Name: 컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 배우세요 자궁경부 단핵세포 격리 및 유세포 분석 방법을. 사이토브러시 샘플링으로 여성 생식기 면역 세포를 비침습적으로 수집하여 면역 기능을 분석하는 기술입니다.

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저자는 이 프로토콜과 관련된 점막 면역학 연구에 도움을 준 나이로비 대학의 연구 프로그램 임상 책임자인 Joshua Kimani에게 감사를 표합니다. 저자는 CHVI 보조금 MOP 86721의 자금 지원에 감사를 표합니다.

윤리 문 : 매니토바 대학교 및 나이로비의 케냐 타 국립 병원 / 대학 모두의 연구 윤리 보드는이 연구를 승인하고 서면 동의서는 모든 연구 참가자로부터 얻은 것입니다. 1. 매체의 제조 및 CMC 수집 관 <ol><li> 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 용액 (137.93 mM의 염화나트륨, 2.67 밀리미터의 KCl, 8.1 mM의 나 2 HPO 4, 1.47 mM의 KH 2 PO 4)를 준비합니다. 불임에 대한 압력솥. 이것은 몇 달 동안 4 º C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 미리 나누어지는 5 ㎖의 PBS로 50 ML 팔콘 튜브 (수집 할 샘플 당 하나)와 4 º C에서 저장 샘플 수집 시간까지. </li><li> 저장을위한 세척을 수집하는 샘플 당 2 ~ 4 cryovials 또는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 레이블을 지정합니다. </li><li> 세포 배양 매체를 준비 RPMI 1640 + 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 암포 테리 신 B (최종 농도 100 단위 / ㎖, 100 ㎍ / ㎖ 및 250 겨 / ㎖, respectiv더 FCS / FBS와 엘리는 덧붙였다. </li></ol> Cytobrush 샘플 2. 컬렉션 cytobrush 샘플 컬렉션은 훈련 MD 또는 산부인과 의사에 의해 수행되어야하는 비 침습 절차입니다. <ol><li> cytobrush와 나무 또는 플라스틱 긁는 도구를 모두 사용하여 자궁 경부 단핵 세포 (CMC)를 수집합니다. (그림 1) 긁는 도구를 삽입하고 자궁 OS 중심으로 회전하여 검경 시험에서 참가자에서 CMC를 수집합니다. , 자궁 경부 OS에 cytobrush를 삽입 360 ° 회전, 즉시 PBS의 5 ML을 포함하는 50 ML 팔콘 튜브에 cytobrush 스크레이퍼를 모두 배치합니다. </li><li> 처리까지 4 º C에서 / 얼음에 샘플을 보관하십시오. 컬렉션의 2 시간에서 세포 생존 능력, 공정 샘플을 유지합니다. </li><li> 가능하면 말초 혈액 단핵 세포 CMC 분석을위한 비교 / 제어 역할을하는 (PBMC) 분리를위한 녹색 최고 헤파린 vacutainers에 일치하는 혈액 샘플을 수집합니다. </리&gt; </ol> CMC를 3. 분리 이중 장갑 멸균 생물 안전 캐비닛, 바이오 안전성 수준이 실험실에서 시료 처리를 수행합니다. <ol><li> 수집하는 동안, CMC 샘플은 혈액에 오염 될 수 있습니다. 최종 샘플 PBMC의 혼란 포함을 방지하기 위하여 연구 결과에서 볼 혈액 오염과 샘플을 제외. 인해 CMC 샘플로부터 단리 림프구의 낮은 숫자로, 사소한 혈액 오염을 쉽게 CMC 림프구 성분을 압도 할 수있다. </li><li> 브러쉬에서 세포를 떼어 놓다 45 초 cytobrush 스크레이퍼를 모두 포함 소용돌이 팔콘 튜브. 샘플은이 과정에서 거품이 될 수있다; 이것은 정상입니다. </li><li> 스크레이퍼 떨어져 남아있는 재료를 긁어 및 표백 용액에 스크레이퍼를 폐기 cytobrush를 사용합니다. 브러쉬 / 스크레이퍼에 붙어 남아있는 세포를 수집하려면, 엄지 손가락과 집게 손가락 사이에 스크레이퍼를 짜내 신선한 장갑을 사용합니다.세포와 PBS가 동일한 50 ㎖ 튜브에 수집 될 수 있도록 브러시를 밀어. 표백제 용액에 cytobrush를 폐기하고, 장갑을 버린다. 중요 : 각 샘플에 대한 새로운 장갑을 사용하십시오. </li><li> 신선한 50 ML 팔콘 튜브에 100 μm의 나일론 셀 스트레이너를 장착한다. 전달 피펫을 사용하여, 샘플 튜브에서 PBS-세포 현탁액을 수집하고 새로운 튜브로 여과기를 통해 고를. </li><li> 원래 샘플 튜브에 RPMI 1640 5 ML을 추가합니다. 전송 피펫을 사용하여 RPMI로 샘플 튜브의 측면을 씻어 새 컬렉션 튜브에 필터를 통해 전송합니다. 뿐만 아니라 RPMI와 나일론 필터의 바닥을 세척 할 것. </li><li> 514 X g에서 10 분 동안 원심 분리. 이것은 CMC 펠릿 빠지을 방지하기 위하여,이 단계 동안 원심 브레이크를 남겨두기 위하여 중요하다. </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 튜브에서 뜨는을 제거합니다. 펠렛의 크기는 매우 다양 할 것이다; 그래서의다른 경우에, 펠릿이 거의 보이지 및 고투명 동안 저 샘플은 펠릿 인해 상피 세포의 많은 수의 존재로 상당히 크다. </li><li> 팔콘 튜브의 부드러운 교반하여 펠렛을 Resuspend. 