Name: 레이저 캡처 이외에 Microdissection과 코 생검 결합을 통해 획득 후각 뉴런 : 정신 장애의 치료 반응을 연구하기 위해 잠재적 인 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 배우세요 레이저 캡처 현미경 절단법을 이용해 후각 상피에서 풍부한 뉴런을 분리하고 리튬 반응 관련 유전자 발현을 분석하는 방법을. 이 기술은 양극성 장애 치료 반응 연구에 활용됩니다.

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우리는 생검 과정을 조정하기 위한 Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema 및 Mark Christie의 노력과 기여에 진심으로 감사드립니다.

참고 :이 연구의 모든 연구 자원 봉사자는 하워드 대학의 심사위원회 (Institutional Review Board) 및 존스 홉킨스 대학의 승인을 동의 문서를 투여 하였다. 동의 문서에 서명함으로써 동의 만 참가자들은 연구에 등록되었다. 이 분석을위한 연구 기반을 구성 : 20 명 (12 BD 10 컨트롤, 30 % 남성)과 38.2 (14.1) 년의 나이 (SD)를 의미한다. 참고 : 유리 및 플라스틱 표면에서의 RNase 오염을 제거의 RNase 보내 겠 모든 표면을 스프레이. 1. 조직 검사 절차 <ol><li> 연구 참가자의 비강에 국소 리도카인 (xylocaine) 액체 4 %와 oxymetazoline 염산 0.05 % 스프레이와 시간을 마비의 15 분을 할 수 있습니다. </li><li> 리도카인과 oxymetazoline의 혼합물에 ½ × 3 인치 수술 cottonoids을 만끽하고 비중격의 우수한 부분을 따라 비강에 삽입하고 15 분 동안 앉아 할 수 있습니다. </li><li> 30 ° 강성을 사용하여비강 내시경, 비강의 상부를 찾아 여러 개의 작은 표본을 고려하여 비중격의 우수한 부분에서 최대 물고 코 집게를 사용하여 코 점막을 제거합니다. </li></ol> 조직 블록 2. 제조 <ol><li> 직전 생검 조직이 매체를 동결 표준 크기의 cryomolds를 입력합니다. </li><li> 멸균 핀셋을 사용하여, 동결 배지에서 신선한 조직을 탑재하고 드라이 아이스상에서 정지. , 냉동 매체 cryoblock의 나머지 부분을 채우기 드라이 아이스에 cryoblock을 동결하고, -80ºC에서 저장 블록. </li></ol> 3. 냉동 절편 <ol><li> 냉동 절편 직전 폴리에틸렌 나 프탈레이트 (PEN) 막 유리 슬라이드를 준비한다. 5 분의 RNase 보내 겠 솔루션으로 슬라이드를 스프레이. 그런 디 에틸 피로 카보 네트 (DEPC) 물에 슬라이드를 씻어 30 분간 자연 건조를 할 수 있습니다. 30 분 동안 UV 빛 아래 건조 슬라이드를 활성화합니다. </li><li> 동결 절단 (Cryosections)는 각각 30 μm의에서 완전히 차단합니다. 건조 i에서 슬라이드를 유지CE 및 섹션은 가능한 한 많은 냉동. 완료시 -80 ºC에서 보관 슬라이드. </li></ol> 4. 레이저 캡처 이외에 Microdissection <ol><li> 직전 미세 절제에 슬라이드를 탈수하여 시작합니다. 60 % (2 ㎖, 15 초), 80 % (2 ㎖, 15 초), 95 % (3 ㎖, 25 초), 100 : 각 슬라이드에 다음 에탄올 시리즈를 적용 한 후 냉동 슬라이드하자 10 초간 해동하고, % (7 ㎖를, 60 초). </li><li> 에 광 활성화 현지화 현미경 (PALM) 현미경을 켜고 설정 다음 조건에 : (82)에 에너지를 설정 10 배 배율의 경우, (74)에 초점을 맞추고 속도 25 - 30 20 배 배율의 경우, (63)에 에너지를 설정, 67에 초점 속도 및 5 - 6. 최적의 절단 결과를 얻기 위해 필요한만큼 조정한다. </li><li> 시각적으로 20 배 또는 10 배의 배율을 사용하여 신경 세포를 식별합니다. 염색 과정의 사용없이 현미경 기본 서브 점막 표면 후각 뉴런 얇은 층을 구별. 조밀 한 기둥 모양 (18)로 신경 세포를 관찰합니다.</li><li> 4.2 단계에서 상기 한 현미경에서 연필 기능을 사용하여 신경 층을 중심으로 추적. 레이저에서 신경 세포의 연소를 방지하기 위해 약간 떨어져 뉴런에서 추적합니다. 이는 고품질의 RNA를 얻기 위해 필수적이다. 