Name: 심방과 심실에서 심장 근육 세포에 관형 막 네트워크 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 배우세요 심근세포의 관형 막 네트워크 분석 방법을 성인 마우스 심장에서 심방 및 심실 세포를 분리하고 형광 현미경으로 정량 분석하는 기법입니다. 이 방법은 심장 생리학 및 병리학 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (S.E.L.의 하위 프로젝트 A05 및 B05) 및 KFO 155 (S.E.L.의 하위 프로젝트 4)의 지원을 받았으며, E.W.를 지원하는 S.E.L.에 대한 Halbach 재단 상, S.W.에 대한 독일 심장 학회의 보조금, 메릴랜드 대학의 방문객으로 T.K.를 지원하는 DAAD 교환 프로그램의 지원을 받았습니다. 이러한 결과로 이어진 연구는 보조금 계약 번호에 따라 유럽 공동체의 7차 프레임워크 프로그램 FP7/2007-2013에서 자금을 지원받았습니다. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat(S.E.L.로). S.E.L.은 독일 심혈관 연구 센터(DZHK)의 수석 연구원입니다.

<ol><li>Prosser, B. L., Ward, C. W., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Ca2%2B+signaling+in+the+heart+the+role+of+ryanodine+receptor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular Ca2+ signaling in the heart the role of ryanodine receptor sensitivity.</a> J Gen Physiol. 136 (2), 135-142 (2010).</li>
<li>Wehrens, X. H., Lehnart, S. E., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+release+and+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium release and cardiac disease.</a> Annu Rev Physiol. 67, 69-98 (2005).</li>
<li>Cheng, H., Cannell, M. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+excitation-contraction+coupling+into+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Propagation of excitation-contraction coupling into ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 428 (3-4), 415-417 (1994).</li>
<li>Williams, G. S., Chikando, A. C., Tuan, H. T., Sobie, E. A., Lederer, W. J., Jafri, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+calcium+sparks+and+calcium+leak+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of calcium sparks and calcium leak in the heart.</a> Biophys J. 101 (6), 1287-1296 (2011).</li>
<li>Sperelakis, N., Rubio, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R.+orderly+lattice+of+axial+tubules+which+interconnect+adjacent+transverse+tubules+in+guinea-pig+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">R. orderly lattice of axial tubules which interconnect adjacent transverse tubules in guinea-pig ventricular myocardium.</a> J Mol Cell Cardiol. 2 (3), 211-220 (1971).</li>
<li>Soeller, C., Cannell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B.+of+the+transverse+tubular+system+in+living+cardiac+rat+myocytes+by+2-photon+microscopy+and+digital+image-processing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">B. of the transverse tubular system in living cardiac rat myocytes by 2-photon microscopy and digital image-processing techniques.</a> Circ Res. 84 (3), 266-275 (1999).</li>
<li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">et al. ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li>
<li>Oort, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+junctional+membrane+complexes+and+hyperactive+ryanodine+receptors+after+acute+junctophilin+knockdown+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Disrupted junctional membrane complexes and hyperactive ryanodine receptors after acute junctophilin knockdown in mice.</a> Circulation. 123 (9), 979-988 (2011).</li>
<li>Wagner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+emission+depletion+live-cell+super-resolution+imaging+shows+proliferative+remodeling+of+T-tubule+membrane+structures+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Stimulated emission depletion live-cell super-resolution imaging shows proliferative remodeling of T-tubule membrane structures after myocardial infarction.</a> Circ Res. 111 (4), 402-414 (2012).</li>
<li>Asghari, P., Schulson, M., Scriven, D. R., Martens, G., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+tubules+of+rat+ventricular+myocytes+form+multiple+junctions+with+the+sarcoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Axial tubules of rat ventricular myocytes form multiple junctions with the sarcoplasmic reticulum.</a> Biophys J. 96 (11), 4651-4660 (2009).</li>
<li>Lukyanenko, V., Ziman, A., Lukyanenko, A., Salnikov, V., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+groups+of+ryanodine+receptors+in+rat+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional groups of ryanodine receptors in rat ventricular cells.</a> J Physiol. 583 (Pt 1), 251-269 (2007).</li>
<li>Shacklock, P. S., Wier, W. G., Balke, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+transients+%28Ca2%2B+sparks%29+originate+at+transverse+tubules+in+rat+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ transients (Ca2+ sparks) originate at transverse tubules in rat heart cells.</a> J Physiol. 487 (Pt 3), 601-608 (1995).</li>
<li>Reynolds, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctophilin-2+is+necessary+for+T-tubule+maturation+during+mouse+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Junctophilin-2 is necessary for T-tubule maturation during mouse heart development.</a> Cardiovasc Res. 100 (1), 44-53 (2013).</li>
<li>Di Maio, A., Karko, K., Snopko, R. M., Mejia-Alvarez, R., Franzini-Armstrong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+formation+in+cardiac+myocytes+two+possible+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">T-tubule formation in cardiac myocytes two possible mechanisms.</a> J Muscle Res Cell Motil. 28 (4-5), 231-241 (2007).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+density+of+transverse+tubules+and+L-type+Ca%282%2B%29+channels+in+canine+tachycardia-induced+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Reduction in density of transverse tubules and L-type Ca(2+) channels in canine tachycardia-induced heart failure.</a> Cardiovasc Res. 49 (2), 298-307 (2001).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2%2B+release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circ Res. 102 (3), 338-346 (2008).</li>
<li>Lyon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+T-tubules+and+other+changes+to+surface+topography+in+ventricular+myocytes+from+failing+human+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Loss of T-tubules and other changes to surface topography in ventricular myocytes from failing human and rat heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6854-6859 (2009).</li>
<li>Crossman, D. J., Ruygrok, P. N., Soeller, C., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+organization+of+excitation-contraction+coupling+structures+in+failing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in the organization of excitation-contraction coupling structures in failing human heart.</a> PLoS One. 6 (3), e17901(2011).</li>
<li>Kemi, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+exercise+training+on+transverse+tubules+in+normal%2C+remodeled%2C+and+reverse+remodeled+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of exercise training on transverse tubules in normal, remodeled, and reverse remodeled hearts.</a> J Cell Physiol. 226 (9), 2235-2243 (2011).</li>
<li>Sachse, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+structures+and+function+of+myocytes+impaired+during+heart+failure+are+restored+by+cardiac+resynchronization+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular structures and function of myocytes impaired during heart failure are restored by cardiac resynchronization therapy.</a> Circ Res. 110 (4), 588-597 (2012).</li>
<li>Arakel, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+electrical+properties+of+the+heart+by+differential+trafficking+of+KATP+ion+channel+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tuning the electrical properties of the heart by differential trafficking of KATP ion channel complexes.</a> J Cell Sciences. 127 (Pt 9), 2106-2119 (2014).</li>
<li>Richards, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transverse+tubules+are+a+common+feature+in+large+mammalian+atrial+myocytes+including+human%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transverse tubules are a common feature in large mammalian atrial myocytes including human.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1996-H2005 (2011).</li>
<li>Trafford, A. W., Clarke, J. D., Richards, M. A., Eisner, D. A., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+microdomains+and+the+t-tubular+system+in+atrial+mycoytes+potential+roles+in+cardiac+disease+and+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling microdomains and the t-tubular system in atrial mycoytes potential roles in cardiac disease and arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 98 (2), 192-203 (2013).</li>
<li>Greiser, M., Schotten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+remodeling+of+intracellular+Ca2%2B+signaling+during+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic remodeling of intracellular Ca2+ signaling during atrial fibrillation.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 134-142 (2013).</li>
<li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2%2B+transients+and+membrane+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> J Vis Exp. (77), 10-3791 (2013).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+genetic+manipulation+of+adult+cardiac+myocytes+for+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging.</a> J Vis Exp. (31), (2009).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>King, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intact+cardiac+myocyte+mechanics+cross-bridge+and+titin-based+stress+in+unactivated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mouse intact cardiac myocyte mechanics cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells.</a> J Gen Physiol. 137 (1), 81-91 (2011).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%2C+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji, an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+histological+sections+Application+to+mammary+gland+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of histological sections Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li>
<li>Liu, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale+space+approach+to+directional+analysis+of+images%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Scale space approach to directional analysis of images.</a> Appl Opt. 30 (11), 1369-1373 (1991).</li>
<li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem Biophys Res Commun. 72 (1), 327-333 (1976).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li>
<li>Kohl, T., Westphal, V., Hell, S. W., Lehnart, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+in+heart+-+cardiac+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy in heart - cardiac nanoscopy.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 13-21 (2013).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 존재하지 않는다고 선언합니다.

