Name: 낮은 풍부 단백질을 검출하기위한 플라즈마 또는 소변의 하이드로 겔 나노 입자 수확 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 배우세요 생물학적 유체에서 저분자량 단백질 바이오마커를 수확하고 농축하는 하이드로겔 나노입자 기법을. 이 방법은 기존에 검출 불가능했던 저풍부 단백질을 포착하여 진단 민감도를 획기적으로 향상시킵니다.

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친절하게 그림 5의 데이터 수집 및 분석을 지원 마이클 헨리, 더블린 시립 대학은,.이 작품은에 의해 부분적으로 지원되었다 (1) 조지 메이슨 대학 (George Mason University), (2) 이탈리아 / 미국의 틀에서 이탈리아어 IstitutoSuperiore 디 SANITA &#39; 건강의 미국과 복지부, 조지 메이슨 대학 (George Mason University), 그리고 공중 보건의 이탈리아어 자원부, (3) NIH, IMAT 프로그램 보조금 1R21CA137706-01 및 LAL에 1R33CA173359-01, (4) 세레스 Nanosciences, Inc의 협력 계약 .

인간의 혈장과 소변은 조지 메이슨 대학위원회 (Institutional Review Board)가 프로토콜을 승인 한 다음, 동의서와 함께, 건강한 자원 봉사 기증자로부터 수집되었다. 기증자는 동일하게 개별적으로 분석 하였다 25, 42 샘플 세 사이의 백인 남성과 여성 사이에 분포하고 풀링되지 않았다. 혈청 또는 혈장 샘플의 1 나노 입자 처리 플라즈마의 잠재적 낮은 풍부한 바이오 마커는 하이드로 겔 나노 입자 용액에 캡처됩니다. 입자를 세척하고, 원심 분리에 의해 분리 배양 혈장에 첨가하고, 캡처 된 단백질을 용출 하였다. 용출 된 단백질을 질량 분석법 하류 서열 식별 용 질소 기류 하에서 건조시킨다. <ol><li> microcentrifuge 관에서 50 mM의 TrisHCl pH가 7 (500 ㎕의 혈청 + 500 ㎕의 TrisHCl)와 함께 2 : 혈청 1의 500 μl를 희석. </li><li> 500 μL 폴리 (NIPAM / AAC) 핵심 nanop 추가기사. 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 고정 각 로터가 장착 된 원심 분리기에서 10 분 동안 16,100 XG에 25 ° C를 샘플을 스핀. 제거하고 상층 액을 버린다. </li><li> 펠릿에 500 ㎕의 티오시 안산 나트륨 (25 밀리미터)를 추가합니다. 격렬하게 피펫 팅하여 여러 번 아래 나노 입자를 재현 탁. </li><li> 고정 각도 로터와 원심 분리기에서 10 분 동안 16,100 XG에 25 ° C를 샘플을 스핀. 제거하고 상층 액을 버린다. </li><li> 나노 입자 펠렛을 MilliQ- 물 500 μl를 추가합니다. 격렬하게 피펫 팅하여 여러 번 아래 나노 입자를 재현 탁. </li><li> 고정 각도 로터와 원심 분리기에서 10 분 동안 16,100 XG에 25 ° C를 샘플을 스핀. 제거하고 상층 액을 버린다. </li><li> 신선한 용출 버퍼를 준비 : 깨끗한 튜브에 300 ㎕의 수산화 암모늄에 μL 아세토 니트릴 700를 추가합니다. 주의 : 수산화 암모늄 부식성이다. 적절한 환기와 함께 사용합니다. 주 : 용출 버퍼가 준비이어야ared 즉시 사용하기 전에. 용출 버퍼를 보관하지 마십시오. </li><li> 나노 입자의 펠렛에 용출 버퍼의 300 μl를 추가합니다. 격렬하게 피펫 팅하여 여러 번 아래 나노 입자를 재현 탁. 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 고정 각도 로터와 원심 분리기에서 10 분 동안 16,100 XG에 25 ° C를 샘플을 스핀. 제거하고 깨끗하고 표시된 microcentrifuge 관에 용출액을 저장합니다. </li><li> 1.10 - 반복 1.9 단계를 반복합니다. 한 microcentrifuge 관에이 용출액을 결합합니다. </li><li> 8 (그림 2 층)로 설정 공기 흐름을, 42.1 ° C에서 질소 증발기 매니 폴드의 질소 흐름에서 용출액을 건조. </li><li> O / N 저장을 위해 실온에서 건조 된 용출액을 저장 또는 장기 저장을 위해 -20 ° C,에서 질량 분석법, 웨스턴 블롯, 또는 ELISA 분석 (옵션) 이전에. </li></ol> 소변 샘플의 2 나노 입자 처리 보통 소변 미만 30 밀리그램 / DL 단백질을 포함하고1 + 혈액보다. 그러나, 많은 질병 / 조건은 소변의 단백질과 혈액의 정상 수준을 변경할 수 있습니다. 소변 샘플에 추가 된 나노 입자의 최적의 양을 결정하는데 원조하기 위해, 나노 입자는 뇨를 수확하기 전에 수행된다. 소변은 생체 소변량에 나노 입자의 비율을 최적화 필요할 수도 극도로 낮은 농도로 존재할 수있다. 이 절차는 다운 스트림 서양 얼룩 분석을위한 소변 샘플의 나노 입자 수확에 대해 설명합니다. <ol><li> 깨끗하고 마른 플라스틱 컵에 소변 샘플을 수집합니다. 22 ㎖의 최소 볼륨이 필요합니다. 분석 할 준비가 될 때까지 보관 소변은 -80 ° C에서 표본. </li><li> RT 또는 4 ° CO / N에서 냉동 소변을 해동. 와류 믹서에 잠깐 섞는다. 50ml의 원뿔형 바닥 폴리 프로필렌 튜브에 소변 중 적어도 22 ㎖에 붓고. </li><li> 15 분 동안 3,700 XG에서 스윙 아웃 로터와 원심 분리기에 소변을 봐. 