그런 다음 레이저 유도 절단을 시작합니다. </li><li> 좋은 팁 미세 절제 집게를 사용하여 절개 섹션을 들고 얼음에 100 μL 용해 버퍼를 포함하는 마이크로 튜브에 조직을 넣어. 하나의 샘플에서 얻은 모든 신경 부분에 대해 반복합니다. 50 분을 초과 할 수 없습니다 샘플 당 총 해부 시간. </li><li> 해부가 완료 즉시 소용돌이 샘플 해물과 드라이 아이스 계속되면. 총 RNA 격리를위한 -80ºC에서 보관 샘플. </li></ol> 총 RNA 및 품질 관리 분석 5. 분리 <ol><li> 얼음에 해동 샘플 해물. 볼 (수정없이 업체로의 프로토콜에 따라 DNase의-I의 불 활성화와 RNAqueous 마이크로 키트 총 RNA 분리를 수행합니다 &lt;강한&gt; 그림 1). 용출 총 부피는 약 20 μL이다. </li><li> RNA의 농도를 측정하고 Bioanalyzer를 사용하여 RNA 무결성 번호 (RIN)와 RNA의 품질을 평가한다. 도 2의 품질 관리 기준을 만족 샘플 cDNA 합성에 사용될 수있다. </li></ol> 6. cDNA를 합성 <ol><li> 검증 된 상용 키트를 사용하여 cDNA를 합성 (시약의 표 참조). 튜브 당 8 ㎕의 총 부피로 RNA (이용 가능성에 따라)의 RNase없는 물과의 NG 1.0 - 0.1를 조합하여 어닐링 공정을 수행한다. 그런 다음 10 μL의 총 볼륨, 튜브 당 혼합 올리고 D (T) 20 프라이머 1 μL, 10 mM의 dNTP의 1 μl를 추가합니다. </li><li> 5 분 65 ° C에서 부드럽게 소용돌이와 원심 분리기 샘플 및 어닐링 샘플. 얼음에 반응이 종료 된 후, 즉시 냉각 샘플. </li><li> 표 1의 사양에 따라 마스터 믹스 솔루션을 준비합니다. 그런 다음 9.5 μ를 추가각 튜브에 L 마스터 믹스 및 상업적으로 제조 된 역전사 효소 (RT)의 0.5 μL. 대신 RT의 관을 제어하는​​ 0.5 μL의 RNA 분해 효소가없는 물을 추가합니다. </li><li> 없이 자전거로, 50 분, 5 분 및 최종 4 ºC 유지를위한 다음 85 ºC 50 ºC에서 처음 배양과 RT 반응을 실행합니다. </li><li> 물과 나누어 함께 5 배의 모든 샘플을 희석. -80 ºC에서 보관 샘플. </li></ol> 7. 리얼 타임 PCR - 신경 농축 확인 <ol><li> . 표 2의 사양에 따라 마스터 믹스 솔루션을 준비 같은 GAPDH와 같은 내부 통제를 사용합니다. 신경 농축을 결정하기 위해 undissected 조직에 OMP 식 microdissected 조직에서 후각 마커 단백질 (OMP) 식을 비교. 참고 : OMP는 후각 신경 세포 마커입니다. OMP 서열 포워드, 5&#39;- CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 &#39; , 역 5&#39;-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 &#39; GAPDH 순서 : 앞으로, 5&#39;-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 &#39; 역, 5&#39;-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 &#39;. </li><li> cDNA를 각 웰 3 μL에 마스터 믹스의 7 μl를 추가하여 PCR 플레이트를 설정합니다. </li><li> 300 XG (1,300 RPM)에서 5 분 동안 원심 분리 판. 이러한 SYBR 푸르 qPCR의 상업적인 수퍼 믹스 지정된 기본 열 사이클링 조건을 이용하여 실행을 리얼 타임 PCR 반응. </li><li> 데이터를 (사양 그림 2 참조) 분석합니다. </li></ol> 8. 리얼 타임 PCR - 관심의 유전자의 발현 <ol><li> 2 배 이상의 신경 세포의 농축을 보여 샘플을 수행합니다. </li><li> 각 프로브 표 3의 사양에 따라 별도의 튜브 (이자 및 VIC 표지 GAPDH의 FAM 표지 프로브) 얼음에 마스터 믹스를 준비합니다. </li><li> cDNA를 각 웰과 2 μL 8 μL 마스터 믹스 PCR 플레이트를 설정합니다. </li><li> 300 XG (1,300 RPM)에서 5 분 동안 접시를 원심 분리기. DEF를 사용하여 실시간-PCR 반응을 실행제조자의 유전자 발현 마스터 믹스 프로토콜에 따라 AULT 열 사이클링 조건. 식의 결과를 (사양 그림 2 참조) 분석합니다. </li></ol>

