Name: 본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-04T23:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 배우세요 생체 외에서 기능적으로 연결된 쥐의 비강기관과 부속 후각 망울을 준비하는 방법을. 정교한 해부 기술로 감각 신호 처리를 연구하고 전기생리학적 기록을 통해 신경 활동을 측정합니다.

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, F30 DC011673 (GFH : NINDS, NIH)과 유타 남서부 시작 기금 (JPM) :이 연구는 R00 DC011780 (NINDS, NIH JPM)에 의해 지원되었다.

모든 실험은 UT 요리 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행하였으며, 실험 동물에 의해 경험 한 스트레스, 불편과 고통을 최소화하도록 선택되었다. 1. 해부 상공 회의소 사용자 지정 해부 실 및 작은, 얇은 플라스틱 판자는 최상의 결과를 (그림 1)이 필요합니다. 이 프로토콜을 시도하기에 앞서 이러한 챔버를 구축 또는 구하십시오. 2. 해부 솔루션 <ol><li> 단계 3.22-5.4에 사용하기 위해 표준 인공 뇌척수 (ACSF)의 1 L를 준비합니다. 염화나트륨 125 밀리미터,의 KCl 2.5 밀리미터, 염화칼슘 2 ㎜, MgCl2를 1 ㎜, 탄산 수소 나트륨 25 밀리미터,의 NaH 2 PO 4 1.25 밀리미터, 미오 이노시톨 3 mm의 나트륨 피루 베이트 2 ㎜, 아스 코르 빈산 나트륨 0.4 ㎜를 추가하고 25 포도당 mM의 발열 물질이없는 물 1 L에. </li><li> 에 대한 초기 해부 ACSF (200 ㎖) 준비단계 3.3-3.22에 사용합니다. 표준 ACSF 200 ㎖를 타고 MgCl2를 수화물 0.366 g을 추가하여 9 개 mm로 MgCl2를 농도를 높입니다. </li><li> 염화나트륨 115 밀리미터, KCl을 5 밀리미터, 염화칼슘, 2 ㎜, MgCl2를 2 ㎜, 탄산 수소 나트륨 25 밀리미터, HEPES 10 mM의를 포함하는 단계 4.11-5.4에 사용되는 정맥을 통해 VNO에 자극을 수행하는 표준 링어의 솔루션을 준비, 10 mM의 포도당. </li><li> 버블 사용할 때까지 15 분의 최소 37 ° C의 물을 욕조에 95 % O 2, 5 % CO 2 가스 표준 ACSF 및 링거의 0.5 L의 0.8 L. </li><li> 거품 95 % O 2 초기 해부 ACSF의 200 ㎖, 그것은 4 ° C를 15 ~ 20 분 동안 얼음에 5 % CO 2 가스에 도달 할 때까지 </li></ol> 3. 기본 해부 <ol><li> 해부 영역을 준비합니다. 세 35mm 페트리 접시를 놓고 산소 ACSF, 바로 가위, Adson 집게, # 11 두피를 해부 가위를 해부 곡선 잘린 가위,,엘 칼날과 손잡이와 얼음에 면도날. </li><li> 산소 ACSF 4 ° C로 냉각 한 후, 깊이 2 ~ 5 ㎖의 Isothesia (99.9 % 이소 플루오 란)를 사용하여 건조 챔버에서 동물을 마취. 동물이 깊은 마취를 보장하기 위해 꼬리와 발 핀치 테스트를 수행합니다. </li><li> 깊은 마취가 확인되면, 동물의 목을 벨 즉시 냉장 해부 ACSF 가득 페트리 접시에 머리를 놓습니다. 참고 : 사용하지 않을 때의 절차를 통해 시원한 곳에 보관하는 냉장 해부 ACSF의 조직을 담근다. </li><li> 곡선 가위로 낮은 측면 (복부 인두, 아래 턱, 혀)를 제거합니다. </li><li> Adson의 포셉 deglove (껍질) 표피와 두개골의 근육 첨부 파일을 사용하여. 껍질 주동이에 꼬리에서 두피 첨부 파일의 전용 사이트까지 앞니 이상이다. 곡선 가위를 사용하여 접속 지점에서 조직을 잘라. 집게로 잡고 눈을 제거하고 준비에서 떠나십시오. N귀 degloving 절차의 끝, 위턱 뼈없는 근육 첨부 파일 Adson의 집게를 사용하여 섬세한 코의 연골에 여분의 힘을 피하십시오. 참고 : 바로 가위로 두개골의 꼬리 부분에서 두피를 분리합니다. </li><li> 가위 팁 (직전 rhinal 동을) 정면 뼈에 몇 mm가 될 때까지 똑바로 가위, 주동이에 꼬리에서 두개골의 중간 선을 삭감. </li><li> Adson의 집게를 사용하여 두개골의 정수리와 정면 뼈를 제거합니다. 참고 : 정면 뼈의 조각은 종종 rhinal 동에 꼬리 코 뼈에 부착 된 상태로 유지됩니다. 후각 전구와 접촉하지 않도록주의하여이 조각을 제거합니다. </li><li> 부비동에 전두엽 2mm의 꼬리를 통해 관상 컷을 한 다음 컷으로 뇌의 꼬리를 제거하기 위해 메스를 사용합니다. 완전히 후방 조직을 절단하는 메스 연락처 복부 두개골의 뼈 윤곽의 끝을 확인합니다. 참고 :이 수측면 후각 책자 또는 후각 전구에 기계적 스트레스를주지 않고 뇌의 대부분을 제거. </li><li> 바로 가위로 복부 두개골의 노출 꼬리 부분을 제거합니다. 부비동과 남아있는 신경 조직을 남겨주세요. </li><li> 바로 가위를 사용하여 두개골의 해부학 오른쪽 광대뼈 아치와 얼굴 근육을 제거 </li><li> 입의 지붕을 노출 (복부 측면을 위로) 주둥이를 뒤집으십시오. </li><li> 잘라 앞니에 미각이 바로 꼬리 제거합니다. 