Name: 체외 Globoid 셀 Leukodystrophy에서 휴대 병태 생리의 연구에 대한 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 배우세요 크라베병에서 미세아교세포가 globoid 세포로 변형되는 과정을 세포 배양 모델로 연구하는 방법을. 사이클린 처리와 면역형광 현미경을 통해 세포 핵형성과 식세포 능력을 평가합니다.

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이 연구는 미국 국립다발경화증학회(National Multiple Sclerosis Society, RG 5001-A-3 to S.J.C.), 미국 국립보건원(National Institutes of Health, NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), UConn Health Center(SJC) 및 Kim Family Fund(K.I.C. 지원을 위한 UCHC)의 창업 자금.

동물을 포함한 모든 절차는 동물 애호 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 정책에 따라 수행 된 실험 동물 복지 사무소 (NIH)에 의해 만 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인과 규정 코네티컷 보건 센터. 혼합 폐해 문화의 1 준비 <ol><li> 사용하기 전에 모든기구를 소독. 차가운 유지하기 위해 얼음에 유지 세 멸균 60mm 배양 접시에 (MG 2 + 또는 칼슘을 2 +)에는 양이온을 포함하지 않는 얼음처럼 차가운 무균 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 3 ㎖를 추가합니다. </li><li> 이전 17, 18 설명한 바와 같이, 산후 P0-P2 마우스 새끼의 피질을 분리합니다. 참고 : 같은 해마와 같은 피질 하 구조는, 이러한 문화에 포함되지 않습니다. </li><li> NE를 사용하여 조심스럽게 수막을 제거하고 신선한 HBSS에 고립 피질을 전송하고 효소 조직을 떼어 놓다제조 업체의 프로토콜에 따라 우랄 조직 해부 키트. </li><li> 플레이트 멸균 T-175 플라스크에 세포와 미디어에 밤새 품어 [둘 베코 변형 이글 배지 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신이 포함 된 10 % 소 태아 혈청 (DMEM) (FBS)]. </li><li> 신선한 미디어 다음 일 모든 미디어를 교체합니다. 약 3 주 동안 또는 세포 단층이 설정 될 때까지, 일반 미디어 변화, 문화를 배양하기 위해 계속합니다. 주 : 1 비율 19 :이 단층은 약 10 성상 세포 및 미세 아교 세포로 구성됩니다. </li></ol> 혼합 폐해 문화에서 2 Globoid 세포 유도 <ol><li> ECM 코팅 된 커버를 준비합니다. <ol><li> 30 분 동안 멸균 페트리 접시에 멸균 한 N 염산 (HCL) 원형 커버 슬립 (95 %)을 적 십니다. 멸균 수의 3 배에 커버 슬립을 세척 한 후 적어도 20 분 동안 95 %의 EtOH에 흡수. 다음 자연 건조를 할 수 있습니다. </li><li> 희석 세포 MATR 장소 방울파라 필름의 시트 상 IX (ECM) 단백질 도료 (ML 멸균 인산 완충 용액에 용해 라미닌 10 μg / 예 : 150-250 μL / 액적 [PBS]). 이 물방울에 배치 할 때 커버 슬립 터치 없기 때문 방울을 배포합니다. 조심스럽게 집게를 사용하여 물방울에 건조 된 각 coverslip에 배치합니다. </li><li> 약에 대한 방울에 커버 슬립을 둡니다. 새시와 문화 후드 내부에 4 ~ 6 시​​간 마감했다. </li><li> 24 - 웰 플레이트의 각 웰에 ECM - 코팅 된 커버 (ECM 코팅 사이드)를 놓는다. 멸균 PBS 배와 잘 각을 세척하고 필요할 때까지 4 ° C에 보관하십시오. </li></ol></li><li> Coverslips는에 도금에 대한 폐해 세포를 준비합니다. <ol><li> 아교 문화에서 매체를 대기음 부드럽게 멸균 PBS의 10 ml의 폐해 단층 배를 씻는다. 