<ol><li>Goodwin, F. K., Jamison, K. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodwin%2C+FK+%22Manic-depressive+illness%22">Manic-depressive illness</a>. , Oxford University Press. (1990).</li>
<li>Einat, H., Manji, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+cascades%3A+genes-to-behavior+pathways+in+animal+models+of+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder.</a> Biol Psychiatry. 59 (12), 1160-1171 (2006).</li>
<li>Severino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenomics+of+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenomics of bipolar disorder.</a> Pharmacogenomics. 14 (6), 655-674 (2013).</li>
<li>Beech, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+differences+in+peripheral+blood+between+lithium+responders+and+non-responders+in+the+Lithium+Treatment-Moderate+dose+Use+Study+%28LiTMUS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Gene-expression differences in peripheral blood between lithium responders and non-responders in the Lithium Treatment-Moderate dose Use Study (LiTMUS).</a> Pharmacogenomics J. 14 (2), 182-191 (2013).</li>
<li>Horiuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+cells+via+nasal+biopsy+reflect+the+developing+brain+in+gene+expression+profiles%3A+utility+and+limitation+of+the+surrogate+tissues+in+research+for+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Olfactory cells via nasal biopsy reflect the developing brain in gene expression profiles: utility and limitation of the surrogate tissues in research for brain disorders.</a> Neurosci Res. 77 (4), 247-250 (2013).</li>
<li>Dryer, L., Graziadei, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+the+olfactory+bulb+in+an+elasmobranch+fish%2C+Sphyrna+tiburo%3A+segregation+of+inputs+in+the+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Projections of the olfactory bulb in an elasmobranch fish, Sphyrna tiburo: segregation of inputs in the telencephalon.</a> Anat Embryol (Berl. 190 (6), 563-572 (1994).</li>
<li>Hahn, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+neurogenesis+in+human+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro neurogenesis in human olfactory epithelium.</a> J Comp Neurol. 483 (2), 154-163 (2005).</li>
<li>Cascella, N. G., Takaki, M., Lin, S., Sawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+involvement+in+schizophrenia%3A+the+olfactory+epithelium+as+an+alternative+model+for+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental involvement in schizophrenia: the olfactory epithelium as an alternative model for research.</a> J Neurochem. 102 (3), 587-594 (2007).</li>
<li>Sawa, A., Cascella, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+olfactory+system+for+clinical+and+basic+psychiatry%3A+a+promising+entry+point+to+the+mystery+of+brain+mechanism+and+biomarker+identification+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Peripheral olfactory system for clinical and basic psychiatry: a promising entry point to the mystery of brain mechanism and biomarker identification in schizophrenia.</a> Am J Psychiatry. 166 (2), 137-139 (2009).</li>
<li>Mor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-382+expression+is+elevated+in+the+olfactory+neuroepithelium+of+schizophrenia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-382 expression is elevated in the olfactory neuroepithelium of schizophrenia patients.</a> Neurobiol Dis. 55, 1-10 (2013).</li>
<li>Kano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+multiple+histone+methylations+in+olfactory+cells%3A+further+implications+for+cellular+susceptibility+to+oxidative+stress+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of multiple histone methylations in olfactory cells: further implications for cellular susceptibility to oxidative stress in schizophrenia.</a> Mol Psychiatry. 18 (7), 740-742 (2013).</li>
<li>Toritsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficits+in+microRNA-mediated+Cxcr4%2FCxcl12+signaling+in+neurodevelopmental+deficits+in+a+22q11+deletion+syndrome+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Deficits in microRNA-mediated Cxcr4/Cxcl12 signaling in neurodevelopmental deficits in a 22q11 deletion syndrome mouse model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17552-17557 (2013).</li>
<li>Evgrafov, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+neuroepithelium-derived+neural+progenitor+cells+as+a+model+system+for+investigating+the+molecular+mechanisms+of+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatr+Genet%22%5BJournal%5D)">Olfactory neuroepithelium-derived neural progenitor cells as a model system for investigating the molecular mechanisms of neuropsychiatric disorders.</a> Psychiatr Genet. 21 (5), 217-228 (2011).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+dynamics+are+altered+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion dynamics are altered in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 74 (6), 418-426 (2013).</li>
<li>Ishizuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+symptoms+of+schizophrenia+correlate+with+impairment+on+the+University+of+Pennsylvania+smell+identification+test%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Negative symptoms of schizophrenia correlate with impairment on the University of Pennsylvania smell identification test.</a> Neurosci Res. 66, 106-110 (2010).</li>
<li>Sattler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+olfactory+epithelium+as+a+dynamic+marker+for+CNS+therapy+development%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human nasal olfactory epithelium as a dynamic marker for CNS therapy development.</a> Exp Neurol. 232 (2), 203-211 (2011).</li>
<li>Rimbault, M., Robin, S., Vaysse, A., Galibert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+profiles+of+rat+olfactory+epithelia%3A+individual+and+age+related+variations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA profiles of rat olfactory epithelia: individual and age related variations.</a> BMC Genomics. 10, 572(2009).</li>
<li>Tajinda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+biomarkers+from+patients+with+mental+illnesses%3A+a+novel+method+through+nasal+biopsy+combined+with+laser-captured+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Neuronal biomarkers from patients with mental illnesses: a novel method through nasal biopsy combined with laser-captured microdissection.</a> Mol Psychiatry. 15 (3), 231-232 (2010).</li>
<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li>
<li>Fink, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+RT-PCR+after+laser-assisted+cell+picking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative RT-PCR after laser-assisted cell picking.</a> Nat Med. 4 (11), 1329-1333 (1998).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Nurnberger, J. I. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+interview+for+genetic+studies.+Rationale%2C+unique+features%2C+and+training%5BTitle%5D)+AND+%22NIMH+Genetics+Initiative.+Arch+Gen+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Diagnostic interview for genetic studies. Rationale, unique features, and training.</a> NIMH Genetics Initiative. Arch Gen Psychiatry. 51 (11), 849-859 (1994).</li>
<li>Montgomery, S. A., Asberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+depression+scale+designed+to+be+sensitive+to+change%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A new depression scale designed to be sensitive to change.</a> Br J Psychiatry. 134, 382-389 (1979).</li>
<li>Young, R. C., Biggs, J. T., Ziegler, V. E., Meyer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rating+scale+for+mania%3A+reliability%2C+validity+and+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A rating scale for mania: reliability, validity and sensitivity.</a> Br J Psychiatry. 133, 429-435 (1978).</li>
</ol>