심장 근세포 절연 및 32 년간 연구되어 왔지만, 최근의 리뷰가 일관된 고품질 근세포 절연 부 (27)가 도전 남아 있다고 결론 지었다. 이것은 힘? 힘 공통 표준 접근의 부족, 공유 메타 데이터 및 투명 세포 품질의 문서 기본 심장 근육 세포의 분리를위한 상대적으로 복잡한 프로토콜을 반영한다. 세포 격리 프로토콜은 일반적으로 개별 그룹에 의해 정의되고, 세포 분리의 변수 결과를 생산 개별 모델 설정 (예를 들어, 종, 연령, 공존 심장 조건)에 따라, 일반적으로 특정 실험 조건에 대한 조정됩니다. 멤브레인 연구 및 프로토콜이 여기에 제시된 정량적 TATS, 품질 평가 및 문서의 필수 레벨의 컨텍스트 내에서 대사 및 분리 프로토콜에 따라 변화하는 경향이 개별 세포막 구조 또는 공 초점 현미경에 관한 수퍼 해상도 모두AM 또는 VM에서. 중요한 것은, 세포 분리의 높은 수익률이 건강한 그대로 근육 세포를 제안하더라도, 연구자들은 문서화하고 비판적으로 인한 다른 유형에 특정 변경 대 격리 절차의 비 특정 손상에 비해 표면과 TATS 막 무결성의 형태 학적 기준에 따라 신중하게 각각의 셀을 판단 할 필요가 중재의 같은 조건을 제어하는​​ 비교. 심장 세포 격리 중 중요한 변수는 소정의 콜라게나 많은 특정 활동이다. 콜라겐의 새로운 많이 선택하려면 몇 가지 콜라겐 시료의 효소 활성은 심장 근육 세포 수율과 품질을 평가하고, 제조사의 지시에 따라 서로에 대해 테스트해야합니다. 이상적으로, 콜라겐의 새로운 많은이 이전 성공적으로 사용을 많이 유사한 콜라게나 제 활성을 식별된다 (가능한 효소 활동의 확장 된 평가 대상 및 방법 테이블에서 &quot;콜라게나 많은 선택 도구&quot;참조). T함께 AKEN, TATS 막 시각화의 정량적 접근 방법은 세포 격리 품질과, 그 반대의 분리 절차의 중요한 검토 및 수정을 트리거해야 TATS 현미경으로 설명 된대로 불특정 막 손상으로 이어지는 심장 세포 절연 부에 결정적으로 의존한다. 세포 격리 품질과 TATS 막 시각화 및 정량화가 본질적으로 연결되어 있기 때문에,이 문서에서 설명하는 프로토콜은 연속적인 전략으로 모든 주요 측면을 커버합니다. 추가 과제 및 심장 연구, 세포 손상 및 / 또는 세포 손실 일반적인 문제는 심근 경색 9 다음 대사 저해 개입 등으로 인하여 발생할 아직 세포 격리 중 주목 공기 색전증 다음, 전위 부주의 한 파손 등 대해 판단 할 필요가있다. 병든 마음에서 심장 근육 세포의 분리는 추가로 상당한 세포 손실로 이어질 세포 수율을 감소 할 수 있습니다. 따라서, 비교 예세포 격리 및 카운팅 일관 표준화 된 프로토콜을 통해인가되는 경우 제어 및 심장 질병 간의 절연 손상 세포의 총수의 ISON은 의미가있을 수있다. 결과적으로, 최상의 심근 세포 격리 품질을 반영 적절한 대조군을 통해 셀의 무결성을 판단하는 것이 중요하다. 중요한 것은 각각의 셀의 품질과 비교 근세포 또는 질병 건강의 생균 현미경 부주의 크게 TATS 막 네트워크의 분석에 영향을 미칠 수있는 분리 절차에 의해 손상. 여기에 제시된 프로토콜에 따라서 세포 격리 및 양막의 생균 생리 현미경 중에 막 요소의 무결성과 안정성을 강조한다. 전체 흐름은 이러한, membran 파쇄 막 세뇨관 같은 분리 멤브레인 종속 아티팩트를 나타낼 것이기 때문에, 달성하고 손상된 세포를 제외한 상태 그대로 TATS 세포막 성분을 보존하기 위해 연속적으로 설계 전략전자 기흉 및 변경된 TATS 네트워크 잘못 양적 분석 제어 조건에서 타협. 부사장은 반대, 같은 전략은 TATS 막 변경 사실 병에 걸린 세포에 비해 진정한 건강 사이의 의미있는 비교 컨트롤에 결정적으로 의존 TATS 멤브레인을 방해 할 가능성이있는 중재 연구에 중요하다. 또, AM 세포의 기술적 훨씬 더 도전 격리를 달성하는 절차를 다룬다. 진보 및 개선 된 프로토콜에도 불구하고, 그것의 VM 고품질 셀 아이솔레이션을 재현 사소한 심지어 덜 신뢰할 AMS 대없는 것을 강조하는 것이 중요하다. 이것은 VM 세포 손상의 순한 정도 인해 상대적으로 높은 세포에 세포 현탁액 덜 명백 할 수도있는 반면, 세포 격리 중에도 작은 오차 또는 변형이 AM 세포 분리의 완전한 고장으로 이어질 수 AM 세포의 전반적인 낮은 수율로 인해 숫자는 오전에 비해. AM 셀 C가 될 수 있으므로단계 4.3에서 설명 된대로 분리 한 후 urved 여러 ROI를 통해 분석이 유용 할 수 있습니다. 세포 격리 단계의 세부 절차에 따라, 우리는 직접 세포막 염색 및 공 초점 또는 VM 및 AMS 모두 TATS 네트워크의 STED 수퍼 해상도의 영상을위한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 이전에 설정된 매개 변수를 통해 양적 분석과 TATS 세포막의 구성 요소 선택의 차별화를 할 수 있습니다. VM에 비해, 3 차원 조직 및 AMS의 심방 TATS 네트워크의 기능적 동작은 현재 덜 이해된다. 살아있는 세포에서 이미지 TATS 막에 대한 절차는 (3.7 3.1 단계) 상업 공 초점 (자재 / 장비의 표)와 맞춤 STED 형광 현미경 9로 개발되었다. 형광 화상 생성 TATS 및 정량 분석​​을위한 현미경 설정을 최적화하기 위해, 다음과 같은 점은 일반적으로 중요하다 : <ul><li> 목표 </str옹&gt; 경험적으로, TATS 막 구조의 세부 사항을 해결 작은 셀 깊은 몇 마이크로 미터를 포커싱하는 동안 높은 이미지 품질을 제공하는 객관적인 테스트하기 위해. 특정 공 초점 현미경 여기에 사용 63X 1.4 NA 오일 목적 대조적으로, 물이나 글리세롤 목표에 더 잘 수행 할 수있다. 100X 배율의 목표는 나노 미터 해상도 34에 작은 시야각을 거래, 수퍼 해상도 STED 현미경에 사용됩니다. </li><li> 여기 및 이득 여기 전력 검출기 이득의 최적 설정은 현미경 광로 레이저 성능 및 샘플 특성에 의존한다. 이상적으로는, 레이저 출력과 이득은 검출기의 전체 범위를 활용하면서도 화상 포화를 피하기 위해 조정된다. 현미경 상용 소프트웨어 패키지는 일반적으로 동적 범위의 하한 및 상한을 시각화 룩업 테이블을 제공한다. 또한, 염료 표백 최저 리터를 사용 최소화아직 충분한 구조 TATS 막 세부 사항을 제공 aser 전원. 또한, 구동 전력은 심근 경축 및 죽음에 이르는 누적 사진 손상을 방지하도록 충분히 낮아야한다. </li><li> 픽셀 크기 나이 퀴 스트 (Nyquist) 샘플링과 호환되는 픽셀 크기, 주어진 설정으로 달성 절반 정도의 해상도를 사용합니다. 촛점 촬상 100 nm의 X 100nm의 픽셀 크기는 표백 제한되는, 호환된다. 수퍼 해상도 현미경은 상당히 작은 픽셀 크기는 STED 현미경 9 예를 들어, 20 나노 미터 × 20 nm의 사용됩니다. </li><li> 전환 시간 공 초점 현미경 평균화 기능을 제공한다. 일반적으로, 신호 평균화 예와 조합 표백 않도록 최단 화소 체류 시간을 사용하여, 라인 평균 ≥ 8은 신호 - 대 - 잡음 비율을 향상시키기 위해. </li><li> 메타 데이터를 통해 응용 현미경 설정을 문서화 에 어떻게 설정되면TATS 막 구조의 이미지 세부 사항은 특정 공 초점 현미경에 안전 최적화 및 / 또는 설정 (프로토콜 메타 데이터)를 문서화 하였다. 같은 목적, 여기 전력, 이득, 픽셀 크기, 픽셀 체류 시간, 평균 기능 세포의 (또는 사이) 그룹 (들) 내의 모든 이미지를 획득. 