Name: 고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 배우세요 고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 활용한 단백질-단백질 상호작용 검출 방법입니다. 형광 표지된 항체로 결합 신호를 측정하여 수천 개의 상호작용을 병렬 분석하고 바이오인포매틱스로 데이터를 해석합니다.

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이 작업은 NIH의 보조금으로 지원되었습니다. 그림 1에 표시된 분석은 Joseph Fasolo 박사가 수행했습니다. 도움이 되는 의견을 주신 Rui Chen 박사님께 감사드립니다.

1. 프로브 준비 <ol><li> 문화 다음과 다른 단백질과의 상호 작용을 조사하기 위해 사용 V5 융합 키나제 프로브를 정제 : <ol><li> 갓 줄무늬 효모 균주 Y258을 사용 (마타 pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) (게이트웨이 벡터 pYES-DEST52에서 표현) V5 융합 단백질을 포함. 마이크로 어레이에 프로브로 분리 된 단백질을 사용합니다. 합성 완료 - 우라실 (SC-URA) / 2 % 덱 스트로스 / 한천의 효모 플레이트 및 냉동 문화 (-80 ° C 글리세롤 주)에서 3 일간 30 ℃에서 성장한다. </li><li> 하나의 식민지에서 스타터 문화 (5 ~ 20 ㎖)에 접종하고 30 ℃에서 플랫폼 (220-250 RPM) 또는 휠을 흔들어에 사우스 캐롤라이나 우라 / 2 % 포도당에서 하룻밤 성장. </li><li> 다음 날 아침, 최종 OD 0.1 600에 충분한 스타터 문화와 사우스 캐롤라이나 우라 / 2 %의 라 피노 오스 문화의 400 ml에 접종. </li><li> 0.6 (600)는 V5 키나아제 쿵푸의 갈락토스 유도 다음 OD하기 위해 접종 성장시온 그래서 갈락토스의 최종 농도가 2 % 인 (3)의 인자에 의해 유도 배지를 희석하기에 충분히 첨가하여, 6 % 갈락토스로 보충 3X 효모 추출물 / 펩톤 (YEP)의 용액을 첨가함으로써 발현을 구성. </li><li> 흔들리는 플랫폼에서 6 시간 동안 30 ° C에서 세포를 유도한다. 적절한 통풍을 보장하기 위해 2 L 삼각 플라스크를 사용합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 1,000 XG에 세포 현탁액 400ml를 회전하여 JA-10 (또는 유사한) 로터를 사용하여 세포를 수확. </li><li> 얼음 50 ml의 차가운 PBS는 버퍼와 50 ML 원뿔 튜브로 전송 한 번 세포를 씻으십시오. 용해를위한 튜브 캡 스냅 ㎖로 2 용해 및 전송에 사용 (세제 또는 기타 첨가제없이) 얼음 차가운 PBS 버퍼에 다시 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 펠릿을 피펫 거리 버퍼 4 ° C에서 1 분간 20,000 XG에서 세포를 스핀. </li><li> 얼음에 튜브를 넣고 용해 단계를 진행합니다. </li><li> 를 Lyse 세포 (250-350 μL 펠렛) 0과1 : 1에서 0.5 mm의 지르코니아 비드를 세포 펠렛, 비드, 인산염 완충 식염수 (PBS)를 1 볼륨을 4 ℃에서 2 분 간격으로 버퍼와 소용돌이를 교반 플랫폼을 3 회 사용하여 혼합물을 용해. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 탁상의 microfuge에 20,000 XG에 해물을 원심 분리기. </li><li> 피펫 폴리 카보네이트 고속 원심 분리기 튜브에 뜨는 4 ° C에서 15 만 XG에 30 분 동안 ulracentrufugation에 의해 명확하게. </li><li> 히스티딘을 캡처 4 ℃에서 2 시간 동안 nutator에 미리 세척 니켈 2 + 친 화성 수지 (~ 100 μL)를 포함하는 튜브에 명확히 해물을 전송하고 부화 (그의) 6X는 V5-융합 단백질 태그. </li><li> 세척 버퍼와 4 ℃에서 10 분 동안 수지 세 번 씻으십시오. 