Name: 의 미세 주입을위한 방법 Patiria의 minata 접합자 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 배우세요 Patiria miniata 해별아 배아의 미세주입 기법으로 발달생물학 및 유전자 조절망 연구를 수행하는 방법을 익히세요. 이 프로토콜은 게임트 채취, 수정, 주입 단계를 포함합니다.

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수있는 한 15 ° C에서 모든 바다 물 또는 인공 해수 (SW), 성인 동물, 그리고 문화를 유지합니다. 확인 계란 접합자는 SW에 몰입 보관됩니다. 증류수 또는 역삼 투 물로 재구성 상업적으로 제조 된 바다 소금 SW의 소스로도 제공합니다. 비중계를 사용하여 염분을 확인하고 최적의 수준을 달성하기 위해 염 또는 물을 조정합니다. 1.020-1.025 사이의 비중 수준을 유지합니다. 모든 유리를 유지하고 plasticware에 화학 물질과 모든 오염을 방지하기 위해 모든 다른 실험 실용에서 분리합니다. 탈 물이나 물에 여러 번 세척 한 다음 묽은 차아 염소산 나트륨에 가끔 몸을 담근 채 수세에 의해 청소 배아 학년 실험 실용. Patiria의 miniata 성인에서 1 얻기 및 성숙 배우자 <ol><li> 생식선을 절제하는 동물을 선택합니다. 난소 또는 고환의 존재를보고 절제 후 섹스를 결정 P. 때문에 miniata는 자체 아니다xually 동종 이형. </li><li> 메스 블레이드 (그림 1A)와 바다 별 암의 측면을 따라 1cm보다 크지 않은 작은 구멍을, 잘라. 작은 무딘 종단 집게 다시 절개의 가장자리를 당겨 사용하면 생식선 조직에 액세스하여 절개를 통해 생식소 조직을 당겨. 참고 : 느슨한 회색 또는 갈색 조직 (그림 1B)는 장 조직을 철수하지 마십시오. 고환은 흰색 또는 베이지 색 동안과 모양 (그림 1D)에 우유 또는 흐린되기 위해 해수의 원인이됩니다 중단 할 때 난소, 일반적으로, 오렌지, 노란색, 또는 밝은 갈색 (그림 1C)입니다. </li><li> 수족관에 여성을 반환합니다. 산란을 유도 할 수 있습니다 처리에서 스트레스 때문에 SW의 용기에 한 두 시간에 대한 남성을 분리합니다. 동물 절개 사이트 함께 치유하고 몇 달 동안 배우자를 제공하기 위해 계속합니다. </li><li> 가능한 한 적은 SW와 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 고환을 수집하고 사용할 때까지 얼음에 저장합니다. 우리는 고환을 저장하지주까지 4 ° C에서 컬렉션의 날 에디션. </li><li> SW의 몇 밀리리터 작은 유리 배양 접시에서 난소를 수집합니다. 더 큰 조각이 남아 있지 않을 때까지 집게 이쌍과 조직을 떨어져 애타게, 난소 조직에서 난자를 해제합니다. 참고 : 최적, 난자의 대부분이 완전히 개발된다. 이러한 난자 (그림 2B), 갈색, 작은 낟알, 그리고 불투명 한 미개발 난자의 부분 집합에 비해, 큰 라운드와 난자 (그림 2A)에 뚜렷한 싹 소포 노란색 또는 밝은 갈색 분명하다. 난자보다 약 25 % 이상이 개발되지 않은 다양한 경우 난자를 얻기 위해 다른 여성을 선택합니다. </li><li> 200 μm의 기공 크기의 메쉬 필터 컵을 통해 난자와 나머지 조직을 붓고 흐름을 통해 수집합니다. 이 난자의 모든 종류를 포함하지만, 난소 조직을 제거합니다. w 분사하여 필터에 의해 잡힌 조직에서 남은 난자을 제거물총 병에서 i 번째 SW. 