평등 이미징 조건은 세포의 (또는과) 그룹 (들) 내에서 직접 비교하고 정량 할 수 있습니다. </li><li> 일반적인 지침과 원칙 및 공 초점 현미경의 응용 프로그램에 대한 자세한 사항은 생물 공 초점 현미경 (Pawley JB, 제 3 판, 2006, 스프링 과학 + 비즈니스 미디어, LLC)의 핸드북을 참조하십시오. </li></ul> 여기에 제시된 직접 분석 전략, TATS 막과 질병 관련 변경 사항을 설명하는 이전의 출판물과는 달리 푸리에 TRANSF에 따라 양적 전략 16, 17, 또는 간접적으로 지역 전략으로 T-세관 밀도의 지역 집계 판독을 사용했다T-세뇨관 성분 7 규칙 성을 평가하기 위해, 선 형상의 막 신호 ormation 분석. 대조적으로, 여기에서 설명하는 양적 접근 방식은 직접 개별 TATS의 구성 요소와 관련된 멤브레인 네트워크 특성과​​ A-세관의 비율과 같은 특정 구성 요소를 포함하여 추가 매개 변수를 제공한다. 또한, TATS 네트워크 밀도는 ROI 면적당 전체 추출 골격의 길이로 정규화 정량화 될 수있다. 세 개인의 삼중 접합의 개수는 연속적으로 연결된 세뇨관 성분은 TATS 막 네트워크 분파 복잡도의 측정치로서 사용될 수있다. 우리는 작은 TATS 구성 요소의 분석은 염색 절차에 따라 있습니다. 우리의 경험에 의하면, 50 μM 디 - 8 - ANEPPS 용액 800 μL은 50,000 VM 세포 구를 포함하는 세포 펠렛에 완료 TATS 네트워크를 염색하기에 충분하다. 그러나, 세포 펠렛은 심장 근육 세포의 낮은 숫자가 포함 된 경우강력한 형광 검출기를 사용할 수 있으며, 경우에 작은 막 자세한 내용 및 양적 변화가 관심있는 것이 아니라 전체 TATS 네트워크 분포의 공 초점 이미징, 낮은 염료 농도는 실제 테스트를 기반으로 사용할 수있다합니다. 마지막으로, 설명 된 분석 용으로 작성된 소프트웨어 매크로 다른 처리 군 (예를 들면, 약물), 세포 유형 간의 비교를 위해 특히 유용하다 더 큰 데이터 세트의 분석을 용이하게하는 화상 처리 단계를 자동화하는데 사용될 수있다 (예를 들면, VM 대 AM ) 및 병태 생리 학적 개입 (예를 들어, 심근 경색 대 가짜). TATS 네트워크의 화상 분석을 위해, 원칙적으로 다음과 같은 일련의 단계가 적용된다 : 1) 압연 공 배경 차감 (4.5.1)이 배경 강도의 공간적 변화를 제거하는 단계; 2) 지역 대비 향상 (4.5.2).; 3) 이미지 다듬기 (4.5.3); 4) 통계 영역 병합 (4.5.4); 5) 정의이미지 이진화의 임계 값 (4.5.6); 골격 데이터 및 6) 계산 (4.5.8). 형광 TATS 화상의 골격 화 동안 중요한 단계는도 6에 도시 된 이미지 이진화이다. 연관된 임계 단계 궁극적 진정한 막 구조가 배경 잡음에서 에러로 식별 잠재적으로 잘못된 구조 대 기초 TATS 성분을 나타내는 검출 된 정의한다. 바이너리 이미지 분석을위한 정확한 임계 값의 식별은 공 초점 현미경 및 수퍼 해상도 접근법위한 충분히 높은 신호 - 대 - 잡음 (SNR)에 따라 각 비율에 해당 TATS 막 구조와 일치한다. 따라서, 충분한 화상 품질이 제 명시된이어서 시야 화상에 의해 문서를 포함 개별 셀의 품질 판단의 임계 결합이 확립되어야한다. 다른 옵션은 주어진 현미경 데이터 출력 및 / 또는 PHY들에 대한 이미지 분할 프로토콜 적응학적 질문 이미지 디컨 볼 루션과 ImageJ에 플러그인으로 사용할 수 &quot;오츠&quot;또는 &quot;이소 데이터&quot;와 같은 다른 임계 절차를 포함한다. 관계없이 최종 분할 절차, 우리는 이미지 오버레이 의해 추출 된 원시 데이터 간의 비교 필수 품질 관리 단계를 고려한다. 요약하면, 각각의 절연 근세포, 세포 TATS 막의 충분한 염색, 형광 촬상 용 파라미터 최적화, 추출 골격 데이터의 오버레이 제어의 형태와 막 무결성 모두 형광 TATS 이미지 및 정량 결과의 품질에 기여한다. 마우스보다 큰 종 세포 분리에 사용하는 경우, 프로토콜은 용이하게 적절히 적용될 수있다. 다음으로 큰 종이를 들어, 쥐의 마음이 무딘 14 G 정맥 (외경 2.1 mm)와 유관 할 수 / 분 8 ML에서 관류. 크게 세 또는 질병 마음 더 큰 정맥의 크기를 필요로 할 수있다. 유전자에RAL 심장 관류는 저장조 및 대동맥 사이 또는 연동 펌프를 사용함으로써 일정한 흐름 1m 높은 물 컬럼을 사용하여, 일정한 압력에 의해, 예를 들면 어느 수행 될 수있다. 콜라게나 소화는 결국 일정한 흐름 프로토콜에 의해 어느 정도 제어됩니다 누출 용기 침대에서 과도한 관류 속도로 최고의 관상 동맥 저항 혈관을 방해하기 때문에 쥐와 쥐 같은 작은 설치류 마음에서 세포 격리를 들어 일정한 흐름이 유리할 수있다. 유량 및 정확한 삽관의 모니터링이 변경된 혈관상 저항 행동 중재 모델뿐만 아니라 세포 격리 절차 훈련 유리하다 우선,하면 반대로 정압 관류 유리하다. 위에서 설명한 바와 같이, 충분한 셀 품질이 내생 멤브레인 시스템의 정량적 연구에 매우 중요합니다. 그러나, 심장 관류 및 콜라게나 소화하는 동안 수많은 요인 CR 수 있습니다itically는 프로토콜 최적화 또는 문제 27 촬영 중 과소 평가해서는 안 세포 격리의 품질에 영향을 미칩니다. 특히, 주어진 콜라게나 로트의 활성 연구의 나머지 부분에 걸쳐 유지 될 관심 예 : 심방 또는 분리 조건을 설정하는 실험 선의 연구의 실행에 앞서 심실의 특정 조직에 대해 결정되어야한다. 또한, 관류 설정의 수질, 산도, 온도, 최적화 및 청소 오염물 및 색전에서 부주의 한 손상의 위험을 최소화하고, 잠재적으로 추가적인 요인은 세포 격리 중에 최적의 항상성의 조건을 확립하기 위해 모니터링되어야한다. BDM (2,3 - 부탄 - monoxime) 마이 오신 ATPase의 크로스 다리의 가역적 억제제는 일반적으로 세포 아이솔레이션의 수율을 증가 심장 근육 이완을 유지하기 위해 조직의 절개 및 소화 중에 사용됩니다. 그럼에도 불구하고, 연구자들은 t 필요오 BDM 오프 대상 효과 예를 들어, 특정 조건 33에서 나 + / 칼슘 교류 전류의 억제로 이어지는 비 특정 포스 파타 아제의 활동을 행사할 수도 있다는 점을 유의해야합니다. 일부의 실험은 독성이 비교적 고가 심정지 솔루션, 그러나,이다 마이크로 몰 농도의 마이 오신에 대한 높은 선호도 억제제로 blebbistatin에 의해 BDM을 대체하는 것이 유리할 수 있습니다 및 기타 오프 대상 영향을 미칠 수 있습니다. 휴식 건강한 심근 추가 분석에서 제외해야 전기 자극하고 세포의 부재에있는 수축을 보여주지해야한다. 한편, 생체 외 칼슘 농도에서 전기 자극에 응답하여 심장 근육 세포의 수축과 이완에 건강 관리 대 심장병 기능성 셀의 품질 및 / 또는 비정상적인 행동을 평가하기 위해 추가적인 수단으로 정상적인 수축 거동을 확립하는데 사용될 수있다 세포. (21)뿐만 아니라 용의 미세 소관 네트워크의 정량 분석을 VM 9 TATS 막 네트워크의 촛점 및 수퍼 해상도 현미경 적용 및 AM되었습니다 고정 심장 근세포 (데이터 미도시). 이러한 서로 다른 발달 단계에서 TATS 멤브레인의 특성 또는 TATS 네트워크를 문의 막 관련 단백질 또는 세포 내 소기관 구조의 분석과 같은 실험 다양한 질문에 대한 길을 열 수있는 프로토콜이와 미래의 응용 프로그램은 매우, 도메인 특정 신호 지역화 발휘 AM 및 VM 세포의 기능을한다.

