컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석

이 절차의 전반적인 목표는 사이토 브러시를 사용하여 자궁경부 내 긁힘으로부터 경추 단핵 세포를 분리하는 것입니다. 일단 분리된 이 세포는 여성 생식기에서 면역 세포의 표현형과 기능을 결정할 수 있는 유세포 분석을 포함한 여러 분석에 사용할 수 있습니다. 사이토 브러시 및 자궁경부 세척 샘플 채취는 산부인과 의사 또는 숙련된 의사가 수행해야 하는 비침습적 절차입니다.

경추 질 세척은 먼저 자궁경부내경부를 두 개의 PBS로 세척한 다음 세척 후 후엽에서 채취합니다. 경추 스크레이퍼의 오목한 끝은 자궁 경부에 대고 회전하여 경추 개구부 또는 경추 OS를 샘플링합니다. 다음으로 cyto brush를 Endocervical OS에 삽입하고 360도 회전시킵니다.

부드러운 압력을 사용하면 샘플의 혈액 오염을 방지하는 데 도움이 됩니다. 스크레이퍼의 사이토 브러시는 5mil의 PBS가 들어 있는 튜브에 수집됩니다. 얼음 위로 운반된 후, 샘플은 빠르게 소용돌이치며 사이토 브러시에서 세포를 분리시킵니다.

시료를 매체로 세척한 후에는 100미크론 나일론 필터를 통해 여과합니다. 이를 통해 샘플에서 림프구, 단핵구 및 상피 세포를 수집할 수 있습니다. 이제 세포는 표면 단백질에 대한 항체로 염색할 준비가 되었으며, 일단 고정되면 유세포 분석기에서 실행할 수 있습니다.

자궁경부에 존재하는 CD 4 및 CD 8 T 세포 집단의 표현형을 평가하기 위해 결과 데이터를 분석하는 방법을 보여드리겠습니다. 안녕하세요, 저는 Dr.Keith 민속 연구실의 박사 과정 학생입니다. 본 연구는 면역 활성화와 HIV 감수성 및 질병 진행 사이의 연관성에 초점을 맞추고 있습니다.

현재 HIV 감염의 대다수가 이성관계를 통해 발생하기 때문에 우리는 여성 생식기로 HIV가 전염되는 것에 대한 보호의 상관관계를 결정하는 데에도 관심이 있습니다. 불행히도, 생식기에서 샘플을 채취하는 것은 매우 까다로울 뿐만 아니라 연구 참가자에게 상당히 침습적일 수 있습니다. CMC 또는 자궁경부 단핵 세포를 수집하기 위해 사이토 브러시를 사용하는 것은 생검과 같은 다른 프로토콜에 비해 더 빠르고 쉬운 방법입니다.

이 동영상에서는 유세포 분석 또는 기타 다운스트림 응용 분야에서 사용하기 위해 CMC를 분리하고 준비하는 방법을 보여줍니다. 채취 후, 사이토 브러시와 스크레이퍼는 5mil의 차가운 PBS로 운반됩니다. 처리 시간까지 얼음 위에서 샘플을 운반하는 것이 중요하며, 이는 샘플 채취 후 2시간을 넘지 않아야 합니다.

이 시점에서 미량의 혈액으로 오염된 모든 샘플은 cyto brush에서 세포를 분리하기 위해 추가 분석에서 제외해야 합니다. 세포가 여전히 사이토 브러시와 스크레이퍼에 남아 있기 때문에 45초 동안 튜브를 높게 켜십시오. 수동으로 제거해야 합니다.

새 장갑을 끼고 사이토 브러시를 사용하여 스크레이퍼에 남아 있는 물질을 긁어냅니다. 표백제 용액에 버린 후 엄지와 검지를 사용하여 팔콘 튜브를 위아래로 짜서 사이토 브러시에 남아 있는 모든 세포를 제거합니다. 사이토 브러시를 버린 후 다른 샘플을 준비하기 전에 장갑을 교체하고 전사 피펫을 사용하여 PBS로 튜브 측면을 세척하여 모든 샘플이 수집되었는지 확인합니다.

100 미크론 나일론을 맞 춥니 다. 새 Falcon 튜브를 걸러내고 피펫을 사용하여 PBS 용액의 전체 부피를 걸러냅니다. FBS가 없는 RPMI 배지 5mil을 원래 튜브에 추가합니다.

피펫을 사용하여 튜브의 측면을 철저히 세척하여 부착된 점액이나 부스러기를 제거합니다. 그런 다음 필터를 통해 미디어를 전송합니다. 표백제에 버리기 전에 여과된 매체 중 일부를 사용하여 필터 바닥을 세척하십시오.

고립된 세포를 펠릿화하기 위해. 펠릿이 빠지는 것을 방지하기 위해 오후 1500시에 10분 동안 샘플을 원심분리하십시오. 세포가 유세포 분석에 사용될 경우 원심분리기 브레이크를 끄는 것을 잊지 마십시오.