입천장에 구개 병렬에서 메스 블레이드의 팁을 삽입하여이 작업을 수행 한 후 앞니를 향해 칼날을 이동합니다. </li><li> Adson 집게와 미각의 해제 (주동이의) 가장자리를 잡고 꼬리 쪽 잡아 당겨 제거합니다. </li><li> 두개골의 해부학 왼쪽에, 어금니 근처의 작은 난원에서 시작, 꼬리 쪽 팔 라틴 난원을 확장 메스 블레이드를 사용합니다. 메스 즐의 끝을 삽입하여이를 달성어금니 근처 무효로 해제하고 손목을 회전. 참고 : 블레이드의 팁만을 사용에 각별한주의를 기울이십시오 - 깊은 상처가 중격 조직을 손상시킬 수 있습니다. </li><li> 해부학 왼쪽 vomeronasal 기관에 주동이를 시작, 앞니를 통해 구개 난원에서 잘라 메스 블레이드의 팁을 사용. 여러 점수 인하를 사용합니다. 너무 깊이 블레이드를 삽입하여 중격 조직과 vomeronasal 신경을 손상하지 마십시오. </li><li> 그래서 지느러미 두개골가 직면하고있는 조직을 켠 다음 준비의 꼬리 가장자리에 수직으로 직선 면도날 (중간 선에 평행) 방향. </li><li> 조직의 복부 에지에서 즉시 정중선의 왼쪽 면도날의 절삭 날을 터치. 날을 부드럽게 바위와 왼쪽 팔 라틴 난원 (단계 3.14에 도입 된 지역을 절감)를 따라 이동합니다. </li><li> 조직의 지느러미 가장자리에서 즉시 정중선의 왼쪽 (1 mm 미만)에 면도기의 최첨단을 배치합니다. </li><li> 유지블레이드가 조직의 전방을 향해 압력을 서서히 면도날 바위, 중앙선에 평행. 소공 질의 플레이트에 저항을 알 수 있습니다. 이 저항을 돌파 한 후 즉시 중지합니다. NOTE :이 시점에서, 우반구가 좌반구에서 느슨하게된다. 유일하게 남아있는 연결은 소공 질의 플레이트 등의 주둥이 앞쪽에 따라 반구 사이에있다. </li><li> 장갑을 낀 손가락으로 꼬리 양쪽 근처를 잡고 부드럽게 옆으로와 전방을 회전하여 반구를 분리합니다. 참고 :이 단계는 특히 편향 또는 부서지기 쉬운 주둥이 (예를 들어, 이전 마우스)와 생쥐 실험 다양성의 원천입니다. 또한, 강한 저항이 결합 조직을 약화 등의 주둥이 (소공 질의 플레이트 앞쪽) 점수가 발생하는 경우, 서로 떨어져 반구를 회전하는 동안. 이렇게하는 동안, 중격 TI를 손상시킬 수있는, 깊이 메스를 삽입하지 세심한주의를 가지고ssue 및 vomeronasal 신경. </li><li> 판자에 조직 접착제의 소량 (50 ~ 100 μL)을 적용하고 부드럽게 Adson의 집게를 사용하여 접착제에 오른쪽 반구의 측면 가장자리를 놓습니다. 판자에 조기 접착제의 중합 및 느슨한 부착을 방지하기 위해 종이 타월을 사용하여 준비의 측면에서 과잉 수분을 제거합니다. 참고 : 조직이 접착제에 배치 된 후 접착제의 중합 반응을 가속화하기 위해 샘플에 냉장 해부 ACSF 몇 방울을 적용합니다. 이 조직은 판자에 단단히 개최 유지되도록합니다. </li><li> 보조 해부 실의 중간에 진공 그리스의 작은 금액 (3-5 mm 직경, 깊이 2mm)를 놓고 단단히 그리스에 대한 조직 맞은 판자의면을 배치합니다. 즉시 미세 해부 영역에 전송하고 산소 표준 ACSF와 관류를 시작, 냉장 해부 ACSF으로 해부 챔버를 입력합니다. 후각 망울이 직접 있도록 판자의 방향을갓 산소 표준 ACSF의 스트림. </li></ol> 4. 보조 해부 <ol><li> 미세 집게를 사용하여 준비에서 눈에 보이는 반대편 (왼쪽) 후각 망울 또는 대뇌 피질의 조직을 제거합니다. (세미 무딘 점을 형성하는) 미세 집게를 함께 꼬집어하고 중간 선 부근의 지느러미와 조직의 꼬리 부분에 배치합니다. 부드럽게 멀리 전방 움직임에 천천히 오른쪽 뇌의 조직을 박리, 중간 선을 따라 슬쩍 집게를 실행합니다. 반대측의 후각 망울의 조직을 포함하여 반대측의 조직을 모두 제거합니다. AOB 또는 vomeronasal 신경에 손상을 줄 수있는 조직을 찌르지 않도록 세심한주의를 기울입니다. </li><li> 후각 망울의 등 / 내측 표면을 따라 흰색 뇌경막을 준수하십시오. 미세 집게 두 쌍의 경질의 백인 부분에 잡고 후각 망울의 등 / 꼬리 가장자리를 따라이 경막 눈물 멀리 그 시점에서 그들을 잡아 당깁니다. 경질 단단히입니다후각 전구를 감싸, 그것을 제거하는 동안 쉽게 자체 조직을 통해 슬라이스 할 수 있습니다. 후각 망울과 AOB 자체의 내측 표면의 손상을 방지. 참고 : 경질이 시점에서 쉽게 찢어 저항하는 경우, 분리를 용이하게하기 좋은 봄 팁 해부 가위로 작은 상처를 소개합니다. </li><li> 차분히 기본 후각 전구를 손상시키지 않고 미세 집게와 정면 외피를 벗겨. AOB에 바로 꼬리 반투명 순으로 나타나는 혈관의 컬렉션을 준수하십시오. 전기 생리학 실험에서 전극의 침투를 용이하게하기 위해 미세 집게로이 그물을 제거합니다. 그것은 정면 피질 후퇴하는 동안 AOB에서 분리로 집게로 그물을 잡고 AOB을 만지지 않도록 조심하면서, 꼬리 쪽과 내측으로 잡아 당겨 제거합니다. 전두엽 피질의 후각 전구에서 분리되면, AOB에 복부와 뒤 집게로 절단하여 제거합니다. 참고 : 예를 가지고그것이 너무 크게 할 경우 그물 제거와 함께 치료를 트림에 대한 사구체 층이 손상 될 수 있습니다. </li><li> 노출 반대편 비강에서, 미세 집게를 사용하여 남아있는 반대측 중격 조직 (혈관을 포함하는 얇은 황색 시트)를 제거합니다. (중격 뼈 근처) 꼬리 / 등의 지역에서 조직을 파악하고 전방 측을 향해 조직을 리프트 / 당깁니다. 참고 : 반대측 중격 조직이 실수로 hemisection 단계 (단계 3.20) 동안 제거 할 수 있습니다. 