건강한 횡문근 세포에서 세포 주 축에 수직 &quot;횡&quot;방향 (T-세뇨관)와 관형 막 구조는 풍부하다. 결과적으로, T-세뇨관 깊게 셀 중심쪽으로 세포질 침투 근육 세포 주 &quot;측&quot;표면 막 (sarcolemma)의 지속적인 확장으로 특성화되었다. 외면 막 연속 T-세뇨관의 생리 학적 역할은 전압 - 활성화 된 L-타입 칼슘의 나노 근접 결합에 의해 비교적 큰 심장 근육 세포 부피에 걸쳐 SER 소기관 접촉 영역에 의해 형성 원격 세포 내 구획의 급속한 전기적 결합이다 2+ 채널 인접 ryanodine 수용체 (RyR2) SER 칼슘 릴리스를 활성화 전류 (I CA) 안쪽 (Cav1.2). 접합부의 SER 도메인과 T 사이의 심실 근세포 (VM에), 비 연속 막 친구 ( &quot;접합&quot;)에-tubules는 각 셀에 하나의 개별 세포 내 칼슘 릴리스 nanodomains의 수천을 제어 할 것으로 생각된다. 주어진 도메인에 대해 접촉, 병치 막 부 T-세관과 주연 (접합부) SER 각각은 서로 가까이 15 nm의 nanodomain 그러므로 정의는 대략이다. 따라서, 아주 작은 개인의 세포질 부분 공간은 준 세포 자율 구획 동작을 가능하게하는 분리된다. 들어오는 활동 전위가 VM을, 상대적으로 작은 칼슘의 T-세관에서 Cav1.2 채널을 활성화하면 2 + 안쪽으로 전류가 빠르게 attoliter 크기 nanodomain 하나의 부분 공간 칼슘 농도 [칼슘] S 증가합니다. 다음에, [칼슘] 2 + S 증가 -gated ryanodine 수용체 (RyR2) 병치 SER 막 접합에 나노 미터 근방에서 칼슘을 활성화하고,이 결합 프로세스는 모두 전기적으로 연결 걸쳐 발생D의 심근 nanodomains. RyR2s 5-10 RyR2 채널이 1 Cav1.2 채널 추정 화학량 론과 같은 고밀도 멀티 채널 클러스터를 발생한다. SER 대 세포질 때문에 [CA는 2 +] 구배는 매우 가파른 (비율 10 4 : 1)이고 RyR2s 기능적으로 결합 된 클러스터에서 높은 컨덕턴스 칼슘 방출 채널 기능, 정량적 큰 칼슘에 RyR2 활성화 결과 2+ 1-2 밀리 3,4에서 100 μM 이상으로 [칼슘 2 +] S 지역 부분 공간을 증가 T-세관 결합 접합부의 SER 도메인의 현재 놓습니다. 이 심장 신호 증폭 동작은 또한 칼슘 릴리스 (CICR) 유도 칼슘 2라고합니다. 이와 함께, T-세관 빠르게 여기 수축 (EC) 커플 링 중 접합부 nanodomain의 SER 연락처와 세포 전체 CICR을 통해 칼슘 방출 신호를 활성화 필수적인 막 구조이다. T-세뇨관에 더하여, 축 세뇨관메인 (종 방향) 셀 축에 상당히 상이한 방향에 평행으로 S (A-세뇨관)는 전자 현미경 (EM) 및 공 초점이 광자 현미경 연구에 의해 설명되었다. 예를 들어, 근절의 Z-라인 근처에 T-세관과 상호 근원 섬유 사이의 A-세관의 셀 전체의 연속 격자 세포 추적자 고정 기니 돼지의 VM (5)의 EM 영상으로 표시했다. 세포 외 덱스 트란 연결된 형광 염색법을 사용하여 쥐의 VM의 2 광자 이미징을 살고, 복잡한 망상 3D 세관 네트워크는 ~ 60 % T-세관 및 ~ 40 % A-세관 6 이루어진 시각화했다. 이 연구는 또한 EM 시각화 단면하는 것은 본질적으로 가로 축 세관 시스템 (TATS)와 같은 복잡하고 역동적 막 네트워크의 분석을 위해 제한되어 있음을 실현, 풍부한 A-세관의 3D 시각화에지도하지. 따라서, TATS 세포막의 공 초점 라이브 세포 이미징 직접 염색 디 - 8 - ANNEPS이 개발되었다. 만약 라이브 셀TATS 네트워크는 푸리에 변환에 의해 분석되고, 근절의 Z-선 근처의 공간에서 T-세뇨관 성분의 정규 외관 줄이있는 신호들 (7)의 영역에서 앙상블 파워 스펙트럼에 의해 반사된다. 이 간접 분석 전략은 질병 모델 7 TATS 컴포넌트 규칙에서 셀 전체의 지역 변경을 검출하기 위해 사용되어왔다. 예를 들어, shRNA를 매개 junctophilin-2 노크 다운 심부전 및 이소 특정 단백질 결핍 nanodomain 칼슘 방출 장애 8 T-세관 개편 결과가 발생했습니다. 우리는 최근 직접 정량 방법을 통해 더욱 유도 방출 고갈 (STED) nanoscopy 9를 사용하여 마우스의 VM에서 TATS 개별 성분의 생균 수퍼 해상도 현미경 TATS 막 네트워크 분석을 확장 하였다. 횡 방향의 분포를 대략 50:50 작은 TATS 개별 성분의 직접 분석에 허용 나노 이미지 해상도축 세관 방향 대, 정량적으로 건강한 마우스 마음 9이 풍부한 아직 차동 중심의 개별 TATS 구성 요소를 확인. 이러한 전략은 아래에 더 프로토콜 절에서 설명 될 것이다. 성인 심장의 풍부한 A-세관 구성 요소의 생리 학적 역할은 수수께끼 남아있다하지만, EM 연구는 2 + 내인성 칼슘 기니 돼지와 쥐 VM을 5, 10에서 릴리스 nanodomains을 제안 A-세관과 관련된 SER 막 구조를 설명했다. Cav1.2 RyR2 및 공 촛점 분석은 A-10에 접합 세뇨관 colocalization을 높은 수준을 발견 하였다. VM이 T-세관은 일반적으로 발생하는 Z-라인 줄무늬에서 비교적 멀리 떨어져 유래 쥐에 자연 칼슘 스파크 ~ 20 % 때문에, 하나의 인수는 A-세관 관련 nanodomains이 실제로 존재하고 기능 수있다 칼슘 릴리스 사이트 등 11, 12. 흥미롭게도, T-세관 형성과 성숙 OC단 생후 CURS 및 P5에 전구체 sarcolemmal의 함입의 발아 내지 예 심근 세포의 성장을, 평행 및 미성숙 쥐 13 P10에서 TATS 네트워크 어셈블리 분지. 그것은 Junctophilin-2 shRNA를 노크 다운 이후 출생 TATS 네트워크의 성숙에 중요합니다 지연 칼슘 릴리스와의 미성숙 A-가느 다란 관 지배 구조와 일치 병리학 TATS 조직에 선도적 인 SER 접합에 T-세관 세포막의 고정을 방지 나타납니다 VM을 13. 이러한 관찰은 궁극적으로 개념 증명 T-세관 추가 또는 대체 세포 내 메커니즘 (14)를 통해 변신 할 수 있습니다 A-세관 반면 막 함입의 과정을 통해 형성 될 수 있습니다. 심장 질환의 TATS 막 변화의 특성은 병태 생리 학적 질문에 대한 중요한 연구 분야가되고있다. 페이싱에 의한 심장 failu의 개 모델의 초기 보고서다시 T-세뇨관 Cav1.2 및 전류 (I CA) (15)의 손실을 보였다. 허혈성 심근 병증의 돼지 모델은 T-세관 밀도를 감소 보였다 세포 내 칼슘의 감소 된 동시성 (16)를 해제 2 +. 심부전 자발적으로 고혈압 래트 (SHR) 모델을 이용하여, T-세뇨관의 손실 &quot;orphaning RyR2&quot;의기구에 의해 제안 된 Cav1.2 RyR2과의 커플 링을 감소 nanodomain 연관되었다 (7). T-세관의 손실 또한, 허혈성 확장 성 및 비후성 심근 병증 샘플 17에서 인간의 VM에 표시되어 있습니다. 또한, A-세뇨관의 증가는 인간 동공 심근증 (18)의 조직 섹션에보고 하였다. 심근 경색에 따라, 우리는 A-세뇨관 요소 (9)의 증가에 대비 T-세뇨관의 상당한 감소와 마우스의 VM에서 TATS 재구성 차동기구를 보였다. 중요한 것은, 개선 지역의 막 대비 생균 superre을 통해 달성용액 STED 현미경 전반적인 TATS 네트워크 길이의 증가 및 복잡성 9 분파와 A-세뇨관 상당한 증식을 보였다 직접적인 측정을 통하여 정량 상세한 성분 분석 할 수 있었다. 또한, 심근 경색 19 후 심장 재 동기화 치료는 심방 tachypacing에 의한 심장 마비 (20) 개에 T-세관의 리모델링을 반전으로 이어질 수 있다는 것을 쥐의 T-세관 리모델링을 반전 할 수 있습니다 그 운동 훈련으로 넘어졌습니다. 프로토콜에 설명 아래 부분 결과로 함께 촬영, 병에 걸린 사람과 동물의 VM을뿐만 아니라 잠재적 인 치료 개입의 두 연구는 틀림없이 높은 품질의 세포 격리 절차 및 세부 정량 분석​​ 전략에서 도움이 될 것입니다. KATP 채널의 TATS 막 인신 매매 21 이소 폼 대 측면에 의해 최근에 입증 더욱이, 그것은 심방 m를 고려하는 것이 중요하다yocytes 생물학적으로 구별뿐만 아니라 VM을 대 비교 심장 세포 모델로 (AMS). T-세관은 최근 양, 인간의 AMS (22)에 설명 하였다. 현재 증거는 몇 T-세관이 작은 설치류 (23) 양, 인간,하지만 같은 큰 포유 동물에서 일반적으로 AM 세포에 존재하는 것이 좋습니다. VM을 달리 AMS에서 세포 내 칼슘 방출 2+ 표시 시공간 칼슘 결과 23 그라디언트 셀 중심을 향해 확산에 의해 세포 표면에서 발생하는 전파 나타난다. 이 프레임 워크 내에서 그와 같은 심방 세동 (24)로 세포 내 칼슘 일반적인 질병 형태의 불안정성 신호의 메커니즘을 규명하는 것이 중요 보인다. 요약하면, 건강하고 병에 걸린 마음 모두 AM 및 VM 세포 분리 및 각 일반적으로 프로토콜을 사용된다. 충분한 셀 품질의 미세한 문서에 의해 판단으로 세포 격리가 제대로 수행되는 경우에만, AM 및 VM 샘플은 캘리포니아해야양적 TATS 분석을 위해 앞으로 rried. 따라서, 다음과 같은 프로토콜 섹션은 마우스 또는 그대로 TATS 세포막을 분석하는 라이브 셀 현미경으로 다음에 다른 종에서 분리 된 높은 품질의 세포에 매우 의존한다. 이전에 지적한 바와 같이, TATS 멤브레인의 특성은 고정 및 준비 유물 6, 삼투압 변화로 인해 막 변경 및 기존의 광학 현미경 9의 해상도 제한에 대한 성향을 가진 도전적인 연구 영역이다. 