고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

이 절차의 가장 중요한 목표는 다른 기술로는 불가능한 병렬 비편향 방식으로 주어진 단백질체 내에서 단백질, 단백질 상호 작용을 식별하는 것입니다. 이는 현미경 슬라이드 표면의 좌표 평면에 증착된 고도로 정제된 전체 길이 기능성 단백질 라이브러리와 함께 관심 단백질을 먼저 혼성화하고 에피토프(epitope)로 태그하여 수행됩니다. 단백질이 어레이의 각 표적 단백질과 평형에 도달하면 결합되지 않은 분획이 씻겨 나가고 표준 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 형광 부분에 접합된 에피토프에 대한 단클론 항체로 단백질 상호 작용이 검출됩니다.

결과 이미지는 결합된 단백질 및 형광 신호와 관련된 각 특징의 강도에 관한 정보와 인터레이스됩니다. 이 정보는 마이크로어레이 분석 소프트웨어의 도움으로 외삽되어 어레이의 각 특징에 대한 강도 값 목록을 생성합니다. 단백질-단백질 상호 작용 쌍에 관한 정보를 다운스트림 생물정보학 분석 소프트웨어로 내보내 특징별 데이터를 스코어링하고 관심 단백질과 마이크로어레이의 단백질 간의 단백질 상호 작용을 식별할 수 있습니다.

원시 신호 강도 데이터는 inter 및 intra assay 변동을 설명하기 위해 두 개 이상의 단백질 마이크로어레이에 걸쳐 컴파일되며, 데이터는 각 상호 작용에 점수를 매기기 위해 정규화됩니다. 결과 출력은 상호 작용하는 단백질의 표적 목록을 생성하며, 이는 단백질 단백질 상호 작용에 대한 추가 조사를 안내하는 데 사용할 수 있습니다. 생체 내 기능성 단백질 마이크로어레이는 15년 전 마이클 스나이더(Michael Snyder)의 연구실에서 개발되었습니다.

그 이후로 이 기술은 다목적성과 생화학적 단백질체학 분석으로 인해 많은 성공적인 응용이 있었습니다. 이 기술은 단백질 상호 작용 및 모듈 식 신호 전달 네트워크의 연구뿐만 아니라 대체 연결 및 이전에 알려진 신호 캐스케이드의 연구를 용이하게합니다 V 5 융합 키나아제 프로브를 배양 및 정제하기 위해 V 5 융합 단백질 플레이트, 합성 완전 우라실, 2 % 포도당 한천에 효모를 함유 한 갓 줄무늬 효모 균주 Y 2 58을 사용하고 냉동 배양에서 3 일 동안 섭씨 30도에서 성장합니다. 단일 군체에서 스타터 배양액을 접종하고 합성 완전 우라실에서 하룻밤 동안 자랍니다.

섭씨 30도에서 흔들리는 플랫폼이나 바퀴에 2%포도당. 다음 날 아침, 400ml의 합성 완전 우라실을 접종합니다. 600나노미터 또는 0.1의 OD 600에서 최종 광학 밀도를 달성하기에 충분한 스타터 배양을 가진 2%라피노스 배양.

접종물을 0.6의 OD 600으로 성장시킨 다음 충분한 3 x 효모 추출물을 첨가하여 V 5 키나아제 융합 구조물 발현을 유도합니다. 유도 매체를 3배 희석하기 위해 6%갈락토오스를 보충한 펩톤 또는 2%의 최종 갈락토오스 농도를 함유한 펩톤진탕 플랫폼에서 섭씨 30도에서 6시간 동안 세포를 유도합니다. 적절한 통기를 보장하기 위해 2리터 삼각 플라스크를 사용하십시오.

400ml의 세포 현탁액을 1000배 G로 섭씨 4도에서 5분 동안 회전시켜 세포를 수확합니다. 50ml의 얼음처럼 차가운 PBS 버퍼로 세포를 한 번 세척하고 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수 또는 A PBS 완충액으로 다시 세척하고 용해를 위해 2개의 밀리리터 스냅 캡 튜브로 옮깁니다.

