Name: 차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 학습하세요 장 오가노이드에서 레트로바이러스 매개 유전자 전달 기법을 통해 기능적 유전학 연구를 수행하는 방법을. GFP 형광을 이용하여 유전자 발현을 평가하고 안정적인 바이러스 통합을 선별하는 이 체외 모델은 동물 실험 대안으로 유용합니다.

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쿠 BK와 Mustata RC는 의학 연구위원회 (MRC)가 지원하는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 및 앤더슨 - 롤프에서 헨리 데일 원정대에 의해 지원된다. 핑크 J는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 4 년 박사 - 프로그램에 의해 지원됩니다.

다음 프로토콜에 사용 된 모든 마우스는 무균 상태를 유지하고, 모든 절차는 영국 홈 오피스 규정에 따라 수행되었다. 1 준비 <ol><li> 사용에 앞서 미디어 1 시간을 준비 적어도 10 분 사용하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 사전 따뜻한 (표 1 및 재료 목록 자세한 내용 참조). </li></ol> 2 배양 소장 (SI) Organoids 참고 : 달리 명시되지 않는 한, 모든 인큐베이션은 가습 배양기에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 수행됩니다. 살아있는 세포와 접촉 장비 및 시약은 멸균해야합니다. 사전 예열이 지하 매트릭스 (마트 리겔 또는 BME)이 시드 때 퍼지는에서 드랍 방지로 조직 배양 플레이트 것이 중요합니다. 또한, 지하 행렬은 항상 얼음에 보관해야합니다. -20 ° C와 해동에서 보관사용하기 전에 얼음에. <ol><li> 납골당을 분리 <ol><li> 소장의 격리를 위해 그 때, 국가 규칙 및 규정에 따라 마우스를 희생의 뒷면에 동물을 배치하고 70 % 에탄올로 복부를 씻는다. 흉골에 사타구니에서 길이 중간 선 절개를 수행합니다. 먼저, 피부 후 피하 조직을 잘라. 위장 맹장에서 소장을 제거합니다. 십이지장, 소장 및 회장에서 분리 된 납골당은 organoid 문화에 사용할 수 있습니다. </li><li> 칼슘 또는 마그네슘 (PBS0)없이 미리 냉각 된 인산염 완충 식염수와 격리 소장을 씻으십시오. </li><li> 3~5cm 긴 조각으로 조직을 절단하고 길이 방향으로 자르면 가위를 사용합니다. 집게를 사용하여 조직을 확산. </li><li> 커버 슬립을 사용하여 융모를 다 쳤어요. 주의, 너무 많은 힘이 찢어 조직의 원인이됩니다 및 단계는 다음의 지하실의 수율을 감소시킬 것이다. </li><li> 미리 냉각 된 PBS0 날기를 함유 50ml를 튜브에 조직을 이동시켜g 집게. 격렬 통해 조직 조각을 씻고 PBS0을 변경합니다. 2 ~ 3 배를 반복하거나 PBS0 덜 흐린 꺼질 때까지. </li><li> 튜브 롤러에 4 ° C에서 30 분 동안 1 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)와 PBS0의 30 ML을 포함하는 50 ML 튜브에서 조직을 품어. </li><li> 적극적으로 튜브를 흔들 5 mM의 EDTA와 PBS0의 30 ML을 포함하는 또 다른 50 ML 튜브에 조직을 전송합니다. (이전에 조직 포함)을 1 mM의 EDTA 용액 소낭 및 융모의 혼합물을 포함 할 것이다. 종종 융모의 높은 비율로 포함 분획이 organoids의 시드에 적합하지 않다. </li><li> 튜브 롤러에 4 ° C에서 1 시간 동안 조직을 더 품어. </li><li> 적극적으로 튜브를 흔들 깨끗한 50 ML 튜브에서 솔루션을 수집합니다. 지하실의 존재를 확인하고 광학 현미경에 의해 50 μL의 지하실을 계산하여, 예를 들어 수를 추정한다. 50-100 지하실을 구하여 1.5 ML의 t에 전송하는 데 필요한 양을 계산우베. </li><li> 5 분 동안 300 XG에 스핀. 상층 액을 버리고 미리 예열 24 웰 플레이트에 지하 행렬의 50 μL에서 펠렛 종자를 재현 탁. 지하 행렬은 중합 있도록 5 ~ 15 분 동안 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어. </li><li> 500 μL ENR 매체와 오버레이 (표 1 참조). 작은 원형 낭성 모양을 보여줍니다 organoids 파종 후와 구조 신진 다른 2-3일 후 약 24 시간이 표시됩니다. 3 일마다 신선한 ENR 미디어로 변경합니다. </li><li> 항로는 7 일마다 문화를 organoid. </li></ol></li><li> 계대 및 유지 Organoids <ol><li> 매 3 일 통과 한 미디어를 새로 고쳐 organoids 유지 : 루멘은 죽은 세포, 약 7 일마다 가득 채워져 5로 : 3 일. </li><li> 1 ml의 pipetman 팁을 사용하여 매체 지하 매트릭스 돔 휴식 및 1.5 ML 튜브에 잘에서 전송합니다. </li><li> 기계적 피펫을 통해 organoids을 떼어 놓다pproximately 50 배 벌금 (예를 들어, 200 μL) 팁을 사용. </li><li> 5 분 동안 300 XG에 스핀. </li><li> 뜨는을 취소하고 지하 행렬의 150 ~ 250 μL에 펠렛을 재현 탁. 씨앗 24 웰 플레이트 (/ 웰 지하 행렬의 50 μl를) 사전은 따뜻하게. 코팅 한 지하 행렬 상하 팁의 벽을 피펫 파종 전에. 피펫은 천천히 확산 지하 행렬을 방지하기 위해 잘 중간에 거품과 씨앗을 방지 할 수 있습니다. 이 웰의 중심에 지하 행렬의 돔을 얻는 것이 바람직하다. </li><li> 지하 행렬은 중합 있도록 5 ~ 15 분 동안 조직 문화 배양기에서 배양한다. 물론 당 500 μL의 ENR 미디어와 오버레이. </li></ol></li></ol> 3 전 감염 SI Organoids의 치료 NOTE도 1은 형질 도입 절차를 도시한다. <ol><li> ENRWntNic에 환율 ENR은 중간 (표 1 참조) t에 organoids 성장삼일 또는 그들이 낭성 형태를 채택 할 때까지 최소 자신의 매체. 니코틴 아미드 (닉) 문화 효율을 개선하면서 Wnt3a는 줄기와 Paneth 세포의 수를 증가시킨다. </li></ol> 4 바이러스 생산 <ol><li> 플래티넘-E 세포 중 하나 150mm의 요리는 감염에 필요한이. 종자 약 퓨로 마이신 (1 μg / ml) 및 블라스트 (10 μg / ㎖)의 존재 하에서 15 ~ 18 ㎖의 매체 (DMEM + 10 % FBS) 5 × 106 세포. 