우리는 칼슘 이미징 및 패치 클램프 및 세포 배양에 대한 쥐의 VM 인간의 AMS의 분리를위한 최근의 최첨단 프로토콜 이전에이 일기 (25), (26)에 발표되었다 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Chemicals and Enzymes</td></tr><tr><td>2,3-Butanedione monoxime</td><td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>소 송아지 혈청</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>SH30073</td><td>트리플 0.1 &마이크로; M 멸균 여과.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, 뮌헨, 독일</td><td>21115</td><td>100mM CaCl2 stock 농도를 얻기 위해 MQ 물에 1:10으로 희석했습니다.</td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany</td><td>요청 시</td><td>효소 활성은 개별 콜라겐분해효소 배치에 따라 다릅니다. 콜라겐분해효소 II 및 기타 효소 활성(카제이나제, 클로스트리파인, 트립틱)은 "콜라겐분해효소 로트 선택 도구"에서 평가할 수 있습니다. 각각의 새로운 콜라겐 분해 효소 로트에 대해 세포 수율과 품질을 개별적으로 측정합니다.</td></tr><tr><td>포도당</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Rotexmedica, Trittau, Germany</td><td>PZN-03862340</td><td>0.9% NaCl에 희석하여 복부 피부에 피하 주사.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Forene 100% (V/V)</td><td>Abbott, Libertyville, IL,</td><td>USA B506</td><td>활성제: 이소플루란, 250 ml. 공기/산소 디스펜서 기기에 약 2 Vol%를 사용합니다.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Laminin (2 mg/ml)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>354232</td><td>적층은 2.1단계에서 설명합니다.</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Carl Roth, 칼스루에, 독일</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>8283.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>4984.2</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>HN01.1</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>4721.2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dyes</td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, 다름슈타트, 독일</td><td>D-3167</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td><td>T8154</td> Trypan blue의 스톡 용액 2 mM<td>은 Neubauer 세포분석기에서 세포 계수 전에 팁 컷 1 ml 플라스틱 피펫과 세포 현탁액을 통해 1:1로 부드럽게 혼합됩니다.</td></tr><tr><td colspan="4">Langendorff 관류 설정</td></tr><tr><td>순환 온도 조절기</td><td>Lauda, Lauda-K&ouml; 독일</td><td></td><td>NigsShofen Louch et al.(JMCC 2011)을 참조하십시오. 관류 튜브의 온도 조절기와 버퍼를 37 &deg로 가열합니다. C 사용 15분 전.</td></tr><tr><td>연동 펌프용 유연한 실리콘 튜빙 Tygon</td><td>VWR, 다름슈타트, 독일</td><td>224-2252</td><td>튜빙은 정기적으로 교체해야 합니다.</td></tr><tr><td>온도 조절기 용 유연한 실리콘 튜브 Tygon</td><td>VWR, 다름슈타트, 독일</td><td>228-4340</td><td></td></tr><tr><td>가열 코일 주변 관류 튜브</td><td>Rettberg, G &ouml; ttingen, 독일</td><td>맞춤형</td><td>가열 코일 및 튜브는 사용 후 MQ 물을 통해 철저히 청소해야 합니다. 세제를 사용하지 마십시오. 유리 부품은 정기적으로 목욕해야 합니다&nbsp; 하룻밤 동안 10mM NaOH에서.</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Ismatec, Wertheim, Germany</td><td>ISM830</td><td></td></tr><tr><td>Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm</td><td>Braun, Melsungen, Switzerland</td><td>16500C</td><td></td></tr><tr><td>쓰리 웨이 스톱 수탉 Discofix 3SC</td><td>Braun, Melsungen, Switzerland</td><td>4095146</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instruments</td></tr><tr><td>42 mm 유리 커버슬립</td><td>멘젤 gl&auml; ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>요청 시</td><td>0.13-0.16mm 두께</td></tr><tr><td>Cannula 21 G</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA</td><td>304432</td><td>~5mm 길이로 자르고 사포로 거칠게 합니다.</td></tr><tr><td>Neubauer cytometer 24 x 24 mm</td><td>Menzel Gl &auml용 커버 슬립; ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>요청 시</td><td>0.38-0.42mm 두께</td></tr><tr><td>Graefe 집게, 0.5mm 팁, 약간의 곡선</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710 NLO</td><td>Carl Zeiss, Jena, Germany</td><td></td><td>63X 1.4 NA oil objective</td></tr><tr><td>Neubauer improved cytometer</td><td>Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany</td><td>1100000</td><td>계수 절차: 70% 에탄올이 함유된 계수 챔버와 함께 제공된 세포분석기와 커버슬립을 닦습니다. 계수 챔버의 커버슬립을 부드럽게 눌러 두 개의 유리 표면이 접촉하고 뉴턴의 고리를 관찰할 수 있도록 합니다. 그 후, 10-20 &micro; L cell suspension은 모세관 작용에 의해 공극으로 빨려 들어가기 위해 coverslip의 가장자리에 적용될 수 있습니다. 100 nl을 반영하는 cytometer 그리드의 제곱을 사용하여 온전한 대 결함 myocytes를 계산합니다. 세포분석기에 제공된 두 번째 그리드에서 계수 절차를 반복합니다. 원래 세포 현탁액에 있는 세포의 밀도는 모든 희석을 고려하고 바로 가기를 계산하여 계산합니다.</td></tr><tr><td>POC-R2 이미징 챔버</td><td>Pecon, Erbach, 독일</td><td></td><td>세포 현탁액 부피: 800 & 마이크로; l; 원하는 도금 밀도 : ~ 1,000 AM 및 ~ 10,000</td></tr><tr><td>VM 스프링 가위, 8mm 블레이드 스트레이트, 무딘</td><td>Fine Science Tools, 하이델베르크, 독일</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Student dumont # 7 forceps, inox</td><td>Fine Science Tools, 하이델베르크, 독일</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>학생 홍채 가위, 곡선, 11.5cm</td><td>Fine Science Tools, 하이델베르크, 독일</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>학생 홍채 가위, 스트레이트, 11.5 cm</td><td>Fine Science Tools, 하이델베르크, 독일</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Tissue thumbps, 1 x 2 teeth, slim, 10 cm</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>11023-10</td><td></td></tr></tbody></table>