다음으로, T-175에 8 ~ 10 ㎖의 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가하고, 37 ° C에서 5 ~ 10 분 동안 배양한다. </li><li> 단일 층의 대부분이 분리 된 경우, 완전한 미디어 (20)를 가하여플라스크에 트립신을 중지합니다. 50ml의 원뿔형 튜브에 분리 된 세포를 포함하는 매체를 수집하고, 실온에서 300 XG에서 10 분 동안 스핀. </li><li> 부드럽게 P1000 피펫을 사용하여 용액을 피펫 팅하여 신선한 완전한 미디어 2 ㎖에 세포를 다시 일시 중지 한 후 펠렛을 방해하지 않고 상등액을 흡인하고. </li><li> 원하는 밀도 (예를 들면 105 세포 / ㎖)에 완전 배지에서 세포를 일시 중지 한 후 다시 혈구를 사용하여 세포의 수를 결정하고. ECM - 코팅 된 커버 (24 웰 플레이트의 각 웰에 500 ㎕의 예) 위에 세포 플레이트. 37 ° C에서 배양의 각 웰 3-5 일 추가 신선한 전체 미디어를 추가하거나 세포가 원하는 시각적 합류로 성장할 때까지. </li></ol></li><li> Psychosine로 처리. <ol><li> 주식 농도 디메틸 설폭 사이드에서 (108.3 밀리미터) (DMSO)에 psychosine를 복원합니다. 작업 주식을 만들기 위해 100 %의 EtOH이 주식을 희석하는 수n은 10 μM의 최종 농도를 달성하기 위하여 24 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. </li><li> psychosine를 추가하는 때, 부드럽게 문화 미디어에 psychosine을 혼합 배양 플레이트 소용돌이 친다. 일주에 10 μM 다른 모든 일의 상당을 추가하여 psychosine 보충. </li></ol></li><li> psychosine 치료 7 일 후, 미디어와 각 웰에 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 피펫 500 μl를 수집합니다. 20 분 세포를 해결하기 위해 상온에서 품어. 그런 다음, PBS로 각 웰 배를 씻어 (아래 참조) 면역 세포 화학 처리 될 때까지 4 ° C에서 접시를 유지합니다. 주 : 필요한 경우 세포 배양액이 시점에서 효소 또는 ELISA 분석을 위해 수집 될 수있다. </li></ol> 3 면역 세포 화학 (ICC)는 Globoid 세포를 시각화 <ol><li> 버퍼 [PBS + 0.3 % 트윈 20 + 5 % 정상 염소 혈청 (NGS)] 차단에 PBS를 교체하고 실온에서 1 시간 동안 세포를 배양한다. </li><li> 에서년 Iba-1에 대해 차 항혈청에 고정 된 세포를 cubate [(1 : 1000) PBS에 희석 + 0.3 % + 2 % NGS-20 트윈] 실온에서 적어도 1 시간 동안, 그 다음 PBS 3X 5 분 간격으로 각을 잘 씻어 / 씻는다. </li><li> 핵을 식별 할 수 : 4 &#39;, 6 - diamidino-2 - 페닐 인돌 (1000 DAPI, 1)와 항체 라벨 및 카운터 얼룩 차를 식별 할 수있는 적절한 보조 형광 접합 된 항체를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 차 항체 용액에 부화 PBS 3X 5 분간 씻어. </li><li> 설치 매체를 사용하여 슬라이드를 현미경 각 커버 글라스를 탑재합니다. 시각 및 정량 분석​​을위한 형광 현미경에서 볼 슬라이드. </li></ol> (4) 분석 및 차 문화 Globoid 세포의 특성 <ol><li> 문화 globoid 셀을 식별하기 위해 다음과 같은 세 가지 형태 학적 기준을 사용 <ol><li> , 미세 아교 세포 마커 면역 양성 라벨에 의해 이바-1 +를 형광 현미경을 사용하여 globoid 세포를 식별합니다. </li><li> 확인polynucleated (즉, 포함 된 두 개 이상의 DAPI 긍정적 인 핵)로 globoid 세포. </li><li> 미세 아교 세포를 휴식의 높은 지형 모양과 구별 둥근 형태로 globoid 세포를 식별합니다. NOTE : 세포 배양에서 이러한 유동 세포 계측법에 의해 세포 표면 마커 분석 및 정량을 위해 수집 될 수있다. </li></ol></li><li> 미세 아교 세포 및 globoid 세포의 탐식 활성을 측정 <ol><li> psychosine 처리 된 미세 아교 세포의 탐식 활성을 평가하기 위해, 제조업체의 지침에 따라 우물에 FITC 표지 라텍스 구슬을 추가합니다. 