샘플을 씻어 PBS의 5 ML을 추가합니다. </li><li> 아니 원심 브레이크와 514 XG에 10 분 다시 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 취소하고 위의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 세포 (PBMC의 냉동 보존 프로토콜을 사용하여) 냉동 보존, 자극 또는 표현형 유동 세포 계측법 중 하나에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 4. CMC 표면의 얼룩 및 유동 세포 계측법 <ol><li> 차단 용액 100 μL 3.10 단계에서 펠렛을 재현 탁하고 96 - 웰 플레이트 또는 FACS 튜브 내로 하나 옮긴다. 차단 솔루션 (Fcγ 수용체를 차단하기 위해) 다음과 같은 조리법은 : 1.8 ㎕의 마우스 IgG의 (최종 농도 0.2 ㎍ / μL), 5 μL의 FBS 93.2 ㎕의 FACS 세척 (PBS 2 % FBS).염색법은 펠릿 크기가 충분히 작은 경우에 96 웰 플레이트에서 수행 될 수 있지만, 펠릿 일상적 큰 경우 FACS 튜브에서 수행 될 필요가있다. 그에 따라 항체를 적정하는 것이 중요합니다. </li><li> 4 ℃에서 얼음 / 10 분의 샘플을 차단 </li><li> 96 - 웰 플레이트에 FACS 워시 (PBS 2 %의 FBS) 100 μL, 또는 FACS 튜브에 500 ㎕ 씩 세포를 씻으십시오. 최저 브레이크와 4 ° C에서 10 분 600 XG에 원심 분리기 (끄거나, 낮은 브레이크 설정을 사용할 수없는 경우가). </li><li> 뜨는을 제거하고 교반하여 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 생존의 얼룩 (라이브 죽은 고칠 가능성 염료)를 추가합니다. 제조업체의 지침에 따라 생존의 염료를 준비합니다. 각 실험실 / 사이토 설치에 사용하기 위해 적정해야 할 수 있습니다. 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 알을 품다 </li><li> (96 - 웰 플레이트 / FACS 튜브의 경우) 세포에게 PBS 100 μl/500 μl를 씻으십시오. 저 / 노 브레이크 10 분 600 XG에 원심 분리기. supernatan를 제거T와에 resuspend 세포. </li><li> 100 μL의 총 부피, 표면 마커 항체의 칵테일 세포를 품어. 중요 : 최적화 및 염색을 샘플링하기 전에 패널 세포 계측법 각 흐름을 적정한다. 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 세포를 품어 </li><li> 4.5 단계를 반복합니다. FACS 튜브에 96 - 웰 플레이트, 전사 셀에 염색하고 1 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 포함하는 FACS 세척 750 μL의 최종 부피로 희석 (또는 CytoFix을 소재 1 희석). 유동 세포 계수기에 데이터 수집을 진행합니다. </li></ol> 5. 수집 및 자궁 경부 질 세척의 준비 (CVL) <ol><li> 샘플링을 cytobrush하기 전에, 멸균 PBS의 2 ㎖로 자궁 경부 씻어 후방 원개에서 세척을 흡인하기 위해 주사기를 사용합니다. </li><li> 15 ML 팔콘 튜브에 흡입 된 세척 샘플을 수집하고 처리 할 때까지 4 º C에서 / 얼음 계속. </li><li> 세포 파편을 제거하는 7 분 400 XG에 샘플을 원심 분리기. </li><li> 공동-70 ℃에서 1 ㎖ 또는 500 μL 씩 분주하고, 가게에 뜨는 나누어지는에게 샘플을 llect 분취 량은 ELISA 또는 CVL 단백질의 비드 어레이 분석 해동 만 체류 냉동 / 해동 사이클을 피할 수있다. </li><li> 원하는 경우, 제조자의 프로토콜에 따라 RNA의 발현을 측정하기 위해 나중에 RNA에서 세포 파편의 펠렛을 재현 탁. </li></ol> 6. 데이터 수집 <ol><li> 항체 패널 일치 보상 튜브 세트를 준비한다. 스펙트럼 중복을 조정 보상 튜브를 실행합니다. 그 사이토 어떤 여러 가지 빛깔의 흐름에 샘플을 실행은 패널에 사용되는 형광 색소 결합 된 항체에 대해 구성됩니다. </li><li> 림프구 집단을 검출하기 위해 순방향 캐터 (FSC) 및 측면 스 캐터 (SSC)의 전압을 조정하는 제 PBMC 시료를 획득. 리니어 스케일의 각 축 (100)에 그들을 유지하십시오. PBMC 제어를 실행하면 상당히 쉽게 CMC 림프구 인구를 찾을 수 있습니다. </li><li> CMC 샘플에 대한 FSC 임계 값은 낮은 FSC의 값에 SSC 축을 얼룩에 의한 PBMC 샘플에 상대적으로 증가해야 할 수 있습니다. </li><li> 취득하기 전에 각 튜브를 소용돌이. 수집 된 림프구 게이트 이벤트의 수를 최대화 할 전체 튜브를 획득. 막힘을 방지하기 위해주의 깊게 시스템을 모니터링합니다. </li><li> 그러한 FlowJo 같은 유세포 분석 프로그램으로 데이터를 내보낼. </li></ol> 7. 게이팅 전략 <ol><li> 고 앞으로 측면 산란 (FSC-H)을 선택 / 앞으로 측면 산란 영역 (FSC-A) 중항 인구를 결정합니다. </li><li> 인수의 품질을 제어하기 위해 (예를 FITC로) 형광 마커 대 시간을 선택합니다. 유량의 변화는 데이터에 유물을 소개 할 수 있습니다. 유량의 차이를 보여줍니다 어떤 지역을 제외합니다. </li><li> SSC-A/FSC-A 플롯의 림프구 인구를 확인합니다. 식별을 용이하게하기 위해 PBMC 컨트롤을 사용합니다. CMC 림프구 인구가 PBMC 제어와 같은 명확하지 않을 수 있습니다. &lt;/ 리&gt; <li> SSC-A/viability에 게이트는 살아있는 세포에서 죽은 세포를 제외 염색. 죽은 세포가 아닌 구체적으로 유물을 소개하는 항체를 통합 할 수 있습니다. </li><li> SSC-A/CD3에 게이트는 T 세포 인구를 식별 할 수 있습니다. 이 게이트에서 CD4 +와 CD8 + 인구를 식별합니다. </li></ol>