4 ° C에서 1,000 XG에서 5 분을위한 테이블 탑 원심 분리기를 사용하여 수지 펠렛과 뜨는을 대기음. 각 세척 신선한 세척 버퍼를 추가하고 세척하는 동안 튜브를 교반에 대한 nutator을 반환합니다. </li><li> 세척 인트 후PS이 완료, 용출에 대한 신선한 G-25 컬럼 세척 수지를 적용합니다. </li><li> 9 분획의 총 50 밀리미터 단위 500 mM의 이미 다졸을 100 mM의 이미 다졸로 시작 단계적인 방식으로 용출 완충액 25 μl를 적용한다. </li><li> 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔을 사용하여 수집 된 분획을 분석 (SDS-PAGE) 및 분석에서의 사용을 위해 가장 고농축 분획 (들)을 식별하고 -80 ° C에서 30 %와 저장소에 글리세롤을 추가 쿠마시 염색에 사용까지 분석. </li></ol></li></ol> 2. 배열 프로브 참고 : 분석을 시작하기 전에 항체 용액을 제조하는이 섹션의 단계 2.6을 참조하십시오. <ol><li> 상호 작용을 검출하는 프로브 버퍼에 260 ng를 / ㎖로 V5-형광 물질 항체 (예 : AlexaFluor 647)를 희석 흔들어 잘 섞는다. 참고 : 사용하고 nutat에 튜브를 배치 30 분 이전에이 항체 솔루션을 준비또는 또는 휠 완전한 혼합 및 항체의 균질 한 현탁액을 보장합니다. </li><li> 5-500 μg의 / ml의 농도 범위 V5 융합 단백질 프로브를 희석. 주 : 프로브 버퍼를 사용하여 각각의 단백질 - 단백질 상호 작용 분석을 위해 최적화. 최적화 버퍼를 조사하기 위해 더 많은 프로브를 추가 포함한다. 일반적으로 10 μg의 / ml의 시작점으로 이용되고, 신호 강도에 기초하여 적절하게 조정. </li><li> 냉동 (-20 ℃)​​에서 단백질 마이크로 어레이를 제거하고 사용하기 직전에 냉장고에 4 ℃에 가져다. </li><li> 누출을 방지하기 위해 파라 필름으로 위쪽 micorarrays 단백질을 함유하는 슬라이드 홀더에 직접 블로킹 완충액 추가 커버. 4 ° C에서 무대에서 50 rpm으로 흔들어 1 시간 동안 버퍼를 차단하는 배열을 차단합니다. </li><li> 차단 한 후, 4 ℃로 냉각 가습 실에 배열을 전송, 직접 배열 표면에 희석 프로브의 90 μl를 추가합니다. 도착 오버레이1.5 시간 동안 4 ℃에서 가습 실에서 제기 리프터 슬립 AYS 및 정적 배양 (NO 떨고). </li><li> 세 50 ML 원뿔 튜브 프로브 버퍼에 1 분마다 배열하는 과정을 3 회 반복한다. 완전히 슬라이드를 봉투에 충분한 사전 냉장 프로브 버퍼를 포함하는 원뿔 튜브 슬라이드를 추가합니다. 리프터 슬립 부드럽게 단백질 마이크로 어레이 (이 어레이의 표면에 손상을 줄 수 있기를 강제로 해제하지 않음)의 미끄러하도록 허용합니다. </li><li> 바로 이전 제기 리프터 슬립 세척 (단계 2.5) 및 오버레이를 완료 한 후 배열에 직접 항체 용액을 적용합니다. 습윤 챔버에서 4 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션 배열. </li><li> 실온에서 5 분 동안 원심 탁상 800 XG에 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 동일한 워시 (프로브 버퍼에서 1 분 3 회) 전 단계로서, 스핀을 수행한다. 647 nm에서 배열을 스캔하기 전에 30 분 동안 어둠 속에서 슬라이드 홀더에 배열을 공기 - 건조. </li></ol>