이전 PFA로 고정에 형광 - 복합 라텍스 구슬 48 시간을 추가합니다. (3 절에서 설명) 면역 세포 화학 (2.4 절에서 언급 한 바와 같이) 구슬로 처리 된 세포 및 프로세스를 수정합니다. </li><li> 그들은 형광 표지 된 비드 형광 발광 스펙트럼을 겹치지 않도록 형광 공역 이차 항체를 선택한다. </li><li> Analyz전자 해당 셀 식별하여 이바-1 + 미세 아교 세포의 phagocytotic 프로필 형광 표지 구슬 주식 - 지역화. 참고 : Psychosine는 미세 아교 세포를 활성화합니다. Phagocytosed 구슬이 문화 속에서 단핵 및 다핵 이바-1 + 세포 내에서 확인할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 정제 된 미세 아교 세포 배양에서 Globoid 세포의 (5) 유도 참고 : 성상 세포 및 미세 아교 세포 사이의 세포 간 신호를 해독하는 다른 방법이 체외 globoid 셀 모델의 또 다른 장점이다. 다음 단계 (5.2 절 참조)에 설명 된대로 replating 또는 공동 배양을위한 기본 미세 아교 세포의 정제, 문화에서 자신의 낮은 준수 속성에 의해 달성 될 수있다. <ol><li> 50 ML 원뿔 튜브에 합류 혼합 된 아교 문화 매체를 수집하고 배양기에서 37 ° C에서 그것을 유지한다. </li><li> 차 혼합 폐해 문화에서 미세 아교 격리입니다.<ol><li> 합류 혼합 신경교 배양 T175 플라스크에서 매체를 제거한 후, [+ 25 mM의 4 - (2 - 히드 록시 에틸) -1 - 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) + 25 mM의 중탄산 나트륨 (시그마) 완전한 미디어 이루어지는] 따뜻한 흔들면서 용지를 추가한다. 100 회전 (37 ° C에서) 진탕 기에서 3 ~ 4 시간 동안 플라스크를 흔들어. 50 ML 원뿔 튜브에이 동요 플라스크에서 용지를 수집합니다. 참고 :이 미디어 플라스크에서 덜 부착 된 미세 아교 세포가 포함됩니다. </li><li> 실온에서 10 분 동안 300 XG에서 미디어 스핀. 성상 세포 에어컨 미디어 2 ㎖의 세포를 다시 일시 중지 한 후 뜨는을 대기음 (단계 5.1에서 수집). </li><li> 혈구를 사용하고 기판 코팅 된 커버 상에 미세 아교 세포를 플레이트 인수 세포의 수를 구축 면역 세포 화학 (2.1 절 참조), 또는 다른 종류의 세포와 공동 배양 globoid 세포의 미래를 수집 초저 준수의 웰 플레이트에 접시, 같은 희소 돌기 아교 세포로 (내림차순으로) 다음 섹션에서 ribed. 참고 : 일단 미세 아교 세포가 (2.3 절 참조) 전술 한 바와 같이 psychosine (10 μM)로 처리 할 수​​있다 도금. </li></ol></li><li> 세포 독성 분석을위한 기본 희소 돌기 아교 세포와 공동 배양. NOTE : 기본 희소 돌기 아교 세포의 배양, 또는 희소 돌기 아교 세포의 전구 세포 상에 후속 공동 배양 낮은 부착 판으로부터 psychosine 처리 된 미세 아교 세포의 컬렉션은 시험 관내에서 이러한 globoid 유사 세포의 잠재적 인 세포 독성 기능을 검사하는데 사용될 수있다. <ol><li> 설립 방법 (18, 20)를 사용하여 기본 희소 돌기 아교 세포의 문화를 개발한다. psychosine 처리 된 미세 아교 세포를 수집하려면, 부드럽게 우물의 바닥에서 느슨하게 부착 세포를 분리 피펫. 10 분 동안 300 XG에서, 원심 분리기를 세포를 수집하고 신중 Neurobasal 매체 이루어지는 희소 돌기 아교 세포의 분화 매체 [에서 재현 탁, L-글루타민 (1X), B-27 보조제 (1X), 및 트리 요오 도티 로닌 (T3, 10 NG / ㎖ )]. </li><li> 혈구를 이용하여 세포의 수를 계산하고 대략 한 결과, 1 × 105 세포 / ml로 배양 희소 돌기 아교 세포 상에 미세 아교 세포를 시드 : 2 소교 / 희소 돌기 아교 세포의 비율. 최대 3 일 동안 공동 문화로 품어. </li><li> 면역 세포에 대한 세포를 수정 (2.4 절 참조). ELISA를위한 세포 배양 배지를 수집하거나 필요한 화학 분석. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