저자는 상업적 이익과 재정적 관계를보고하지 않습니다.

코 조직 검사 및 LCM을 결합하여 풍부한 후각 신경 층을 얻기위한 새로운 플랫폼을 제시하고 본 연구에서 검증되었습니다. 이 기술은 광범위하게 영향을 미칠 수 있습니다. 이 분야에서 폭 넓은 영향을, 치료 반응을위한 것들을 포함 바이오 마커 연구, 및 다른 조건에 대한 신경 정신병 약물 발견 노력으로 적용될 수있다. 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 의무 고품질의 신경 세포를 얻으려면 몇 가지 중요하고 문제 해결 단계를주의해야합니다. 적절한 샘플 크기를 갖도록 환자 당 후각 조직의 6 개 - 우선,도 4를 얻었다. 샘플 RNA 분해에 민감하기 때문에 둘째, 적절한 온도에서 조직을 유지 된 RNase 무료 장비와 표면, 사용 장갑 작업, 샘플을 통해 직접 흡입하지 않도록 할 것. RNA 품질이 여전히 낮은 경우, 50 분 이내에 완료 미세 절제를 고려하고 즉시 절개 또는 vort 후 RNA 추출을 수행전 시료는 즉시 -80 ° C에서 저장 될 때까지 드라이 아이스 계속. RNA...