<ol><li>Fasolo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+protein+kinase+interactions+identified+by+protein+microarrays+reveal+novel+connections+between+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes.</a> Genes. 25, 767-778 (2011).</li>
<li>Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProCAT%3A+a+data+analysis+approach+for+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays.</a> Genome biology. 7, R110(2006).</li>
<li>Breitkreutz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+protein+kinase+and+phosphatase+interaction+network+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast.</a> Science. 328, 1043-1046 (2010).</li>
<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415, 141-147 (2002).</li>
<li>Jeong, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+monospecific+monoclonal+antibodies+using+a+human+proteome+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293, 2101-2105 (2001).</li>
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<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

프로토콜은 원래 생체 한 새로운 키나제 상호 작용 네트워크의 식별 결과 효모 단백질 키나제의 구별과 관련 제품군 간의 결합 활성을 비교하는 (85) 고유의 효모 단백질 키나제 V5 융합 단백질을 사용하여 수행 하였다 선보였다. 신흥 프로테옴 프로파일 링 기술로, 높은 처리량 (HTP) 펩타이드 라이브러리, 진핵 생물과 원핵 생물의 모델 생물 8,17에 의존 단백질 마이크로 어레이를 이용하여 프로테옴의 선별 검사의 개발; 이후, 이러한 분석 플랫폼은 식물과 인간의 5,7- 등의 고급 진핵 세포에 적용 하였다. 현재 어떤 상업적으로 이용 가능한 효모 단백질 어레이는 없다. 그러나 순서는 cDNA를 수집 여러 자원에서 사용할 수있는 검증 기술이 강력 할 수 있지만, 염두에 두어야 하나주의해야 할 점은, 따라서 결과는 오탐 (false positive)이있을 것이다, 분석은 <...

단백질 생화학 및 생체 내에서 결합 활성의 글로벌 분석을 수행 할 필요가 단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제) 및 전체 프로테옴 1,3-8의 번역 후 변형 프로파일에 대한 새로운 방법의 발전을 가져왔다. 단백질 마이크로 어레이는 항체 (10, 11)를 포함하는 4-6,8,9 전체 길이 기능성 단백질을 사용하여 기능성 단백질 마이크로 어레이, 또는 분석 단백질 마이크로 어레이로 제조된다. 이들은 12 광범위한 분석을 생화학 실험 실시에 필요한 다양한 조건을 용이하게하기 위해, 표면의 화학 다양한 현미경 슬라이드 상에 배열 된 단백질의 고밀도를 포함하도록 설계된다. 같은 다른 사람 (13) 사이의 친 화성이 부착 그의 - 태그 단백질과 글루타티온를 연결하는 니켈 킬레이트 슬라이드로 라이신 또는 선호도 부착 방법을 통해 화학 부착 니트로 셀룰로오스와 알데히드 표면 화학. </p&gt; 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 기능성 단백질 마이크로 어레이를 사용하면 고품질의 기능성 단백질 라이브러리 (14)에 대한 액세스를 필요로한다. S.을 cerevisiae의 높은 처리량 크로마토 그래피 정제 기술과 단백질 구조를 태그 높은 복사 친 화성의 페어링을 통해 이러한 라이브러리를 생산하는 의무가있다. 효모 게놈의 대부분은 서열화되어 거의 전체 프로테옴 정화용 높은 카피 플라스미드로부터 발현 될 수 있으며, 생화학 (12)를 분석한다. 단백질을 수득 및 384- 웰 포맷으로 배열되면, 이들은 빠른 병렬 다중 파라 생화학 및 생물 정보학적인 분석을 가능하게 심문 8,14-16 현미경 슬라이드 상에 인쇄된다. 단백질 마이크로 어레이는 다른 많은 응용들 중 단백질, 지질, 소분자, 핵산과 효소 분석법과의 상호 작용을 위해 사용되어왔다. 프로테옴의 표면에 단백질의 접근성배열은 다음과 같은 분석 검출 다른 유형의 면역 친 화성에 그들이 순종 할 플라즈몬 공명, 형광 및 다른 많은 기술을 표면. 또한,이 생체 내에서 수행하기 어려울 수있는 실험 조건의 미세 조정을 허용한다. 이 프로토콜의 목적은 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 기능성 단백질 마이크로 어레이의 적절한 사용을 설명한다. 이 애플리케이션은 관심 고순도 검체 (단백질)를 사용하여 단백질 결합 활동 높은 처리량 병렬 생화학 분석을 가능하게한다. C 말단 (말단 카복시) 관심 V5 미끼 융합 단백질 단백질 정제를 위해 최적화 된 효모 균주에서 높은 카피 플라스미드로부터 생성되는 태그. C 말단 태깅 전장 단백질 번역 한 것을 보장한다. 본 연구에 사용 된 단백질은 His6X 태그를 통해 니켈 친 화성 수지를 사용하여 정제한다 Tda1-V5 융합 단백질 키나아제이다. Tda1-V5 융합 CONSTRUCt는 분석법에 사용하기에 가장 고농축 분획을 용리 이미 다졸 구배를 사용하여 용출을 통해 직렬 정제한다.