비특이적 항체 결합을 방지하는 데 필요한 차단 용액을 준비합니다. 원심분리 단계에서는 샘플당 100마이크로리터의 차단 용액을 사용합니다. 차단 솔루션에는 93.2마이크로리터의 팩스, 세척 또는 PBS와 2%FBS, 5마이크로리터의 FBS 및 1.8마이크로리터의 마우스 IgG가 포함되어 있습니다.

스핀 후, 생존 가능한 세포가 있는 대부분의 샘플에는 눈에 보이는 펠릿이 있습니다. 어떤 경우에는 펠릿이 상당히 클 것입니다. 다른 샘플에서는 거의 보이지 않을 수 있습니다.

펠릿 크기가 항상 세포 수율과 관련이 있는 것은 아닙니다. 상층액이 상층액을 깎아내리지 않도록 주의깊게, 세포를 방해하지 않도록 하고, 부드러운 교반으로 펠릿을 재현탁시킵니다. 5mils의 PBS로 세포를 세척하고 1500에서 10분 동안 원심분리를 반복합니다.

RRP M을 분리하고 다시 한 번 상등액을 디캔팅하고 이전과 같이 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 이 시점에서 세포는 염색하기 전에 동결 보존되거나 표면 염색될 준비가 됩니다.형광 항체를 사용하면 초기 원심분리 중에 준비된 차단 용액으로 세포를 배양하여 비특이적 결합을 차단하는 것이 좋습니다. 세포 펠릿이 재현탁된 후 샘플에 100마이크로리터의 차단 용액을 추가하고 철저히 혼합합니다.

나머지 프로토콜 단계는 96웰 플레이트 또는 팩스 튜브에서 수행할 수 있습니다. CMC 펠릿의 크기에 따라 다릅니다. 차단 용액과 셀 혼합물을 팩스 튜브로 옮깁니다.

샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다. 10분 배양 동안 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하는 데 사용할 생존 염료를 준비합니다. 데이터 분석 중에 제조업체의 지시에 따라 생존도 염료를 준비하고 필요에 따라 적정 전합니다.

염료 혼합물을 사용할 준비가 될 때까지 염료 혼합물을 빛으로부터 덮어 두십시오. 10분 배양 후 500마이크로리터의 팩스로 세포를 세척하고 2% FBS로 세척 또는 PBS를 한 다음 1600RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 회전 후 팩스 튜브에서 상등액을 디캔팅합니다.

교반으로 세포를 다시 현탁시킵니다. 이제 이전에 준비된 생존력 염료를 적절한 부피로 추가합니다. 섭씨 4도에서 30분 동안 세포를 배양하고 은박지로 싸서 샘플이 빛으로부터 덮여 있는지 확인합니다.

이 배양 중에 세포를 라벨링하는 데 사용할 형광 항체의 마스터 믹스를 준비할 수 있습니다. CMC에 사용하기 전에 말초 혈액 조절 샘플에서 항체를 사전 적정하고 검증해야 합니다. 적정된 항체를 혼합하고 샘플당 100마이크로리터의 최종 부피를 만듭니다.

이 단계에서 팩스, 세척, 모든 항체를 빛으로부터 보호하십시오. 30분 배양 후 다시 한 번 500마이크로리터의 팩스로 샘플을 세척하고, 세척하고, 원심분리기, 디캔팅하고, 이전과 같이 세포를 재현탁합니다. 이제 이전 배양 중에 준비된 100마이크로리터의 항체 칵테일로 세포를 배양할 때입니다.

다시 한 번, 섭씨 4도에서 30분 동안 샘플을 배양하여 빛으로부터 보호되도록 합니다. 인큐베이팅 CMC는 이제 마지막으로 500마이크로리터의 PBS로 세척할 준비가 되었습니다. 1600 RPM에서 10분 동안 시료를 원심분리합니다.

디캔팅 및 리서스 후, 펠릿을 현탁액으로 1% 파라알데히드 용액에 750마이크로리터의 최종 부피로 희석합니다. 이를 해결하려면 유세포 분석기의 막힘을 방지하기 위해 이 큰 부피의 세포를 다시 현탁시키는 것이 중요합니다. 이 부피에서도 샘플 튜브가 상당히 흐린 것처럼 보일 수 있습니다.

세포가 유세포 분석기에서 획득될 때까지 섭씨 4도의 어두운 곳에 세포를 유지합니다. 사이토 브러시 샘플 외에도 우리는 일상적으로 자궁 경부와 질에서 2mil의 PBS 세척을 수집합니다. 이 샘플은 1400RPM에서 7분 동안 원심분리하여 세척에서 세포 파편을 제거합니다.