그들은 70~80%의 포화 상태에 도달 할 때 2 ~ 3 일 후에 세포를 형질. 퓨로 마이신없이 형질 전환 이전에 블라스트 DMEM + 10 % FBS에 매체를 변경합니다. </li><li> OPTI-MEM 1 ㎖를 포함하는 튜브를 분리하는 폴리에틸렌 이민 (PEI)의 레트로 바이러스 DNA 구조의 30 μg과 240 μl를 추가합니다. 혼합하고 5 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 이 솔루션을 수영장과 20 ~ 30 분 동안 실온에서 배양한다. 플래티넘-E 세포의 매체에 완전한 혼합물을 추가하고 조심스럽게 작은지면을 흔들전자는 DNA-PEI 단지의 동등한 분배를 보장합니다. </li><li> 밤새 형질 전환 혼합물과 백금-E 세포를 품어 매체에게 다음과 같은 일을 새로 고칩니다. 이일을 위해 새로운 매체의 세포를 유지합니다. </li><li> , 50 ML 팔콘 튜브 만 매체를 수집 12-16 시간 동안 4 ° C에서 8,000 XG에서 0.45 μm의 필터와 원심 분리기를 통해 전달합니다. 상등액을 버리고 전달 매체의 250 μL에 펠렛을 재현 탁 (표 1 참조). </li></ol> 5 Organoid 조각 준비 <ol><li> 한 감염은 24 웰 플레이트에서 잘 하나가 필요합니다. 1 ml의 pipetman 팁을 사용하여 매체 지하 매트릭스 돔 휴식 및 1.5 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 미세한 볼륨 팁 (예를 들어, 200 μL 팁) 피펫 (30-50x)를 통해 organoids를 기계적으로 방해하기 위해 사용합니다. 이 솔루션은 흐린 될 것입니다 더 전체 organoids는 볼 수 없습니다. </li><li> 5 분 동안 실온에서 원심 분리, 900 XG<html> . </li><li> 상층 액을 제거하고 세포 배양 등급 재조합 단백질 분해 효소 (예를 들어, TrypLE)의 500 μL에 펠렛을 재현 탁. 5 분 동안 37 ° C에서 품어. 배양 한 다음 프래그먼트 당 세포의 수를 세고, 광 현미경을 사용하여 organoid 단편의 크기를 확인한다. 5-10 세포를 포함하는 단편은 이상적이다. 단편의 대부분은 세포의 더 높은 번호를 포함하는 경우 배양 시간은 시간에 2 분으로 증가 될 수있다. </li><li> ENR 배지 500 μl를 첨가하여 분해 처리를 종료한다. </li><li> 실온에서 원심 분리기, 5 분 동안 900 XG. 상층 액을 제거하고 얼음 또는 4 ° C에서의 펠렛을 유지합니다. </li></ol> 6 레트로 바이러스 형질 도입 <ol><li> 48 웰 플레이트 잘 하나에서 (4.5부터) 레트로 바이러스 솔루션의 250 μL와 organoid 조각을 결합합니다. 1 ㎖의 pipetman 팁을 사용하여 천천히 피펫으로 가볍게 섞는다. </li><li> 파라 필름과 판을 밀봉합니다. </li></ol>전자 &quot;&gt; 7. Spinoculation 및 도금 <ol><li> 1 시간 동안, 32 ° C, 600 XG에서 접시를 원심 분리기. 조심스럽게 파라 필름을 제거하고 6 시간 동안 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어. </li></ol> 감염 Organoid 조각의 8 시드 <ol><li> 5 분 동안 900 XG에 1.5 ML 튜브, 스핀에 우물에서 감염된 organoid 조각 및 전달 매체를 전송합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 멋진 5 분 동안 얼음에 펠렛을 포함하는 튜브를 넣어. 지하 매트릭스의 100 μl를 추가하고 위아래로 천천히 피펫 팅하여 펠렛을 재현 탁. </li><li> 새로운 24 웰 플레이트에 50 ㎕의 &#39;혼합 -cell 지하 매트릭스&#39;의 종자 삭제합니다. 지하 매트릭스 응고 될 때까지 5 ~ 15 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 우물에 폴리 브렌없이 전달 매체를 추가하고 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어. 2-3 일마다 미디어를 변경합니다. </li></ol> 9 선택 <ol><li> 시작 자체미디어에 퓨로 마이신 (1 μg / ml)에 추가하여 2~3일 후 성귀. </li><li> 조각이 형성 organoids 퓨로 마이신 (1 μg / ml)로 보충 ENR 매체와 전달 매체를 대체하기 시작합니다. </li></ol> (10) 후 감염 SI Organoids의 치료 <ol><li> 문화에 따라 &quot;과 Passaging 및 organoids을 유지&quot;프로토콜 (2.2.1) organoids 형질. 1~2주 후 SI의 organoids는 신진 구조를 되 찾을 것입니다. </li><li> 1 μM의 농도로 작동 hydroxytamoxifen 4-(4-OHT)를 추가하여 miRNA의 또는 cDNA의 발현을 유도 신진 구조물의 모양에 따라. 이 단계가 Addgene (pMSCV -에 loxP-DsRed의 -에 loxP-eGFP는 - 순수하지 않아-WPRE (32702), pMSCV -에 loxP-DsRed의 -에 loxP-3xHA - 순수하지 않아-WPRE (32,703), 그리고 pMSCV에서 레트로 바이러스 벡터를 사용하는 경우에만 유효합니다 차 돌려 - 순수하지 않아-DsRed의-GFP-miRNA가 (32704)) 먹어 치운다-ERT2을 표현 organoids. </li></ol> 감염 및 EXPR의 11 확인관심의 유전자의 ession / 억제 <ol><li> Addgene (32702, 32703 및 32704)에서 레트로 바이러스 벡터를 사용하는 경우 전달 효율은 DsRed의 발현의 관찰에 의해 확인 될 수있다. 쿠 외 4에 예시 된 바와 같이 또한, 관심의 유전자의 발현 또는 억제는 GFP 또는 (유전자 녹다운을위한) 3xHA의 (유전자 과발현) 에피토프 및 qPCR에를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 확인 될 수있다. </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+and+liver+physiology%22%5BJournal%5D)">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871(2013).</li>
<li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다. 저자는 이해 상충을 선언하지 않았습니다.