필터 컵은 50 ML 원뿔 튜브 (그림 3A-A &#39;)를 사용하여 만들어집니다. </li><li> 100 μm의 메쉬 필터 컵을 통해 단계 1.6을 통해 흐름을 따르십시오. 을 통해 흐름 작은 난자를 폐기하십시오. 필터에 남아있을 것입니다 성숙을위한 준비가 큰 완전히 개발 된 난자. 깨끗한 200 ㎖의 비이커에 난자를 씻어. </li><li> 난자의 200 ㎖의 유리 비커에 SW의 95 ML을 추가합니다. 10 μM의 최종 농도 200 μM 일 - methyladenine의 5 ML을 추가합니다. </li><li> 15 ° C에서 큰 얕은 배양 접시와 장소에 난자를 전송합니다. 대량 배양 접시에 고 표면적 산소 교환을 허용한다. 난자는 성숙하지 않거나 그들이이 성숙 단계에서 과밀 경우 잘 개발하지 않을 수 있습니다. 문화 미만 200 난자 / ㎖가 될 때까지 여러 SW의 요리 플러스 10 μM 일 - methlyadenine로 분할합니다. </li><li> F 난자이 될 수없는 난자를 렌더링으로 더 이상 45 ~ 90 분 동안 성숙하지만, 허용되지ertilized. 성숙이 완료되었는지 확인하려면 해부 범위에 난자를 봐주세요. 성숙 동안 세포막와 새싹 소포 향해 이동하고 퓨즈. 그런 다음 고장 때문에 더 이상 성숙 난자 (그림 2C)에서 볼 수 없습니다. </li></ol> 성숙한 난 모세포의 2 시비 <ol><li> SW의 약 1 ml의 작은 유리 배양 접시에서 고환 조직, 대략 완두콩 크기, 말하다의 작은 클러스터를 선택했다. </li><li> 성숙한 난자의 약 100 ml의 결과 우유 바다 물 2 ~ 3 방울을 전송하고 섞어 배양 접시를 소용돌이하는 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 고환 조직의 조각을 전송하지 마십시오. polyspermy 이후 가난한 개발에 위험이 있습니다 정자의 큰 수량을 추가하지 마십시오. </li><li> 몇 분 후 해부 범위에 난자를 관찰합니다. 수정란 또는 접합자는 CEL을 상승 명확한 거품이 풍부하게 봉투를 가지고리터 막 (그림 2D). 참고 : 가난한 수정률도 잘 개발하지 않을 수 있습니다 건강에 해로운 문화의 표시이기 때문에 계란의 적은 약 90 % 이상이 비옥 경우 문화를 진행하지 마십시오. </li><li> 수정이 완료되면, 100 μm의 메쉬 필터를 통해 쏟아져 신선한 SW와 배양 접시에 세척하여 접합자의 SW를 변경합니다. 이는 산소 고갈을 방지하기 위해 과량의 정자를 제거하는 것이 중요하다. 15 ~ 30 분 동안 15 ° C에서 배양 접시를 놓습니다. </li></ol> 3 디 - jellying 및 노 수정란 <ol><li> 60 X 15mm의 폴리스티렌 페트리 접시에서 뚜껑을 고려하여 사출 요리를 준비합니다. <ol><li> 마이크로 인젝션 현미경 시야 일치 주변 접시의 뒷면에 영구 마커 펜으로 선을 그린다. 이 모든 저었다 배아보기의 현미경 필드 내에 있는지 확인합니다. </li><li> 원 페이지를 통해 선을 점수 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여referably 원 (그림 3B)의 한면을 끕니다. 주사 바늘 (4.5 단계) 휴식 나중에 줄을 사용하십시오. 참고 : 시약은 일반적으로 성게 배아 예는, 프로타민 설페이트, 폴리-L 라이신이 불필요을 준수하는 데 사용됩니다. P. 드 - 젤리 miniata의 접합자는 코팅 플라스틱에 잘 붙어. 