그런 다음 남은 상층액을 할당하고 섭씨 영하 80도에서 동결하여 향후 가용성 단백질 농도를 분석할 수 있습니다. 이 데이터는 유세포 분석으로 얻은 세포 표현형 데이터와 함께 사용할 때 특히 유용할 수 있습니다. CMC 샘플을 실행하기 전에.

스펙트럼 중첩을 조정하기 위해 비드 또는 단일 염색 셀을 사용하여 게이팅 런 보상 튜브를 지원하기 위해 PBMC 컨트롤을 준비하는 것이 도움이 됩니다. PBMC 샘플과 비교하여 모든 이벤트를 수집하기 위해 전체 CMC 튜브를 획득합니다. CMC는 높이 플롯에 비해 FSC 영역에서 더 많은 이중선을 나타내며 pbmC만큼 독특한 림프구 집단을 나타내지 않을 수 있습니다.

샘플을 획득한 후 FlowJo와 같은 프로그램에서 분석할 파일을 내보냅니다. 여기에서는 CMC 유래 CD 4 양성 T 세포 및 CD 8 양성 T 세포에 대한 일반적인 게이팅 전략의 주요 구성 요소를 보여줍니다. 샘플의 싱글릿에 대한 G에 대한 FSC 면적 대 높이 플롯을 사용합니다.

이 일치된 비교에서는 p BMC에 비해 CMC 샘플에서 증가된 doublet 수를 명확하게 확인할 수 있습니다. 다음으로, 형광 마커 또는 FSC 대 시간을 플로팅하는 것은 품질 관리 단계로 사용됩니다. 유속의 변경으로 인해 데이터에 아티팩트가 유입된 경우 이 단계에서 제거할 수 있습니다.

상단에서 고품질 샘플을 나타내는 시간 경과에 따른 일관된 형광 프로필을 볼 수 있습니다. 아래에서 다중 중단 및 유속이 있는 샘플을 볼 수 있으며, 이는 추가 분석에서 제외할 수 있습니다. CMC 샘플에서 림프구 집단을 식별하는 것은 어려울 수 있습니다.

A-P-B-M-C 컨트롤을 사용하면 보행 배치에 도움이 됩니다. 보시다시피, 일부 샘플은 큰 명확한 집단을 나타내는 반면 다른 표본은 림프구 집단이 부족합니다. 이러한 샘플은 전체적으로 제외되어야 합니다.

우리는 림프구 집단에 초점을 맞출 것입니다. 계통 마커의 발현이 부족한 세포에 게이팅을 통해 단핵구를 ging하는 것도 가능합니다. 수지상 세포와 CD 16 및 CD 11과 같은 단핵구 마커의 조합을 발현하는 세포를 식별할 수 있습니다. C. 생존력 마커 또는 염료의 포함은 신선한 세포에서도 CMC 분석에 매우 중요합니다.

보시다시피 대부분의 CMC 림프구는 생존 가능하지만 일부 샘플에는 분석에서 제외해야 하는 높은 빈도의 사멸 세포가 포함되어 있습니다. 죽은 세포는 비특이적으로 항체를 흡수하여 림프구 보행 내에서 데이터 분석을 혼란스럽게 할 수 있습니다. CD 3 염색은 견고해야 합니다.

CD 3개의 양성 T 세포의 비율은 PBMC 샘플보다 낮고 가변적이기 때문에 전체 CMC 샘플을 획득하고 수집된 이벤트 수를 최대화하는 것이 중요합니다. CD 4 양성 및 CD 8 양성 T 세포 집단은 TBMC 샘플에서와 마찬가지로 확인할 수 있습니다. 일부 CMC 샘플에서.

CD 4 대 CD 8 비율은 말초 혈액에서 관찰되는 것보다 낮으며 일부 개인은 큰 이중 음성 T 세포 집단을 나타냅니다. CD 4개의 양성 T 세포 집단과 CD 8개의 양성 T 세포 집단을 확인한 후, 수많은 표현형 마커의 발현을 정량화할 수 있습니다. CD 1 61 발현은 CMC에서 검출될 수 있지만, 혈액에서 뚜렷한 CD 1 61 밝은 집단은 생식기에는 없습니다.

마찬가지로, CD 69 및 H-L-A-D-R과 같은 활성화 마커와 CCR 5 및 PD 1과 같은 마커의 발현은 CMC 샘플 중에서 안정적으로 측정하고 정량화할 수 있습니다. 사이토 브러시 샘플을 사용하면 특히 감염성 질환의 맥락에서 점막 면역 세포의 표현형과 기능을 모두 특성화할 수 있습니다. 이를 통해 점막 및 생식 면역학을 조절하는 메커니즘에 대한 더 큰 통찰력을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 점막 백신 효능에 대한 새로운 측정 방법을 개발할 수 있는 기반을 제공합니다.