<html> 높은 전달 효율 특정 부분이 중요한 달성하기 위해. 그들은 원형 낭성 형상을 채택 할 때까지 하나 ENRWntNic 매체와 organoids의 전처리이다. 이것은 줄기 세포의 수와 트랜스의 안정한 통합을 얻을뿐만 아니라 전달 과정의 전반 SI organoids의 생존율을 증가시켜 기회를 증가시킨다. 또 다른 매개 변수는 spinoculation 다음 배양 시간이다. 각각 가난한 전달 효율과 organoids의 가난한 생존, 너무 짧거나 너무 긴 배양 결과. 그것은 현저하게 형질 organoids의 비율을 증가시킨다하더라도 spinoculation 단계는 필수적인 것은 아니다. 마지막으로, 높은 역가의 바이러스가 성공적으로 전달하기위한 열쇠입니다. 이것은 패키징 세포주 및 바이러스의 종류에 의존한다. 백금 E 세포주 및 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV)의 조합은, organoids의 전달에 충분한 높은 역가를 생성하는 것으로 확인되었다. ve_content &quot;&gt; 다음은 성공적인 전달을 달성하는 데 도움이 될 수있는 문제 해결에 대한 도움말입니다. 포장 세포주의 형질이 좋지 않을 경우 첫째, 세포의 배양이 70 ~ 80 % 사이와의 배양 시간 있다는 것을 확인 풀링 PEI-DNA 혼합물을 20 ~ 30 분 사이입니다. 전달하는 동안 organoids의 생존은 매우 단편 크기에 따라 달라집니다. 너무 오래 트립신 미만 3 세포를 구성하는 조각의 대부분을 발생시켜 organoid 생존을 감소시킨다. 또 다른 요인은 Wnt에 조정 배지의 활성은, 활성이 너무 낮은 생존율을 증가시킬 수 5 μM의 작동 농도 CHIR99021의 첨가를 통해 증폭하는 경우. CHIR99021 증가 Wnt 신호의 결과로, GSK3 억제. 또한, Y-27362, 어느 방지 organoids 전에 전달에 단편 (1-10 세포를 포함)로 파쇄되기 때문에 anoikis는 organoid 생존 성을 향상시키기 위해 전달 매체에 첨가된다.로서는(60)는, 위에서 언급 한, spinoculation 후 배양 시간이 6 시간을 초과하지 않아야합니다. 나쁨 전달이 관찰되면 마지막으로 바이러스 역가 및 레트로 바이러스 벡터에 대한 인서트의 크기 제한에 영향을 미치는 전술 한 인자가 고려되어야한다. 최저의 효율성의 miRNA에 크게 의존한다. 효율이 표적 유전자의 miRNA와의 조합에 따라 변화하기 때문에 그것이 가장 잘 작동 자들을 식별하는 효율 화면을 수행 가치가있다. 이 기술은 organoid 시스템의 상피 현상으로 제한됩니다. 향후에는 각각 면역계로부터 유래 성분과 병원균 또는 재구성의 공존 배양을 통해 감염성 또는 면역 - 매개 질환을 연구 할 수있을 것이다. 또한, 레트로 바이러스는 단지 상대적으로 작은 크기의 삽입을 수행 할 수있다. 결과적으로, 자연적으로 발생하는 규제 영역은 제외해야하므로 형질 전환 유전자의 발현의 모방 할 수 없습니다내생 유전자. 전술 한 바와 같이, 최저 효율 및 표적 유전자의 miRNA에 의존한다. 적합한 최저 효율의 miRNA가 전혀 발견되지 않는 경우는 해당 특정 표적 유전자에 대한 기술의 사용을 제한 할 수있다. 이론적으로, organoids 세포주에 사용되는 모든 표준화 된 속임수 기술과 호환됩니다. 레트로 바이러스 전달 4를보고 할 수있는 첫 번째 방법이고, 최근 BAC (박테리아 인조 염색체) -transgenesis 5 사용할 수있게되었다. 2~3주의 총 발생 시간, 패키징 세포주에 바이러스 플라스미드의 형질 감염 후에, 그 트랜스 제닉 (Tg)가 마우스의 세대보다 훨씬 빠르다. 줄기 세포뿐만 아니라 소장 상피 세포 분화의 모든 계통을 함유하면서 생체 토굴-융모 아키텍처를 유지함으로써, organoid 배양 시스템은 TG 동물과 이전에 사용 된 세포 배양 물 사이의 간극에 다리. <p클래스 = &quot;jove_content은&quot;&gt; 여기에 설명 된 프로토콜은 이득이를 통해 시험관 내에서 내배엽 상피 세포의 표현형 분석을 수행하는 방법 및 기능 연구의 loss-을 제공합니다. 이 TG 마우스의 최소한의 필요와 성체 줄기 세포 생물학의 생리 학적 관련 문의 사항에 답변을 제공하는 것이 가능합니다. 예를 들어, 조건부 녹아웃 마우스의 생성은 산기 치사 6 신생아 돌연변이로부터 유도 organoids를 사용함으로써 회피 될 수있다. 또한, 기술은 추가적인 최저의 7,8을 수행함으로써 paralogues의 역할을 연구하기 위해 이전에 설정된 녹아웃 마우스로부터 유도 organoids에 적용될 수있다. 소장 organoids의 설립에 따라, 원래 문화 프로토콜의 적응은 췌장, 간, 대장과 위 상피 9-11의 배양을 허용했다. 또한, 인간의 장내 organoids 종양 organoids는 기본 아덴, 정상적인 인간 생체 검사로부터 유도 된OMA 및 대장 암은 10 생검. 바이러스 감염 프로토콜은 쉽게 organoids 이러한 유형의 확장과 인간 유래 조직에서 기능 연구를 수행하는 전례없는 방법을 제공 할 수 있습니다. 종합적으로, 소장 organoids의 레트로 바이러스 전달은 줄기 세포 유지, 분화 및 세포 운명 결정뿐만 아니라, 세포 신호 및 세포 - 세포 상호 작용을 조사하는 유용한 자원이다.

