소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

다음 비디오의 전반적인 목적은 포유류 발현 시스템을 사용하여 단백질 또는 단백질 복합체의 우수한 수율을 생산하는 간단하고 저렴한 기술을 보여주는 것입니다. 이는 5%의 이산화탄소로 유지되는 대기를 가진 가습된 진탕 인큐베이터에서 현탁액 HEC 2 93 F 세포를 배양함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 세포는 하나 이상의 고복사수 발현 플라스미드로 일시적으로 transfection됩니다.

형질주입제인 폴리에틸렌 EIN 또는 PEI를 사용하여, 세포를 수확하기 전에 48시간 동안 성장시키도록 하였다. 다음으로 친화성 수지를 사용하여 단백질 정제를 수행한 다음 겔 여과를 수행하여 구조 및 기능 연구를 수행하기 위해 관심 단백질 복합체를 정제합니다. 궁극적으로, 이 저렴하고 간단한 포유류 발현 시스템은 박테리아 세포에서 발현하기 어려운 단백질과 단백질 복합체의 발현과 정제를 가능하게 합니다.

이 접근법의 주요 장점은 단백질 복합체의 발현을 위한 편의성과 다양성입니다. 박테리아에서 단백질을 만드는 것만큼 쉬운데, 특히 단백질 발현 벡터를 혼합하고 일치시킬 수 있기 때문에 더욱 그렇습니다. 이 방법은 처음에는 단백질 압축의 발현을 테스트하기 위해 소규모로 사용할 수 있지만 단백질 압축의 우수한 수율을 생성하도록 쉽게 확장할 수 있습니다.구조 및 기능 연구의 경우 성공의 열쇠는 박테리아나 효모 감염이 없는 건강한 상태로 세포를 유지하는 것입니다.

미디어에 나와 있는 항생제는 단백질 수율을 크게 감소시킵니다. 먼저 액체 질소에서 밀리리터당 2,000만 개의 세포 밀도로 1밀리리터의 HEC 2 9 3 F 세포가 들어 있는 극저온 바이알을 제거하고 섭씨 37도의 수조에서 빠르게 해동합니다. 위아래로 몇 차례 피펫팅하여 덩어리를 분해하고 전체 내용물을 34ml의 Prewarm 배지가 들어 있는 250ml 원뿔형 세포 배양 플라스크에 피펫팅합니다.

48시간 후 섭씨 37도, 120RPM 및 5% 이산화탄소의 가습된 궤도 진탕 인큐베이터에 배양물을 넣습니다. trian blue로 세포 생존력을 확인합니다. 이 단계에서 정상적인 세포 생존율을 염색하는 것은 약 70%이며, 세포가 밀리리터당 약 100만 개의 세포 수에 도달했을 때 발생합니다.

60밀리리터의 예열 배지가 들어 있는 250밀리리터 원뿔형 세포 배양 플라스크에 밀리리터당 35만 개의 세포가 최종적으로 계산될 때까지 마사지하고, 48시간마다 또는 밀리리터당 약 200만 개의 세포에 도달할 때 세포를 계속 마사지합니다. 여기에 표시된 것은 transfection을 위해 seeded 준비가 된 stock에서 밀리리터당 230만 개의 세포를 가진 Trian blue stain HEC 2 9 3 F 세포 샘플입니다. 세포는 단일 세포 또는 분열 세포로만 존재해야 합니다. 세포가 과도하게 자라면 큰 덩어리를 형성하고 이 그림과 같이 생존력이 매우 낮습니다.

세포가 군집을 형성하고 있는 경우, 25초 동안 격렬한 소용돌이에 의해 세포가 분해될 수 있습니다. 우선, 대규모 배양은 1리터당 50만 개의 세포를 파딩하여 각 1리터 롤러 병에 300밀리리터의 최종 부피를 만듭니다. 세포가 밀리리터당 100만 개의 세포 밀도에 도달할 때까지 섭씨 37도, 135RPM 및 5% 이산화탄소의 가습된 오비탈 쉐이커에서 24시간 동안 배양합니다.

다음으로, 총 300마이크로그램의 필터를 피펫으로 DNA를 멸균한 DNA를 30밀리리터의 인산염 완충 식염수 또는 PBS에 넣고 3초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다. 그런 다음 밀리리터당 0.5밀리그램 1.2밀리리터를 추가합니다. 멸균된 PEI를 PB SDNA 용액에 여과하고 추가로 3초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다.

혼합물을 실온에서 20분 동안 배양한 후 유아용 침대 다음 세포에 혼합물을 첨가하십시오. Transfection은 48시간 후 섭씨 37도, 135RPM 및 5% 이산화탄소에서 48시간 동안 가습된 안와 진탕 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 3000배 G로 5분 동안 세포를 원심분리하여 세포 내 단백질을 수확합니다.