<table><tbody><tr><td>페트리 접시</td><td>: VWR</td><td>NC-10747</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>박 토 효모 추출물</td><td>: Difco</td><td>0217-17</td><td></td></tr>, <tr><td>Bacto 펩톤</td>, <td>Difco</td><td>0118-17</td><td></td></tr>, <tr><td>Bacto 한천</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td></td></tr>, <tr><td>포도당</td><td>시그마</td><td>D9434</td><td></td></tr>, <tr><td>라피 노스</td><td>시그마</td><td>R0514</td><td></td></tr><tr><td>갈락토스</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>Sc-Ura 드롭아웃 미디어</td><td>MP Bio</td><td>114410622</td><td></td></tr><tr><td>소형 배양 튜브</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>대형 삼각 플라스크</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 JA-10 로터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브(500ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 튜브(50ml)</td><td>VWR/Fisher</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>시그마</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep 튜브 (2 ml 스크류 캡 튜브)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastPrep 기계</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>지르콘 비즈</td><td>BioSpec</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>시그마</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>시그마</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S3014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸 (pH = 7.4)</td><td>시그마</td><td>I5513&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>완전한 억제제 칵테일 (EDTA 무료)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase 억제제 칵테일 1</td><td>시그마</td><td>P2850</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>A2153&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>트윈-20</td><td>시그마</td><td>P1379&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>시그마</td><td>A1852&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터 (30 &deg; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>니켈 친화력 수지</td><td>Life Technologies</td><td>R901-01</td><td></td></tr><tr><td>G25 열</td><td>GE 생명과학</td><td>27-5325-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 젤 (NuPage)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>단클론 V5 항체</td><td>Life Technologies</td><td>R960-25</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 태그 단클론 V5 항체</td><td>Life Technologies</td><td>451098</td><td></td></tr><tr><td>단백질 마이크로어레이 Kit</td><td>Life Technologies</td><td>PAH0525013</td><td></td></tr><tr><td>Genepix 스캐너</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>리프터 슬립</td><td>토마스 사이언티픽</td><td></td><td>http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/</td></tr> <tr><td>용해 버퍼: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM 이미다졸 (pH 7.4), 완전한 프로테아제 억제제 칵테일 &ndash; EDTA-free, Phosphatase 억제제 칵테일 1, 1 mM PMSF&nbsp; (사용 직전에 추가)</td><td></td><td></td><td>1x PBS(0.01M 인산염 완충액, 0.0027M 염화칼륨, 0.137M 염화나트륨, pH 7.4)에 시약을 추가하여 원하는 부피의 용해 용액을 얻습니다.</td></tr><tr><td>차단 완충액: 1% 소 혈청 알부민(BSA), 0.1% Tween-20</td><td></td><td></td><td>1x PBS에 시약을 추가하여 원하는 부피의 차단 완충액</td></tr><tr><td>을 얻습니다.프로브 버퍼 : 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% 트리톤 X-100, 50 mM NaCl, 500 &mu; M ATP(키나아제용), 1% BSA</td><td></td><td></td><td>원하는 부피의 프로브 완충액을 얻기 위해 1x PBS에 시약을 추가합니다</td></tr>. 세척 <tr><td>완충액: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td>1x PBS에 시약을 추가하여 원하는 부피의 프로브 완충액</td></tr><tr><td>을 얻습니다.용리 완충액 : 0.1 % 트리톤 X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 &ndash; 500 mM 이미다졸 (pH 7.4), 완전한 프로테아제 억제제 칵테일 &ndash; EDTA 프리, 인산가수분해효소 억제제 칵테일 1, 1 mM PMSF (사용 직전 추가)</td><td></td><td></td><td>시작하기 전에 이미다졸의 농도 구배(50 &ndash; 500 mM)를 기록하고 각 농도에 대해 별도의 튜브를 만드는 것이 중요합니다(50 mM 단위를 사용하여 간격을 만드는 것이 좋습니다). 원하는 양의 프로브 버퍼를 얻기 위해 시약을 1x PBS에 추가합니다</td></tr>. <tr><td>3x YEP +6% 갈락토스: 효모 추출물 30g과 펩톤 60g을 H2O 700ml에 용해하고 오토클레이브합니다. 멸균 처리된 20% 갈락토오스 (wt/vol)</td><td></td><td></td> 필터 300ml 추가<td>&nbsp; Galactose는 고압멸균해서는 안 됩니다.</td></tr></tbody></table>