깨끗한 50 ML 원뿔 바닥 polypr로, 펠렛을 방해하지 않고, 소변을 가만히 따르다opylene 관. 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 다중 분석 &quot;소변 딥 스틱&quot;시약 스트립을 사용하여 소변 검사를 수행합니다. 참고 : 직사광선 및 습도 17, 18에서 멀리 밀폐 된 용기에 시약 스트립을 저장합니다. <ol><li> 깨끗하고 마른 종이 타월에 시약 스트립, 페이스 업을 놓습니다. </li><li> 단계 2.3에서 제조 소변 1 ㎖를 흡인하기 위해 일회용 피펫을 사용합니다. </li><li> 2 분 타이머를 설정하지만, 그것을 시작되지 않습니다. 시약 스트립의 각각의 테스트 패드에 소변이 드랍 - 빠르게 한 분배. 즉시 타이머를 시작합니다. 참고 : 소변 용기에 직접 시약 스트립을 잠수함하지 마십시오. 시약 스트립에 염료 / 화학적 지표 잠재적 소변 용기 내로 시약 스트립의 용출 될 수있다. </li><li> 시약 스트립 용기에 표시된 시간에 대응하는 컬러 코드에 바랭이 개별 시약 스트립의 색을 비교하여 시약 스트립에 대한 다양한 분석 물질의 질적 결과를 기록시약 용기에 TORS. 일반적인 정상적인 소변의 결과는 다음과 같습니다 (일반 또는 음) 혈액, 단백질, 백혈구, 아질산염, 포도당, 케톤, 빌리루빈, 그리고 urobilinogen에 대한; 소변의 pH (5.5-7.0) 비중 (1.001-1.020). 주 : 소변 표본에서 높은 수준의 단백질은 나노 입자 결합 부위에 대한 관심의 단백질과 경쟁 할 수있다. 나노 입자와 단백질을 수확을 극대화하기 위해, 나노 입자 부피 / 소변 체적비가 높은 풍부한 단백질 중 하나에서 제한 경쟁으로 조절 될 수 있거나, 매우 낮은 농도로 존재하는 단백질을 수확하기 위해 최적화 될 수있다. 요 단백 값이 1 + 이상이있는 경우, 아래 단계 2.5에서 나노 입자의 2 배 볼륨을 추가합니다. 주요 피검 물이 매우 낮음 풍부한 단백질 인 경우에는 2 ㎖ (도 3)를 나노 입자의 양을 증가시킬 필요가있을 수있다. </li></ol></li><li> 전송 깨끗한 50 ML 원뿔 바닥 폴리 프로필렌 튜브에 단계 2.3에서 정화 된 소변 20 ㎖. 하지 마십시오소변 튜브의 아래쪽에있을 수있는 어떠한 파편 / 펠렛을 방해. 20 ㎖의 소변 샘플에 나노 입자의 200 μl를 추가합니다. 와류 믹서에 잠깐 섞는다. 요 단백 값이 1 + 이상이면, 20 ㎖의 소변에 나노 입자의 400 μl를 추가합니다. </li><li> 락 / 혼합없이, RT에서 30 분 동안 소변 / 나노 입자 혼합물을 배양한다. </li><li> 10 분 동안 3,700 XG에서 스윙 아웃 로터가 장착 된 원심 분리기에 소변 / 나노 입자 현탁액을 스핀. 주 : 펠릿을 보이는 다음 원심 분리가없는 경우, 부가적인 2 샘플을 스핀 - 7 분. </li><li> 제거하고 상층 액을 버린다. 나노 입자의 펠릿에 500 μL을 MilliQ- 물을 추가합니다. </li><li> 격렬하게 피펫 팅하여 여러 번 아래 나노 입자를 재현 탁. 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 나노 입자 용액을 전송합니다. </li><li> 10 분 동안 16,100 XG에 고정 된 앵글 로터를 구비 한 원심 분리기에서 스핀 나노 입자. 주 : 펠릿 FOL 표시가 없으면7 분 - 원심 분리를 lowing의, 추가로 2 샘플을 회전. </li><li> 제거하고 상층 액을 버린다. </li><li> 반복 나노 입자를 씻어 200 μl의 18을 MilliQ- 물 (2 회) 2.8 및 2.11 단계를 반복합니다. </li><li> 신선한 용출 버퍼를 준비 : 깨끗한 튜브에 30 ㎕의 수산화 암모늄에 μL 아세토 니트릴 970를 추가합니다. 주의 : 수산화 암모늄 부식성이다. 적절한 환기와 함께 사용합니다. 참고 : 용출 버퍼가 즉시 사용하기 전에 미리 준비되어 있어야합니다. 용출 버퍼를 보관하지 마십시오. </li><li> 나노 입자의 펠렛에 20 μL 용출 버퍼를 추가합니다. 격렬하게 피펫 팅하여 여러 번 아래 나노 입자를 재현 탁. 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 10 분 동안 16,100 XG에서 나노 입자 샘플을 스핀. 제거하고 깨끗하고 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 뜨는을 저장합니다. 나노 입자 펠렛을 방해하지 마십시오. 생물 학적 쓰레기 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 화학 흄 후드에서 랙에 샘플을 놓습니다. 뚜껑을 열고 inc를30 분 동안 RT에서 ubate. (- 2 시간 1) 또는 건조 할 때까지 40 ° C에서 질소 흐름에서 샘플을 배치. </li><li> 샘플 15 ㎕의 트리스 - 글리신 SDS 샘플 버퍼 (2 배)를 추가합니다. (100)에서 열 열거 나 튜브에 남아있는 볼륨까지 모자와 5 분 동안 건조 열 블록 ° C는 더 이상 20 μL 없습니다. 참고 : 끓는 물에 목욕을 사용하지 마십시오. 수욕에서 습도는 버퍼의 증발을 방지한다. </li><li> 튜브에 뚜껑을 놓습니다. 열 블록에서 튜브를 제거합니다. 샘플은 -80 ° C에서 저장 또는 다운 스트림 서양 얼룩 분석을 위해 즉시 사용할 수 있습니다. </li></ol>