양극성 장애 (BD)이 기분 병리학 적 변화를 특징으로하는 심각한 신경 장애이며, 드라이브 및인지 1. BD의 치료에 사용되는 리튬은 동물 연구에서 두 유전자의 다수의 정상 상태의 mRNA 수준을 변경하기 위해 도시되었지만, 이들 분자 중 2 인간 임상 반응과 연관된 경우에는 알려지지 않았다. 리튬의 반응 메카니즘을 이해하는 것은 신경 조직에서의 리튬 - 유발 분자 변화를 조사 요구한다. 불행히도, BD 환자의 뇌 생검 전후 리튬 요법 리튬 반응 분자 서명을 식별하기 위해 수득 실용적이지 않다. 사후 뇌 조직은 BD 바이오 마커의 연구를 위해 사용 된, 그러나, 감정,인지와 이용시의 동적 변화와 관련 분자 마커를 평가하기 위해 사용될 수 없다; 소급 확인 리튬 치료 반응의 유효성이 문제가 될 수있다 (4). 림프구 및 기타 혈액 세포가 유용 할 수 있지만, 혈액 세포의 분자 변화는 신경 세포의 변화 3-5 반영되지 않을 수 있습니다. 뇌척수액은 질환 관련 약물 가역 본질적인 변화를 반영 할 수있다 세포 내 분자에 대한 정보를 얻을 불충분 할 수있다. 후각 상피 (OE)가 중추 신경계 (CNS)의 고유 부분이며, 변연 구조 (6)에 발생 학적으로 관련; 그리고 코 조직 검사를 통해 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 그것은 이루어져 신경교 형상 개발 7-9의 다른 단계에서 (즉, sustentacular) 세포, 기저 세포 증식, 후각 수용체 뉴런지지. 따라서, OE는 접근 가능 신경 정신 질환 (7) 환자의 CNS의 역동적 인 변화를 연구하는 독특한 기회를 제공합니다. 연구는 그 OCC을 반영 질병 관련 사건을 조사하기위한 대리 조직으로 OE의 유용성을 입증하고 있습니다뇌 신경 세포 8,9에 urring. 예를 들어, 연구는 정신 상태 10-14과 관련된 분자 프로파일을 조사하기 위해 OE를 활용했다. 후각 시스템은 또한 정신 분열증 (15)의 음성 증상과 관련된 냄새 적자 임상 endophenoytpes을 식별하는 데 도움이된다. 또한, 신경 발달 과정은 정신 조건 8,9의 기본 병태 생리를 모델링 할 수있는 유용한 수단을 제공하고, 전 생애에 걸쳐 OE에서 계속합니다. 그러나,이 조직의 사용의 단점은 비 - 신경 세포와 함께 16 후각 생검의 실질적인 오염이다. 예를 들어, 이전의 연구에서 OE 유전자 발현 연구에 사용 된 총 RNA 비 신경 세포 (17)로부터 전체 RNA를 포함 비강 생검 조직에서 추출한 RNA를 함유 하였다. 따라서, 이전의 접근법은 세포의 품질에 의해 제한되어왔다. 이 문제를 극복하기 위해 새로운 접근 방식을 구하는<html> 레이저 캡처 미세 절제 (LCM)와 비강 조직 검사를 결합하여 풍부한 신경 세포 집단은 18 개발되었습니다. LCM은 적외선 레이저와 함께 19-21 UV 레이저 절삭을 사용하여 세포의 선택적 분리를 허용하는 기술이다. OE 방식과 결합 LCM함으로써 신경 세포 (18)의 농축을 강화, 비 신경 세포에 의해 OE 상당한 오염을 최소화 할 수 있습니다. 또한, 신경 층함으로써 염색에 대한 필요성을 제거 현미경 점막하 층으로부터 구별 될 수있다. 신경 세포 유형은 또한 관심 7 세포 유형에 의해 발현되는 일차 항체를 사용하여 다른 세포 집단 구별 될 수있다. 따라서,이 절차는 유전자 발현 연구, 면역 및 기타 형태 학적 연구에 사용할 수있는 거의 순수한 신경 세포 집단의 농축을위한 쉬운 방법을 확립한다. ve_content는 &quot;&gt;이 연구는 질병 상태와 치료 반응과 관련된 후각 신경 세포의 분자 변화를 조사하기 위해 실험 플랫폼을 구축하는 것을 목표로하고있다.이 문제를 해결하기 위해, BD의 DSM-IV 진단 기준을 충족 금연 환자의 작은 세트에 기반 유전 연구에 대한 진단 인터뷰 (DIG) (22)는 두 개의 코 조직 검사를 받아야하는 채용되었다 : 리튬과 두 번째 생검 한 조직 검사 전처리, 경구 리튬 치료 6 주 후에 또한, 자격 BD 환자 수 있어야합니다. 우울증 증상 몽고메리 - ASBERG 평가 척도 (MADRS) (23) 투여 임상의 60에서 ≥10 득점에 따라 (YMRS) 경조증 또는 조증 증상, 젊은 매니아 평가 척도 투여 임상에 56 점 만점 점수 ≥10에 따라 . 24;. MADRS 모두 저울에 대한 임상의 간의 합의에의 YMRS있는 Rater-간 레이터 계수 모두 또는 ≥10는 조직 검사 후 신경 enri 0.96했다&gt;는LCM에 의해 OE에서 CHED. 신경 조직 및 농축로부터 고품질의 RNA 추출을 위해, 추가의 품질 관리 방법에 따라 실시간 RT PCR은 관심 유전자의 사전 및 사후 처리의 발현 수준을 조사하기 위해 실시되었다. 다음의 섹션은이 방법의 유효성 검사에 대한 설명, 프로토콜의 최적화를 강조 표시하고 문제 촬영 프로토콜을 적용 된 전략이 포함되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tissue Preparation</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Molds</td><td>Sakura Finetek</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cryosectioning</td></tr><tr><td>Membrane Slide 1.0 PEN (D)</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>415190-9041-000</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 처리 수</td><td>질 생물학</td><td>351-068-131</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microdissection</td></tr><tr><td>Microscope: PALM 시리즈 MicroLaser 시스템</td><td>Carl Zeiss 현미경</td><td></td><td>모델: Axiovert 200M 
소프트웨어: Robo v3.2</td></tr><tr><td>No. 5 Dumont Microdissction Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-49085</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">RNA Extraction</td></tr><tr><td>RNAqueous Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">cDNA Synthesis</td></tr><tr><td>SuperScript III First Strand Synthesis Kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">OMP qPCR</td></tr><tr><td>SYBR GreenER qPCR SuperMix</td><td>Invitrogen</td><td>11760-500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Taqman qPCR</td></tr><tr><td>TaqMan 발현 분석 프로브</td><td>Applied Biosystems</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr></tbody></table>