하이 스루풋 기능 유전학 전류 기초 과학 및 의학 향상시키기 위해, 우리 몸의 생물학적 이해를 높일 필요가있다. 마우스 유전학은 시간 소모적이고 비용이 모두 있지만, 생체 내에서 유전자의 기능을 조사하는 금 표준이었다. 저렴하면서 다른 일반적인 선택되는 세포주는, 높은 처리 용량을 가지고있다. 그러나, 이들이 생체 내에서 본 적절한 미세 환경함으로써 생리적 반응을 재현하는 그들의 무능력에 의해 방해된다. 따라서, 비용 / 시간 효율적인 처리량 분석 동안 허용하기 쉬운 손잡이 모델 시스템에 대한 명백한 필요성이 존재 생체 내 유전자 전이 온도 (Tg) 마우스 실험에서 관찰 된 생리적 반응을 모방. 내배엽 상피를 들어 하나의 모델 시스템은 2009 년 1 나타났다. 지식 Lgr5 양성 장 줄기 세포로부터 얻은 발견 하였다 중에서도줄기 세포의 유지 보수에 필요한 세포 외 기질과 성장 요인에 대응하는 틈새 시장에 대한 정보를 제공합니다. 그것은 또한 organoids 2로 알려진 &#39;미니 용기&#39;를 구축 할 가능하게되었다이 정보를 활용. 최근 organoids가 &#39;enteroids&#39;라고합니다 체외 문화에 대한 공감대 명명법은 세를 제안했다. 세포주와 마찬가지로, organoids는 끊임없이 확장 및 리간드 및 억제제로 처리하기 쉽다. 그러나, 대신에 이차원 인의 이들은 입체 자기 조직화 토굴-융모 조직을 유지하는 구조뿐만 아니라 줄기 세포 및 소장 (SI)의 분화 된 세포 계통이다. Organoids는 내강 영역을 둘러싸는 상피 세포의 단일 층으로 구성. 신진 돌출 구조는 줄기 세포 구획을 포함하는 작은 창자 지하실에 대응한다. 그들은 MI로서 신진 구조의 선단부터 출발 전구 세포는 분화말기 분화 세포가 루멘으로 발산하는 상피 향해 쇠 격자. 세포주에 비해,이 시스템은 생체 더 밀접 정상적인 생리학을 되풀이하기 때문에 소장 상피위한 유망한 모델 시스템이다. 레트로 바이러스 형질 도입이 동영상 프로토콜에서는이 신규 organoid 배양 시스템에서 생체 외 유전자 기능 연구를 가능하게하는 방법을 제시한다. 우리는 단계별 방식으로 문화를 organoid 설명함으로써 시작하고, 전달 절차에 의해 다음에 레트로 바이러스의 생성을 보여줌으로써 계속합니다. 마지막으로, 문제 해결을위한 추가 조언 섹션이있다. 이 기술의 장점은 장내 상피 항상성, 세포 운명 결정 및 세포 - 세포 상호 작용을 연구하는 라이브 영상 또는 약물 스크리닝과 결합 될 수 있다는 것이다. 때문에 자신의 간단한 구조와 빠른 회전율로, organoids 이상적인 모델들 대표성체 줄기 세포 생물학 연구를위한 ystem. 또한 레트로 바이러스 전달은 미리 설정된 트랜스 제닉 마우스뿐만 아니라 인간 환자로부터 유도 된 시료 organoids에 적용될 수있다. 에 노크 노크 아웃 방식은 인간에게 확장 할 수 없기 때문에, 인간의 SI의 organoids는 매력적인 대안을 구성한다. 요약하면, 레트로 바이러스 전달을 통해 유전자 조작은 인간 유래의 조직에서 연구에 새로운 길을 여는 동안하여 마우스 유전학과 세포 라인을 보완, 쥐 또는 인간의 조직 샘플에서 파생 된 소장 organoids의 표현형 분석을 할 수 있습니다. 레트로 바이러스 형질 도입은 이득이 가능하고 기능 상실 연구 organoid 배양 시스템 (4)에서 수행된다. 이것은 세 루피 (감소, 정제 및 교체)에 따른하면서 유전자 기능, 성체 줄기 세포 생물학 및 질병을 조사하는 귀중한 자원한다.