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

~ 4,200 재조합 효모 단백질을 함유하는 고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이는 판독에 대한 V5 에피토프 태그를 함유하는 친 화성 정제 효모 키나제 융합 단백질을 사용하여 키나아제 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사한다. 정제 키나제 키나제 V5 융합체는 GAL 유도 성 프로모터 하에서 구축 플라스미드를 함유하는 형질 높은 사본 단백질 생산을 위해 최적화 효모 균주의 배양을 통해 얻어진다. 효모는 2 %의 갈락토오스와 유도 한 다음 6 시간 동안 중립 탄소원과 제한 배지에서 성장시킨다. 그 다음, 배양 물 수거되고 키나제 분석에 사용하기위한 고순도의 단백질 키나아제를 얻었다 표준 친화 크로마토 그래피 기술을 사용하여 정제한다. 정제 키나아제 분석을 위해 적절한 범위로 키나아제 완충액으로 희석하고 단백질 마이크로 어레이는 종래 단백질 마이크로 어레이와 하이브리드 화를 차단한다. 혼성화 후, 어레이는 단클론 V5의 antib로게나ODY은 키나제-V5 단백질에 의해 결합 단백질을 식별합니다. 마지막으로, 어레이는 표준 마이크로 어레이 스캐너를 사용하여 스캔되고, 데이터는 생체 내에서 검증을 위해 하류 단백질 상호 작용의 세트 높은 신뢰도를 결정하기 위해 하류 정보학 분석 1,2- 위해 추출된다.

단백질 - 단백질 상호 작용 활성 Tda1-V5 단백질 키나제 융합 약 4,200 고유 S. 함유 효모 기능성 단백질 마이크로 어레이에 대해 미끼 단백질로서 구성 평가하는 표준 칩 판독기를 사용하여 관찰 cerevisiae의 GST 융합 단백질. 제품, GenePix 소프트웨어 또한 심문은 다양한 강도의 이벤트를 바인딩의 다수를 한 것으로 밝혀졌습니다. 친화도는 목표 (V5 키나아제)에 결합 모노클 V5 항체 - 형광 물질로부터 유도 된 신호의 강도 등급에서 계측 하였다. ProCat 스코어링 알고리즘 2 (각 단백질 어레이에 두 번 발견되는) 이중으로 분석 단백질 각각에 대한 두 개의 별도의 단백질 마이크로 어레이에 걸쳐 단백질 - 단백질 상호 작용을 확인하는 데 사용 된 후 임계 컷오프가 관찰 상호 작용을 처치 구 하였다. 하나 4 기술은 복제 (N = 4) INT를 결정하기 위해 사용할 수있는 두 개의 배열을 취득 비교...

거의 전체 (S)를 포함하는 단백질 마이크로 어레이를 사용하여 cerevisiae의 프로테옴은 병렬 단백질 - 단백질 상호 작용의 수천의 신속한 편견 심문 프로브된다. 이 방법은 단백질 - 소분자, 번역 후 수정 및 높은 처리량의 다른 분석을 위해 이용 될 수있다.