심방과 심실에서 심장 근육 세포에 관형 막 네트워크 분석

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

심장 근세포에서는 복잡한 막세뇨관 네트워크인 횡축세뇨관계(TATS)가 깊은 세포 내 신호 전달 기능을 제어합니다. 외부 표면 멤브레인 및 관련 TATS 멤브레인 구성 요소는 연속적인 것처럼 보이지만 지질 및 단백질 함량에는 상당한 차이가 있습니다. 심실 근세포(VM)에서 특정 TATS 구성 요소는 매우 풍부하여 직선 세뇨관 네트워크 및 규칙적인 분기 3D 아키텍처에 기여합니다. 말초 TATS 구성 요소는 세포 표면에서 수천 개의 원격 세포 내 육질소포체(SER) 막 접촉 도메인으로 활동 전위를 전파하여 세포 내 Ca2+ 방출 단위(CRU)를 활성화하는 것으로 생각됩니다. VM과 대조적으로, 심방 근세포(AM)에서 TATS 막의 조직 및 기능적 역할은 크게 다르며 훨씬 덜 알려져 있습니다. 종합하면, 건강한 근세포와 병든 근세포에서 TATS 막 네트워크의 정량적 구조적 특성화는 기능적 가소성 및 병태생리학적 재구성에 대한 더 나은 이해를 위한 필수 전제 조건입니다. 여기에서는 살아있는 VM 및 AM에서 TATS 멤브레인 네트워크의 직접적인 정량 분석을 위한 프로토콜의 전략적 조합을 제시합니다. 이를 위해 마우스 VM 및/또는 AM의 1차 세포 분리와 함께 중요한 품질 관리 단계 및 TATS 멤브레인의 형광 이미징을 위한 직접 멤브레인 염색 프로토콜을 수행합니다. 컨포칼 또는 초해상도 TATS 이미지 처리를 위해 최적화된 워크플로우를 사용하여 TATS 네트워크 및 해당 구성 요소의 정량적 분석을 위해 이진화 및 스켈레톤화된 데이터를 생성합니다. 이전에 발표된 간접 지역 응집체 이미지 분석 전략과 달리, 당사의 프로토콜은 높은 처리량과 오픈 액세스 소프트웨어 도구를 사용하여 특정 구성 요소의 직접적인 특성화를 가능하게 하고 살아있는 근세포에서 TATS 멤브레인 네트워크의 복잡한 생리학적 특성을 도출할 수 있습니다. 요약하면, 결합된 프로토콜 전략은 생리학적 근세포 적응 또는 질병 변화, 다양한 심장 또는 골격근 세포 유형의 비교, 형질전환 모델의 표현형, 약리학적 또는 치료적 개입 중 정량적 TATS 네트워크 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.

심장 근육 세포에서 관형 막 구조가 세포 내 네트워크를 형성한다. 우리는 품질 관리, 최첨단 형광 현미경 II) 살아있는 세포 염색을 포함하여 마우스의 심장에서 심근 세포의 난) 절연을위한 프로토콜을 최적화 대해 설명하고, ⅲ) 직접 이미지 분석은 구성 요소의 복잡성과 세포 멤브레인의 가소성을 정량화하기 네트워크.

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

이 절차의 전반적인 목표는 심방 및 심실 근세포의 세뇨관 막 네트워크를 분석하는 것입니다. 이는 먼저 성체 쥐의 심장에서 심방 및 심실 근세포를 분리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서, 횡축 세뇨관 시스템 또는 tats는 손상되지 않은 살아있는 고립된 심장 근세포에 염색됩니다.다음으로, 공초점 또는 스테드 형광 현미경으로 tats 멤브레인 네트워크를 시각화한 다음 네트워크의 구성 요소를 정량적으로 분석합니다. 궁극적으로, 서로 다른 세포 유형의 막 네트워크 간의 차이점 또는 가짜와 치료 그룹 간의 차이는 정량적 tats 이미지 분석을 통해 밝혀질 수 있습니다. 이 세포 분리 및 분석 기술의 주요 장점은 분리 프로세스의 포괄적인 워크플로우를 통해 근세포의 직접 형광 이미징으로 이어져 터치막 네트워크의 정량적 데이터 분석이 가능하다는 것입니다.이 방법은 살아있는 건강한 심근세포의 복잡한 막 네트워크 조직에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 병에 걸린 동물이나 형질전환 동물의 근세포에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 신규 사용자는 고품질 심장 근세포를 일관되게 분리하기 위한 추가 입문 교육의 이점을 얻을 수 있으며, 이 기술을 수행하기 위한 중요한 전제 조건인 근세포를 분리하려면 장기 추출이 가능해진 직후 섭씨 37도의 산소가 함유된 관류 완충액으로 12주 이상 마우스의 심장을 4분 동안 관류하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 섭씨 37도의 소화 버퍼로 8-10분 동안 심장을 정독하면서 조직 소화 진행 상황을 모니터링하여 겉보기 심장 표면 전체에 걸쳐 불투명, 부드러움 및 산도를 증가시킵니다.소화 후 우심방 부속기를 편향시키고 심방 심실 판막 바로 위의 우심방을 절개합니다. 좌심방으로 박리를 계속한 다음 섬유판 장치를 해부하고 폐기합니다. 필요에 따라 좌우 자유심실벽과 중격 및 더 작은 조직 부분을 분리하여 박리를 마칩니다.다음으로, 전체 심실 조직을 2.5ml의 소화 완충액이 들어 있는 60mm 페트리 접시로 옮긴 다음 조직을 약 1mm 입방체 조각으로 자릅니다. 전사 피펫으로 조직 조각을 천천히 먹어 심실 근세포를 단일 세포 현탁액으로 부드럽게 해리하고 거품이나 유체 분사 손상을 방지하기 위해 주의합니다. 그런 다음 7.5ml의 정지 버퍼를 세포 현탁액에 추가합니다.동시에 소화된 심방 조직을 1밀리리터의 소화액으로 약 1mm 입방체 조각으로 자르고 60mm 페트리 접시에 완충한 다음 방금 시연한 대로 심방 근세포를 부드럽게 삼중화합니다. 