본원에 기재된 프로토콜 개발 및 미세 아교 세포 활성화 및 세포 globoid 기능적 특성을 연구하는 새로운 모델 시스템을 제공한다. 임 외의 사전 작업. HEK293 세포주를 사용하여 globoid 셀 형상 (21)의 연구에 대한 본 프로토콜의 개발을위한 템플릿을 제공 하였다. 이 모델에서 파생 된 globoid 세포가 GLD에 식별 가능한 고유 globoid 세포에서 다르다는 것을 지적하는 것도 중요합니다. GLD에서 globoid 세포가 자주 열 핵의 초과 함유 관찰 된 반면 예를 들어, 우리는 정기적으로 우리의 쥐 문화 미세 아교 세포의 quadranucleation을 관찰했다. 생체 내에서 관찰 된 것과 비교하여 두 번째로, 시험 관내 시스템에서 형성된 globoid 세포는 직경이 작다. 사용 된 배양 시스템의 상대적 단순성을 포함 할 수있다 이러한 표현형의 차이에 대한 몇 가지 이유가 될 가능성이 있습니다. 예를 들어, 전혀 없다뉴런 또는 일차 신경...

또한 크라 질환으로 알려져 Globoid 세포 leukodystrophy (GLD)는, galatocerebrosidase (galc) 유전자 하나의 기능 돌연변이의 손실로 인한 ​​치명적인 탈수 초성 질환이다. GLD의 가장 일반적인 형태는 초기 아동기에 발병으로 대표되는 자주 시대 2,3의 오년 전에 모터와 조기 사망으로 이어지는인지 기능 저하의 공격적인 임상 경과 특징으로 유아 변종이다. 유전자 검사는 GLD (4)의 진단을 확인하는 데 사용된다. GLD의 신경 병리학은 globoid 세포 5-7라는 대폭적인 탈수 초화, 신경 쇠약, astrogliosis과 부풀어 오른 멀티 핵 미세 아교 세포의 존재를 알 수있다. 이러한 눈에 띄는 세포의 특정 기능이 애매 남아있다하더라도 종종 자신의 세포질에서 tubulous 내포물을 포함 globoid 세포의 식별은 지난 구십칠년에 대한 GLD의 정의하는 기능을하고있다. 비 myel의 참여GLD의 병인에 inating 아교 세포 (미세 아교 세포와 성상 세포는) 길이의이 질병 팔에 심각한 탈수 초화에 차 반응으로 간주되고있다. 흥미롭게도, 1916 5 KNUD 크라 만든이 질병의 첫 번째 설명,라는 이름의 한 지질 파편을 포함하는 다핵 식세포의보고 형성은 &#39;세포를 globoid&#39;이 질병의 특성을 정의합니다. GLD에서의 역할 오랫동안 무시되어 있지만 Globoid 세포는 GLD 병리의 특징 기능입니다. 흥미롭게도,이 세포는 GLD의 CNS 조직에서 가장 오래된 특성을 변경 중입니다. 지식의 부족으로 인해 다핵 식세포, 다른 질환이라는 거대 세포의 형성은 일반적으로 오히려 초기 병원성 원동력이 9보다 병리의 결과로 간주되는 것을 전제로하고 있습니다. 따라서, WHI에 의한 메커니즘을 조사하는 몇몇 연구가 있었다CH globoid 세포는 특히 GLD의 CNS에서 식세포로부터 형성된다. 이 보고서에 기술 된 절차에 CNS globoid 셀 형성의 중요성과 탐식 활성의보다 높은 수준을 나타내 시험 관내 미세 아교 세포 및이 세포의 유도 psychosine multinucleation 이전 시연에 초점을 맞춘다. 이러한 관찰과 일치, twitcher 뇌에서 globoid 세포 자주 식세포 활동의 높은 수준을 제안, PAS 양성 파편이 포함되어 있습니다. Globoid 세포도 페리틴에 대한 면역 양성으로 발견된다 (미세 아교 세포 마커) 10, KP-1 / CD68 (단핵 세포 마커), 그리고 일부는 멘틴에 대한 긍정적 인 (중간 필라멘트 단백질과 성상 세포의 마커 및 활성화 된 미세 아교 세포) 11, HLA-DRA (MHCII 표면 수용체), 및 TNF-α 07 및 12 년 Iba-1 (미세 아교 세포를 식별하는 데 사용되는 칼슘 결합 단백질). 마커의 컬렉션을 기반으로 globoid 세포를 개발하는 미세 아교 세포에서 발생독특한 표현형. 자신의 고유성에도 불구하고, 특정 기능과 GLD의 병인에 대한 GC를 기부금은 크게 간과하고있다. Globoid 세포는 만성 탈수 초화의 이차 결과로 생각되고있다. 그러나 GLD의 백질 병리 globoid 세포의 시간적 관계를 검사하는 과거의 연구는 출생 초기 기간의 후반에 globoid 배아 세포의 존재를 확인했다; 희소 돌기 아교 세포의 세포 사멸 및 명백한 탈수 초화 (13) 위의 시간. 