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

이 절차의 가장 중요한 목표는 다른 기술로는 불가능한 병렬 비편향 방식으로 주어진 단백질체 내에서 단백질, 단백질 상호 작용을 식별하는 것입니다. 이는 현미경 슬라이드 표면의 좌표 평면에 증착된 고도로 정제된 전체 길이 기능성 단백질 라이브러리와 함께 관심 단백질을 먼저 혼성화하고 에피토프(epitope)로 태그하여 수행됩니다. 단백질이 어레이의 각 표적 단백질과 평형에 도달하면 결합되지 않은 분획이 씻겨 나가고 표준 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 형광 부분에 접합된 에피토프에 대한 단클론 항체로 단백질 상호 작용이 검출됩니다.결과 이미지는 결합된 단백질 및 형광 신호와 관련된 각 특징의 강도에 관한 정보와 인터레이스됩니다. 이 정보는 마이크로어레이 분석 소프트웨어의 도움으로 외삽되어 어레이의 각 특징에 대한 강도 값 목록을 생성합니다. 단백질-단백질 상호 작용 쌍에 관한 정보를 다운스트림 생물정보학 분석 소프트웨어로 내보내 특징별 데이터를 스코어링하고 관심 단백질과 마이크로어레이의 단백질 간의 단백질 상호 작용을 식별할 수 있습니다.원시 신호 강도 데이터는 inter 및 intra assay 변동을 설명하기 위해 두 개 이상의 단백질 마이크로어레이에 걸쳐 컴파일되며, 데이터는 각 상호 작용에 점수를 매기기 위해 정규화됩니다. 결과 출력은 상호 작용하는 단백질의 표적 목록을 생성하며, 이는 단백질 단백질 상호 작용에 대한 추가 조사를 안내하는 데 사용할 수 있습니다. 생체 내 기능성 단백질 마이크로어레이는 15년 전 마이클 스나이더(Michael Snyder)의 연구실에서 개발되었습니다.그 이후로 이 기술은 다목적성과 생화학적 단백질체학 분석으로 인해 많은 성공적인 응용이 있었습니다. 이 기술은 단백질 상호 작용 및 모듈 식 신호 전달 네트워크의 연구뿐만 아니라 대체 연결 및 이전에 알려진 신호 캐스케이드의 연구를 용이하게합니다 V 5 융합 키나아제 프로브를 배양 및 정제하기 위해 V 5 융합 단백질 플레이트, 합성 완전 우라실, 2 % 포도당 한천에 효모를 함유 한 갓 줄무늬 효모 균주 Y 2 58을 사용하고 냉동 배양에서 3 일 동안 섭씨 30도에서 성장합니다. 단일 군체에서 스타터 배양액을 접종하고 합성 완전 우라실에서 하룻밤 동안 자랍니다.섭씨 30도에서 흔들리는 플랫폼이나 바퀴에 2%포도당. 다음 날 아침, 400ml의 합성 완전 우라실을 접종합니다. 600나노미터 또는 0.1의 OD 600에서 최종 광학 밀도를 달성하기에 충분한 스타터 배양을 가진 2%라피노스 배양.접종물을 0.6의 OD 600으로 성장시킨 다음 충분한 3 x 효모 추출물을 첨가하여 V 5 키나아제 융합 구조물 발현을 유도합니다. 유도 매체를 3배 희석하기 위해 6%갈락토오스를 보충한 펩톤 또는 2%의 최종 갈락토오스 농도를 함유한 펩톤진탕 플랫폼에서 섭씨 30도에서 6시간 동안 세포를 유도합니다. 적절한 통기를 보장하기 위해 2리터 삼각 플라스크를 사용하십시오.400ml의 세포 현탁액을 1000배 G로 섭씨 4도에서 5분 동안 회전시켜 세포를 수확합니다. 50ml의 얼음처럼 차가운 PBS 버퍼로 세포를 한 번 세척하고 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수 또는 A PBS 완충액으로 다시 세척하고 용해를 위해 2개의 밀리리터 스냅 캡 튜브로 옮깁니다.20, 000 시간 G에 세포를 4 섭씨 온도에 1 분 동안 회전시킨 후에, 피펫을 가진 완충기를 제거하고 얼음에 관을 두십시오. 0.5 밀리미터 지르코니아 비드로 세포를 일대일 부피의 세포 펠릿에서 비드로 PBS 용해, 완충액으로 라이스합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 2분 간격으로 교반 플랫폼을 사용하여 혼합물을 세 번 와류로 회전시킵니다.20, 000 시간, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 탁상용 마이크로 fuge에 있는 G에 용해물을 분리기를 설치하십시오. 