20, 000 시간 G에 세포를 4 섭씨 온도에 1 분 동안 회전시킨 후에, 피펫을 가진 완충기를 제거하고 얼음에 관을 두십시오. 0.5 밀리미터 지르코니아 비드로 세포를 일대일 부피의 세포 펠릿에서 비드로 PBS 용해, 완충액으로 라이스합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 2분 간격으로 교반 플랫폼을 사용하여 혼합물을 세 번 와류로 회전시킵니다.

20, 000 시간, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 탁상용 마이크로 fuge에 있는 G에 용해물을 분리기를 설치하십시오. 정화된 용해물을 약 100마이크로리터의 사전 세척된 니켈 친화성 수지가 들어 있는 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 2시간 동안 너트레이트에서 배양합니다. 히스타민을 포획하기 위하여는, 표기된 V 5 융해 단백질은 상층액의 제거 후에 1000배 G 그리고 4 섭씨 온도에 5 분 동안 탁상용 분리기를 사용하여 수지를 표

돌연변이체에서 섭씨 4도에서 10분 동안 세척 버퍼로 수지를 세척합니다. 신선한 세척 버퍼로 세척을 두 번 더 반복합니다. 200 밀리몰 올레의 100 마이크로 리터 부피 2 개로 단백질을 용리시킵니다.

샘플의 30%의 최종 농도에 글리세롤을 추가하고 분석에 사용될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 상호 작용을 감지합니다. V five fluoro four conjugated antibody를 프로브에서 밀리리터당 260나노그램으로 희석하고 진탕하여 완충하고 완전히 혼합합니다.

그런 다음 V five 융합 단백질 프로브를 밀리리터당 5-500마이크로그램의 농도 범위로 희석합니다. 다음으로, 냉동실에서 단백질 마이크로어레이를 제거하고 사용 직전에 냉장고에서 섭씨 4도로 가져옵니다. 단백질 마이크로어레이가 들어 있는 슬라이드 홀더에 차단 버퍼를 직접 추가하고 파라폼으로 상단을 덮어 누출을 방지합니다.

섭씨 4도의 스테이지에서 50RP로 흔들어 1시간 동안 블로킹 버퍼의 어레이를 블록합니다. 차단 후 어레이를 섭씨 4도로 타일링된 가습 챔버로 옮기고 90마이크로리터의 희석된 프로브를 어레이 표면에 직접 추가합니다. 어레이를 돌출된 리프터 슬립으로 오버레이하고 섭씨 4도의 가습실에서 1시간 30분 동안 흔들리지 않고 배양합니다.배양 후 슬라이드를 완전히 둘러쌀 수 있는 충분한 사전 냉각 프로브 버퍼가 포함된 50ml 원추형 튜브에 슬라이드를 추가하여 리프터 슬립이 단백질 마이크로어레이에서 부드럽게 미끄러질 수 있도록 합니다.

3개의 원뿔형 튜브에 각각 1분씩 어레이를 세 번 세척합니다. 세척을 완료한 직후 항체 용액을 어레이에 직접 바르고 지워진 리프터 슬립으로 오버레이합니다. 이전과 마찬가지로 가습 챔버에서 섭씨 4도에서 30분 동안 어레이를 배양합니다.

이전과 동일한 세척 단계를 수행하고 탁상용 원심분리기에서 800배 G로 15ml 원뿔형 튜브를 5분 동안 회전시킵니다. 실온에서 647나노미터로 어레이를 스캔하기 전에 어둠 속에서 30분 동안 슬라이드 홀더의 어레이를 자연 건조합니다. 본 실험에서는 TDA one V five의 결합 활성을 조사하였다.

대략 4, 200의 전장 GST 융합 단백질과 중복에서 점박힌 효모 단백질 microarrays는 빈 벡터 대조군 또는 TDA 1개의 V 5개의 probe로 배양되었다. 삽입 패널은 두 어레이의 동일한 영역을 비교합니다. 특히 주목할 만한 것은 RIM 11인데, 흥미롭게도 이전에 발표된 연구에서 TDA 1의 인산화 표적으로도 확인되었습니다.

표적이 확인되면 생체 내에서 생화학적 및 기능적 활성을 테스트할 수 있습니다. 이 비디오를 시청하고 있다면 추가 생체 내 검증 및 질의를 위해 후보 단백질 단백질 상호 작용을 식별하는 수단으로 기능성 단백질 마이크로어레이를 사용하는 방법을 더 잘 이해할 수 있을 것입니다.