그들은 유리 접시에 잘 달라 붙지 않는 것이 있습니다. </li></ol></li><li> 표면이 포함되도록 각 접시에 약 10 ㎖의 SW를 추가,하지만이 저었다 배아를 교란 될 수 있으므로 물이 접시에 지나치게 튀하지 않습니다. </li><li> P. 제거 앞서 노에 산 SW와 miniata 접합자 젤리 코트. 이 젤리 코트 모델 성게 종에 대한 관찰 된 것보다 더 광범위하다. <ol><li> pH가 4.0-4.2의 범위에서 산 SW를 준비합니다. pH는 정상적인 발달을 허용하면서 젤리 코트를 효율적으로 제거 할 수하는 것이 중요합니다. </li><li> SW의 1 L의 재고로 SW에 1 N (1 M) HCl을 한 방울을 추가합니다. 각 드롭이 완전히 혼합 할 수 있도록 허용더 염산을 추가하기 전에 산도를 모니터링 할 수 있습니다. 주 : 해당 pH를 염산 결과 여러 mL에 하나는하지만, 한 번에 전체 볼륨을 추가하지 않습니다. 참고 : SW와 흄 후드에 1 N 염산을 준비하고 12 N (12 M) 염산. </li><li> 100 μm의 메쉬 필터에 그들을 부어 접합자에 SW를 제거합니다. (약 10 ㎖) SW의 가능한 가장 작은 양의 200 ㎖의 비이커로 헹군다. 산 SW (산도 4.0) 150 mL에 비커를 위로 채우고 접합자가 3 분 동안 산 SW에 앉아 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 이 200 ㎖의 비커 사이에 앞뒤로을 부어 접합자에서 젤리 코트를 벗겨, 200 μm의 메쉬 필터를 통해 접합체를 통과 할 때마다. 약 2 분 시간 창을 통해 5-10x 주변의 필터를 통해 접합자를 붓는다. </li><li> 100 μm의 메쉬 필터에 접합자를 부어 산 SW를 제거합니다. SW와 작은 유리 배양 접시에 접합자를 씻어. 드 - 젤리 접합자 플라스틱 접시에 충실 수 있습니다. 행 배아 즉시; 그들은 더 J를 생산하기 시작시간이 지남에 플라스틱 접시에 접착 불량에 이르게 엘리 코트. </li><li> 유리 배양 접시에서 접합자를 픽업하여 사출 요리에 직선로를 걸 입 피펫 (그림 3C-C &#39;)를 사용합니다. 유리 소프트 될 때까지 불꽃 위에 파스퇴르 피펫의 얇은 쪽의 중심 용융. 신속 유리의 매우 얇은 신축성을 생성 떨어져 유리의 단부를 당긴다. 유리가 냉각되면, (입 피펫 선박 등을 볼 준비에 대한 추가 정보가 들어 있습니다. 2,004 17 달콤한 등. 2,004 18) 파스퇴르 피펫의 작은 끝을 끊다. <ol><li> 오직 하나의 접합자는 입력 시간에 피펫을 종료되도록 직경이 배아의 직경보다 큰 것이 바로 잉 피펫 같은 확인. 이는 단일 행을 형성 할 수 있습니다. 작은 직경의 피펫은 시비 봉투를 제거하고 P.로 접합체를 방해 할 수 있습니다 miniata의 접합체는 유리 모양의 멤브레인이없는ND는 매우 부드럽고. </li><li> 접합자는 플라스틱 접시에 충실하지 않는 경우, 추가 시간이 산 SW에 (몇 분 이상까지)에 보관하십시오. 대안 적으로 작은 직경의 피펫 접합체보다 효과적으로 부착 할 수 있도록 젤리 코트를 제거하는데 도움을 수있다. </li><li> 접합자는 약간 긍정적 부력 플로트하거나 접시의 바닥 위에 올려 경향이있다. 접합자 부드럽게들이 피펫 (도 3d)를 종료로 접시의 표면에 압착되도록이 경우, 노 피펫 위치. 참고 :. 