<table><tbody><tr><td>고급 DMEM/F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12634-034</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>n-아세틸시스테인 500 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>마우스 EGF 500 &micro; g/ml</td><td>Invitrogen Biosource</td><td>PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Noggin 100 &마이크로; g/ml</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin 컨디셔닝 배지</td><td></td><td></td><td>컨디셔닝 배지는 HEK293 세포에서 생성되며, 자세한 내용은 Sato and Clevers 2013을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>Wnt 컨디셔닝 배지</td><td></td><td></td><td>: 컨디셔닝된 배지는 L 세포에서 생성되며, 자세한 내용은 Sato and Clevers 2013을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>니코틴아미드 1 M</td><td>시그마</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 10 &마이크로; M</td><td>시그마</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>폴리브레네(8 &마이크로; g/ml)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>표준 BD Matrigel 매트릭스</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Basement Matrix 추출물(Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02) AMSBIO에서 공급하는 대안으로 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Greiner Bio One</td><td>662960</td><td></td></tr><tr><td>48웰 플레이트</td><td>Greiner Bio One</td><td>677980</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma</td><td>A3734-1MG</td><td></td></tr><tr><td>백금-E 세포</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113902</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민(PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr></tbody></table>

차 소장 organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5 양성 줄기 세포가 중요한 성장을 보충 할 수있는 것은 EGF, 개가 밀, 문화가 체외에서 차 3D 상피 구조를 끊임없이 확장 우리를 할 수 있습니다 R-Spondin을 요인. 두도 organoids라는이 &#39;미니 용기&#39;의 구조 및 생리 학적 특성은 밀접하게 자신의 생체와 비슷합니다. 이것은 그들이 소장 상피 세포에 대한 매력적인 모델 시스템 있습니다. 레트로 바이러스 형질 도입을 이용하여 유전자의 기능은 현재 조건부 유전자 과발현 또는 최저 의해 수행 될 수있다. 이 동영상은 organoid 문화의 절차, 레트로 바이러스의 생성, 시험 관내에서 소장 상피 세포의 표현형 분석을 지원하기 위해 organoids의 레트로 바이러스 전달을 보여줍니다. 레트로 바이러스 매개 유전자 발현과 함께이 신규의 Organotypic 모델 시스템 costl의 필요없이 시험 관내에서 유전자 기능을 신속하게 분석하기위한 유용한 도구를 제공한다형질 전환 동물에 대한 y를 시간이 많이 소요되는 세대.