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여성의 생식기 (FGT)에서 내성에 대한 지식의 큰 격차를 감안할 때, CMC를의 표현형 분석은 자궁 경부에있는 다수의 림프구 집단에 대한 통찰력의 다양한 배열을 제공 할 수 있습니다. 프로테옴 분석 및 자궁 세척에서 바이러스 부하 측정과 함께, 성병 감염 (STI)의 다른 병원균에 대한 면역은 다양한 인구에서 해부 할 수 있습니다. 기술적 고려 사항 - CMC를가 : 분리 및 CMC 샘플을 성공적으로 염색 도전이 될 수 있습니다. CMC 수집 프로토콜의 최적화는 마지막으로 다음 자궁 스크레이퍼 다음에 먼저 CVL 수집의 효율성 및 cytobrush을 강조했다. 이는 후술 다양한 이유로 샘플 배제 가능성 증가로 인해 말초 혈액 연구, 계산에 비해 계획된 샘플 크기를 증가시키는 것이 중요하다. 욕망의 테스트CMC 샘플에 D 흐름 패널 개시를 공부하기 전에 중요합니다. 그것은 특히 단핵구 게이트에,...

새로운 HIV 감염의 대부분은 전 세계적으로 여성은 2011 년 (UNAIDS 1) 새로운 감염의 47 %를 대표로, 이성애 전송을 통해 발생한다. 여성의 생식기 (FGT), HIV 및 기타 성병 병원체의 주 진입 포털 중 하나를 이해, 감염을 방지하기 위해 효과적인 전략을 찾는 경로에 높은 중요하다. 생식기 점막의 면역 반응은 분명히 독특하고 말초 혈액 2에서 측정 다릅니다. 그러나, FGT에서 면역 역학의 현재의 지식은 기껏해야 제한됩니다. 현재까지, 점막 면역 환경의 연구는 대부분이 감염 다음과 같은 점막 조직에서 초기 이벤트 이후 질병의 진행 3,4에 큰 영향을 미칠 것이 분명되고있다 창자 관련 림프 조직 (GALT)에 초점을 맞추고있다. 생식기 점막에서 샘플을 수집하는 것은 큰 도전을 나타내고 락 적어도 부분적으로 책임이있다FGT의 면역학의 이해 K. FGT이 로케일에서 샘플을 수집하고 분석하기위한 효율적인 방법을 필요로 한 독특한 환경의 맥락에서 호스트와 병원체의 면역 동적으로 퍼즐을 해결. FGT는 두 개의 섹션으로 나누어 져 나팔관, 자궁 내막과 자궁 경부, 그리고 ectocervix을 포함하는 낮은 요로와 질을 포함하는 상부 생식기 (Kaushic 검토를 등 5). 그것은 서로 다른 사이트의 상대적 기여도는 HIV 감염에 무엇 아직 불분명하지만, 그것은 두 사이트 모두 HIV 항목 6에 기여할 수 있다고 믿고 있습니다. T 세포는 대 식세포가 (로드 리 게스 - 가르시아 검토 등 2) 약 10 %를 포함하는 동안, 상단과 하단의 생식 책자에서 백혈구 40 ~ 50 %를 차지한다. T 세포는 질, 경부, 자궁 내막 및 검출 할 수있다. 대 식세포는 더 강하게 locali 있습니다그들은 두 조직에서 검출 될 수 있지만, 자궁 경부보다 자궁 내막 및 자궁 근층 결합 조직에 제드 자형. 마지막으로, plasmacytoid 수지상 세포 (PDCS) 및 랑게르한스 세포는 또한 FGT 조직에서 검출 될 수있다. 표현형 및 면역 인구 및 HIV 감염에 감수성의 비율은 호르몬주기에 따라 중요하게 다를 수 있습니다, 호르몬 피임약, 세균성 질염이나 성적 활동 5,7-9의 사용. 다양한 방법 FGT의 면역 인구와 환경을 연구하기 위해 개발되었다. 