Name: 소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 학습하세요 HEK 293F 서스펜션 세포를 이용한 재조합 단백질 발현 및 정제 방법을. PEI 전염과 친화성 크로마토그래피를 통해 구조생물학 연구에 필요한 고품질 단백질 복합체를 생산할 수 있습니다.

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우리는이 작업과 레스터 핵심 생명 공학 서비스의 대학에 사용되는 식 구조를 준비 박사 Xiaowen 양 (PROTEX 복제 서비스) 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 BBSRC 학생이기 의해 지원되었다, 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 프로그램 및 수석 수사관 보조금 WT085408 &amp; WT100237 및 BBSRC는 RM31G0224을 부여합니다.

주 : 프로토콜은 따라서 시약의 볼륨과 수량이 비례 적으로 조정해야한다 식의 규모에 적합하다. 적합한 포유 동물 발현 벡터는이 프로토콜에 사용되어야한다. 여기서는 편리 클로닝 (도 1)에서 사용되는 제한 효소의 선택에 따라 친 화성 태그를 포함 또는 배제를 허용하여 pcDNA 3.1 변경됨 발현 벡터를 사용 하였다. 다음의 프로토콜은 대규모 트랜 스펙을 설명한다. 1 L 롤러 병에 1 대규모 문화 / 형질 성장 및 표준 프로토콜에 따라 HEK293F 서스펜션 적응 세포를 유지한다. 일반적으로 30에서 100 ㎖로 선발 문화 250 ML 원뿔 세포 배양 플라스크에서 재배된다. <ol><li> 각각 1 L 롤러 병에 300 ml의 최종 부피로 0.5 × 106 세포 / ml의 세포 종자. 주 : 롤러 병에서 최대 150 ㎖가 최소 수용현탁 배양의 300 ML. 큰 규모의 형질에 대해 여러 병을 사용합니다. </li><li> 세포를 1.0 × 106 세포 / ml의 농도에 도달 할 때까지 37 ° C에서 진탕 인큐베이터에서 24 시간, 120 rpm으로, 5 % CO 2 동안 배양 (세포는 대략 매 24 시간을 분할한다). </li><li> 필터 살균 DNA의 300 μg의 총을 피펫 3 초 동안 적극적으로 PBS 30 ㎖의 소용돌이에 (보충 방법 참조). 참고 : 만 형질 세포 당 DNA의 1 μg의 총을 사용합니다. 두 개 이상의 플라스미드 될 경우 세포에 DNA의 비율이 일정하게 유지되도록 각각의 양을 감소 공동 형질. </li><li> 1.2 ml의 0.5 ㎎의 추가 / 3 초 동안 적극적으로 PBS / DNA 용액 소용돌이에 PEI를 살균 필터링 ML. </li><li> 20 분 동안 실온에서 믹스를 품어. </li><li> DNA를 추가 / PEI는 세포에 혼합 - 1 × 106 세포 / ml (단계 1.3)의 밀도에 있어야한다. </li><li> 공동 - 형질 감염 후, 세포를 부화또한 37 ° C에서 48 시간, 120 rpm으로, 5 % CO 2의 진탕 배양기에서. </li><li> 5 분 동안 3,000 XG에서 세포를 원심 분리 및 -80 ° C에서 펠렛을 저장하여 수확 세포 내 단백질. 참고 : 또는 문화 위의 분위기가 5 % CO 2로 대체되고, 병 뚜껑을 밀봉하는 경우 (비-CO 2) 배양기를 흔들어 표준을 사용합니다. 분위기는 각 통로 (일반적으로 모든 이일)에서 교체해야합니다. </li></ol> 전 세포 추출물에서 2 단백질 복합 정제 이 프로토콜은 플래그 - 태그 된 단백질을 사용하여 핵 착물의 정제를 위해 최적화된다. <ol><li> 으로 세포 펠렛을 해동 ~ 미리 냉장 용해 완충액 40 ㎖ (100 mM 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH가 7.5, 5 % 글리세롤, 0.3 % 트리톤 X-100, 프로테아제 억제제) 문화의 L 당. </li><li> 다시 일시 중지로 pipetting에 의해 여러 번 아래로 펠렛을 (거품 방지 소용돌이를하지 않는합니다). </l난&gt; <li> 철저히 유리 균질기를 이용하여 