정화된 용해물을 약 100마이크로리터의 사전 세척된 니켈 친화성 수지가 들어 있는 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 2시간 동안 너트레이트에서 배양합니다. 히스타민을 포획하기 위하여는, 표기된 V 5 융해 단백질은 상층액의 제거 후에 1000배 G 그리고 4 섭씨 온도에 5 분 동안 탁상용 분리기를 사용하여 수지를 표기했다.돌연변이체에서 섭씨 4도에서 10분 동안 세척 버퍼로 수지를 세척합니다. 신선한 세척 버퍼로 세척을 두 번 더 반복합니다. 200 밀리몰 올레의 100 마이크로 리터 부피 2 개로 단백질을 용리시킵니다.샘플의 30%의 최종 농도에 글리세롤을 추가하고 분석에 사용될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 상호 작용을 감지합니다. V five fluoro four conjugated antibody를 프로브에서 밀리리터당 260나노그램으로 희석하고 진탕하여 완충하고 완전히 혼합합니다.그런 다음 V five 융합 단백질 프로브를 밀리리터당 5-500마이크로그램의 농도 범위로 희석합니다. 다음으로, 냉동실에서 단백질 마이크로어레이를 제거하고 사용 직전에 냉장고에서 섭씨 4도로 가져옵니다. 단백질 마이크로어레이가 들어 있는 슬라이드 홀더에 차단 버퍼를 직접 추가하고 파라폼으로 상단을 덮어 누출을 방지합니다.섭씨 4도의 스테이지에서 50RP로 흔들어 1시간 동안 블로킹 버퍼의 어레이를 블록합니다. 차단 후 어레이를 섭씨 4도로 타일링된 가습 챔버로 옮기고 90마이크로리터의 희석된 프로브를 어레이 표면에 직접 추가합니다. 어레이를 돌출된 리프터 슬립으로 오버레이하고 섭씨 4도의 가습실에서 1시간 30분 동안 흔들리지 않고 배양합니다.배양 후 슬라이드를 완전히 둘러쌀 수 있는 충분한 사전 냉각 프로브 버퍼가 포함된 50ml 원추형 튜브에 슬라이드를 추가하여 리프터 슬립이 단백질 마이크로어레이에서 부드럽게 미끄러질 수 있도록 합니다.3개의 원뿔형 튜브에 각각 1분씩 어레이를 세 번 세척합니다. 세척을 완료한 직후 항체 용액을 어레이에 직접 바르고 지워진 리프터 슬립으로 오버레이합니다. 이전과 마찬가지로 가습 챔버에서 섭씨 4도에서 30분 동안 어레이를 배양합니다.이전과 동일한 세척 단계를 수행하고 탁상용 원심분리기에서 800배 G로 15ml 원뿔형 튜브를 5분 동안 회전시킵니다. 실온에서 647나노미터로 어레이를 스캔하기 전에 어둠 속에서 30분 동안 슬라이드 홀더의 어레이를 자연 건조합니다. 본 실험에서는 TDA one V five의 결합 활성을 조사하였다.대략 4, 200의 전장 GST 융합 단백질과 중복에서 점박힌 효모 단백질 microarrays는 빈 벡터 대조군 또는 TDA 1개의 V 5개의 probe로 배양되었다. 삽입 패널은 두 어레이의 동일한 영역을 비교합니다. 특히 주목할 만한 것은 RIM 11인데, 흥미롭게도 이전에 발표된 연구에서 TDA 1의 인산화 표적으로도 확인되었습니다.표적이 확인되면 생체 내에서 생화학적 및 기능적 활성을 테스트할 수 있습니다. 이 비디오를 시청하고 있다면 추가 생체 내 검증 및 질의를 위해 후보 단백질 단백질 상호 작용을 식별하는 수단으로 기능성 단백질 마이크로어레이를 사용하는 방법을 더 잘 이해할 수 있을 것입니다.