자궁 경부 조직 검사, 자궁 및 자궁 경부 cytobrushes lavages (CVL) 10 ~ 12은 가장 일반적으로 문헌에서 사용할 수 있습니다. PBS의 세척에 의한 CVL 컬렉션은 간단한 방법이며, 매우 낮은 세포 수율 면역 조절 성 단백질 만, 결과의 연구를 허용하고, 따라서 FGT (13)의 면역 세포 집단을 공부에 적합하지 않습니다. CVL 샘플은, 반면에, 아르 V이러한 ELISA, 사이토킨 비드 어레이 (14) 또는 질량 분석 등의 방법 (15, 16)를 사용하여 각종 사이토킨, 케 모킨 또는 항균 인자의 발현을 측정함으로써 FGT의 면역 환경을 평가하기위한 유용한 ERY. 면역 세포 주파수, 표현형과 기능의 특성은 자궁 cytobrush 또는 자궁 경부 생검 표본 추출에 의해 자궁 경부 단핵 세포 (CMC)를 수집하여 달성 될 수있다. 자궁 경부 생검의 샘플링은 출혈의 불편과 위험을 증가와 여자 (12)의 면역 상태에 따라 절차에 따라 치료 2~11일 소요 침습적 방법이다. 한편, 자궁 cytobrushes는 수집 세포의 낮은 수율에도 불구하고, FGT로부터 면역 세포를 수집하기 위해 덜 침습적 더 편리한 방법이다. 두 가지 방법은 CD45 + 백혈구의 동일한 수율에 도달 할 수 있지만, 두 개의 연속 자궁 cytobrushes가 포함 된 세포의 동일한 금액을 얻기 위해 필요한 IN 한 생검 13. 그럼에도 불구하고, cytobrush 샘플링은 여전히 14 유동 세포 계측법에 의해 추가로 생체 표현형에 대한 세포의 수용 수 (약 5,000 CD45 + 세포 / cytobrush)를 제공합니다. 자극 세포 유세포 또는 qPCR에 HIV가 특정 면역 반응 (17) 또는 토륨 셀 (18)의 편광을 식별 cytobrush 유래의 CMC를 사용하여 수행되었다로서 또한 기능적인 특성은,이 샘플들에 수행 될 수있다. T 세포 인구의 팽창은 또한 CMC를 19으로 기능적 연구를 용이하게 할 수있다. 그것은 생검 및 cytobrushes는 FGT의 별개의 부분을 샘플링하는 것이 중요합니다. 자궁 cytobrushes은 자궁 경부와 아마 변환 영역의 상피 세포에서 파생 된 세포를 수집, 자궁 OS를 샘플링하면서 생검은 ectocervix (12, 13)의 상피 세포와 기질의 우수한 부분에서 파생됩니다. Cytobrush 샘플 따라서 재를 샘플링조직 검사는 편평 층상 상피 5 줄 지어 영역을 포함하는 동안 기온은 원주 상피 세포의 단일 층으로 구성. 그 결과, 자궁 경부 생검 및 cytobrush 의해 수집 백혈구 집단의 특성은 다르다. cytobrushes는 CD14 + 단핵 세포 / 대 식세포 (13)의 높은 비율의 컬렉션에 발생하는 반면 생검, CD3 + T 세포의 높은 비율을 수집합니다. FGT의 면역학을 공부하는 것은 많은 년간 20 ~ 22에 대한 관심이었다 우리는 cytobrush 파생 CMC를 연구와 전문 지식의 큰 거래를 축적했다. 우리의 연구는 HIV에 감염된 감염되지 않은 및 HIV에 노출 된 혈청 음성 나이로비, 케냐 (HESN) 여성 성 노동자의 연구에 주로 초점을 맞추고있다. HIV는 우선적으로 FGT에 HIV 대상이 될 수있는 활성화 된 세포의 23 숫자가 낮아 HIV 취득에 대한 보호에 기여할 수있는 활성화 된 T 세포에 복제합니다. 이 가설 여러 스투과 일치에스 아직 감염되지 않은 24, 25을 유지하며,이 대기 표현형도 FGT 14에서 관찰되는 높은 HIV에 노출 된 HESN의 성 노동자들 사이 낮은 면역 활성화를 설명했다. 여기, 우리는 처리 방법을 설명하고 생체 유동 세포 계측법에 의해 자궁 경부 cytobrushes에서 파생 된 CMC 샘플에서 T 세포의 활성화를 평가.