세포를 다시 일시. 3주기 (15 초, 15 초 Off)에 대한 초음파 처리. 4 ℃에서 25 분 동안 30,000 XG에 원심 분리기와 뜨는을 유지합니다. </li><li> 평형 수지 평형 완충액 (100 mM 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH를 7.5)로 3 회 세척하여 배양 리터당 아가 로스 수지를 충전 방지 플래그 1.25 ML. </li><li> 하나 이상의 50 ㎖의 원심 분리기 튜브의 친 화성 수지와 단계 2.3에서 전체 세포 추출액을 품어 부드럽게 4 ° C에서 30 ~ 120 분 동안 샘플을 회전 할 수 있습니다. </li><li> 4 ° C, 폐기 상층 액에서 1 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 미리 차게 한 완충액 45 ㎖로 씻어 수지 (100 mM 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH가 7.5, 5 % 글리세롤, 0.3 % 트리톤 X-100). 1 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기 및 상층 액을 제거한다. </li><li> 반복 단계 2.7 높은 염 완충액을 이용하여 낮은 염 완충액 (50 mM의 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH를 7로 (300 mM의 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH가 7.5, 5 % 글리세롤), 이어0.5, 5 % 글리세롤)과 TEV 쪼개짐 완충액 (50 mM의 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH를 7.5, 0.5 mM의 TCEP). 참고 : 각 세척을 확인 완전히 더 이상 수지를 다시 일시 중단하기에 충분한 간단한 즉,이다. </li><li> 수지의 10 ㎕의 샘플을 수집 및 분석을위한 배 단백질 로딩 버퍼 (바인딩 단백질 제어)의 1 부피로 희석한다. 수지에서 항체를 해제 피하기 위해 환원제를 사용하지 마십시오. </li><li> 15 ㎖의 원심 분리 관에 미리 냉장 TEV 절단 버퍼와 전송의 8-10 ML에 수지를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 추가 ~ 40 원래 문화의 L 당 (1 ㎎ / ㎖에서 재고) TEV 단백질 분해 효소 ㎍의 아래로 여러 번을 피펫 팅에 의해 잘 섞는다. </li><li> 단백질 산화를 방지하기 위해 100 % N 2 가스 튜브 분위기를 교체합니다. </li><li> 조심스럽게 4 ℃에서 O / N 회전합니다. </li><li> 10 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기. 적절한 분자량 컷 - 오프와 초 원심 필터에 뜨는을 전송하고 집중500 μL에 이르기까지. </li><li> 농축 된 단백질의 10 ㎕의 샘플을 수집 및 분석을위한 배 단백질 로딩 버퍼의 1 부피로 희석한다. (TEV 제어를 용출액). </li><li> 수지의 10 ㎕의 샘플을 수집 및 분석을위한 배 단백질 로딩 버퍼의 1 부피로 희석한다. 수지에서 많은 양의 항체를 방출 방지하기 위해 환원제를 사용하지 마십시오. (후 TEV 수지 제어). </li><li> 겔 여과 완충액 (50 mM의 아세트산 칼륨, 50 mM 트리스 pH를 7.5, 0.5 mM의 TCEP)와 크기 배제 크로마토 그래피 컬럼을 평형화. </li><li> 0.22 μm의 필터를 통해 단백질을 필터링 </li><li> 열에 샘플을로드하고 분수를 수집합니다. </li><li> 단계 2.9, 2.15 및 2.16와 분석을 위해 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색 공정에 2.19에서 겔 여과의 분획에서 실행 샘플. 참고 : 목적 단백질의 발현을 확인하는 단계 2.9, 2.15 및 2.16 이전 겔 여과에서 샘플의 SDS-PAGE를 실행하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

