루시 페라 제 발현 재조합 바이러스의 높은 처리량의 적정

다음 실험의 전반적인 목표는 고처리량 정량화 방법을 사용하여 루시퍼라제 태그 바이러스의 바이러스 역가를 추정하는 것입니다. 이는 적정 대상 샘플의 상등액과 바이러스 표준 곡선을 허용 세포주에 전달하여 루시페라제 발현을 허용함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, RESA zurin을 원래 샘플에 첨가하여 세포 생존율을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

다음으로, 적절한 배양 시간 후에 발광으로 정량화하기 위해 luciferian을 세포에 첨가합니다. 결과는 루시페라제 발현을 기반으로 샘플의 바이러스 양을 보여줍니다. 플라크 적정과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 많은 수의 샘플을 동시에 빠르게 처리할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 바이러스를 발현하는 딸깍거리는 루시퍼라아제(luciferase)로 확장될 수도 있습니다. 플라크 형성에 의존하지 않기 때문에 세포 독성에 대한 판독은 워크플로우에 쉽게 통합될 수 있으며 약물 스크리닝의 맥락에서 유용할 수 있습니다. 제 연구실의 대학원생 3명인 바네사(Vanessa), 라미아(Ramia), 콜린(Colin)이 시연할 예정인데, 먼저 96년에 반딧불이 루시페라아제를 표현하는 VSP Delta 51을 사용하여 감염을 수행합니다.

음, 이러한 플레이트의 상등액은 적정 24시간 전에 적절한 배양 시간 후에 적정됩니다. 10%FBS 30 밀리몰 힙 및 1%페니실린 스트렙토마이신 C를 함유하는 DMEM에서 밀리리터당 5번째 세포에 2.5 곱하기 10의 농도로 Vero 세포의 현탁액을 96의 네 번째 세포에 2.5배 10으로 준비합니다. 웰 화이트, 단단하고 평평한 바닥 플레이트는 마이크로 플레이트 디스펜서를 사용하여 세포 현탁액을 준비하고 튜브를 50 밀리리터의 멸균수로 세척하여 마이크로 플레이트 디스펜서 카세트를 청소합니다.

그런 다음 마이크로플레이트 디스펜서 라인에 세포 현탁액을 채워 5ml의 세포 현탁액이 통과할 수 있도록 합니다. 흰색 벽의 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터를 디스펜싱하는 프로그램을 선택하고 추가 플레이트에 대해 필요에 따라 반복합니다. 또한 세포 건강과 밀도를 확인하기 위해 96웰 투명한 흰색 바닥판에 몇 개의 웰을 파종합니다.

완료되면 셀을 원래 용기로 다시 플러시합니다. 50%에탄올 70밀리리터를 흐르게 한 다음 튜브를 통해 50밀리리터의 따뜻한 멸균수를 흘려 카세트를 청소합니다. 그런 다음 가습된 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.

vero 세포로 이식한 후 밀리리터당 플랫폼 단위의 최종 농도가 다음과 같도록 혈청이 없는 DMEM에서 VSV Delta 51의 표준 곡선을 준비합니다. Vero 세포 플레이트당 각 농도의 50마이크로리터를 준비하고 추가로 10%표준 곡선을 96 딥 웰 플레이트로 전달할 수 있습니다. 다음으로, 광학 현미경으로 투명한 바닥 96 웰 플레이트에 도금된 Vero 셀을 확인하여 단층이 최소 95%의 융합 트랜스 전달인지 확인합니다.

표준 곡선의 각 희석액 25마이크로리터에서 12채널 다중 채널 피펫터를 사용하여 흰색 벽으로 된 플레이트에 앉은 Vero 셀에 25마이크로리터의 샘플 상등액을 두 개의 지정된 컬럼의 Vero 셀에 주입합니다. 실온에서 430Gs로 5분 동안 플레이트를 원심분리합니다. 그런 다음 가습된 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 5시간 동안 플레이트를 배양합니다.

이 시점에서 바이러스와 세포를 포함하는 샘플의 96웰 플레이트의 각 웰에 있는 부피의 10%에 해당하는 양으로 zurin을 추가합니다. 2-4시간 후, 여기(excitation)에 530-560, 방출 보고에 590을 사용하여 형광판 리더로 신호를 읽고 기록합니다. 다음 공식에 따른 샘플에 대한 세포 생존율.

5시간 배양이 끝나기 30분 전에 루시퍼를 준비하여 멸균 인산염 완충 식염수에서 밀리리터당 2밀리그램 용액을 얻습니다. 25마이크로리터의 루시퍼에서 5시간의 배양 기간 후 광도계에 통합된 자동 디스펜서를 사용하여 흰색 고체 플레이트에 있는 Vero 세포의 각 웰로 용액을 빛으로부터 보호합니다. 다음 매개변수로 플레이트를 읽습니다.

5초 동안 흔들고 30초 동안 기다립니다. 적절한 고정 감도 슬래시 노출 값에서 발광을 읽은 다음 정량화된 생물 발광 강도를 기록하고 저장합니다. 자동 디스펜서를 사용하여 루시퍼를 추가하고, 루시퍼를 퍼붓고, 멸균수 또는 정확한 결과로 선을 프라이밍한 경우 비선형 회귀를 풀어 표준 곡선에서 언덕 방정식을 생성합니다.

이 방정식을 역가된 샘플에 적용하여 바이러스 발현 단위를 계산합니다. VSV Delta 51의 일반적인 표준 곡선의 결과가 여기에 표시되거나 매개변수 비선형 회귀 분석이 알려지지 않은 입력 형성 단위를 보간할 수 있는 우박 플롯을 생성했습니다. Vero 세포에 대한 표준 플라크 분석으로 얻은 바이러스 역가를 동일한 샘플에서 계산된 바이러스 역가와 비교했습니다.

고처리량 루시페라아제 분석을 사용하여 적정한 샘플은 VSV Delta 51 및 7, 8, 6, 0 세포의 복제 및 확산을 향상시키기 위해 다양한 화학 물질을 사용한 실험에서 유래했습니다. R 제곱이 0.8083이고 Pearsons R 점수가 0.899인 역가와 바이러스 발현 단위 간의 선형 상관관계가 여기에 설명되어 있습니다. 대사 분석에서 얻은 일반적인 세포 독성 데이터는 감염 전에 화학 물질로 처리된 7, 8, 6, 0 세포에 대한 것입니다.

VSV Delta 51을 사용하면 반딧불이 루시퍼라아제를 모두 발현하는 단순 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스 및 아데노 관련 바이러스에서 얻은 일반적인 표준 곡선이 여기에 표시됩니다. 마스터링되면 이 기술을 사용하여 관심 바이러스와 함께 화합물 라이브러리의 고처리량 스크리닝을 수행하여 역가 및 세포 독성 데이터를 생성할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안에는 바이러스 발현 단위를 보간하는 데 중요하므로 표준 곡선을 적절하게 희석하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

살아있는 바이러스와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 생물 안전 캐비닛에서 작업하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이 동영상을 시청한 후에는 알려지지 않은 바이러스 발현 단위의 보간에서 생물 발광의 루시페라제 이식유전자 측정의 발현을 기반으로 하는 고처리량 정량화 방법을 사용하여 바이러스 역가를 추정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 표준 곡선 샘플에서 세포 독성은 적절한 생존도 분석에 의해 동시에 측정될 수 있습니다.