레이저 캡처 이외에 microdissection과 코 생검 결합을 통해 획득 후각 뉴런 : 정신 장애의 치료 반응을 연구하기 위해 잠재적 인 접근

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

양극성 장애 (BD)이 제대로 이해 병태 생리학과 심한 신경 정신 질환과 전형적 기분 안정제, 탄산 리튬으로 처리 하였다. 동물 연구뿐만 아니라 인간의 유전 연구는 리튬이 신경 세포의 성장, 생존과 성숙, 그리고 Wnt 신호에 관여 특히 분자에 관여하는 분자 표적에 영향을 미친다는 사실을 보여. 중추 신경계 (CNS)에서 리튬 응답과 연관된 동적 분자량 변화를 조사하는 뇌 생검 구하기 윤리적 도전 감안할 번이 goal.The 후각 상피 후각 수용체 뉴런을 포함 달성 후각 조직으로부터 수득 된 뉴런의 사용을 고려할 수있다 개발 및 신경교 유사 세포를지지하는 다른 단계에서. 이 안전하게 코 조직 검사에서 얻은 후각 조직을 사용, 신경 정신 질환을 가진 환자의 CNS의 역동적 인 변화를 연구하는 독특한 기회를 제공합니다. SUBST로 인한 단점을 극복하기 위해비 신경 세포와 후각 생검 조직의 antial 오염, 풍부한 신경 세포 인구를 얻을 수있는 새로운 접근 방식은 레이저 캡처 미세 절제와 코 생검을 결합하여 개발되었다. 이 연구에서, 신경 조직에 치료 - 관련 분자의 동적 변화를 조사하는 시스템은 리튬 치료 반응의 분자 메커니즘의 연구를 위해 모집 BD 환자의 작은 파일럿 샘플을 사용하여, 개발 및 검증 하였다.