우리는 표현 및 재조합 단백질 및 포유 동물 세포에서 다중 서브 유닛 단지 많은 양의 정제 (PEI는 시중에서 판매하는 친 유성 형질 전환 시약보다 훨씬 적은 비용) 간단하고 비용 효율적인 방법을 개발했습니다. 프로토콜 절에서 설명한 바와 같이 고순도의 플라스미드 DNA (280 분의 260 1.8 내지 2.0) PEI와 조합하여 사용하는 경우 최적의 형질 전환 및 발현 효율에 도달 할 수있다. 세포 serum-과 항생제가없는 배지에서 배양해야하므로, 멸균 기술은 엄격히 비용과 시간이 소요되는 감염을 방지하기 위해 계대 및 형질 세포 요구된다. 세포 생존율이 90 % 이상이어야하며 문화가 2.5 × 10 6 세포보다 더 큰 밀도로 성장하지 말아야 / 즉시 형질 전환하기 전에, 이렇게 같이 단백질 생산량을 줄일 ML. 성공적인 형질의 경우, 문화는 단일 또는 분할 세포를 포함해야합니다. 클러스터는 활기에 의해 나누어 질 수있다30 초 (그림 5) OU를 소용돌이로 교반 (20). 공동 - 형질 전환에 사용 된 각 플라스미드의 비율은 연구 복잡한 존재의 화학량 론에 따라 사용자에 의해 변경 될 수있다. 적합한 발현 시간이 설정 될 수 있도록 발현 효율, 관심 단백질에 대해 최적화 될 수있다. 정제는 불필요한 단백질 가수 분해의 위험을 감소시키기 위해 시점의 단백질 샘플 차가운 유지 수행되어야한다. 그들은 종종 감소 된 용해도 및 / 또는 효소 활성의 손실의 결과, 구조적 요소 또는 특정 단백질의 활성 부위를 방해 할 수 있기 때문에, 태그와 정화 버퍼의 선택은 중요하다. 소규모 형질 큰 단백질 복합체의 정제를위한 다른 구조를 테스트하기 위해 특히 유용하다. 오늘, 대체 방법의 큰 다양성 재조합 진핵 생물의 단백질 (표 2)의 표현을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Baculovi곤충 세포에서 발현 RUS 널리 높은 전달 효율과 기타 바이러스 종 6과 비교하여 세포 독성의 결여로 인해 사용된다. 그러나 바이러스의 제조 공정은 시간 소모적이며 불안정성 바이러스 오랜 기간 동안 저장 될 수 없습니다. 한편, 효모 발현 시스템은 높은 단백질 수율 7의 결과, 발효기 배양에서 세포에 매우 높은 밀도의 증가 가능성을 제공한다. 그러나 그들은 여전히​​ 제대로 접과 단백질 파트너와 상호 작용하는 진핵 생물의 단백질에 필요한 번역 후 변형의 전체 다양성이 부족하다. HDAC3은, 예를 들면, 발현 되나 E.를 접을하지 대장균. 293F 세포에서 발현 때, 우리는 공동 억제 (SMRT)와 원핵 세포에서 발견되지 이노시톨 tetraphosphate (IP4) 8의 분자 복잡한에서 활성 효소를 정제 할 수 있었다. 이 방법은 성을 정화하고 결정을 해결하기 위해 우리를 허용했다HDAC1 유사 IP4 구에 의해 활성화되는 NuRD 단지에서 MTA1와 상호 작용 ructure. 이상적으로, 우리는 항상 자연, 생리적 환경에서 진핵 생물의 단백질을 표현하고 싶습니다. 생물 반응기에서 10-12 HEK-293 세포를 EBNA1 이용한 포유 동물 발현 시스템을 설명하고 단백질의 매우 높은 수준을 수득하지만, 이러한 사용이 복잡 할 수있다. 우리의 방법은 박테리아, 효모 및 생물 반응기 시스템의 표현에 대한 간단하고 접근 대안입니다. 발현 방법은 빠르고 롤러 병 또는 플라스크 분위기 5 % CO 2 인큐베이터 진탕 및 표준을 사용하는 대체되는 경우에 특히 고가의 장비의 사용을 요구하지 않는다. 우리는 여러 플라스미드 - 형질을 공동 문화&gt; 1 ㎎ / ℓ의 수율 최대 5 단백질과 복합체를 정화하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 흥미롭게도, 시스템이 안정적으로 잘 작동 단지의 식별을하는 데 도움이됩니다. 예, 예를 들어HDAC1과 Sin3A의 이진 단지의 Pression의 단백질의 제한 수율을 준, 아직 SDS3의 추가는 더 높은 금액을 5 배, 따라서 적절한 구조와 결정화 안정적인 단지 선택에 구조 생물학을 안내 결과.