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Benjamin Espina는 이 기사에 사용된 시약을 생산하는 Ceres Nanosciences, Inc.의 직원입니다. Lance Liotta, Alessandra Luchini 및 Virginia Espina는 이 기사에 사용된 나노입자 기술에 대한 특허(미국 특허 7,935,518 및/또는 8,497,137)를 보유하고 있습니다. 대학 직원으로서 그들은 대학 정책에 따라 이러한 특허로부터 로열티를 받을 자격이 있습니다. Lance Liotta와 Alessandra Luchini는 Ceres Nanosciences의 주주이며 과학 자문 위원회에서 활동하고 있습니다.

임상 관련성 혈청 또는 혈장 시료 전체적으로 유기체의 상태에 관한 정보의 다양한 소스를 제공 할 수있는 단백질 및 펩티드를 순환 미량을 포함하는 것으로 생각된다. 혈청 단백질 체학의 약속에도 불구하고, 임상 적 이익을 10, 11, 16, 25로 바이오 마커의 발견과 번역을 훼방 세 가지 기본 심각한 생리적 장벽이있다. 1 중요한 진단 바이오 마커는 혈액에서 매우 미량 (농도)에 존재할 수있다. 이러한 사전 전이성 암 병변 초기 단계 병에 걸린 조직은 몇 mm 세 미만 구성 할 수있다. 같은 작은 조직 볼륨에서 순환으로 창고 바이오 마커는 높은 전체 혈액량에 희석 될 것입니다. 관련 분석은 질량 분석과 종래의 면역 분석의 검출 한계 이하로 존재할 수있다. 2 낮은 풍부한 바이오 마커 /단백질은 플라즈마 프...