<table><tbody><tr><td>100 &뮤; 50ml 팔콘 튜브</td><td>BD</td><td>352360</td><td>CMC 처리</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td>CMC 처리</td></tr><tr><td>태아 혈청</td><td>생명 기술</td><td>16000044</td><td>CMC 처리</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>생명 기술</td><td>15290-018</td><td>CMC 처리</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>시그마</td><td>P4333-20ml</td><td>CMC 처리</td></tr><tr><td>50ml 팔콘 튜브</td><td>피셔</td><td>14-959-49A</td><td>CMC 처리</td></tr><tr><td>혈액 은행 일회용 전송 피펫</td><td>피셔</td><td>13-711-6M</td><td>CMC 처리</td></tr><tr><td>Cytobrush plus</td><td>Cooper 외과</td><td>C0121</td><td>CMC 샘플링</td></tr><tr><td>일회용 자궁 경부 스크레이퍼</td><td>빠른 의료</td><td>2183</td><td>CMC 샘플링</td></tr><tr><td>15ml 팔콘 튜브</td><td>피셔</td><td>14-959-70c</td><td>CVL processsing</td></tr><tr><td>1.5 ml tube Eppendorf</td><td>Fisher</td><td>05-402-18</td><td>CVL storage</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Various</td><td>Flow cytometry 시약</td></tr><tr><td>Fixation buffer (4% PFA)</td><td>BD</td><td>554655</td><td>Flow cytometry regeant</td></tr><tr><td>IgG mouse</td><td>Sigma</td><td>I8765</td><td>유세포 분석 regeant</td></tr></tbody></table>

컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

점막 병원체(HIV 포함)의 공중 보건 중요성에도 불구하고, 특히 여성 생식기(FGT)의 점막 면역에 대해서는 상대적으로 알려진 바가 거의 없습니다. 이성애 전염이 현재 HIV 전염의 지배적인 기전을 나타내고 있고 성병(STI)의 지속적인 확산을 감안할 때 생식기 점막에서 숙주와 병원체 사이의 상호 작용을 이해하는 것이 중요합니다. FGT 면역에 대한 지식의 상당한 격차는 부분적으로 점막 샘플을 성공적으로 수집하고 처리하는 데 어려움이 있기 때문입니다. 충분한 표본 크기로 연구를 용이하게 하기 위해서는 채취 기법이 최소 침습적이고 효율적이어야 합니다. 이를 위해 경추 사이토브러시 샘플 수집 및 후속 자궁경부 단핵 세포(CMC) 분리를 위한 프로토콜이 최적화되었습니다. 체외 유세포 분석 기반 면역 표현형 분석을 사용하면 CMC 림프구/단핵구 집단 빈도 및 표현형을 정확하고 신뢰할 수 있게 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 사이토카인, 케모카인 및 항프로테아제를 포함한 용해성 면역 매개체를 포함하는 자궁경부-질 세척제(CVL) 수집과 결합할 수 있으며, 이 모든 것은 질의 항염증 또는 전염증 환경을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

다 항목 유동 세포 계측법은 이전에 uncharacterized 조직에서 세포 부분 집합의 표현형과 기능을 해부 할 수있는 강력한 도구입니다. CMC의 샘플 분석은 적절한 게이팅 전략 림프구 및 단핵구 집단 모두에 대한 정보를 얻을 수있다. 대표적인 CMC 게이팅 전략, 일치 PBMC 프로파일에 비해, 그림 2와 같다. FSC-H 플롯 대 FSC-A도 여과 한 후, PBMC에 비해 CMC 샘플에서 매우 널리 퍼진 세포 이중선, 배제 가능 (그림 2A). 품질 관리로 인해 샘플 덩어리로 유량이나 유물의 변화는 쉽게 (그림 2B)를 식별 할 수있는 시간에 게이팅에 의해 흐름 문제의 제거를 포함합니다. 림프구 / 단핵 세포 인구의 식별 PBMC 및 CMC 샘플 (그림 2B) 모두에서 상대적으로 유사합니다. 생존의 염료에 의해 죽은 세포의 제외는 포함을 방지비특이...