분자 세포 생물학의 급속한 발전과 의학에서 개선 된 의약품에 대한 지속적인 필요가 구조 생물 학자들이 점점 더 복잡한 단백질 구조를 보면 할 필요를 만들었습니다. 이들은 종종 자신의 정교한 폴딩 및 효소 활동을 지원하기 위해 특정 번역 후 변형, 분자 보호자와 공동 요인을 요구할 수 있습니다. 박테리아 발현 시스템을 사용하여 수득 된 단백질 데이터 뱅크에 존재하는 구조의 대부분 동안, 원핵 이러한 변형의 다수를 수행 할 수없는 많은 진핵 필수적인 공동 요인이 부족하다. 이 작은 신호 전달 물질에 의해뿐만 아니라 핵, 세포 표면과 정교한 접는 기계를 필요로 분비 단백질 활성화 대형 멀티 - 서브 유닛 단지의 연구에 문제가 될 수 있습니다. E.의 숫자 대장균 균주는 이러한 한계 일의 일부를 극복하기 위해 설계되었다. m의 최근에는, 그러나, 사용그들이 안정적으로 다른 시스템 2에 표현 그렇지 않으면 문제가된다 진핵 세포 단백질을 생산하기 때문에 ammalian 발현 시스템이 증가하고있다. 오늘은 화학 매개 형질 전환에 바이러스 성 전달에 이르기까지 다양 다양한 기술을 통해 안정적이고 과도 포유 동물 발현 세포주를 얻을 수있다, 이러한 일렉트로 및 직접 분사 3과 같은 물리적 유전자 전달. 이들 방법 모두가 장점과 단점을 자신의 세트를 가지고 있지만, 그 중 일부는 어느 너무 비싸고 및 / 또는 시간 소모적 인 구조적 연구에 적합하다. 여기에서 우리는 서스펜션 성장 포유 동물 세포에서 구조 생물학에 대한 단백질 복합체를 표현하기위한 매우 간단하고, 빠르고, 저렴하면서도 효율적인 방법을 설명합니다. 접근 방법 (예를 들어, 자유형 HEK 293F 세포) 인간 배아 신장 (HEK) 세포주의 과도 공동 형질을 사용합니다. 이러한 세포는 HEK 293 CE로부터 유도 된LL 라인은, 혈청이없는 배지를 사용하여 고밀도 (예 : 자유형 293 식 매체로서)에 도달, 현탁 배양 물에서 성장하도록 적응된다. 세포는 일시적으로 폴리에틸렌 이민의 분지 버전 (PEI), 엔도 시토 시스 (5)에 의해 숙주 세포를 입력 DNA / PEI 복합체를 형성함으로써 포유 동물 세포 (4)의 넓은 범위에서 작동하는 것으로보고되었다 저렴 중합체 시약을 사용하여 형질 전환된다. 이 방법은 소규모 (30 ml) 및 (300 mL로) 큰 규모의 실험 모두에 적합하며 정제 단백질 복합체의 높은 수준을 생성 할 수있다. 그것은 복잡한 접는 기계, 공동 요인 또는 박테리아, 효모 및 곤충 세포에 의해 수행 할 수없는 특정 번역 후 변형을 필요로하는 단백질을 연구에 특히 유용합니다. 이 프로토콜에서 우리는 Sin3A 전사 억제 복합체의 세 가지 단백질 중앙 지지체의 발현 및 정제를 제시한다. 이 히스톤 구성아세틸 라제 일 (HDAC1), 결함이 음소거 세 (SDS3)의 보호 회로 및 스위치 독립적 인 세 (Sin3A). 정제 된 단지는 높은 처리량 결정화 실험에 사용됩니다.

<table><tbody><tr><td>프리스타일 HEK 293F 셀&nbsp;</td><td>LifeTechnologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>LifeTechnologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>SIGMA</td><td>A220</td><td></td></tr><tr><td>250ml 삼각 플라스크(통풍 캡 포함</td>) <td>Corning</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>롤러 병(통풍 캡 포함</td>) <td>Corning</td><td>01836-02</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민, 25kDa, 분기</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>H2O에 0.5mg/ml 주식을 만들고 묽은 HCl로 pH를 7.0으로 조정하고 -20 - 4&ordm에서 보관합니다. C</td></tr><tr><td>포유류 발현 벡터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &마이크로; m 원심 필터 유닛</td><td>Amicon</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 초원심 필터 (10 kDa 컷오프)</td><td>Amicon</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex&nbsp; 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr></tbody></table>

소설 및 액세스 접근 : 구조 hek 293f 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

다량의 재조합 단백질 복합체의 발현 및 정제는 구조 생물학 연구의 필수 요구 사항입니다. 20년이 넘게 동안 E. coli와 같은 원핵 발현 시스템은 비용이 많이 들고 효율성이 떨어지는 진핵 세포주에 대한 과학 문헌을 지배해 왔습니다. 박테리아에서 재조합 단백질을 발현하는 수율 및 비용 측면에서 분명한 이점에도 불구하고 특정 보조 인자, 샤페론 및 번역 후 변형이 없으면 기능 상실, 잘못된 접힘이 발생할 수 있으며 특정 진핵 생물 다중 소단위 복합체, 표면 수용체 및 분비 단백질의 단백질-단백질 상호 작용을 방해할 수 있습니다. 포유류 세포 발현 시스템을 사용하면 진핵생물 발현 환경을 제공하기 때문에 이러한 단점을 해결할 수 있습니다. 그러나 이러한 방법의 낮은 단백질 수율과 높은 비용으로 인해 최근까지 구조 생물학에 대한 사용이 제한되어 왔습니다. 여기에서는 현탁액 성장 HEK(Human Embryonic Kidney) 293F 세포의 일시적인 transfection을 수행하여 밀리그램 양의 단백질을 발현하고 정제하는 간단하고 접근 가능한 방법을 설명합니다.