인간 게놈 시퀀싱의 완성에도 불구하고 상당한 진전은 초기 질환의 예측 식별 생체 제되지 않았거나 그 치료 결과, 1 또는 예후와 상관 관계. 진행의 부족이 이유 중 하나는 많은 중요한 잠재적 바이오 마커는 종래의 질량 분석 등의 바이오 마커 발견 플랫폼의 검출 한계 이하의 농도로 존재한다는 것이다. 질량 분석법 (MS)과 다중 반응 모니터링 (MRM)을 전형적으로 검출 감도가 50 이상 / ㎖ 겨 동안 50 PG / ㎖ 및 10 NG / ㎖ 사이의 범위에있는 임상 화학 가을 면역 분석법에 의해 측정 된 분석 물의 대부분 . 특히 질병의 초기 단계에서 많은 바이오 마커는, 종래와 MRM MS (2)에 의해 검출 될 수 없다는 것을 의미한다. 또한 이러한 복잡한 생물학적 유체에서 알부민 및 글로불린 같은 고 풍부 단백질의 존재는 종종 억 배 EXC 의해 마스크ESS 미량, 저 분자량의 단백질 및 펩티드 3, 4. 따라서 여러 샘플 준비 작업 단계가 질량 분석 시퀀싱 및 식별에 앞서 요구된다. 하나는 이러한 준비 단계는 상업적으로 이용 가능한 고갈 열 5-8로 높은 풍부한 단백질의 고갈을 고용하고있다. 그들은 종종 비공유 제거되는 캐리어 단백질과 연관되어 있기 때문에 불행하게도이 공정은 바이오 마커 후보의 수율의 감소를 이끈다. 샘플이 수집되면 또 다른 문제는 바이오 마커 후보의 전 생체을의 안정성으로 표시됩니다. 단백질은 내인성 또는 외인성 단백질 분해 효소 (9)에 의해 분해 될 수 있습니다. 10-13 열화로부터 단백질을 보호하는 동시에 하이드로 겔 나노 입자, 분석의 범위 내의 수준으로 바이오 마커 추정 농도를 증폭함으로써 이러한 중요한 과제를 초월 할 수있다. 그것은 일을 주목해야합니다LMW에서 혈액 내 단백질은 작은 그대로 단백질뿐만 아니라 큰 단백질 단편의 혼합물이다. 60 kDa의보다 큰 조직 유래 단백질은 수동적으로 혈관 기저막을 통해 혈류에 들어가기에 너무 클 수 있지만 그것들은 펩티드 또는 단백질의 단편 (14)과 같은 혈액에서 표현 될 수있다. 우리의 목표는 질병의 조기 진단, 치료에 대한 환자 층화하고, 치료에 대한 반응을 모니터링하기위한 후보가 될 수있는 신규 한 생체 순환을 측정하는 방법이다. 우리의 나노 입자를 동시에 작은 단백질과 펩타이드를 캡처하고 시작 볼륨에 따라 100 배에 그들을 집중하면서 선택적으로, 높은 풍부한 면역 글로불린과 알부민을 제외 만들어집니다. 우리 그룹이 성공적으로 단백질 및 펩타이드에 대해 높은 친 화성 분자 미끼 작용할 수 작은 유기 염료의 세트를 식별. 결합 단백질 염색으로 인해 소수성 및 정전 기적 상호 작용의 조합에 의한 것으로 생각된다의. 염료에 방향족 고리는 단백질의 소수성면 (11)에 포켓을 통해 단백질 인터리빙. 미끼는 자신의 화학에 따라 분석의 선택된 클래스에 대한 특별한 친화력을 보여줍니다. 미끼는 단백질 또는 펩티드, 알부민과 같은 담체 단백질과 경쟁. 저 분자량 단백질 / 펩타이드는 입자에 포획된다. 알부민과 글로불린과 같은 고 분자량의 단백질 때문에 하이드로 겔 (11) (도 1)의 제한으로 인해 기공 체질 능력 입자 들어가는 것이 방지된다. 하이드로 겔 나노 입자 (11) 황산 암모늄 침전에 의해 개시 중합에 의해 합성된다. N-이소 프로필 아크릴 아미드 (NIPAM)은 아크릴산 (AAC) 및 알릴 아민 (AA)와 가교제 N, N&#39;-메틸렌 비스 (BIS)의 코 모노머는 희석 조건 (1)에서 6 시간 동안 70 ° C에서 반응하도록 허용1, 13. 폴리 높은 단백질 결합 친화도 (N-이소 프로필 아크릴 아미드 - 코 - 아크릴산) 공유 (아미노 - 함유 염료를 통합 즉., sulfonatedanthraquinonetriazine 염료)를 나노 입자로를 통해 달성 (폴리 (NIPAM-CO-AAC) nanoparticlesis 염료의 친수성 / 소수성 특성에 따라 수용성 또는 유기 용매에서 수행 아미드 화 반응은 11 anthraquinonetriazine 염료의 염소 원자를 가진 나노 입자의 아민 기의 13. 친 핵성 치환은 염료 - 함유 폴리 (NIPAM를 만드는 데에 이용된다 -CO-알릴 아민) (AA)는, 나노 입자 (11) 12. 두 단계의 중합 방법은 비닐 술폰산 (VSA) (11), (13)의 외부 쉘 나노 입자를 함유하는 하이드로 겔을 생성하는 데에 이용된다. 하이드로 겔 나노 입자는 전체 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 땀, 뇨 등의 다양한 생물학적 유체에 적용될 수있다. 한 단계에서, 용액, Nanoparticles는 (분 이내) 신속한 격리 및 저 분자량의 농도는 10, 11, 13, 15-18 수행 분석 물. 단백질이 후속하여 나노 입자로부터 용출 검출 웨스턴 분석법 10, 11, 13, 15, 18, ​​22 질량 19-21 블롯, 23, 면역 / ELISA 10, 11, 15, 18, ​​또는 역상 단백질 마이크로 어레이 (16), 24 분석. 나노 입자는 화학 미끼로 작용하고, 코어 또는 코어 쉘 구조, 캡처를 제시하고 미끼 / 쉘 물리 화학적 특성에 따라 단백질을 집중한다. 나노 입자에 혼입 다른 염료 따라서 염료 선호도에 기초하여 효율, 용액의 pH, 및 고 단백질 풍부 (13)를 경쟁의 존재 / 부재를 가변으로 단백질의 상이한 서브 세트를 캡처한다. 또한, 용액의 부피에 관련하여 나노 입자의 양은 나노 입자에서 단백질 수율에 영향을 미칠 것이다. 이러한 측면하이드로 겔 나노 수확 단백질을 다량 함유 혈장 샘플로부터 수확하는 세 가지 단백질 나노 입자를 사용하여 입증 베이트, 전형적으로 많은 양의 단백질을 포함하지 않는 소변 샘플에서된다. 이 프로토콜에서는 수확 및 폴리 (NIPAM-CO-AAC), 폴리 (NIPAM / 염료), 및 코어 - 쉘 나노 입자를 사용하여 혈장 샘플에서 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)를 집중을 설명 (폴리 (NIPAM-CO-VSA)) . 폴리 (NIPAM / 염료) 나노 입자는 결핵균에 감염된 개인을 모방하기 위해 인간의 소변 샘플에 추가 된 마이 코박 테 리움 종의 항원을 집중 표시됩니다.