Organoids 중앙 루멘 인해 죽은 세포 (그림 2)의 존재에 어두운 때 분할 할 준비가 된 것입니다. 전처리 organoids 2 ~ 3 일 후에 라운드 낭성 형태 (그림 3)을 채택해야한다. 이것은 안정한 통합을 얻는 가능성을 향상 줄기 세포의 수를 증가시킨다. 바이러스 펠릿의 크기로 인해 펠렛 크기로 세포 파편의 변화에​​ 기여, 바이러스 상청액 다음 원심 분리 가능성을 변할 수있다. 전달 효율에 명확한 상관 관계가 관찰되지 않았다. 사람 안정적인 통합이 남아하면서 선택 과정 동안 비 형질 organoids는 죽을 것이다. MSCV-eGFP는 레트로 바이러스에서 형광 단백질 (그림 4) 전달 다음 2~3일 내 낭성 형태를 가지고 생존 organoids에서 유래 세포에서 관찰 할 수있다. <img alt> = "그림 1"FO : 콘텐츠 너비 = "6 인치"SRC = "/ 파일 / ftp_upload / 51,765 / 51765fig1highres.jpg"너비 = "600"/&gt; 그림 1 레트로 바이러스 전달 절차의 개략도. 이전 감염 organoids에 대한 사전 처리가 낭성 구조 (1 단계)을 채택 할 때까지 ENRWntNic을 사용하고 있습니다. 백금-E 세포 패키징 세포주로 사용하고, 그들은 70-80%의 포화 상태에 도달 할 때까지 배양된다. 그 후 그것들은 PEI를 사용하여 레트로 바이러스 구축물로 형질 감염된다. 바이러스는 이일 이상 (2 단계) 수확. Organoids 1-10 세포 (단계 3)를 포함하는 단편을 수득 트립신 처리하고, (단계 4)를 감염. 안정적인 통합 (7 단계)를 수행 할 수 있습니다와 spinoculation를 수행하면 감염 효율 (5 단계) 증가, 감염된 organoid 조각이 긍정적 인 클론 (6 단계) 2 ~ 3 일 후에 선택을 씨앗을 품고있다. 1765fig2highres.jpg "폭 ="500 "/&gt; 그림 문화 4-6 일 후에 organoids의 2 대표 이미지. 루멘은 죽은 세포로 가득 어두워 표시하고있다. 이 단계에서 Organoids는 계대 할 준비가 된 것입니다. <img alt="표면 장력을 입증하는 정적 평형 연구 중 액체 내 기포의 현미경 이미지." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="그림 3"> 3~4일에 대한 ENRWntNic 미디어에서 배양 소장 organoids의 그림 3 대표 이미지. organoids는 낭성 형태를 채택한다. <img alt="세포 형태 이미지, 명시야 및 형광 현미경, 세포 구조 분석." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="그림 4"> 소장 organoids의 그림 4 대표 이미지 (a)는 바이러스 성 유전자 발현 (B, eGFP는)을 보여 그. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> ADVAnced DMEM / F12 + + + </td></tr><tr><td colspan="2"> 사주 4 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> 고급 DMEM / F12 </td><td> 500 ml의 </td></tr><tr><td> Glutamax의 100 배 </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 헤 페스 한 M </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 항생제의 100 배 </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic 매체 (20 ㎖ 용) </td></tr><tr><td colspan="2"> 이주 4 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> 고급 DMEM / F12 + + + </td><td> 7.2 ml의 </td></tr><tr><td> B27 보충제 (50 배) </td><td> 400 μL </td></tr><tr><td> N2 영양 (100 배) </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td> N-아세틸 시스테인 (500 밀리미터) </td><td> 50 μL </td></tr><tr><td> 마우스 EGF (500 μg / ㎖) </td><td> 2 μL </td></tr><tr><td> 마우스 개가 밀 (100 μg / mL)에서 세척 하였다 </td><td> 20 μL </td></tr><tr><td> R-Spondin의 conditioned 매체 </td><td> 2 ML </td></tr><tr><td> Wnt3a 조정 배지 </td><td> 10 ML </td></tr><tr><td> 니코틴 아미드 (1 M) </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td colspan="2"> 전달 매체 (20 ㎖ 용) </td></tr><tr><td colspan="2"> 신선한 준비 </td></tr><tr><td> ENRWntNic 매체 </td><td> 20 ML </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 μM) </td><td> 20 μL </td></tr><tr><td> 폴리 브렌 (8 μg / ㎖) </td><td> 20 μL </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR 매체 (20 ㎖ 용) </td></tr><tr><td colspan="2"> 사주 4 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> 고급 DMEM / F12 + + + </td><td> 17.4 ML </td></tr><tr><td> B27 보충제 (50 배) </td><td> 400 μL </td></tr><tr><td> N2 영양 (100 배) </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td> N-아세틸 시스테인 (500 밀리미터) </td><td> 50 μL </td></tr><tr><td> 마우스 EGF (500 μg / ㎖) </td><td> 2 μL </td></tr><tr><td> 마우스 개가 밀 (100 μg / mL)에서 세척 하였다 </td><td> 20 μL </td></tr><tr><td> R-Spondin 조정 배지 </td><td> 2 ML </td></tr><tr><td colspan="2"> 플래티넘-E 세포에 대한 미디어 (500 ml의 경우) </td></tr><tr><td colspan="2"> 12 주 4 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449.45 ML </td></tr><tr><td> 태아 혈청 (FBS) </td><td> 50 ML </td></tr><tr><td> 퓨로 마이신 (1 μg / ㎖) </td><td> 50 μL </td></tr><tr><td> 블라스트 (10 μg / ㎖) </td><td> 500 μL </td></tr></tbody></table> 플래티넘-E 세포에 대한 고급 DMEM / F12 + + +, ENRWntNic 매체, 전달 매체, ENR 매체와 매체에 대한 표 1 미디어 조성.

이 프로토콜은 기본 Lgr5-positve organoid 문화와 레트로 바이러스 전달의 후속 성능을 설명합니다. 이 시험관의 Organotypic에 소설에서 수행 할 기능 연구를 전달 유전자의 Cre 호텔 유도 과발현 또는 최저을 가능하게하고 있습니다 모델 시스템.