여기에서 우리는 HDAC1, SDS3, Sin3A 삼원 복합체의이 L (8 × 250 ㎖의 문화) 과도 공동 형질 전환 및 정제를 보여줍니다. HDAC1과 SDS3는 Sin3A의 HDAC 상호 작용 도메인 (HID)를 통해 Sin3A와 상호 작용합니다. 문화의 리터 당 단지의 1 mg의 최대 일반적인 정제 수율. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500"> 도 변경됨하여 pcDNA 3.1 발현 벡터의 개략도. 플라스미드 Sin3A의 아미노 말단에 친 화성 태그와 TEV 절단 부위를 포함하도록 ECORV 및 효소 EcoRI로 분해 하였다. HDAC1과 SDS3의 태그가 지정되지 않은 버전을 복제하려면 벡터를 KpnI과를 EcoRI로 소화했다. <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500"> 그림 2 SDS-PAGE 정화의 첫 번째 단계를 표시합니다. "결합 단백질"차선의 친 화성 수지에 결합 된 복합체를 보여줍니다. TEV 소화 후, Sin3A-HID에 태그 본 오프 절단하고 겔의 두 번째 및 세 번째 레인에 도시 한 바와 같이 복합체 수지로부터 용출된다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500"> 그림 단백질 - 복합 정제하여 크기 배제 크로마토 그래피의 3 크로마토 그램.이 용액에 이합체를 형성하기 때문에 순수한 복잡한 공극 부피에서 용출합니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500"> 도 3에 도시 된 겔 여과의 분획을 보여주는도 4 SDS-PAGE. 6 세포 / ㎖ 준비 2.3x10에서 그림 5 트리 판 블루 염색 HEK 293F 세포를 형질 전환합니다. 큰 클러스터가 약 25 초 동안 격렬한 소용돌이로 교반에 의해 나누어 질 수있는 반면 세포는, 단일 또는 분할 세포와 같은 존재해야한다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 문제 </td><td> 가능한 원인 </td><td> 액션 </td></tr><tr><td rowspan="4"> 낮은 단백질 수율. </td><td> 세포의 낮은 수는 형질. </td><td> 확인 세포 밀도가 1.0 × 10 6의 문화에 형질 전환 반응 혼합물을 추가하기 전에 약합니다. </td></tr><tr><td> 세포는 여러 번 계대 배양되었을 수 있습니다. </td><td> 약 90 패스를 신선한 스톡 세포를 사용하여나이. </td></tr><tr><td> DNA는 성능 저하 또는 불순물의 많은 양이 될 수있다. </td><td> 확인 플라스미드 DNA를 사용하고 있는지 확인하십시오 1.8과 2.0 사이의 280 분의 260 비율을 가지고있다. 아가로 오스 겔에서 DNA를 실행하면 그 품질을 평가하는 것이 좋습니다. </td></tr><tr><td> 단백질 (들)로 표현되는 안정 또는 충분히 용해되지 않습니다. </td><td> 이전에 형질 스케일링 업에 작은 규모의 다른 구조를 테스트합니다. 반드시 태그 관심 단백질 (들)의 구조를 방해하지 않도록해야. </td></tr><tr><td> 세포는 흐린 모양과 특이한 색상 및 / 또는 냄새가. </td><td> 세포는 세균이나 효모에 감염된다. </td><td> 좋은 멸균 기술은 항상 사용할 수 있어야합니다. 층류 후드를 소독하고 감염의 경우에는 세포 배양 공간은 UV-소독하는 문제를 포함 할 수 있습니다. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 세포는 낮은 가능성을 가지고있다. </td><td> 미디어의 잘못된 산도. </td><td> 확실히 문화 CO 2 5-8%에서 재배되어 있는지 확인항상. </td></tr><tr><td> 세포 3.0x10 6 세포 / ㎖ 이상 농도를 배양하고있다. </td><td> 세포는 2.5 × 10 6 세포 / ㎖ 즉시 형질 전환 이전과 결코 6 10 X 3.0 이상 세포 / ml 이상 밀도로 성장 할 수 없습니다. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 선호도 정화 작동하지 않았다 </td><td> 단백질 (들) 표시되지 않습니다. </td><td> 위의 내용을 참조하십시오. </td></tr><tr><td> 정제 조건은 잘못 될 수 있습니다. </td><td> (예를 들어, 높은 소금, 낮은 소금, 산도를.) 버퍼 상태를 조정 </td></tr></tbody></table> 표 1 문제 해결. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 시스템 </td><td> 장점 </td><td> 단점 </td></tr><tr><td> E. 콜라이 </td><td><ul><li> 빠른발현 시스템 </li><li> 고 단백질 수율 </li><li> 저렴 </li><li> 동위 원소로 표지 된 단백질의 경제적 인 제조에 적합한 </li></ul></td><td><ul><li> 단백질 접힘이 필요할 수 있습니다 중요한 보호자의 부족 </li><li> 많은 포스트 번역 상 수정의 부족 </li><li> 단백질 기능 및 / 또는 복잡한 어셈블리에 중요한 공동 인자를 결여있다. </li></ul></td></tr><tr><td> P. 파스 </td><td><ul><li> 포스트 병진 변형의 대부분을 수행 할 </li><li> 저렴 </li></ul></td><td><ul><li> 일부 번역 후 변형을받지 못한 </li><li> 단백질 기능 및 / 또는 복잡한 어셈블리에 중요한 공동 인자를 결여있다. </li></ul></td></tr><tr><td> 곤충 세포에서 배큘로 바이러스 발현 </td><td><ul><li> 모든 게시물 번역 수정을 수행 할 수 있습니다 &lt;/ 리&gt; </li><li> 배큘로 바이러스는 다른 바이러스 균주보다 세포 독성 </li></ul></td><td><ul><li> 전달에 대한 바이러스를 준비하는 데 많은 시간이 소요될 수 있습니다 </li><li> 바이러스는 안정되지 않고, 장기간 저장할 수없는 </li><li> 곤충 세포는 단백질 기능 및 / 또는 복잡한 어셈블리에 중요한 공동 인자를 결여있다. </li></ul></td></tr><tr><td> 포유류 시스템과 생물 반응 장치 </td><td><ul><li> 모든 게시물 번역 수정을 수행 할 수 있습니다 </li><li> 단백질 기능 및 복잡한 조립에 필요한 모든 공동 요인을 제공 할 수 </li><li> 매우 높은 밀도의 수는 세포를 배양 </li><li> 복잡한 접는 기계를 필요로하는 모든 포유 동물의 단백질을 표현할 수 </li><li> 매우 높은 단백질 수율 </li></ul></td><td><ul><li> 생물 반응기를 사용하는 전문 직원이 필요합니다. </li><li> 고가의 장비가 필요합니다. </li><li> 최적화 표현 조건의 시간이 소요될 수 있습니다. </li></ul></td></tr><tr><td> HEK 293F 서스펜션 세포 </td><td><ul><li> 모든 게시물 번역 수정을 수행 할 수 있습니다 </li><li> 단백질 기능 및 복잡한 조립에 필요한 모든 공동 요인을 제공 할 수 </li><li> 복잡한 접이식 기계를 필요로하는 모든 포유 동물의 단백질을 표현할 수 </li><li> 빠르고 직관적 인 형질 전환 프로토콜 </li><li> 생물 반응기 및 / 또는 다른 상업적으로 이용 가능한 형질 감염 시약에 비하여 상대적으로 저렴. </li></ul></td><td><ul><li> 세균의 발현으로 비록 저렴한 가격으로 저렴하지 </li></ul></td></tr></tbody></table> 표 2에 장점 및 주요 발현 시스템의 단점.

포유류 시스템에 의한 재조합 단백질의 발현은 구조 생물학을 위한 단백질 복합체를 생산하는 매력적인 방법이 되고 있습니다. 여기에서 우리는 구조 연구를 위해 단백질 복합체를 정제하기 위해 현탁액 성장 포유류 세포를 사용하는 간단하면서도 매우 효율적인 발현 시스템을 제시합니다.