이러한 경우에, 흰색, 무 혈관 중격 연골과 약간 투명, 혈관 중격 뼈를 관찰합니다. 이 경우, 스텝 8.8은 생략 될 수있다. </li><li> 조심스럽게 중격 연골과 VNO &quot;날개&quot;(두 VNOs의 지느러미 가장자리를 따라 실행 뼈 조직의 얇은 조각 사이의 미세 집게의 단일 지점을 실행하여 반대측 VNO를 제거합니다. <ol><li> 연골의 날개 분리 후, 배쪽으로 집게의 끝으로 이동중간 선 부근 반대측 VNO에. 집게로 잡고 멀리 들어 올려 제거 할 수 있도록, 그것을 풀어야 반대측 VNO의 주동이 / 꼬리 축을 따라 여러 위치에서이 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 미세 집게와 꼬리 / 복부 가장자리에 상처를 (그것이 중격 뼈의 복부 가장자리를 따라 흰색 무혈성 지구 실행에 좁은 곳)함으로써 중격 연골을 제거하기 위해 준비합니다. </li><li> 반 무딘 점을 만들기 위해 함께 미세 집게를 집어 중격 연골을 제거합니다. 단계 4.6에서 만든 컷을 확인, 해당 컷에 (측면) 뒤에 슬쩍 집게를 삽입 한 다음 천천히 중격 조직에서와 rostrally 진행 연골을 들어 올립니다. 참고 : 기본 중격 조직을 방해하지 마십시오. 연골 들어 올릴으로 인해 연골에 느슨하게 유착에 중격 조직 스트레칭의 기본 시트를 관찰합니다. 느슨한의 사이트를 따라 슬쩍 미세 집게의 정기 온화하고 안정된 움직임dhesion 크게 두 구조의 성공적인 분리를 용이하게 할 수있다. </li><li> 중격 뼈를 제거하기 위해 구부러진 팁 # 3 포셉 한 쌍을 사용합니다. 각도 중격 뼈 접근 거의 중격 뼈의 평면에 평행. 중격 조직과 중격 뼈 사이의 곡선 가지를 삽입합니다. 집게와 뼈를 잡고 부드럽게 소공 질의 플레이트 근처에 균열 때까지 앞뒤로 뼈를 이동합니다. NOTE : 일부 경우에, 중격 뼈 소공 질의 플레이트 근처 속보 레지스트 것이다. 이 경우, 부드럽게 단지 4.8 단계를 반복 한 다음, 소공 질의 판에 전방 지느러미 / 복부 축을 따라 중격 골을 득점하는 미세 집게를 사용합니다. </li><li> 입구에 미세 집게 일쌍으로 곤란 및 미세 집게의 또 다른 쌍의 rostrally 당겨 단지 VNO에 주동이의 흰색 연골을 제거합니다. </li><li> 빠른 관류 장치에 폴리이 미드 정맥을 연결하고 폴리이 미드 캐 뉼러를 통해 링거액 (0.1 ~ 0.3 ㎖ / 분)의 흐름을 시작합니다.NOTE : 라인, 작은 양의 유량계 측정 유량. 컴퓨터 제어 공기 부양 스위칭 장치의 사용은 자극시 유량의 변화를 줄일 수 있습니다. 응답을 자극 특정 보장하기 위해 모의 자극 (링거액을 제어)에 대한 응답으로 자극을 테스트하는 신경 반응을 비교. </li><li> VNO 입구 정맥 평행의 방향. 캐 뉼러가 만족 VNO 입구 평행하면 출구 압력이 VNO이 원인으로, 혈관의 피난 선도 &quot;팽창&quot;본다. 바로이 VNO 개방 평행하게되도록 정맥 상수의 각도를 유지하는 VNO에 캐 뉼러를 삽입합니다. 참고 : 플라스틱 판자에 대한 미세 집게 일쌍과 정맥을 잡고 약간 위쪽 각도로 정맥의 끝을 미세 집게의 또 다른 쌍을 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 하나의 실수 VNO 뒤에 뉼러를 배치하는 경우, 유출은 VNO 혈관에게 발생할 수대피, 적절한 삽관을 수행 한 인상을 선도. 적절한 위치는 링거 용액에 염료를 혼입에 의해 확인 될 수있다. 정맥이 제대로 배치되면, 염료 만해야 VNO 입구를 통해 종료합니다. 또한, 하나는 정맥이 VNO의 반투명 중간 부분을 통해 쉽게 볼 수 있음을 확인하여 적절한 위치를 확인할 수 있습니다. </li><li> AOB가 VNO에서 정맥을 제거하지 않도록주의하고, 표준 ACSF의 직접 교류가 될 때까지 천천히 플라스틱 판자를 이동합니다. 해부가 완료되고 생리 기능의 평가는 즉시 시작할 수 있습니다. 5 단계는 간단히 이러한 평가를 만들기위한 한 가지 방법에 대해 설명합니다. </li></ol> 5. 평가 <ol><li> 세포 증폭기 및 오실로스코프에 연결된 2-4 MΩ 붕규산 유리 미세 전극으로 AOB의 표면을 침투. </li><li> 천천히에서 100 ~ 200 ㎛의 깊이에 미세 전극을 사전50 ㎛ / 분의 속도로 표면. 참고 :이 조직의 깊이에, 하나는 미세 전압의 날카로운, 짧은 (~ 1 ~ 2 밀리 초) 편향에 의해 예시 가끔 자발적 활동 전위 파형을 발생합니다. </li><li> 활동 전위 파형을 발생하면, 미세 전극을 발전 정지. </li><li> 관찰 및 / 또는 VSN 활성의 공지 된 활성화 제 (예를 들어, 50 mM의 KCl을 함유 링거액)로 제어 링거에서 자극 전달 솔루션을 바꾸면서 활동 전위 속도를 기록한다. 해부에 성공하면, 활동 전위 속도 또는 지역 현장 잠재력 자극에 의​​존하는 변화는 관찰 할 수있다. 참고 : 모든 AOB 뉴런 (50 밀리미터의 KCl을 포함하는 링거액 등의) 발사 속도의 증가에 따라 모든 자극에 응답합니다. 발사 속도의 자극에 의​​존 감소는 또한 기능적인 연결 및 성공적인 절개를 나타냅니다. 두 개 이상의 뉴런가 발생하는 경우에 그VNO의 자극에 응답하지 않는, 또는 어떤 활동 전위가 여러 전극 침투 후 관찰되지 않은 경우,이 실패 절개를 제안합니다. 이 경우, 새로운 절개는 3 단계에서 시작될 수있다. </li></ol>