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이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

본 연구에서 우리는 특정 단백질의 글리코 실화 프로 파일링에서 사용할 수있는 렉틴 검출 방법과 멀티 플렉스 높은 처리량 항체 microarray를위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 새로운 신뢰할 수있는 시약을 갖추고 있으며 훨씬 이전 절차에 비해 시간, 비용, 연구 장비 요구 사항을 줄여줍니다.

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

이 동영상은 비오틴화된 세포 침투 펩타이드를 사용하여 세포 내 단백질-단백질 상호 작용을 감지하는 기술을 보여줍니다. 세포 침투 펩타이드는 접합 펩타이드가 세포에 들어가 상호 작용하는 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 용이하게 합니다. 비오틴은 아비딘(avidin)에 결합한 후 세포 용해물에서 상호 작용하는 단백질 복합체를 정제할 수 있습니다.

단백질과 단백질의 상호작용을 검출하기 위한 Biotinylated Cell-Penetrating Peptide 프로브

이 동영상은 근접 결찰 분석법(PLA)을 사용하여 초파리 신경근 접합부(NMJ)에서 단백질-단백질 상호 작용의 시각화를 보여줍니다. 체벽을 분리한 후 상호 작용하는 단백질을 1차 항체 및 PLA 접합 2차 항체로 조사합니다. 상호 작용하는 단백질의 근접성은 커넥터 올리고뉴클레오티드와 프로브의 결찰을 용이하게 하여 원형 DNA를 형성한 다음 롤링 서클 증폭에 의해 증폭됩니다. 형광 프로브는 증폭된 DNA에 결합하여 NMJ에서 단백질-단백질 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

Detection of Protein-Protein Interactions in Drosophila larvae using a Proximity Ligation Assay(근접 결찰 분석을 사용한 초파리 유충의 단백질-단백질 상호작용 검출)

펩타이드 어레이 스크리닝은 단백질-단백질 상호 작용 부위를 식별하기 위한 고처리량 분석법입니다. 이를 통해 표적 단백질의 여러 상호 작용을 매핑할 수 있으며 단백질을 표적으로 하는 억제제의 부위를 식별하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 여기에서는 펩타이드 어레이를 스크리닝하고 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

단백질은 서로 상호 작용하며 이러한 상호 작용은 단백질의 기능을 대부분 결정합니다. 단백질 상호 작용 파트너는 디하이드로폴레이트 환원효소 단백질-단편 보완 분석법(DHFR-PCA)을 기반으로 하는 효모 적합성 분석을 사용하여 생체 내에서 고처리량으로 식별할 수 있습니다.

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

여기, 우리는 높은 처리량 프로토콜 화면 extracellular 단백질 microarrays 소설 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 제시. 우리는 또한 단백질 microbead 복합물을 사용 하 여 일시적인 단백질-단백질 상호 작용의 탐지를 강화 하는 방법을 설명 합니다.

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Cognate J-도메인 단백질은 Hsp70 샤페론과 협력하여 단백질 폴딩에서 분해에 이르는 수많은 생물학적 과정을 지원합니다. 여기서, 우리는 세균, 효모 및 인간 세포에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 기계의 모니터링을 허용하는 내부 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다.

박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링

여기에서는 화학 프로브 및 질량 분석법을 사용하여 천연 세포 및 조직에서 질병 특이적 단백질-단백질 상호 작용을 포착하고 식별할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 결과 상호 작용 데이터 세트는 전용 웹 기반 플랫폼을 통해 분석되어 질병과 관련된 동적 네트워크 기능 장애 및 경로 변경을 밝힙니다.

질병에서 기능 장애 단백질-단백질 상호 작용 매핑

배우세요 고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 활용한 단백질-단백질 상호작용 검출 방법입니다. 형광 표지된 항체로 결합 신호를 측정하여 수천 개의 상호작용을 병렬 분석하고 바이오인포매틱스로 데이터를 해석합니다.

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

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