따라서, GLD의 신경 병리학의 발달의 시간적 순서 globoid 세포가이 병 (14)에서 탈수 초화의 사전에 형성되는 것이 나왔다. 이 GLD에서 globoid 세포의 초기 형성이 희소 돌기 아교 세포 손상 15 차, 반응성 응답보다는 정의 병원성 이벤트를 나타낼 수있는 우리의 가설되었다. 또한, GLD에서 미세 아교 세포 활동의 조절 이상은 사실상 간주하고있다R 16이 질병을 치료하기위한 hematopeotic 줄기 세포 요법의 장기 효능을 제한. 따라서 psychosine에 응답하여 미세 아교 세포 기능 및 조절, 및 globoid 세포를 조사 GLD의 병인에 새로운 통찰력을 제공 할 것으로 기대된다. 최근까지 globoid 세포 형성을 연구하기에 적절한 모델의 부족은 정확한 기능과 GLD의 병리 이러한 세포의 기여에 대한 이해를 제한했다. 최근 연구에서, globoid 유사 세포가 GLD 축적 병원성 지질 독소 psychosine 직접적인 반응으로 형성 될 수 있다고 판단 하였다. 우리는 미세 아교 세포를 발견,하지만 대식 세포는 활성화되고 15 psychosine에 대한 응답으로 주 아교 문화 globoid 세포로 변환됩니다. globoid 세포로이 변환은 세포 외 단백질 분해 효소, 매트릭스 메탈 (MMP) -3 (15)에 의해 매개되는 것으로 밝혀졌다. 최근 우리이 체외 모델 시스템 개발이 psychosine 활성화 된 미세 아교 세포 및 globoid 세포를 이러한 연구 결과를 확장하고 결정한 희소 돌기 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포의 전구 세포에 강력하게 독성이. 따라서, GLD, psychosine와이 질병의 미세 아교 세포에 대한 신흥 차 및 가능한 병원성 역할을 지원할 것이다 탈수 초화 이전 globoid 세포 형성의 초기 축적의 맥락에서 고려 될 때. 우리는이 질병에 대한 우리의 이해에 기여할 GLD의 발병 기전에 대한 새로운 정보를 발표 할 예정이다 globoid 세포 형성의 연구를 제안한다. 또한, GLD의 새로운 휴대 전화 모델은 새로운 치료 접근 방법이 질병의 병리학 적 변화를 테스트 할 수 해결할 수있는 새로운 형식을 제공 할 수있다. 따라서이 보고서에서 우리는 비 myelinating 아교 세포의 차 문화 psychosine 유도 globoid 세포의 체외 개발에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>행크' 양이온이 없는 균형 잡힌 염 용액(HBSS)(Mg2+ 및 Ca2+)을 포함합니다.</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>신경 조직 해리 키트</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 &#956; m 세포 여과기</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Hank' 양이온(Mg2+ 및 Ca2+)를 포함하는 균형 잡힌 염 용액(HBSS).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Life technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>라미닌</td><td>시그마</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 솔루션</td><td>Life Technologies</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>Psychosine</td><td></td><td>Sigma P9256</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iba-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor conjugated antisera</td><td>Life Technologies</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 미디어</td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Phagocytic Assay Kit</td><td>Cayman Chemicals</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