기계적 교반 후 4ml의 정지 완충액을 첨가하여 심방 근세포 현탁액에서 잔류 콜라겐분해효소 활성을 정지시킵니다. 그런 다음 세포 현탁액을 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 나머지 조직 조각을 15초 동안 침전시킨 후 supinate 분획으로 분리된 myocyte를 수확합니다.한 번의 세척 단계 후, Resus는 5ml의 관류 완충액에 심방 근세포를 부드럽게 현탁시키고 세포 현탁액을 3개의 세포 분취액에 약 10회 1.5ml의 마이크로 원심분리 튜브로 분할하여 심실 근세포의 tat membrane을 염색합니다. 먼저 세포를 8분 동안 중력에 의해 침전시킨 후 1.5ml의 반응관을 사용하여 심방 근세포를 염색하고 두 세포 유형 중 하나에 대해 실온에서 20배 G로 2분 동안 세포를 거부합니다. 다음으로, 세포 펠릿의 불필요한 교반을 피하도록주의하면서 supinate를 조심스럽게 제거하십시오.그런 다음 800마이크로리터의 멤브레인 특이적 tyle dye dye eight 및 eps에 세포를 부드럽게 재현탁시키고, dark wash에서 15분 배양 후 이미징 챔버의 laminin coated cover slips로 myocytes를 즉시 전달합니다. 덮개가 한 번 미끄러진 다음 1ml의 관류 버퍼로 덮습니다. 중심 세포 내 근세포 절편의 샘플 이미지를 촬영한 다음 crop 기능을 사용하여 자르기 창과 최종 픽셀 크기를 100 x 100 나노미터로 조정합니다.최종 이미징 평면을 선택하려면 단일 이미지 프레임을 사용하여 Z 방향에서 가장 적합한 이미징 평면을 수동으로 선택합니다. TAs 멤브레인 네트워크에 t tubial 및 tubial 구성 요소가 모두 포함되어 있고 초점면에서 시각적으로 뚜렷한지 확인합니다. 일반적인 intracellular imaging plane은 중앙 intracellular reference point로 핵을 포함할 수 있습니다.tats 멤브레인 네트워크 및 그 구성 요소를 분석하려면 이제 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 엽니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 이 이미지에 표시된 것처럼 외부 표면 멤브레인을 제외하고 tats 멤브레인 네트워크의 세포 내 부분을 포함하면서 관심 영역을 묘사합니다. 다음으로, edit 및 clear outside 명령을 사용하여 선택한 세포 내 영역에 tats 네트워크의 세포 내 멤브레인 부분만 포함되지만 표면막의 어떤 부분도 포함되지 않도록 선택한 ROI를 생성합니다.이제 프로세스를 클릭하고 배경을 빼고 롤링 볼 반경을 5픽셀로 설정합니다. 그런 다음 프로세스를 선택하고 로컬 대비를 향상시킵니다. 그리고 블록 크기를 49로, 히스토그램 빈을 256으로, 최대 기울기를 3으로, 마스크를 none으로 설정합니다.플러그인에서 프로세스 및 매끄럽게 클릭하고 세분화 및 통계 영역 병합을 선택한 다음 매개변수를 Q 100으로 설정합니다. 그런 다음 평균 표시를 클릭합니다. 그런 다음 이미지 유형 및 8비트를 선택한 다음 임계값 40부터 시작하여 이미지 조정 및 임계값을 선택합니다.올바른 임계값 선택은 특정 tats 멤브레인 구조만 생성해야 하며 배경 잡음으로 인한 거짓 양성 신호는 생성하지 않아야 합니다. 그런 다음 플러그인에서 스켈레톤 및 스켈레톤화된 2D 3D를 선택하고 스켈레톤화된 2D 이미지를 채택 파일로 저장합니다. 이제 플러그인을 다시 선택하고 골격 2D 3D를 분석하여 정량적 데이터 출력을 위해 골격 이미지 파일을 분석합니다.그런 다음 정리 주기 방법에 대해 없음을 선택하고 결과 데이터 테이블의 자동 생성을 확인합니다. 이제 피지 플러그인 방향성을 사용하여 스켈레톤화된 이미지 데이터에서 적절한 세금 네트워크 구성 요소의 개별 방향을 분석합니다. 방법에서 FURIER 구성 요소, 끝 빈 180 및 히스토그램 시작 -45도를 선택합니다.마지막으로 디스플레이 테이블을 확인하고 방향성 히스토그램을 생성합니다. 이 첫 번째 그림에서, 이미지의 X축에 수직인 횡방향 요소와 X축에 평행한 축 구성 요소로 구성된 건강한 심실 근세포의 tats의 대표적인 골격 이미지가 표시되며, 방향성 플러그인을 적용하면 0도에서 유사한 피크를 가진 심실 tats에 대한 방향 히스토그램이 생성됩니다. 축 비율을 나타내고 90도에서 횡 방향을 나타냅니다. 대조적으로, 심방 근세포에서 문신의 대표적인 골격 이미지는 주로 이미지의 X축에 평행한 축 구성 요소로 구성됩니다.따라서 해당 배향 히스토그램은 축 방향 tat 비율을 나타내는 0도 bin 부근의 지배적인 피크와 횡방향 tats 비율을 나타내는 90도에서 작은 피크만 나타냅니다.이 절차를 시도하는 동안 세포 분리 후, 이미징 중, 그리고 가장 중요한 모든 단계에서 세포 품질을 확인하는 것이 중요합니다. 이미지 분석 직전. 이 동영상을 시청한 후에는 복잡한 멤브레인 구조, tes 네트워크 및 잠재적으로 멤브레인 관련 단백질이 어떻게 완전히 분화되는지 잘 이해할 수 있을 것입니다. 성인 심장 근세포는 컨포칼 현미경으로 이미지화하고 정량적으로 분석할 수 있습니다.친유성 눈, 소화 효소 및 감염 가능성이 있는 심장 환자와 함께 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이러한 절차를 수행하는 동안 항상 철분 피부 보호와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 세포 내 칼슘에 사용할 수있는 인간의 심방 근육 세포의 분리를...