차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

이 절차의 전반적인 목표는 오가노이드에서 기능적 유전 연구를 수행하는 방법을 입증하는 것입니다. 이는 먼저 WINT 3 A 함유 배지로 오가노이드를 전처리하여 낭포 모양을 채택하고 줄기 세포 수를 증가시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 바이러스를 생성하고 오가노이드 단편을 형질도입하여 접종합니다.마지막 단계에서는 형질주입된 오가노이드를 안착시킨 다음 안정적인 바이러스 통합을 위해 선택합니다. 궁극적으로, 관심 유전자의 발현 또는 억제는 GFP 형광으로 평가할 수 있습니다. 마우스와 같은 기존 AL 모델에 비해 이 기술을 사용하는 주요 이점은 이 기술을 사용하면 장 오가노이드를 사용하여 기능적 유전 실험을 in vitro에서 수행할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Amanda Andro입니다.소낭선을 분리하려면 미리 냉각된 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS로 소장을 세척하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 조직을 3-5cm 길이의 조각으로 자르고 가위로 조각을 세로로 엽니다. 겸자를 사용하여 조직을 벌리고 커버 슬립을 사용하여 과도한 융모를 긁어낸 다음 조각을 식힌 PBS가 들어 있는 50ml 튜브로 옮깁니다.조직 조각을 격렬하게 흔들어 2-3회 세척하고 마지막 세척 후 PBS가 덜 흐려질 때까지 PBS를 변경하고 튜브 롤러에서 섭씨 4도에서 1밀리몰 EDTA가 보충된 30밀리리터의 PBS가 들어 있는 50ml 튜브에서 조직을 배양합니다. 30분 후 튜브를 다시 흔들고 5밀리몰 EDTA가 보충된 30밀리리터의 PBS가 들어 있는 다른 50밀리리터 튜브로 조직을 옮깁니다. 섭씨 4도에서 한 시간 동안 배양 한 후 튜브 롤러에서 격렬하게 배양합니다.튜브를 다시 흔들고 용액을 새 50ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 50 마이크로 리터의 crypt 수를 세십시오. 50-100 crypts를 포함하는 부피를 계산하여 1.5 millilit 튜브로 옮깁니다.다음으로, crypts를 회전시키고 펠릿을 50 마이크로 리터의 지하 매트릭스에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 crypt solution을 Prewarm 24 Well 플레이트에 파종하고 조직 배양 incubator에서 5-15분 동안 플레이트를 배양합니다. 기저막이 중합되면 세포 배양 인큐베이터에서 500마이크로리터의 ENR 배지로 매트릭스를 배양합니다.착석 후 약 24시간 후 3일마다 배지를 새로 고치면 오가노이드는 작은 둥근 낭포 모양을 나타냅니다. 또 다른 2-3일 후, 오가노이드가 150mm 접시에 있는 6개의 백금 E 세포에 약 5배의 10배의 낭포 형태 Seed를 채택하는 동안 싹이 트는 구조가 보이게 되며, 15-18ml의 배지는 pur, mycin 및 blastin이 보충됩니다. 2-3일 후, 배지를 항생제가 없는 배지로 변경하고 30마이크로그램의 레트로바이러스 DNA 구조체와 240마이크로리터의 파이를 각각 1밀리리터의 최적을 포함하는 두 개의 개별 튜브에 추가합니다.다음으로, 튜브를 혼합하고 실온에서 배양합니다. 5분 후 두 용액을 풀로 넣고 실온에서 20-30분 더 배양합니다. 완전한 혼합물을 백금 E 세포에 첨가하고 플레이트를 조심스럽게 흔들어 DNA PI 복합체가 균등하게 분포되도록 합니다.하룻밤 배양 후 배지를 새로 고치고 세포를 다시 배양합니다. 이틀 후 50ml Falcon 튜브에 매체만 수집하고 0.45미크론 필터를 통해 걸러냅니다. 다음 8, 000 시간 G 및 4 섭씨 온도에 12 16 시간 동안 해결책을 분리기를 설치하고, 형질 주입 매체의 250 마이크로리터에 있는 펠릿을 refuse.레트로바이러스 형질도입을 위해 오가노이드 단편을 준비하기 위해 먼저 200마이크로리터 피펫 팁으로 배양액을 30-50회 피펫팅하여 오가노이드를 기계적으로 파괴하면 용액이 흐려지고 전체 오가노이드가 검출되지 않습니다. 단편을 회전시킨 후 펠릿을 500마이크로리터의 세포 배양에서 배양하고 섭씨 37도에서 5분 동안 재조합 프로테아제 등급을 매깁니다. 배양 후 광학 현미경을 사용하여 오가노이드 단편의 크기를 평가하고 단편당 세포 수를 계산합니다.그런 다음 500마이크로리터의 ENR 배지를 첨가하여 해리 과정을 종료하고 세포 단편을 스핀다운합니다. 상등액을 버린 후 펠릿을 얼음 위에 놓고 조각을 48 개의 한 웰에 뿌립니다. 이전에 준비된 레트로바이러스 용액 250마이크로리터에 웰 플레이트를 넣습니다.세포 용액을 1ml 피펫 팁으로 부드럽게 혼합한 다음 param으로 플레이트를 밀봉하여 접종 1차 원심분리를 수행합니다. 600 시간 G 및 32 섭씨 온도에서 1 시간 동안 48 웰 플레이트. 그런 다음 파라 필름을 조심스럽게 제거하고 세포 배양 인큐베이터에서 6시간 동안 플레이트를 더 배양합니다.배양 후 감염된 조각을 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 오가노이드 조각을 다시 회전시키고 펠릿을 얼음에서 5분 동안 냉각합니다. 펠릿이 냉각되면 100마이크로리터의 지하 매트릭스를 튜브에 추가하고 펠릿을 위아래로 천천히 피펫팅하여 다시 현탁시킵니다.그런 다음 24웰 플레이트의 각 웰에 단편 매트릭스 현탁액 50마이크로리터 방울을 시딩하고 기저 매트릭스가 응고된 후 5-15분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하고 폴리 브레인 없이 형질도입 매체로 오가노이드를 배양합니다. 2-3일 후 배지가 포함된 pur mycin을 웰에 추가하여 선택을 시작합니다. 단편이 오가노이드를 형성하기 시작하면 형질도입 배지를 보충된 ENR 배지로 교체합니다.puram을 사용하면 Mycin 오가노이드는 죽은 세포의 존재로 인해 중앙 내강이 어두워질 때 분리할 준비가 되어 있습니다. Wint 3 배지 전처리 2-3일 후, 오가노이드는 낭포 형태학을 중심으로 채택하여 줄기세포의 수를 늘리고 줄기세포에서 안정적인 통합을 얻을 가능성을 높여야 합니다. 이 이미지에서 M-S-C-V-E-G-F-P 레트로바이러스의 형광 단백질 발현은 형질도입 후 2-3일 이내에 예상되는 낭성 형태를 획득한 생존 오가노이드에서 유래한 세포에서 관찰할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 오가노이드 단편의 크기를 확인하는 것이 중요한데, 이는 생존율에 큰 영향을 미치기 때문입니다. 이 동영상을 시청한 후에는 오가노이드의 레트로바이러스 형질도입을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