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<li>Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+and+transformation+of+sensory+information+in+the+mouse+accessory+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system.</a> Nature. 13, 723-730 (2010).</li>
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저자는 공개 할 관심의 큰 충돌이 없습니다.

이 프로토콜에서 설명하는 VNO-AOB 생체 준비는 생체 내 5-7 급성 라이브 슬라이스 AOB 기능의 17 실험에서 마취 할 수있는 유용한 대안이다. 또한 전기 생리학 및 광학 레코딩을위한 회로 소자를 노출 급성 AOB 슬라이스 실험과는 달리,이 혼합물은 모든 감각 구 심성과 내 AOB의 연결을 유지합니다. 이 또한 생체 방법에 마취라고 할 수 있지만, 마취제의 존재는 반드시 이것과 다른 후각 회로 (18) 정보 처리를 위해 매우 중요합니다 신경 기능, 즉 흥분성 / 억제의 균형을 변경합니다. 제제는 마취제의 사용을 피할 수 있기 때문에, 그리고 AOB 표면이 완전히 superfusate에 노출되기 때문에, 그것은 로컬 신경 처리에 약리 문의 의무이다. 이 준비의 몇 가지 제한 사항이 물론 있습니다. EV가깊은 AOB 층, 많은 억제 과립 세포 <sup...