자궁경부에서 림프구와 단핵구를 채취하기 위해 사이토브러시 샘플링을 사용하는 것은 여성 생식기 면역 분석을 위한 샘플을 제공하는 최소 침습 기술입니다. 이 프로토콜에서는 유세포 분석 분석을 위한 cytobrush 샘플 수집 및 면역 세포 분리에 대해 설명합니다.

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

이 절차의 전반적인 목표는 사이토 브러시를 사용하여 자궁경부 내 긁힘으로부터 경추 단핵 세포를 분리하는 것입니다. 일단 분리된 이 세포는 여성 생식기에서 면역 세포의 표현형과 기능을 결정할 수 있는 유세포 분석을 포함한 여러 분석에 사용할 수 있습니다. 사이토 브러시 및 자궁경부 세척 샘플 채취는 산부인과 의사 또는 숙련된 의사가 수행해야 하는 비침습적 절차입니다.경추 질 세척은 먼저 자궁경부내경부를 두 개의 PBS로 세척한 다음 세척 후 후엽에서 채취합니다. 경추 스크레이퍼의 오목한 끝은 자궁 경부에 대고 회전하여 경추 개구부 또는 경추 OS를 샘플링합니다. 다음으로 cyto brush를 Endocervical OS에 삽입하고 360도 회전시킵니다.부드러운 압력을 사용하면 샘플의 혈액 오염을 방지하는 데 도움이 됩니다. 스크레이퍼의 사이토 브러시는 5mil의 PBS가 들어 있는 튜브에 수집됩니다. 얼음 위로 운반된 후, 샘플은 빠르게 소용돌이치며 사이토 브러시에서 세포를 분리시킵니다.시료를 매체로 세척한 후에는 100미크론 나일론 필터를 통해 여과합니다. 이를 통해 샘플에서 림프구, 단핵구 및 상피 세포를 수집할 수 있습니다. 이제 세포는 표면 단백질에 대한 항체로 염색할 준비가 되었으며, 일단 고정되면 유세포 분석기에서 실행할 수 있습니다.자궁경부에 존재하는 CD 4 및 CD 8 T 세포 집단의 표현형을 평가하기 위해 결과 데이터를 분석하는 방법을 보여드리겠습니다. 안녕하세요, 저는 Dr.Keith 민속 연구실의 박사 과정 학생입니다. 본 연구는 면역 활성화와 HIV 감수성 및 질병 진행 사이의 연관성에 초점을 맞추고 있습니다.현재 HIV 감염의 대다수가 이성관계를 통해 발생하기 때문에 우리는 여성 생식기로 HIV가 전염되는 것에 대한 보호의 상관관계를 결정하는 데에도 관심이 있습니다. 불행히도, 생식기에서 샘플을 채취하는 것은 매우 까다로울 뿐만 아니라 연구 참가자에게 상당히 침습적일 수 있습니다. CMC 또는 자궁경부 단핵 세포를 수집하기 위해 사이토 브러시를 사용하는 것은 생검과 같은 다른 프로토콜에 비해 더 빠르고 쉬운 방법입니다.이 동영상에서는 유세포 분석 또는 기타 다운스트림 응용 분야에서 사용하기 위해 CMC를 분리하고 준비하는 방법을 보여줍니다. 채취 후, 사이토 브러시와 스크레이퍼는 5mil의 차가운 PBS로 운반됩니다. 처리 시간까지 얼음 위에서 샘플을 운반하는 것이 중요하며, 이는 샘플

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

여기에서는 상피내 감마 델타 T 세포의 분석을 위해 인간 상경부 내 림프구를 얻기 위한 분리 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 자성 비드 또는 세포 분류에 의해 자궁경부 감마 델타 T 세포의 정제를 위해 확장될 수 있습니다.