소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

다음 비디오의 전반적인 목적은 포유류 발현 시스템을 사용하여 단백질 또는 단백질 복합체의 우수한 수율을 생산하는 간단하고 저렴한 기술을 보여주는 것입니다. 이는 5%의 이산화탄소로 유지되는 대기를 가진 가습된 진탕 인큐베이터에서 현탁액 HEC 2 93 F 세포를 배양함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 세포는 하나 이상의 고복사수 발현 플라스미드로 일시적으로 transfection됩니다.형질주입제인 폴리에틸렌 EIN 또는 PEI를 사용하여, 세포를 수확하기 전에 48시간 동안 성장시키도록 하였다. 다음으로 친화성 수지를 사용하여 단백질 정제를 수행한 다음 겔 여과를 수행하여 구조 및 기능 연구를 수행하기 위해 관심 단백질 복합체를 정제합니다. 궁극적으로, 이 저렴하고 간단한 포유류 발현 시스템은 박테리아 세포에서 발현하기 어려운 단백질과 단백질 복합체의 발현과 정제를 가능하게 합니다.이 접근법의 주요 장점은 단백질 복합체의 발현을 위한 편의성과 다양성입니다. 박테리아에서 단백질을 만드는 것만큼 쉬운데, 특히 단백질 발현 벡터를 혼합하고 일치시킬 수 있기 때문에 더욱 그렇습니다. 이 방법은 처음에는 단백질 압축의 발현을 테스트하기 위해 소규모로 사용할 수 있지만 단백질 압축의 우수한 수율을 생성하도록 쉽게 확장할 수 있습니다.구조 및 기능 연구의 경우 성공의 열쇠는 박테리아나 효모 감염이 없는 건강한 상태로 세포를 유지하는 것입니다.미디어에 나와 있는 항생제는 단백질 수율을 크게 감소시킵니다. 먼저 액체 질소에서 밀리리터당 2,000만 개의 세포 밀도로 1밀리리터의 HEC 2 9 3 F 세포가 들어 있는 극저온 바이알을 제거하고 섭씨 37도의 수조에서 빠르게 해동합니다. 위아래로 몇 차례 피펫팅하여 덩어리를 분해하고 전체 내용물을 34ml의 Prewarm 배지가 들어 있는 250ml 원뿔형 세포 배양 플라스크에 피펫팅합니다.48시간 후 섭씨 37도, 120RPM 및 5% 이산화탄소의 가습된 궤도 진탕 인큐베이터에 배양물을 넣습니다. trian blue로 세포 생존력을 확인합니다. 이 단계에서 정상적인 세포 생존율을 염색하는 것은 약 70%이며, 세포가 밀리리터당 약 100만 개의 세포 수에 도달했을 때 발생합니다.60밀리리터의 예열 배지가 들어 있는 250밀리리터 원뿔형 세포 배양 플라스크에 밀리리터당 35만 개의 세포가 최종적으로 계산될 때까지 마사지하고, 48시간마다 또는 밀리리터당 약 200만 개의 세포에 도달할 때 세포를 계속 마사지합니다. 여기에 표시된 것은 transfection을 위해 seeded 준비가 된 stock에서 밀리리터당 230만 개의 세포를 가진 Trian blue stain HEC 2 9 3 F 세포 샘플입니다. 세포는 단일 세포 또는 분열 세포로만 존재해야 합니다. 세포가 과도하게 자라면 큰 덩어리를 형성하고 이 그림과 같이 생존력이 매우 낮습니다.세포가 군집을 형성하고 있는 경우, 25초 동안 격렬한 소용돌이에 의해 세포가 분해될 수 있습니다. 우선, 대규모 배양은 1리터당 50만 개의 세포를 파딩하여 각 1리터 롤러 병에 300밀리리터의 최종 부피를 만듭니다. 세포가 밀리리터당 100만 개의 세포 밀도에 도달할 때까지 섭씨 37도, 135RPM 및 5% 이산화탄소의 가습된 오비탈 쉐이커에서 24시간 동안 배양합니다.다음으로, 총 300마이크로그램의 필터를 피펫으로 DNA를 멸균한 DNA를 30밀리리터의 인산염 완충 식염수 또는 PBS에 넣고 3초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다. 그런 다음 밀리리터당 0.5밀리그램 1.2밀리리터를 추가합니다. 멸균된 PEI를 PB SDNA 용액에 여과하고 추가로 3초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다.혼합물을 실온에서 20분 동안 배양한 후 유아용 침대 다음 세포에 혼합물을 첨가하십시오. Transfection은 48시간 후 섭씨 37도, 135RPM 및 5% 이산화탄소에서 48시간 동안 가습된 안와 진탕 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 3000배 G로 5분 동안 세포를 원심분리하여 세포 내 단백질을 수확합니다.셀 펠릿을 즉시 사용할 수 없는 경우 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜은 단백질 중 하나에 flag tag가 있는 핵에서 단백질 복합체를 정제하는 데 최적화되어 있습니다. 정제 resus를 시작하려면 세포 팔레트를 약 40 ml의 사전 냉각 용해, 배양 리터당 완충액, 위아래로 여러 번 피펫팅의 조합을 사용하여 현탁하고 유리 균질기를 15 초 동안 15 초 동안 3 회 초음파 처리합니다.