포유류의 뇌에있는 감각 처리는 일반적으로 감각 입력에서 특정 기능을 추출하고, 각각의 다중 상호 연결의 연결 회로에 걸쳐있다. 감각 경로에서 초기 정보 처리는 정상적인 인식과 행동에 매우 중요합니다. 액세서리 후각 시스템 (AOS)에서 액세서리 후각 망울 (AOB)은 호르몬 균형, 2, 침략 3, 4 각성을 지시 다운 스트림 구조로 감각 주변을 연결하는 주요 신경 회로이다. 이와 같이,이 회로 내의 정보 처리 강하게 동물 행동의 변화에​​ 연계된다. 액세서리 후각 망울이 조밀 한 아래의 주요 후각 망울 (MOB)의 등 / 꼬리 / 후방 측면에서 생쥐와 쥐에 있으며 rhinal 부비동 혈관이. AOB는 vomeronasal 기관 (VNO)에있는 주변 vomeronasal 감각 뉴런 (하여 VSN)의 축삭에서 구 심성 신경 지배를받는, 스말그냥 부드러운 구개 위의 앞쪽 주둥이에있는 L 블라인드 종단 관. 이 축삭은 비강의 내측 경계에서 중격 조직의 섬세한 시트를 통과. 몇몇 연구는 마취 된 쥐 5-7 자유로이 탐험 동물 8을 사용하여 생체 내에서 (예 : 마우스 소변 등) AOS 냄새의 근원에 AOB 신경 반응을 탐색 할있다. 영웅은 () tracheotomies 비 휘발성 냄새를 소개하는 깊은 마취를 보장하고 액체 자극 5-7의 구토물이기도를 막는 것을 방지, 교감 자궁 경부 신경절 6 vomeronasal 기관 5,7 직접 삽관의 (b)의 자극에 참여 생체 내 연구에서 마취 및 (c) 전두엽 절제 유무에 관계없이 craniotomies는 AOB (6)에 전극의 발전을 허용합니다. 깨어 / 연구에게 마이크로 드라이브 8-10 참여 외과 주입을 행동. 결론적으로,이 실험 패러다임은 강력하지만 매우 어려운 종종 마취를 필요로합니다. 11-15로 신체 (생체) 외부 살아 감각 구조 및 다운 스트림 신경 회로를 유지하려고했습니다. VNO와 AOB 간의 연결은 동측 남아 있고, 정중선 중격 티슈는 단일 반구 산소화 superfusate에 노출 될 수 있기 때문에, 우리는 자신의 기능적 연결성을 유지하면서, 이러한 구조를 분리하는 이러한 단일 반구 생체 외 접근법을 개발하기 위해 노력하기 때문에. 우리는 최근에 이러한 목표 16 달성에 성공했다. (중간 선 소프트 중격 조직을 따라) 축삭과 AOB 모두 산소 인공 뇌척수를 (superfused에 액세스 할 수있는 600 μm의 기능 &lt;비교적 얕은 때문에 6 시간 -이 준비 VNO과 AOB 살아 기능적 최소 4에 대한 연결을 모두 유지 ACSF). 이 VNO-AOB 생체 준비 얇은 캐 뉼러를 통해 VNO에 제어 자극의 도입을 허용하고,대상 전극 배치 및 / 또는 라이브 형광 현미경의 작은 AOB에 직접 시각적으로 액세스 할 수 있습니다. 하나는 마취제의 부재에서 이러한 회로를 공부하기를 원하는 경우,이 메소드는 장점이있다. 이 방법은 원심 연결을 끊고이므로, 잘 AOB 기능의 원심 변조에 문의에 적합하지 않다. VNO-AOB 생체 준비는 배우기 어렵지만, 한 번 달성이 강력한 감각 회로 회로 조직, 정보 처리 및 신경 가소성을 조사 할 때 신뢰할 수있는 플랫폼을 생산하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>스트레이트 가위</td><td>파인 사이</td>언스 도구 <td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>파인 가위 - 스트레이트</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>파인 가위 - 곡선</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Adson 집게</td><td>파인 사이</td>언스 도구 <td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>#3 메스 핸들</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>#11 메스 블레이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>직선 탄소강 면도날</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 페트리 디쉬</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-21</td><td></td></tr><tr><td>해부 챔버</td><td>맞춤형&nbsp;</td><td>N/A</td><td>참조 Figure 1</td></tr><tr><td>Delrin 플라스틱 플랭크 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm</td><td>맞춤형&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>다우 코닝 실리콘 진공 그리스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>146355D</td><td></td></tr><tr><td>#5 집게, 학생용</td><td>미세 과학 도구</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>#5 집게, 생물학 팁</td><td>미세 과학 도구</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>#5 집게, 학생</td><td>미세 과학 도구</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>미세 과학 도구</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>1/16" 남성 Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-00</td><td></td></tr><tr><td>1/16" 튜빙</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-129</td><td></td></tr><tr><td>투톤 에폭시</td><td>Grainger</td><td>5E157</td><td></td></tr><tr><td>ValveBank 가압 관류 키트</td><td>AutoMate Scientific</td><td>09-16</td><td></td></tr><tr><td>ValveLink 디지털/수동 컨트롤러</td><td>AutoMate Scientific</td><td>01-18</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 이수화물</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 육수화물</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>시그마-알드리치</td><td>, 다양한</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td> <td>Aldrich</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>myo-inositol</td><td>시그마-알드리치</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>Na-피루브산</td><td>, 시그마-알드리치,</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>Na-아스코르브산</td><td>, 시그마-알드리치,</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충액</td><td>, 시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>다양한</td><td></td> <td>포도당</td><td>시그마-알드리치</td></tr></tbody></table>