체외 globoid 셀 leukodystrophy에서 휴대 병태 생리의 연구에 대한 모델

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

globoid 셀 leukodystrophy (GLD)의 중추 신경계에서 독특한 풍부 globoid 세포 불리는 다중 핵 미세 아교 세포의 정확한 기능은 불분명하다. 지식이 격차는 연구를위한 체외 모델의 적절한의 부족에 의해 방해되었다. 여기서, 우리는 기본 뮤린 신경교 배양 시스템을 설명 GLD 검색된 특성 globoid 세포 닮은 미세 아교 세포의 multinucleation psychosine에서 결과하는 치료. 이 신규 한 시스템을 사용하여, 우리는 globoid 세포 연구 및 분석 조건의 모드를 정의. 이 모델 시스템의 사용 가능성은 매트릭스 메탈 (MMP)에 대한 잠재적 인 역할을 식별 우리의 이전 연구에서 입증되었다 -3 GLD에서. 시험 관내 시스템이 신규 이러한 독특한 세포의 형성 및 기능뿐만 아니라 잠재적 인 치료 조작, 공부하는 유용한 모델이 될 수있다.

이 프로토콜은 서면으로, 마무리 (: 실험 워크 플로 계획 그림 1 참조) 시작부터 완료하는 데 약 삼십육일이 걸릴 것으로 예상된다. 그것은이 주 문화 시스템 'globoid 같은'세포의 개발은 신뢰성과 재현성 모두 것을 우리의 경험이다 : psychosine 님의 다핵 세포의 형성은 지속적으로 치료 칠일으로 관찰된다. 대형의 식별을 가능하게 핵 반대 얼룩과 함께 이바-1을 사용하여 미세 아교 세포의 면역 세포 화학 염색, 다핵 세포를 반올림 (그림 1b). 어떤 경우에는 이러한 globoid 같은 세포에서 핵 콘텐츠는 별개의 핵으로 나타납니다. 그러나, 많은 경우에, 핵의 크기가 확대 더러워 이러한 세포 (도 1B)의 다핵 상태를 반영한다. globoid 유사 세포의 수는, 시야에 시야에서 변할 수있다하지만, 시험관 내에서 형성 globoid 세포의 비율이 &lt;소교...

구형세포는 현재 효과적인 장기 치료법이 없는 백혈구이영양증인 크라베병의 특징적인 병리학적 특징입니다. 우리는 활성화된 미세아교세포의 선천적 생물학 및 병원성 잠재력과 구형세포로의 변형을 연구하기 위해 세포 배양 모델을 개발했습니다.