그런 다음 섭씨 4도에서 25분 동안 108, 000회 G를 원심분리하고 앙와위 나트륨을 유지합니다. 다음으로, 수지 평형 완충액으로 3회 세척하여 배양 리터당 1.2밀리리터의 안티 플래그 패킹 아로스 수지를 배양하고, 하나 이상의 50리터 원심분리기 튜브에서 친화성 수지와 함께 전체 세포 추출물을 나타내는 수피네이트를 배양하고, 섭씨 4도에서 1분 동안 3000배 G에서 3000배 G로 원심분리기를 배양한 후 3000회 원심분리기를 부드럽게 회전합니다. supinate를 버린 후, 수지를 15 밀리리터 원심 분리기 튜브에 옮기고 총 45 밀리리터의 사전 냉각 버퍼, 한 번의 원심 분리기로 세척 한 다음 고염 버퍼를 사용하여 supinate 반복 세척 및 원심 분리를 폐기 한 다음 저염 버퍼와 TEV 분할 버퍼를 사용합니다.각 세척이 수지를 완전히 재현탁하기에 충분하지만 더 이상은 아닌지 확인하십시오. 다음으로, 10마이크로리터의 수지 샘플을 수집하고 결합된 단백질 샘플을 나타내기 위한 분석을 위해 단백질 로딩 버퍼의 2배인 한 부피로 희석합니다. 환원제는 수지에서 항체를 방출하므로 사용하지 마십시오.그런 다음 원래 배양 1리터당 약 40마이크로그램의 TEV 프로테아제에서 10ml의 사전 냉각된 TEV 절단 버퍼에 수지를 재현탁하고 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합합니다. TEV 프로테아제의 수준은 발현 단백질의 양에 따라 최적화될 수 있습니다. 튜브 대기를 100% 질소 가스로 교체하여 단백질 산화를 방지하고 다음날 섭씨 4도에서 밤새 부드럽게 회전합니다.3000 times G에서 10분 동안 샘플을 원심분리한 다음 supinate를 적절한 분자량 컷오프가 있는 초원심 필터로 옮기고 500마이크로리터까지 농축합니다. 농축된 단백질의 10마이크로리터 샘플을 수집하고 분석을 위해 단백질 로딩 버퍼의 2배인 1부피로 희석합니다. 이 샘플은 TEV 용리액 샘플을 나타냅니다.그런 다음 10마이크로리터의 수지 샘플을 수집하고 단백질 로딩 버퍼의 2배 부피로 희석합니다. 이 샘플은 TEV 레진 이후 샘플을 나타냅니다. 다음 단계는 크기 배제 컬럼을 통해 단백질을 실행하는 것이며 관심 복합체의 크기에 따라 적절한 겔 여과 매트릭스를 사용해야 합니다.이 경우, 당사는 10 x 300mm S 200 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 A를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 컬럼과 겔 여과 버퍼를 동일시했습니다. 0.22 미크론 필터를 통해 단백질을 여과하고 샘플을 컬럼에 로드합니다. 컬럼에서 나오는 분수를 계속 수집합니다.마지막 단계로서, 수집된 시료에 대해 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영체 또는 SDS 페이지를 수행하고, 겔 여과 분획물, 히스톤 DS SLA 1 또는 HD 1 억제제의 결함 침묵 3 또는 SDS 3 및 syn 3, A HDAC 상호 작용 도메인 또는 syn 3, HID 형성 안정한 turny 복합체. turny complex의 친화력 정제는 SDS 페이지를 통해 관찰 할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 2리터의 세포를 transection하는 cot에 의해 생성된 정제된 복합체입니다.결합된 단백질 레인은 친화성 수지에 결합된 복합체를 보여줍니다. TEV 소화 후, sin three A HID에 존재하는 태그가 절단되고 복합체가 암시됩니다. 여기에 표시된 수지는 10 x 300mm S 200 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제된 단백질 복합체의 크로마토그램입니다.순수 복합체는 용액에서 이량체를 형성하기 때문에 공극 부피에 가깝게 회피합니다. 마지막으로, SDS 페이지 분석은 겔 여과 분획에서 정제된 단백질을 나타냅니다. 이 동영상을 시청한 후에는 HEC 2 및 3 app 세포를 성장, 현탁액 성장 및 코트란 하는 방법과 단백질을 친화, 정제 및 농축하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.복잡하고 건강한 세포는 실험의 성공에 필수적이므로 정기적으로 성장하고 조건과 통과 상태를 유지해야 합니다. 조직 배양으로 인해 미루지 마십시오. 구조 생물학자들은 포유류 세포에서 많은 양의 단백질과 단백질 복합체를 쉽게 발현하고 정제할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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