본래 vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

마우스 액세서리 후각 시스템 (AOS)는 비 휘발성 사회 냄새, 페로몬, 및 kairomones을 검출하는 전문적인 감각의 통로입니다. AOS 경로의 첫 번째 신경 회로는, 액세서리 후각 망울 (AOB)가, 같은 영토 침략과 짝짓기 같은 섹스의 전형적인 행동을 수립에 중요한 역할을했다. 이 작은 (&lt;1mm 3) 회로는 동종의 분비물과 배설물에 화학 감각 신호의 성별, 긴장, 스트레스 등의 독특한 행동 상태를 구별 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 이 시스템의 컴팩트 한 조직이 동시에 회로의 많은 부분에서 기록에 대한 독특한 기회를 제공하는 동안, AOB에있는 감각 처리의 조사는 크게 인해 뇌의 실험적으로 불리한 위치에 도전 남아있다. 여기, 우리는 연결 떠나, 전방 마우스 두개골의 단일 반구 안에 그대로 AOB를 제거하는 다단계 해부을 보여모두 주변 vomeronasal 감각 뉴런 (하여 VSN) 지역 신경 회로 손상에 이온. 절차는 마취제의 부재 및 전기 생리 AOB 회로 소자로부터 광 기록을 용이하게 외관 검사를 지시하는 AOB 표면을 노출. AOB 다운 스트림 활동을 기록하는 동안하여 VSN을 수용하는 vomeronasal 기관 (VNO)로가는 캐뉼라를 삽입하면, 하나는 직접 사회 냄새와 페로몬에 주위를 노출 할 수 있습니다. 이 절차는 행동의 변화에​​ 페로몬에 노출을 연결하는 메커니즘에 대해 설명해 주실 수있는 AOS 정보 처리에 제어 문의 할 수 있습니다.

