 플레이트가 합류하면 96개의 웰 플레이트가 100% 합류할 때까지 확장합니다.뒤집어서 플레이트에서 모든 매체를 제거한 다음 종이 타월에 닦습니다. Resus가 TE 또는 TO 0.1 E.에서 DNA를 현탁한 후 첨부 문서에 설명된 대로 PCR을 위한 게놈 DNA를 준비하고, 첨부 문서에 설명된 대로 확장 긴 템플릿 PCR 시스템을 사용하여 PCR을 수행하고, 전기영동에 의한 양성 클론에 대한 PCR 스크리닝 후 10마이크로리터 PCR 반응당 1-2마이크로리터의 재현탁 DNA를 사용하고 서던 블로팅으로 확인합니다. 양성 클론이 확인되면 하위 배양을 진행하고 나머지 군체 조각을 동결하여 PIT X 3을 엔지니어링합니다.리포터 세포주 hecs. PERY 및 선택에 이어 이 비디오 기사에 설명된 대로 맞춤형으로 설계된 pit X three zinc finger pair 및 pit X three EGFB specific DNA donor vector와 함께 사용하면 여기에서 볼 수 있듯이 게놈 PCR 스크리닝을 통해 양성 HESC 클론이 검출되었습니다. 9,84 염기쌍의 띠로 표시된 바와 같이 수많은 양성 클론이 있었습니다.그런 다음 이러한 PCR 양성 클론의 서던 블롯 혼성화를 5개 및 3개의 특이적 프로브를 사용하여 수행했습니다. 이 그림은 선형화된 타겟팅 벡터의 개략도와 여기에 있는 5개 및 3개의 외부 프로브의 위치를 보여줍니다. 야생형과 표적 대립유전자의 5개 및 3개의 남부 블롯이 표시됩니다.야생형 레인의 단일 밴드는 pit x 3개의 locus 2개의 밴드가 관찰된 전이유전자의 올바른 표적화 후 2개의 동일한 대립유전자를 나타냅니다. 하나는 올바르게 표적화된 대립유전자에 해당하고, 다른 하나는 야생형 대립유전자에 해당합니다. 이 방법론을 완전히 익히면 2-3개월 안에 수행할 수 있습니다.이 동영상을 시청한 후에는 아연 손가락 뉴클레아제를 사용하여 인간 줄기 세포를 표적으로 삼는 방법과 PCR 및 서던 블롯 전략을 사용하여 올바르게 표적화된 cls를 스크리닝하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

유전자 변형의 최근 발전에도 불구하고, 인간 배아 줄기 세포 (HESCs)의 transfection은 변덕 과정 남아있다. 우리의 지식, 인간 유도 만능 줄기 세포를 (iPSCs) transfect하는 체계적이고 효율적인 방법은보고되지 않았습니다. 여기, 우리는 효율적으로 transfect과 인간 iPSCs를 nucleofect하는 강력한 프로토콜을 설명합니다.

인간 유도 만능의 줄기 세포를 Transfecting 및 Nucleofecting

CompoZr 정의 아연 핑거 Nuclease (ZFN) 서비스는 사용자가 정의한 모든 현장에서 모든 유기체 또는 세포 라인의 정밀 게놈 수정을 가능하게합니다. 이 문서 CompoZr 정의 ZFN 서비스의 설계, 제조, 검증 및 구현을위한 프로세스를 설명합니다.

CompoZr 맞춤 아연 손가락 Nucleases와 게놈 편집 (ZFNs)

이 동영상은 인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 아연-핑거 뉴클레아제 기반 게놈 편집 기술을 보여줍니다. hPSC는 잠재적으로 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있기 때문에 이 기술은 환자 맞춤형 방식으로 체외 병리학 및 약리학 연구에 도움이 됩니다.

Zinc Finger Nuclease-based genome editing: double-stranded homology dependent repair mechanism에 의한 인간 만능 줄기세포의 게놈 수정 기법

아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)와 같은 디자이너 클레아는 ​​동종 최종 합류 (NHEJ)과 상동 재조합 (HR) 경로 모두를 트리거하여 마우스의 착상 전 배아의 게놈을 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 진보는 정확한 유전자 변형 생쥐의 신속한 생성을 가능하게한다.

디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

세이프 하버 AAVS1 유전자 자리에서 TALEN 매개 유전자 편집을 통해 인간 iPSC에서 고효율 전이유전자 추가가 가능합니다. 이 프로토콜은 TALEN 및 donor vector 전달을 위해 iPSC를 준비하고, iPSC를 transfection하고, iPSC 클론을 선택 및 분리하여 GFP 유전자의 표적 통합을 달성하여 리포터 라인을 생성하는 절차를 설명합니다.

형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 AAVS1 세이프 하버 (Safe Harbor)에 GFP 유전자 TALEN는 타겟팅

인간 만능 줄기 세포(hPSC)의 게놈 편집을 빠르고 효율적으로 수행할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 EGFP를 발현하고 항생제 내성을 도입하기 위해 AAVS1 세이프 하버 유전자 자리를 편집하여 예시된 바와 같이 hPSC를 유전적으로 조작하는 강력한 실험 절차입니다.

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

여기에서 우리는 이전에 설명한 시스템 개선 한 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)의 AAVS1 궤적에 RMCE에 따라 신속하고 효율적인 유전자 편집 방법을보고합니다. 이 기술을 이용하여, 동질 라인 신속하고 안정적으로 형질 전환 hPSCs 매개 연구를 용이하게 적절한 비교 연구를 위해 생성 될 수있다.

에서 재조합 효소 중재 카세트 교환에 의해 재조합 인간 다 능성 줄기 세포의 신속하고 효율적인 생성<em&gt; AAVS1</em&gt; 로커스

단백질은 종종 다른 세포 기능을 발휘할 수있는 여러 도메인을 포함한다. 유전자 녹아웃 (KO)이 기능의 다양성을 고려하지 않는다. 여기, 우리는 다양한 기능 영역 또는 단백질의 변이의 분자 해부를 허용 KO 배아 줄기 세포에서 재조합 중재 카세트 교환 (RMCE) 기반 구조 - 기능 접근 방식을보고합니다.

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

여기에서는 배아 줄기 세포를 사용하여 유전자 변형 마우스 모델, 특히 대형 DNA 녹인 (KI)을 개발하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용하여 조정되어 기존의 상동 재조합 매개 선형화된 DNA 표적화 방법에 비해 KI 효율이 크게 향상되었습니다.

유전자 조작 마우스 모델 개발을 위한 배아 줄기 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 고효율 유전자 표적화

제시된 방법은 고효율 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템을 사용하여 L2HGDH 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 안정적으로 발현하는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통 H9에서 CRISPR 매개 유전자 knockout의 생성을 설명합니다.

CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

배우세요 아연 손가락 핵산 분해 효소를 이용해 인간 배아 줄기 세포에서 PITX3 유전자 좌위에 효율적으로 표적 유전자를 도입하는 방법을. 이 기술은 중추신경계 발달 연구에 활용됩니다.

인간 배아 줄기 세포에 표적으로 아연 손가락 핵산 분해 효소 향상된 유전자

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