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup&gt; 2 +</sup&gt; 과도하고 막 전류

야생형 마우스와 돌연변이 마우스의 개별 심근세포는 수축성과 칼슘 과도 상태를 연구하기 위해 심장에서 분리할 수 있습니다. 이를 통해 모든 원인에서 심장 기능 장애에 대한 세포 기능 장애의 기여도를 특성화할 수 있습니다.

마우스 심근의 분리 및 생리 학적 분석

심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

선천성 심장 결함으로 이어지는 돌연변이는 발달 중 심장 구조에 대한 생체 내 조사의 이점을 얻지만, 마우스 배아 심장에 대한 고해상도 구조 연구는 기술적으로 어렵습니다. 여기에서는 발달 중인 마우스 심장의 심근세포 특이적 구조를 평가하기 위한 강력한 면역형광 및 이미지 분석 방법을 제시합니다.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

이 프로토콜은 전자 현미경 검사 법 그리고 confocal 현미경 검사 법 심상에서 cardiomyocytes의 세포내 구조의 공간적 상세한 유한 요소 모델을 생성 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 이 공간 세부 모델의 파워는 칼슘 신호 및 생체에서 사례 연구를 사용 하 여 보여 줍니다.

Cardiomyocyte 시스템 생물학에서 세포 아키텍처의 역할을 연구 하기 Cardiomyocyte의 구조적으로 현실적인 유한 요소 형상 모델 생성

이 프로토콜은 청크 소화 접근법을 사용하여 성인 마우스 심장으로부터 단일 심방 심근세포를 분리하는 데 사용됩니다. 이 접근법은 패치 클램프 연구에서 심방 근세포 전기 생리학을 특성화하는 데 사용할 수 있는 우측 또는 좌심방 근세포를 분리하는 데 사용됩니다.

성인 마우스에서 심방 근세포의 격리

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

적절한 sarcomere 네트워크의 형성은 iPSC 유래 심근 세포의 성숙에 중요합니다. 우리는 줄기 세포 유래 심근세포의 구조적 성숙의 정량적 평가를 허용하고, 심장 발달을 촉진하는 배양 조건을 개선할 수 있는 슈퍼 분해능 기반 접근법을 제시한다.

단일 분자 국소화 현미경 검사를 사용하여 인간 iPSC 파생 심근세포에서 α-액티닌 네트워크 분석

여기서, 우리는 미리 분화된 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포로 구성된 3D 자가 조립 심장 미세 조직 배열을 생성하는 사용하기 쉬운 방법론을 기술합니다. 심장 미세 조직을 생성하는 기술을 요구하는 이 사용자 친화적이고 낮은 세포는 질병 모델링 및 약물 개발의 초기 단계를 위해 구현될 수 있습니다.

인간 iPSC 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 사용하여 3D 심장 미세 조직 배열의 제조

마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

분리된 쥐 근세포에서 칼슘(Ca 2+) 과도 측정과 함께 근절 길이 검출을 통한 수축 기능의 측정을 설명하는 일련의 프로토콜이 제시됩니다. 심부전 동물 모델에서의 연구에 대한이 접근법의 적용도 포함됩니다.

설치류 근육 세포에서 심장 수축 기능 장애 및Ca 2+ 과도 현상 분석

배우세요 심근세포의 관형 막 네트워크 분석 방법을 성인 마우스 심장에서 심방 및 심실 세포를 분리하고 형광 현미경으로 정량 분석하는 기법입니다. 이 방법은 심장 생리학 및 병리학 연구에 활용됩니다.

심방과 심실에서 심장 근육 세포에 관형 막 네트워크 분석

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