렌티바이러스 벡터를 이용한 마우스 장 오가노이드로의 유전자 전달

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

기본 생쥐 대장 종양 organoid을 설정하는 간단한 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 대장 종양 세포가 생존하고 상피 정상적인 결장하지 않는 반면, 제한된 성장 인자를 포함하는 미디어 organoids로 성장하는 기능을 사용합니다.

기본 마우스 대장 종양의 체외 Organoid의 문화

이 비디오 프로토콜에서는 1차 장 상피의 오가노이드에서 렌티바이러스 형질전환과 정량적 RT-PCR, RNA-마이크로어레이 및 면역조직화학에 의한 이러한 배양의 처리 및 다운스트림 분석에 대해 단계별로 설명합니다.

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

여기서, 수확 유지하고, 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 및 리스테리아 마우스 소장 organoids을 치료하는 프로토콜뿐만 아니라, 유전자 발현 및 단백질 적절한 정규화 기술에 중점으로 설명한다.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em마우스 소장 Organoids의&gt; 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

우리는 단계별 지침을 설명합니다 : 1) 렌티 또는 레트로 바이러스 변환을위한 자기 나노 입자를 사용하여 장 오르가노이드를 효율적으로 엔지니어링하고, 2) 엔지니어링 된 오르가노이드에서 냉동 섹션을 생성합니다. 이 접근은 다운스트림 효력의 조사를 위한 organoids에 있는 유전자 발현을 능등하게 바꾸는 강력한 공구를 제공합니다.

냉동 절편을 위한 자기 나노입자 전착 바이러스성 벡터를 사용하여 1 차적인 마우스 장 오르가노이드의 유전 공학

여기서는 장 적정별 상호 작용을 모델링할 수 있는 두 가지 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 유래 장 단층층 및 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양은 발광 및 바생측 모두에서 접근할 수 있는 잘 차별화된 상피생성을 용이하게 하는 반면, 극성 반전장 기관가의 측면은 그들의 정면을 노출시키고 높은 처리량 분석에 적합합니다.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

이 프로토콜은 단세포 RNA 염기서열분석(scRNAseq) 기술을 사용하여 단세포 수준에서 숙주/병원균 상호 작용을 특성화하기 위해 자신의 apical 또는 바식측에서 인간 장 기관가를 감염시키는 방법을 설명합니다.

생체 안전 수준 3 (BSL-3) 조건 하에서 병원체 감염 및 단일 세포 염기서열분석에 대한 위장 오르가노이드 적응

이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 뮤린 소장 라미나 프로프리아로부터 유형 1 선천성 림프성 세포를 분리하고, 장 상피 세포와 유형 1 선천성 림프 세포 간의 양방향 상호 작용을 연구하기 위해 두 세포 유형 간의 3 차원 (3D) 공동 배양을 수립하기위한 자세한 지침을 제공합니다.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

여기서는 쥐의 장 오가노이드를 생성하고 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 쥐는 종종 선호되는 전임상 모델이며, 강력한 장 오가노이드 시스템은 in vivo 연구에 수반되는 in vitro 시스템의 필요성을 충족시킵니다.

쥐 장 오가노이드의 생성과 조작

이 프로토콜은 바이러스에 감염된 인간 장 오가노이드에서 칼슘 이미징을 수행하기 위한 접근 방식을 설명하고 분석에 대한 접근 방식을 제공합니다.

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

학습하세요 장 오가노이드에서 레트로바이러스 매개 유전자 전달 기법을 통해 기능적 유전학 연구를 수행하는 방법을. GFP 형광을 이용하여 유전자 발현을 평가하고 안정적인 바이러스 통합을 선별하는 이 체외 모델은 동물 실험 대안으로 유용합니다.

차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜

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