셀 펠릿을 즉시 사용할 수 없는 경우 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜은 단백질 중 하나에 flag tag가 있는 핵에서 단백질 복합체를 정제하는 데 최적화되어 있습니다. 정제 resus를 시작하려면 세포 팔레트를 약 40 ml의 사전 냉각 용해, 배양 리터당 완충액, 위아래로 여러 번 피펫팅의 조합을 사용하여 현탁하고 유리 균질기를 15 초 동안 15 초 동안 3 회 초음파 처리합니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 25분 동안 108, 000회 G를 원심분리하고 앙와위 나트륨을 유지합니다. 다음으로, 수지 평형 완충액으로 3회 세척하여 배양 리터당 1.2밀리리터의 안티 플래그 패킹 아로스 수지를 배양하고, 하나 이상의 50리터 원심분리기 튜브에서 친화성 수지와 함께 전체 세포 추출물을 나타내는 수피네이트를 배양하고, 섭씨 4도에서 1분 동안 3000배 G에서 3000배 G로 원심분리기를 배양한 후 3000회 원심분리기를 부드럽게 회전합니다. supinate를 버린 후, 수지를 15 밀리리터 원심 분리기 튜브에 옮기고 총 45 밀리리터의 사전 냉각 버퍼, 한 번의 원심 분리기로 세척 한 다음 고염 버퍼를 사용하여 supinate 반복 세척 및 원심 분리를 폐기 한 다음 저염 버퍼와 TEV 분할 버퍼를 사용합니다.

각 세척이 수지를 완전히 재현탁하기에 충분하지만 더 이상은 아닌지 확인하십시오. 다음으로, 10마이크로리터의 수지 샘플을 수집하고 결합된 단백질 샘플을 나타내기 위한 분석을 위해 단백질 로딩 버퍼의 2배인 한 부피로 희석합니다. 환원제는 수지에서 항체를 방출하므로 사용하지 마십시오.

그런 다음 원래 배양 1리터당 약 40마이크로그램의 TEV 프로테아제에서 10ml의 사전 냉각된 TEV 절단 버퍼에 수지를 재현탁하고 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합합니다. TEV 프로테아제의 수준은 발현 단백질의 양에 따라 최적화될 수 있습니다. 튜브 대기를 100% 질소 가스로 교체하여 단백질 산화를 방지하고 다음날 섭씨 4도에서 밤새 부드럽게 회전합니다.

3000 times G에서 10분 동안 샘플을 원심분리한 다음 supinate를 적절한 분자량 컷오프가 있는 초원심 필터로 옮기고 500마이크로리터까지 농축합니다. 농축된 단백질의 10마이크로리터 샘플을 수집하고 분석을 위해 단백질 로딩 버퍼의 2배인 1부피로 희석합니다. 이 샘플은 TEV 용리액 샘플을 나타냅니다.

그런 다음 10마이크로리터의 수지 샘플을 수집하고 단백질 로딩 버퍼의 2배 부피로 희석합니다. 이 샘플은 TEV 레진 이후 샘플을 나타냅니다. 다음 단계는 크기 배제 컬럼을 통해 단백질을 실행하는 것이며 관심 복합체의 크기에 따라 적절한 겔 여과 매트릭스를 사용해야 합니다.

이 경우, 당사는 10 x 300mm S 200 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 A를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 컬럼과 겔 여과 버퍼를 동일시했습니다. 0.22 미크론 필터를 통해 단백질을 여과하고 샘플을 컬럼에 로드합니다. 컬럼에서 나오는 분수를 계속 수집합니다.

마지막 단계로서, 수집된 시료에 대해 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영체 또는 SDS 페이지를 수행하고, 겔 여과 분획물, 히스톤 DS SLA 1 또는 HD 1 억제제의 결함 침묵 3 또는 SDS 3 및 syn 3, A HDAC 상호 작용 도메인 또는 syn 3, HID 형성 안정한 turny 복합체. turny complex의 친화력 정제는 SDS 페이지를 통해 관찰 할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 2리터의 세포를 transection하는 cot에 의해 생성된 정제된 복합체입니다.

결합된 단백질 레인은 친화성 수지에 결합된 복합체를 보여줍니다. TEV 소화 후, sin three A HID에 존재하는 태그가 절단되고 복합체가 암시됩니다. 여기에 표시된 수지는 10 x 300mm S 200 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제된 단백질 복합체의 크로마토그램입니다.

순수 복합체는 용액에서 이량체를 형성하기 때문에 공극 부피에 가깝게 회피합니다. 마지막으로, SDS 페이지 분석은 겔 여과 분획에서 정제된 단백질을 나타냅니다. 이 동영상을 시청한 후에는 HEC 2 및 3 app 세포를 성장, 현탁액 성장 및 코트란 하는 방법과 단백질을 친화, 정제 및 농축하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

복잡하고 건강한 세포는 실험의 성공에 필수적이므로 정기적으로 성장하고 조건과 통과 상태를 유지해야 합니다. 조직 배양으로 인해 미루지 마십시오. 구조 생물학자들은 포유류 세포에서 많은 양의 단백질과 단백질 복합체를 쉽게 발현하고 정제할 수 있습니다.