<table><tbody><tr><td>하이드로겔 나노 입자</td><td>Ceres Nanoscience</td><td>CS003</td><td>NanoTrap ESP 입자</td></tr><tr><td>18 M & Omega; -cm 물</td><td></td><td></td><td>유형 1 시약 등급 물</td></tr><tr><td>Tris HCl, 50 mM pH 7.0</td><td>VWR</td><td>IC816116</td><td>50 mM, pH 7</td></tr><tr><td>아세토 니트릴</td><td>BDH</td><td>BDH1103-4LP</td><td></td></tr><tr><td>VWR 수산화 암모늄 NH4OH</td><td>BDH</td><td></td><td>BDH3014 VWR에서 28-30 % NH로 분석 3</td></tr> <tr><td>티오시아 산 나트륨 25 mM</td><td>Acros 유기물</td><td>419675000</td><td>혈청 / 혈장 샘플 용</td></tr><tr><td>다중 분석 lyte 소변 시약 스트립</td><td>Siemens</td><td>2161</td><td>소변 샘플 용</td></tr><tr><td>Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td> <td>Life Technologies</td><td>LC2676</td><td>SDS 침전</td></tr><tr><td>을 방지하기 위해 RT에서 사용가열 블록이 있는 건식수조 인큐베이터(100 oC)</td><td>Barnstead</td><td>11-715-125DQ</td><td>끓는 물 중탕으로 대체하지 마십시오</td></tr><tr><td>질소 증발기 매니폴드</td><td>Organomation Associates</td><td>Microvap118</td><td>혈청/플라즈마 시료용</td></tr><tr><td>원심분리기, 스윙아웃 로터</td><td>Sorvall</td><td>Legend 시리즈</td><td>50 ml 튜브 용량, rcf 3,700 x g</td></tr><tr><td>원심분리기, 고정각 로터</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>1.7 ml 마이크로 원심분리기 용량, RCF 16,000 x g</td></tr><tr><td>50 ml 원추형 원심분리기&nbsp; 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>소변 샘플용 나사 캡</td></tr><tr><td>포함 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Vortex 믹서</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-755</td><td></td></tr><tr><td>타이머</td><td>Fisher Scientific</td><td>S04782</td><td>초/분</td></tr></tbody></table>

낮은 풍부 단백질을 검출하기위한 플라즈마 또는 소변의 하이드로 겔 나노 입자 수확

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

새로운 바이오 마커 발견에 더 민감하고 특정 질환 검출을 제공하는데 결정적인 역할을한다. 생물학적 유체에 존재 불행히도 많은 미량 생체 용이 질량 분석법 또는 그들이 매우 낮은 농도로 존재 불안정성이며, 종종 알부민 또는 면역 글로불린과 같은 높은 풍부한 단백질에 의해 마스킹되기 때문에 면역 분석법으로 검출 될 수 없다. 미끼 함유 폴리 (N-이소 프로필 아크릴 아미드)는 (NIPAM) 기반 나노 입자는 이러한 생리적 장벽을 극복 할 수있다. 한 단계에서 그들은 캡처 집중 체액에서 바이오 마커를 보존 할 수 있습니다. 저 분자량 분석은 나노 입자의 코어를 선택하고 높은 친 화성 단백질 베이트 행동 다른 유기 화학 염료에 의해 포착된다. 나노 입자는 몇 배에 의해 관심의 단백질을 집중 할 수 있습니다. 이 집중 계수는 단백질 내에되도록 단백질 수준을 증가시키기에 충분한현재 질량 분석기, 웨스턴 블롯 및 면역 분석법의 검출 한계. 나노 입자는 생체 체액의 과다와 함께 배양 할 수 있고, 그들은 알부민 및 기타 고 분자량 단백질을 제외하고 크게하면서 저 분자량의 단백질 및 펩티드의 농도로 농축 할 수있다. 우리의 데이타는 특정 분석 물질의 농도가 10,000 배 증폭 이전에 탐지 바이오 마커를 검출하는 질량 분석 및 면역 분석을 가능하게 달성 될 수 있음을 보여준다.