체외 Globoid 셀 Leukodystrophy에서 휴대 병태 생리의 연구에 대한 모델

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

이 절차의 전반적인 목표는 독소 사이클린이 있는 상태에서 미세아교세포가 GLO 세포로 독특하게 변형되는 것을 입증하는 것입니다. 이것은 먼저 커버 슬립을 세포외 기질 단백질로 코팅함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 신경교세포를 커버 슬립에 도금한 다음 사이클린 및 라텍스 비드를 배양액에 투여합니다.마지막 단계에서는 면역화학에 의해 세포를 염색합니다. 궁극적으로, 미세아교세포의 핵형성 및 식세포 능력에 대한 cycline의 효과는 면역형광 현미경으로 평가할 수 있습니다. 미세아교세포주 사용과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 1차 신경교세포 배양을 사용하면 GLO 공허 세포 백혈구 이영양증 또는 GLD를 앓고 있는 개인의 뇌에서 I 성상세포와 미세아교세포 사이의 가설된 상호 작용을 모방한다는 것입니다.세포외 기질 또는 ECM 코팅 커버 슬립을 준비하려면 먼저 원형 커버 슬립을 멸균 염산과 함께 멸균 페트리 접시에 담그십시오. 30분 후 멸균수로 커버 슬립을 세 번 씻은 다음 95% 에탄올에 최소 20분 동안 담가둡니다. 커버가 자연 건조되도록 한 후 150-250마이크로리터의 희석된 ECM 단백질 코팅 재료 방울을 파라폼 시트에 추가하여 입자를 분배하여 배치 후 커버 슬립이 겹치지 않도록 합니다.다음으로, 집게를 사용하여 각 액적에 커버 슬립을 부드럽게 배치한 다음 4-6시간 후에 새시를 닫은 상태에서 파라폼을 세포 배양 후드 내부에 배치하고 커버 슬립 ECM 코팅면을 위로 향하게 하여 24웰 플레이트의 개별 웰에 놓습니다. 그런 다음 멸균 PB S3로 각 웰을 세척하고 커버 슬립을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 커버 슬립에 도금하기 위해 신경교세포를 준비하려면 신경교세포 배양에서 배지를 흡인한 다음 10ml의 멸균 PBS로 단층을 세 번 부드럽게 세척합니다.5-10분 후에 8-10ml의 트립신 EDTA로 세포를 분리합니다. 섭씨 37도에서 플라스크에 20ml의 완전 매체를 첨가하여 반응을 멈춥니다. 그런 다음 세포 현탁액을 50ml 원추형 튜브로 옮기고 10분 동안 세포를 스핀다운합니다.300Gs와 실온에서 P 1000을 사용하여 2ml의 신선하고 완전한 매체에 입천장을 부드럽게 재현탁시킵니다. 계수 후, 세포를 약 1 곱하기 10으로 10 밀리리터 당 5 번째 세포로 희석합니다. 이제 ECM 코팅된 각 커버 슬립에 500마이크로리터의 셀을 플레이트합니다.각 웰에 새로운 완전한 배지를 추가로 추가한 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 3-5일 동안 배양합니다. 세포가 원하는 합류점에 도달하면 갓 준비한 사이클린을 각 웰에 추가하고 배양 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 혼합합니다. 사이클린 치료의 일주일 후에, 매체를 모으고 500 마이크로리터의 추위, 실온에 우물 당 4%para 포름알데히드에 있는 세포를 고치십시오.그런 다음 PBS로 각 웰을 세 번 세척하고 플레이트를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 면역세포 화학으로 GLO 세포를 시각화하려면 먼저 PBS를 차단 버퍼로 교체하고 실온에서 세포를 배양합니다. 한 시간 후, 실온에서 최소 1시간 동안 미세아교세포 마커 IO one에 대해 1차 항혈청의 세포를 배양한 다음 5분 동안 PBS에서 각 웰을 3회 세척합니다.적절한 형광으로 세포를 배양한 후, 접합된 2차 항체로 세포를 대조염색하여 핵을 식별합니다. 그런 다음 방금 시연한 대로 세포를 세척한 후 장착 매체를 사용하여 각 커버 슬립을 개별 현미경 슬라이드에 장착하고 시각적 및 정량적 분석을 위해 형광 현미경에서 슬라이드를 봅니다. 사이클린 처리 후 고정 전에 cycline 처리된 microglia의 phagocytic 활성을 평가하기 위해, 제조업체의 및 지침에 따라 각 G OID 세포 배양에 FITC 표지된 라텍스 비드를 추가합니다.48시간 후, 방금 설명한 대로 PFA에 세포를 고정한 다음 그림과 같이 면역화학을 위해 세포를 처리합니다. 마지막으로, 형광 현미경 검사, 면역화학 물질에 의해 형광 표지된 비드와 함께 국소화되는 IBO one 양성 미세아교세포의 수를 평가합니다. IO one을 핵 카운터 염색과 함께 사용하여 미세아교세포를 염색하면 크고 둥근 다핵 세포를 식별할 수 있습니다.많은 경우에, 핵 크기의 총체적인 확대는 이 이미지에서 관찰된 바와 같이 이들 세포의 다핵 상태를 반영한다는 것을 주목하라, cycline 처리는 또한 다핵화된 GLO 세포뿐만 아니라 mono nucleated microglia의 PHA 산성 활동의 증가에 의해 측정할 수 있는 microglia의 일반화된 활성화를 불러일으킨다. 이 대표적인 이미지에서 관찰된 바와 같이, IBO one 양성 미세아교세포의 PHA Acidly active 프로파일은 희소돌기아교세포 전구세포와의 공동 배양 중에 쉽게 식별할 수 있습니다. 사이클린 치료에 대한 반응으로 이러한 다핵 세포의 형성이 GLD의 신경 병리학을 정의하는 특성이며 이러한 병리학에 대한 이러한 세포의 기여는 이전에 이러한 방식으로 탐구되지 않았기 때문에 이 기술의 의미는 GLD 치료로 확장됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 태아의 척추 코드에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유래를 설명하고 이식이나 oligodendrocytic 혈통의 연구 중 체외 유지.