분자 서명의 연구에서 프로토콜 및 문제 해결 전략이 성공적으로 최적화되었다. RNA 샘플을위한 품질 및 신경 농축 기준 하류 리얼 타임 PCR 분석에 사용되는 표준화 하였다. RIN 및 RNA의 농도는 검출 된 발현 수준을 교란 요인으로 조사 하였다. 1에서부터 RINs 여러 샘플의 분석을 바탕으로 - (10)는, 상술의 ~ 3.0의 최소 RIN은 본 연구에서 분석 하류에 충분하다고 판단되었다. 결과적으로, cDNA의 합성을위한 RNA 량이 1.0 NG로 표준화 하였다. 따라서, 상기 RIN 고품질 시료 1.0 ~ 3.0 및 NG의 RNA 양의 cDNA로 변환시켰다. 0.1 샘플 - 적절한 샘플 크기가 구하기 어려운 경우 RNA 1.0 NG가 사용될 수있다. 신경 엔리치 실시간-PCR 분석을 사용하여 확인 하였다. microdissected 샘플 OMP 유전자 발현 수준은 undissected 시료와 비교 하​​였다신경 층이 농축 된 경우의 확인합니다. 비 해부 조직에 비해 ...

본 연구에서는 새로운 플랫폼을 개발하고 검증 된 양극성 장애 (BD)의 치료 반응의 intraneuronal 분자 서명을 조사합니다. BD 환자의 후각 상피 비강 생검을 통해 얻었다. 이어서 레이저 캡처 미세 절제가 BD 리튬 응답의 분자 특성을 조사하기 위해 실시간 RT PCR과 결합시켰다.

레이저 캡처 이외에 Microdissection과 코 생검 결합을 통해 획득 후각 뉴런 : 정신 장애의 치료 반응을 연구하기 위해 잠재적 인 접근

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

이 절차는 후각 상피 조직에서 신경 세포층을 분리하기 위한 레이저 캡처 미세 해부의 사용에 대해 자세히 설명하고 일부 다운스트림 유전자 발현 분석을 간략하게 설명합니다. 후각 상피 조직을 얻기 위해 코 생검으로 시작하십시오. 그런 다음 레이저 캡처 현저해부를 수행하여 뉴런층을 분리합니다.다음으로 샘플에서 RNA를 분리합니다. CDNA를 역전사하고 QPCR에 의한 유전자 발현을 분석합니다. 궁극적으로, 레이저 캡처 현미해부는 풍부한 뉴런 집단이 후각 상피 조직에서 분리되어 수많은 다운스트림 응용 분야에 적용될 수 있음을 보여주는 데 사용됩니다.신경 세포 배양과 같은 기존 금속에 비해 이 기술의 주요 장점은 신경 세포 맥락에서 상태 및 동적 변화를 모두 연구할 수 있다는 것입니다. 이 프로젝트에 대한 아이디어는 레이저 캡처 미세 해부와 후각 생검을 결합하여 풍부한 신경 세포 집단을 얻을 수 있는 가능성을 발견했을 때 처음 떠올랐습니다. 이 방법은 TDA에 의해 확립되고 시연되었습니다.우리는 이 방법론을 확장하고 환자와 대조군의 다운스트림 Q-R-T-P-C-R 분석을 결합하여 절차가 존스 홉킨스 대학 팀의 기술자인 Chen Chung이 맡을 것임을 입증했습니다. 다음 절차는 미세 해부 직전에 존스 홉킨스 시설에서 촬영됩니다. 얼어붙은 슬라이드를 10초 동안 해동시킨 다음 텍스트 프로토콜에 표시된 시간과 부피를 사용하여 에탄올 시리즈를 사용하여 조직을 탈수합니다.사진 활성화 위치 파악을 위해 현미경을 켭니다. 현미경 검사는 10 배 배율의 조건을 82의 에너지, 74의 초점, 20 배 배율에 대해 25에서 30의 속도로 설정합니다. 에너지를 63으로, 초점을 67로, 속도를 5에서 6으로 설정합니다.이제 20배 또는 10배 배율을 사용하여 뉴런을 시각적으로 식별합니다. 염색 절차를 사용하지 않고 현미경으로 얇은 표면의 후각 뉴런 층을 밑에 있는 점막하 층과 구별합니다. pencil 함수를 사용하여 뉴런이 조밀한 기둥 모양으로 관찰됩니다.뉴런 층 주위를 추적하고 뉴런에서 약간 떨어진 곳을 추적하여 레이저에서 뉴런이 연소되는 것을 방지하여 고품질 RNA를 얻습니다. 그런 다음 레이저 유도 절단을 시작합니다. 미세한 팁 마이크로 절개 겸자를 사용하여 절개된 부분을 집어 올리고 얼음 위에 100마이크로리터의 용해 완충액이 들어 있는 마이크로 튜브로 조직을 옮깁니다.해부 완료 후 총 시간으로부터 50분 이내에 단일 샘플에서 얻

olfactory-neurons-obtained-through-nasal-biopsy-combined-with-laser

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 여기서 쥐, 인간의 비강 충치의 후각 점막 조직 검사로 연구를 해왔하는 방법을 설명합니다. 이러한 biopsies은 뇌 질환의 분자 변이를 식별하거나 뇌 손상 / 질병의 동물 모델에 세포 이식을 위해 활용할 수 multipotent 성인의 줄기 세포를 분리하거나 사용할 수 있습니다.