하이드로 겔 나노 입자 크기와 균일 폴리 (NIPAM-AAC) 입자 사이의 일괄 처리 내에서 매우 높은 수율과 재현성으로 제작되었다. 입자는 캡처, 저장, 및 단백질의 용출 (적어도 48 시간)에 필요한 시간 동안 RT에서 매우 좋은 콜로이드 안정성을 가지고 있고, 나노 입자가 석출 (도 1) (11)이 관찰되지 않았다. 콜로이드 안정성은 나노 입자에 의한 신속한 단백질 / 펩티드 흡수에 매우 중요 할 수있다. 플라즈마에서 수확 된 잠재적 미량 바이오 마커 염료 미끼의 혼입은 용액 중의 분자의 흡수를 구동하고 포착 분자가 저하 13, 15, 18, ​​25에서 보존되는 것을 보장한다. 따라서, 프로테아제 억제제는 시료 전처리 과정이 필요하지 않는...

몇몇 병리학적 바이오마커는 생물학적 유체의 농도가 낮고, 분해 효소가 존재하며, 다량의 고분자량 단백질이 있기 때문에 현재 기술로는 쉽게 검출할 수 없습니다. 화학적으로 기능화된 하이드로겔 나노입자는 저농도 단백질을 수확, 보존 및 농축할 수 있어 이전에는 검출할 수 없었던 바이오마커를 검출할 수 있습니다.