E13 생쥐에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유도

이 비디오는 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 희소돌기아교세포로 분화하고 배근신경절(DRG) 뉴런과 공동 배양에서 수초화를 유도하는 프로토콜을 보여줍니다. OPC는 수초화를 조절하는 신호 단백질을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질전환됩니다. 형질도입된 OPC는 DRG 뉴런과 공동 배양되어 희소돌기아교세포로의 분화 및 신호 단백질 유도 수초화를 평가합니다.

희소돌기아교세포 전구세포에 대한 체외 형질도입 유도 수초화 분석

여기, 우리는 개발을위한 체계적인 접근 방법을 제시 생리 학적 관련성이 민감하고...

Danio rerio를 사용하여 병적 인 인간 게놈의 생체 모델링에

플록스, 조건부 발암성 대립유전자로 조작되고 바이러스 Cre 매개 재조합을 통해 형질전환된 마우스에서 채취한 표현형 야생형 성상세포와 신경 줄기세포는 syngeneic, immune-competent littermate의 뇌에 형질전환된 세포의 orthotopic 주입에 의해 in vitro 및 in vivo에서 성상세포종 발병기전을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다.

모델링 성상 세포종 병인 체외와 생체 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

여기에서는 중추신경계 수초화의 시험관 모델을 통해 희소돌기아교세포에서 희소돌기아교세포의 역할을 구체적으로 조사하기 위해 희소돌기아교세포 전구세포를 바이러스로 조작하여 관심 단백질을 과발현할 수 있는 유연하고 전략적인 기반을 제공하는 프로토콜을 제시합니다.

생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한 체외 수초 분석

염증성 탈수초성 질환의 피질 병변에서 탈수초화 및 신경 세포 사멸의 메커니즘을 다루기 위해 다양한 동물 모델이 사용됩니다. 여기에서는 뇌 절편에 희소돌기아교세포 특이적 CD8+ T 세포를 사용하여 희소돌기아교세포 및 신경세포 사멸을 초래하는 생체 외 접근법을 설명합니다. 모델의 잠재적인 응용 프로그램 및 제한 사항에 대해 설명합니다.

생체 내 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

여기에서는 체외에서 중추신경계로의 림프구 전이를 조사할 수 있는 인간 혈액-뇌 장벽 모델에 대해 설명합니다.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

이 보고서에서 organotypic 문화와 지 루트 마우스 파생 중추의 해리 주 문화의 장점 다양 한 메커니즘 neuroplasticity, 상호 작용 신경 폐해와 관련 된 조사를 강조 표시 됩니다. neuroinflammation, 그리고 바이러스 성 감염에 응답입니다.

성인 마우스 DRG Explant와 해리 셀 모델 Neuroplasticity 바이러스 성 감염을 포함 한 환경 모욕에 대 한 응답을 조사 하

이 기법의 목표는 murine 척수에서 기본 motoneurons (MNs)의 매우 풍부한 문화를 준비. 설명만 질병을 일으키는 돌연변이의 결과 평가 하려면 여기 이러한 격리 절연 MNs 및 그들의 transfection magnetofection에 의해.

마우스 기본 Motoneurons Transfecting으로 Charcot Marie이 질병에서 체 외에서 모델링

뇌 오가노이드는 미토콘드리아 뇌근병증, 유산산증 및 뇌졸중 유사 에피소드(MELAS) 연구를 위한 귀중한 모델 역할을 하며 근본적인 병태생리학에 대한 통찰력을 제공하고 약물 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공합니다. 질병 유발 유전자의 다양한 수준의 이형질을 가진 세포주에서 유래한 오가노이드는 상당한 표현형 차이를 나타냅니다.

뇌 오가노이드를 사용한 미토콘드리아 질환 모델링: 미토콘드리아 뇌근병증, 유산산증 및 뇌졸중 유사 에피소드에 초점

배우세요 크라베병에서 미세아교세포가 globoid 세포로 변형되는 과정을 세포 배양 모델로 연구하는 방법을. 사이클린 처리와 면역형광 현미경을 통해 세포 핵형성과 식세포 능력을 평가합니다.

체외 Globoid 셀 Leukodystrophy에서 휴대 병태 생리의 연구에 대한 모델

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