설치류 또는 인간의 네이절 강한 줄기 세포를 분리

후각 망울의 성인에서 태어난 뉴런은 optogenetically Channelrhodopsin2 - 표현 이식 미니어처와 함께 주동이의 철새 스트림과 만성 photostimulation에서 lentiviral 주사를 LED를 사용하여 조절할 수 있습니다.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

후각 수용체 뉴런 (ORNs)는 수용체에 첫 소절에 후각 망울에서 두 번째 주문 뉴런에 전달 아르 액션 잠재력을 실행하는 현재의 냄새 신호를 변환합니다. 여기 동시에 odorant 유발 수용체 마우스 ORNs의 현재와 실천 가능성을 기록 할 수있는 흡입 피펫 기술을 설명합니다.

흡입 피펫 기법을 사용하여 강한 수용체 뉴런에서 기록 Odorant 유발 응답

우리는 invertebrate 후각 경로의 처음 세 단계에서 냄새 evoked 응답을 특징하는 세포 다중 단위 기록 기술의 변화를 보여줍니다. 이 기술은 쉽게뿐만 아니라 다른 신경 시스템에서 앙상블 활동을 검토하도록 구성 할 수 있습니다.

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; Schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

보존 해부 조직 본래대로 마우스 비강 조직을 준비하는 효과적인 수동 발골 방법

이 프로토콜은 급성 단일 나리스 폐색을 사용하여 쥐에서 측면화된 조기 냄새 선호 학습을 소개합니다. 수평적 학습은 동일한 동물 내에서 행동 결과를 조사하고 생물학적 메커니즘을 뒷받침할 수 있도록 하여 동물 간 설계로 인한 분산을 줄입니다. 이 프로토콜은 조기 냄새 학습을 뒷받침하는 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

신경 회로 토대 메모리 형성을 해부에 대한 신생아 흰쥐의 편측 냄새 학습 모델

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

이 프로토콜은 레이저 포획 미세 분면을 사용하여 높은 정확도와 해부학 적 특성으로 편도체의 중앙 핵에서 단일 뉴런, 마이크로 글리아 및 성상 세포를 수집하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 우리는 이 세포의 전사체의 부분 집합을 측정하기 위하여 미세 유체 성 RT-qPCR의 우리의 사용을 설명합니다.

레이저 캡처 미세 해부 및 미세 유체 qPCR을 결합하여 단일 세포의 전사 프로필을 분석: 오피오이드 의존에 대한 시스템 생물학 접근법

이 논문은 호흡 동기화 후각계를 사용하여 인간의 비강 호흡과 동기화된 냄새 제시 중에 단일 및 이중 코일 경두개 자기 자극(TMS)을 트리거하는 방법을 설명합니다. 이 조합을 통해 쾌적한 냄새와 불쾌한 냄새가 특정 개인의 피질 척수 흥분성과 뇌 효과적인 연결성에 어떤 영향을 미치는지 객관적으로 조사할 수 있습니다.

호흡 동기화 후각계와 뇌 시뮬레이션을 결합하여 냄새가 피질 척수 흥분성 및 효과적인 연결성에 미치는 영향을 연구합니다.

이 기사는 단일 핵 RNA 시퀀싱을 목적으로 쥐 후각 상피의 해부 및 해리를 위한 간소화된 프로토콜을 제공합니다.

단일 핵 현탁액을 위한 마우스 후각 상피의 신속한 해부 및 해리

배우세요 레이저 캡처 현미경 절단법을 이용해 후각 상피에서 풍부한 뉴런을 분리하고 리튬 반응 관련 유전자 발현을 분석하는 방법을. 이 기술은 양극성 장애 치료 반응 연구에 활용됩니다.

레이저 캡처 이외에 Microdissection과 코 생검 결합을 통해 획득 후각 뉴런 : 정신 장애의 치료 반응을 연구하기 위해 잠재적 인 접근

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