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

이 절차의 전반적인 목표는 생물학적 유체로부터 적절한 농도로 저농도, 저분자량 바이오마커를 수확, 농축 및 보존하는 것입니다. 표준 단백질 분석의 경우, 이는 먼저 화학적으로 기능화된 하이드로겔 나노입자를 생물학적 유체, 저분자량에 첨가하여 수행됩니다. 분석물은 나노 입자의 코어로 들어가 친화성이 높은 단백질 미끼 역할을 하는 다양한 유기 화학 염료에 의해 포집됩니다.두 번째 단계는 원심분리를 통해 생체 유체에서 입자를 분리하는 것입니다. 나노 입자는 관심 단백질을 몇 자릿수 크기로 농축합니다. 그런 다음 나노 입자를 물로 세척하여 외부 단백질을 제거합니다.마지막 단계는 나노 입자에서 포획된 단백질을 용리하는 것입니다. 궁극적으로, 웨스턴 블로팅(western blotting), 질량 분석법(mass spectrometry) 또는 아미노 분석법(amino assay)은 이전에 검출할 수 없었던 채취된 저농도 바이오마커의 존재 및/또는 농도를 보여주는 데 사용됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 나노 입자를 세척하고 소생을 중단해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.피펫 팁을 막지 않으면 나노 입자가 세포만큼 쉽게 현탁되지 P.So 첫 번째 배양 후 나노 입자를 적절하게 현탁시키기 위해 위아래로 격렬하게 피펫을 사용해야 합니다. 나노 입자를 사용하면 튜브에 부착될 수 있는 나노 입자 잔류물을 수집하기 위해 튜브의 벽을 헹구는 것이 중요합니다. 혈청 샘플의 나노 입자 처리를 수행하려면 마이크로 원심 분리 튜브에서 50 밀리 몰 트리스, HCL pH 7로 500 마이크로 리터의 인간 혈청 1-2를 희석합니다.500마이크로리터의 폴리 및 isop 프로필 아크릴아미드 또는 아크릴산 코어 나노 입자의 폴리 니팜 CO 단량체를 추가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 10분 동안 16, 100회 G 및 25°C에서 샘플을 회전시킵니다. 고정 각도 로터가 장착된 원심분리기에서 SUP 나틴을 제거하고 버리고 500마이크로리터의 티오시아네이트나트륨을 펠릿에 첨가하기 전에 여러 번 위아래로 격렬하게 피펫팅하여 나노 입자를 재현탁합니다.이전과 같이 샘플을 회전시키고 상등액을 버리고 나노 입자 펠릿에 500마이크로리터의 milli Q 물을 첨가합니다. 다시 한 번, resus는 여러 번 위아래로 격렬하게 피펫팅하여 나노 입자를 현탁시킵니다. 샘플을 다시 회전시킨 후, 시연된 기술을 사용하여 300마이크로리터의 새로운 엘루시안, 완충 및 재현탁액을 얻었습니다.실온에서 15분 동안 배양합니다. 샘플을 마지막으로 회전시킨 후 EIT를 제거하고 라벨이 부착된 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브에 보관합니다. 두 번째 용리하고 두 EIT를 하나의 마이크로 원심분리기로 결합합니다. 2.다음으로, 공기 흐름을 6으로 설정하고 질소 흐름과 질소 증발기 매니폴드에서 질소 흐름과 질소 증발기 매니폴드에서 EIT를 건조합니다. 건조된 EIT를 실온에서 보관하여 하룻밤 동안 보관하거나, 질량 분석, 웨스턴 블로팅 또는 EISA 분석 전에 장기 보관을 위해 섭씨 영하 20도를 추가하여 소변 샘플의 나노 입자 처리를 수행합니다. 최소 22ml의 부피를 수집하고 분석할 준비가 될 때까지 검체를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.얼린 소변을 실온 또는 섭씨 4도에서 밤새 해동합니다. 해동되면 소용돌이 믹서에서 잠시 혼합합니다. 그런 다음 22ml 원뿔형 바닥 폴리프로필렌 튜브에 최소 50ml의 소변을 붓습니다.다음으로, 펠릿을 방해하지 않고 3, 700회 G로 스윙 아웃 로터가 있는 원심 분리기에서 15분 동안 소변을 회전시킵니다. 깨끗한 50ml 원뿔형 바닥 폴리프로필렌 튜브에 소변을 담그고 펠릿을 버립니다. 다중 분석물 소변 계량봉 시약 스트립을 사용하여 소변 검사를 수행합니다.깨끗하고 마른 종이 타월 위에 시약 스트립을 앞면이 위로 향하게 놓습니다. 일회용 피펫을 사용하여 소변 1ml를 흡인합니다. 시약 스트립의 각 테스트 패드에 소변 1-2방울을 빠르게 분주합니다.시약 스트립 용기에 표시된 시간에 이전에 2분으로 설정된 타이머를 즉시 시작합니다. 개별 시약 스트립의 색상을 시약 용기의 해당 색상으로 구분된 표시기와 비교하여 시약 스트립의 다양한 분석물에 대한 정성적 결과를 기록합니다. 일반적인 정상 소변 결과는 pH 5.5 - 7.0, 비중 1.001 - 1.020으로 특징지어집니다.소변은 혈액 단백질, 백혈구, 아질산염, 포도당, 케톤, 빌리루빈 및 우로빌리노겐에 대해 음성이어야 합니다. 다음으로, 정화된 소변 20ml를 깨끗한 50ml 원뿔형 바닥 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다. 소변을 제거하는 소변관 바닥에 있을 수 있는 파편 펠릿을 방해하지 마십시오.200ml의 소변 샘플에 200마이크로리터의 나노 입자를 넣고 와류 믹서에서 잠시 혼합합니다. 그런 다음 소변 나노 입자 혼합물을 흔들거나 섞이지 않고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 스윙 아웃 로터가 장착된 원심분리기에서 소변 나노 입자 현탁액을 3, 700회 G로 10분 동안 회전시킵니다.상층액을 제거하고 버린 후 나노 입자 펠릿에 500마이크로리터의 Milli Q 물을 첨가합니다. 나노 입자를 여러 번 위아래로 격렬하게 피펫팅하여 재현탁합니다. 나노 입자 용액을 깨끗한 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.다음으로, 고정각 로터가 장착된 원심분리기에서 10분 동안 16, 100배 G로 나노 입자를 회전시킵니다. 물로 이 단계를 반복하기 전에 상층액을 제거하고 버리십시오. 나노 입자를 세척하려면 나노 입자 펠릿에 20 마이크로 리터의 새로운 용출 완충액을 추가하고 여러 번 위아래로 격렬하게 피펫을 사용하여 나노 입자를 재현 탁시킵니다.실온에서 15분 동안 배양합니다. 나노 입자 펠릿을 방해하지 않고 스내트를 제거하기 전에 나노 입자 샘플을 다시 회전시키고 깨끗한 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 상등액을 저장합니다. 펠릿을 생물학적 위험 쓰레기통에 버리십시오.샘플을 화학 흄 후드의 랙에 놓습니다. 뚜껑을 열고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 또는 건조될 때까지 섭씨 40도의 질소 흐름 아래에 샘플을 놓습니다.15마이크로리터의 트리스 글리신 SDS 샘플 버퍼를 샘플에 추가합니다. 뚜껑을 연 상태에서 또는 튜브에 남아 있는 부피가 20마이크로리터를 넘지 않을 때까지 건조 열 블록에서 섭씨 100도에서 5분 동안 가열합니다. 튜브에 캡을 놓고 열 블록에서 튜브를 제거합니다.샘플은 섭씨 영하 80도에서 보관하거나 다운스트림 웨스턴 블롯 분석에 즉시 사용할 수 있습니다. Silver stain 1D gel 전기영동은 인간 플라즈마에서 종양 괴사 인자 알파의 나노 입자 캡처 및 농도를 보여줍니다. 종양 괴사 인자 알파를 나타내는 띠는 입자에 대해 문자 P로 지정된 나노 입자 EIT에만 존재하지만 상등액 나노 입자에는 존재하지 않습니다 두 가지 다른 화학 미끼, 아크릴산 또는 VSA 코어 쉘로 기능화 된 코어 쉘은 상층액 및 나노 입자의 플라즈마 웨스턴 블로팅에서 다양한 농도의 IL 17을 수확 할 수 있습니다.EIT는 EIT의 17.5 킬로달톤 대역에서 IL 17의 존재를 명확하게 보여주지만 상등액 나노 입자에서는 존재하지 않습니다. 소변 샘플을 채취하면 이 은색 염색 SDS 페이지에서 박테리아 항원과 사이토카인을 확인할 수 있습니다. U4 및 U 6 열의 소변 샘플 분석은 RET ESAT 6, 결핵균 관련 단백질, IL 2, 사이토카인을 포함하는 소변 샘플의 나노 입자 EIT입니다.이 단백질은 15킬로달톤에서 두드러진 띠로 묘사됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 겔 나노 입자를 사용하여 생물학적 유체에서 낮은 버려진 바이오마커를 수확, 농축 및 보존하는 동시에 원치 않는 버려진 분자를 배제하여 현재 분석 방법의 검출 감도를 크게 높일 수 있는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

hydrogel-nanoparticle-harvesting-plasma-or-urine-for-detecting-low

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 인간의 혈청에서 낮은 분자량의 단백질과 펩티드의 선택적 회수를위한 mesoporous 실리카 박막을 기반으로 기술을 개발했습니다. 우리 mesoporous 칩 physico - 화학적 성질은 잘게 펩타이드 강화에 실질적인 컨트롤을 제공하며, 결과적으로 진단을 위해 혈청 프로테옴을 프로파일하기 위해 조정되었습니다.