인간의 자궁 경부 감마 델타 T 세포의 분리 및 유세포 분석

여기 분리 하 고 그들의 phenotypical 및 기능 특성의 평가 대 한 인간의 여성 재생산 지역에 다른 해 부 격실에서 수지상 세포를 정화 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다른 면역 세포 또는 다른 점 막 조직에서 수지상 세포를 분리 적용할 수 있습니다.

Phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립

종양 내 피 세포는 종양 microenvironment의 중요 한 결정 요인 및 질병의 과정. 여기, 인간 대 장 암 및 마약 테스트 및 병 인 연구에 사용 될 일반 콜론에서 순수 하 고 가능한 내 피 세포의 고립에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

정상적인 대 장 암과 대 장 암-향상 된 프로토콜에서 인간의 내 피 세포의 고립

이 프로토콜은 응용 프로그램 (예: immunocytochemistry, cytometry, 등)의 다양 한 사용 될 수 있는 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집한 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 메서드를 보여 줍니다 목표로 임신 합병증에 다른 세포 인구의 역할...

기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

여기 선물이 monocyte 하위 집합 전체 혈액 cytometry에 의해 특성화에 대 한 프로토콜. 이 하위 게이트 그들의 표현의 표면 마커를 평가 하는 방법을 설명 하 고 (염증 성) M1 및 M2 마커 (염증)의 식 평가의 예를 포함 됩니다.

전체 혈액에 의해 인간 Monocyte 하위 집합의 Flow Cytometry 분석

수다디형 두더지(Hydatidiform moles)는 어금니 게놈에 대한 부모의 기여와 형태학적 특징에 따라 분류될 수 있는 이기종 빈치학을 가진 비정상적인 인간 임신입니다. 여기서, 멀티플렉스 마이크로위성 DNA 의전성 및 포르말린 파라핀 내장 어금니 조직의 유동 세포분석프로토콜은 결과의 해석 및 통합과 함께 상세히 기술된다.

마이크로위성 DNA 게노티핑 및 유동 세포분석분석분석포르민고정파라핀내장화증모금조직

이것은 임신과 비 임신 마우스 둘 다에서 자궁 림프세포를 격리하는 방법입니다. 이 방법은 FACS phenotyping, 세포 선별, 기능 적 작용, RNA-seq 및 프로테오믹스와 같은 여러 다운스트림 응용 제품에 사용할 수 있습니다. 여기서 프로토콜은 혈류 세포측정에 의한 표현형 그룹 1 자궁선천성 림프구 세포를 전파한다.

유동 세포측정에 의한 분석을 위한 자궁 내 선천 림프구 세포의 격리

본 프로토콜은 단일 세포분석기로 인간 정자의 세포사멸, 미토콘드리아 막 전위 및 DNA 손상을 측정할 수 있는 실용적인 솔루션을 제공합니다.

인간 정자의 기능적 결함을 검출하기 위한 바이오마커의 유세포 분석

이 백서에서는 전혈에서 무세포 DNA 및 순환 종양 세포와 같은 물질을 쉽고 효율적으로 분리하고 수집하기 위한 자동화 장비의 적용에 대해 설명합니다.

임상 샘플에서 암 관련 물질의 자동 분리 및 수집

이 프로토콜은 인간 나팔관 상피 세포를 분리하기 위한 1일 방법을 설명합니다. 분리된 상피 세포는 2차원(2D) 배양으로 도말링하거나 단일 세포 현탁액으로 해리할 수 있으며 유세포 분석 및 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 포함한 다운스트림 실험에 활용할 수 있습니다.

단세포 분석을 위한 인간 나팔관 상피를 추출하는 효율적인 방법

배우세요 자궁경부 단핵세포 격리 및 유세포 분석 방법을. 사이토브러시 샘플링으로 여성 생식기 면역 세포를 비침습적으로 수집하여 면역 기능을 분석하는 기술입니다.

컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석

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