이러한 준비와 성공을 달성하는 것은 광범위한 연습이 필요하고, 실패 할 수있는 몇 가지 단계가 있습니다. 하나는 성공을 달성하기 전에 많은 시도를 필요로 할 것으로 예상해야한다. 사용자 지정 해부 실이 프로토콜의 성공적인 완료를 위해 필요하며, 이전에 절개의 이후 단계를 시작하기 얻어야한다. 도 1에 제시된 챔버 설계는이 목적을 위해 충분하며, 최소의 가공 요구에 비교적 저렴한 플라스틱으로 만들어 질 수있다. 하나는 챔버를 생산하는 능력이 부족한 경우, 로컬 또는 온라인 가공 회사에서 협의 될 수 있으며 사용료 챔버를 구성 할 수있다. 준비를 통해 변화의 큰 소스는 실험 동물의 두개골과 주둥이의 뼈의 밀도와 취성이다. hemisection 단계 (단계 3.14-3.20) 동안, 목표 동측 중격 조직 함께 둘 vomeronasal 기관을 분리하며동측 액세서리 후각 망울. 그러나 반대측 반구에 부착 남아 중격 티슈위한 주둥이의 등쪽 뼈 특히 근처 어...

마우스 액세서리 후각 전구 (AOB)는 감각 코딩의 맥락에서 공부하기 어렵다. 여기, 우리는 AOB 신경 마우스 페로몬과 kairomones의 정보 처리에 대한 연구를 촉진, 자신의 주변 입력에 기능적으로 연결되어있는 한 생체 준비를 생산하는 절개를 보여줍니다.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

이 절차의 전반적인 목표는 기능적으로 연결된 마우스 ro 코 기관 또는 VNO, 부속 후각 전구 또는 OB의 생체 외 제제를 생산하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 두개골을 거칠게 해부하여 주둥이와 후각구의 단일 반구를 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 섬세한 VNO 축삭돌기와 OB가 조직 관류 챔버에서 2차 해부를 통해 노출됩니다. 마지막으로, 얇은 캐뉼라를 VNO에 삽입하여 냄새와 자극을 도입할 수 있습니다.궁극적으로, 전기생리학적 기록은 VNO 자극 중 A OB 내의 신경 활동을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 체외 슬라이스 전기 생리학과 같은 기존 기술에 비해 이 기술을 활용하면 감각 기관과 다운스트림 신경 회로가 기능적으로 연결된 상태로 유지됩니다. 배우기 어려운 섬세한 해부 단계가 많고 이러한 단계 중 하나라도 오류가 발생하면 해부에 실패할 수 있기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.1차 해부를 시작하려면 먼저 Addin 집게를 사용하여 마우스 두개골의 두정골과 전두골을 제거하고 후각구에 닿지 않도록 주의합니다.다음으로, 메스를 사용하여 전두엽을 관상동으로 절단하고, 부비동에 2mm 코들링을 한 다음, 절단된 부분에 대한 뇌 코들을 제거합니다. 곧은 가위를 사용하여 부비동과 남아 있는 신경 조직을 남기고 복부 두개골의 노출된 코들 측면을 제거합니다. 두개골의 해부학적 오른쪽에 있는 접합궁과 안면 근육을 제거한 다음 복부 쪽을 위로 돌립니다.입천장을 노출시키려면 즉시 메스 칼날 끝을 입천장과 평행한 팔레트 아래에 삽입한 다음 칼날을 앞니 쪽으로 움직입니다. 팔레트의 자유로워진 가장자리를 집게로 잡고 조금씩 당겨 입천장을 제거합니다. 그런 다음 두개골의 해부학적 왼쪽에서, 메스 칼날 끝부분만 어금니 근처의 빈 공간에 삽입하고, 손목을 돌려 구개공을 조금씩 펴줍니다.어금니 근처의 작은 구멍에서 시작하여 메스 칼날 끝을 사용하여 구개 구멍에서 앞니를 통해 계속 자르고 해부학 적 왼쪽 VNO까지 여러 번의 점수 절단으로 상부를 시작합니다. 그런 다음 조직을 돌려 등쪽 두개골이 위를 향하도록 하고 조직의 복부 가장자리에 있는 준비물의 코들 가장자리에서 직선 면도날을 수직으로 정중선과 평행하게 배치하고 정중선의 바로 왼쪽에 있는 면도날의 절단면을 만지고 Raymond를 위해 왼쪽 구개를 따라 움직이는 칼날을 부드럽게 흔듭니다. 블레이드를 정중선 암석과 평행하게 유지합니다. 면도날은

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Multielectrode 어레이 (MEA) 녹음 뉴런의 대규모 인구의 전기적 활동을 연구하는 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 동시에 조직을 자극하는 동안 마우스 vomeronasal 상피에서 기록 MEA 준비의 세부 사항을 제시한다.