Biomarker 디스커버리를위한 Mesoporous 실리카 박막의 낮은 분자량의 단백질 농축

이 원고는 변형된 침전 기법을 사용하여 인간의 소변에서 엑소좀을 분리하는 프로토콜을 설명합니다.

수정 된 침전 법은 요도 엑소 좀을 분리

이 프로토콜은 30분 이내에 10μL의 전혈에서 단백질의 펨토 어금니 감지 감도를 달성하는 방법을 보여줍니다. 이는 랩온-어-디스크(lab-on-a-disc)에 통합된 전기방사 나노섬유질 매트를 사용하여 달성할 수 있으며, 이는 높은 표면적과 향상된 신호 대 잡음비를 위한 효과적인 혼합 및 세척을 제공합니다.

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여기, 선물이 exosomes 플라즈마와 비 exosomal 혈액 단백질의 감소 공동 정화와 혈 청에서 순화 하는 프로토콜. 최적화 된 프로토콜 적용, 효소 치료, 및 크기 배타 착 색 인쇄기를 포함 한다. Exosomes 혜택 다운스트림 분석, 소포 및 proteomic 특성의 더 정확한 정량화를 포함 하 여 향상 된 정화.

단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하

이 프로토콜은 주사용, 초분자 폴리머 나노입자(PNP) 하이드로겔 생체 재료의 합성 및 제형을 설명합니다. 약물 전달, 바이오 의약품 안정화 및 세포 캡슐화 및 납품을 위한 이러한 물질의 적용이 입증된다.

세포 및 약물 전달 응용 을 위한 주사용 수급 분자 고분자 고분자 나노 입자 하이드로겔

고해상도 광 패터링 도구를 이용하여 세균 세포를 분리하기 위해 광분해성 하이드로겔을 사용하는 것이 보고된다. 프로세스의 필수 실험 절차, 결과 및 이점을 검토합니다. 이 방법은 이질적인 지역 사회 또는 인구에서 희귀하거나 독특한 기능을 보여주는 표적 박테리아의 신속하고 저렴한 격리를 가능하게합니다.

박테리아 스크리닝, 선택 및 격리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스

바이오마커 프로가스트린 방출 펩타이드(ProGRP)로 예시된 건조 혈청 샘플에서 저농도 바이오마커를 측정하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 항체 코팅된 마그네틱 비드는 프로테오타입 ProGRP 펩타이드의 선택적 클린업 및 농축에 사용됩니다. 포획된 펩타이드는 이후 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법으로 분석됩니다.

표적 질량분석법 기반 단백질 분석의 마이크로샘플링 저농도 단백질

이 기사에서는 인간 플라즈마 유래 세포외 소포체(EV)의 분리, 특성화 및 정량화를 위한 방법론을 설명하고 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 사용하여 EV 단백질체의 무표지 분석을 위한 워크플로우를 제시합니다.

심혈관 바이오마커 발견을 위한 혈장 유래 세포외 소포체의 분리, 특성화 및 단백질체 분석

이 프로토콜은 나노입자에 대한 맞춤형 단백질 코로나 프로파일링을 위한 SDS-PAGE 분석을 표준화하여, 암 특이적 신호의 재현 가능하고 확장 가능하며 저비용으로 검출할 수 있게 합니다. 췌장 관성 선암의 조기 진단을 위해 설계된 이 프로토콜은 연구 및 임상 환경 모두에서 복잡한 단백질체학적 방법에 대한 실용적이고 REASSURED에 맞춘 대안을 제공합니다.

조기 암 발견을 위한 맞춤형 단백질 코로나 프로파일링을 위한 표준화된 SDS-PAGE 워크플로우

다목적 플라즈마 리소그래피 기술은 휴대폰 첨부 파일을 안내에 대한 안정된 표면 패턴을 생성하기 위해 개발되었습니다. 이 기술은 천연 조직을 모방하고 몇 가지, 서로 다른 세포 유형을 공부에 사용되었음을 포함 셀 네트워크를 만들어 적용할 수 있습니다.

세포 네트워크의 창조를위한 플라즈마 리소그래피 표면 Patterning

배우세요 생물학적 유체에서 저분자량 단백질 바이오마커를 수확하고 농축하는 하이드로겔 나노입자 기법을. 이 방법은 기존에 검출 불가능했던 저풍부 단백질을 포착하여 진단 민감도를 획기적으로 향상시킵니다.

낮은 풍부 단백질을 검출하기위한 플라즈마 또는 소변의 하이드로 겔 나노 입자 수확

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