Vomeronasal 상피의 Multielectrode 배열 레코딩

마우스에서 페로몬을 감지하는 능력은 원칙적 vomeronasal 기관 (VNO)에 의해 중재됩니다. 여기, 칼슘 이미징을 수행하는 VNO의 급성 조직 슬라이스 준비가 설명되어 있습니다. 이것은 생리적 접근 방식은 살아있는 조직에 subpopulations 및 / 또는 개별 뉴런의 관찰이 가능하고 수용체 - 리간드 식별 편리합니다.

이미징 페로몬은 마우스 Vomeronasal 급성 조직 슬라이스 준비에 감지

서골비기관(VNO)은 사회적 및 생식 정보를 전달하는 종내 화학 신호를 감지합니다. 본 연구진은 VNO 조직에서 G-CaMP2를 발현하는 형질전환 생쥐를 사용하여 Ca2+ 이미징 실험을 수행하였습니다. 이러한 접근 방식을 통해 수많은 페로몬 자극에 대한 서골비 뉴런의 복잡한 반응 패턴을 분석할 수 있습니다.

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

이 비디오는 쥐 성기 장기(VNO)의 분리 및 진동 절편을 위한 조직 준비에 대해 간략하게 설명합니다. 섹션은 특정 감각 뉴런 그룹의 생물물리학적, 생리학적 특성을 특성화하는 데 사용됩니다.

Vibratome Sectioning을 위한 Mouse Vomeronasal Organ의 준비

이 비디오는 천공 패치 클램프 기술을 사용하여 마우스의 후각 감각 뉴런(OSN)을 전기생리학적으로 기록하는 방법을 보여줍니다. 형광단이 부착된 냄새 수용체를 가진 OSN을 포함하는 후각 상피는 마우스에서 분리되어 기록 챔버에 고정됩니다. 기록 피펫은 OSN의 수지상 손잡이에 고정되고 피펫 내의 니스타틴은 멤브레인에 구멍을 뚫어 세포와 전기적 연결을 형성합니다. 마지막으로, 다른 피펫을 사용하여 냄새 자극제를 전달하고 패치된 세포의 전기 생리학적 활성을 기록합니다.

생쥐의 후각 감각 뉴런에 대한 천공된 패치 클램프 기록

프로토콜 비디오는 마우스의 vomeronasal organ(VNO)의 감각 뉴런에서 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프를 설정하는 방법을 설명합니다. 형광 표지된 감각 뉴런이 있는 코로나 VNO 슬라이스가 기록 설정에 배치됩니다. 표지된 뉴런은 화학적 자극에 대한 반응으로 전기생리학적 기록을 위해 전체 세포 구성의 기록 피펫으로 패치됩니다.

Vomeronasal Sensory Neuron의 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 구축

보존 해부 조직 본래대로 마우스 비강 조직을 준비하는 효과적인 수동 발골 방법

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

여기에서는 전체 세포 패치-클램프 기록을 사용하여 마우스 조개 기관의 급성 관상 조직 절편에서 정의된 감각 뉴런 집단을 식별하고 심층 분석할 수 있는 생리학적 접근 방식을 설명합니다.

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

후각 감각 뉴런은 적절한 신경 회로를 만들기 위해 다양한 축삭 정렬 분자를 발현합니다. 이 프로토콜은 후각 감각 뉴런의 축삭 종말에 축삭 - 정렬 분자의 조합 표현을 시각화하기 위해 면역 조직 화학 염색법을 설명합니다.

후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법

이 기사는 단일 핵 RNA 시퀀싱을 목적으로 쥐 후각 상피의 해부 및 해리를 위한 간소화된 프로토콜을 제공합니다.

단일 핵 현탁액을 위한 마우스 후각 상피의 신속한 해부 및 해리

배우세요 생체 외에서 기능적으로 연결된 쥐의 비강기관과 부속 후각 망울을 준비하는 방법을. 정교한 해부 기술로 감각 신호 처리를 연구하고 전기생리학적 기록을 통해 신경 활동을 측정합니다.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

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