그것은이 요리에 많은 행에 맞게 허용된다 P. miniata 배아 멤브레인들은 시간이 지남에 따라 더욱 어려워 침투되지 않고, 따라서 하나 하나의 접시에 수백 접합체를 주입 할 수있다. </li></ol></li></ol> 접합자의 4 사출 <ol><li> 최종 진한 적절한 모르 폴리 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 농도 (MASO)의 mRNA 또는 DNA를 함께 주사 용액을 준비200 밀리미터의 KCl entration. 400 ~ 800 μM MASO 및 DNA의 2.5 NG / μL 독성을 최소화하면서 morphant 표현형을 생산하는 경향이있다. 계란의 최종 농도가 초기 농도의 14 번째 1/125 것이다. 5 분 동안 65 ° C에 MASOs, 열을 포함하는 주사액의 경우 사용 후 실온에서 보관 직전. <ol><li> 주입 된 배아를 정렬하기 쉽게, 0.1 %의 농도를 얻기 위해 주입 용액에 로다 민, 덱스 트란 트레이서를 추가한다. </li></ol></li><li> 제조업체의 지침에 따라 기기를 당겨 바늘에 유리 모세관 튜브 (1.0 mm (외경) x 0.75 mm의 ID, 100mm 길이)를 잡아 당겨 주사 바늘을 준비합니다. 성게 주입에 적합한 바늘은 바다 별 잘 작동, 그래서 유사한 매개 변수 19을 사용합니다. </li><li> microloader 피펫 팁을 사용하여 주사 바늘로 주입 액의 약 2 μl를로드합니다. </li><li> m에 바늘의 뭉툭한 끝을 삽입anipulator. 설정은 100msec 펄스 picospritzer 40 PSI의 공기압. </li><li> 현미경 무대에 저었다 배아의 접시를 놓고 시야에있는 모든 배아를 가지고있다. 득점 라인이 바늘에 가까운 측이되도록 배향 접시. 팁 라인의 중간 근처 단지 수면 위가되도록 약 60 ° 각도로 바늘을 배치. </li><li> 득점 라인에 초점을 맞 춥니 및 팁에 초점이 올 때까지 바늘을 낮 춥니 다. 좀 더 팁을 내리고 득점 라인의 능선으로 가볍게 실행하여 열려 휴식. 접시의 표면에서 팁을 올리고 접합체의 첫 번째 행의 상단으로 놓고 접합체에 초점. </li><li> 이 60 ° 각도 주위에서 들어오는 수정란의 중심을 찌르 것 있도록 팁을 낮 춥니 다. 바늘이 쉽게 침투 P. miniata의 접합체. 인제의 볼 루스를 도입 풋 페달 (또는 주사 바늘로부터 물질을 강제로 다른 수단)에 스텝배아에 ction의 솔루션입니다. </li><li> 20 ~ 30 % 태아의 직경, 또는 25 내지 80 PL 러스 조준. 루스이보다 크거나 작은 경우, picospritzer에 분사의 기간을 조정하고 다음 배아를 주입. 원하는 루스 크기를 얻기 위해 시간을 조정하는 것을 계속한다. 100 밀리 초 시간에 시작합니다. 200 밀리 초보다가 해당 러스 소개 필요한지 바늘을 다시 분해. 바늘을 버리고 미만이 15 ~ 20 밀리 바늘의 크기가 너무 큰 볼 루스로서이 크기를 얻기 위해 필요하며 정상적인 발달을 방해 할 수있는 경우 새로 제조. </li><li> 사출 접시에 남아있는 배아에 주입 진행합니다. 배아 쉽게 절단이 시작 될 때까지 첫째 절단 후 단일 Blastomeres을 주입 할 수 있습니다. 주기적 바늘에 붙어 접합체를 제거 물의 표면 위 바늘 리프트. 필요한 바늘의 끝 부분을 다시 - 휴식이나 막힘이 발생하면 새 바늘을로드합니다. </li></ol><ol><li> 배아 SW에 15 ° C에서 개발을 허용합니다. 산소의 교환을 허용하도록 배양 부피에 큰 표면적을 유지한다. 배아 혼잡되지 않도록; 또는 200 배아 / ㎖ 이하 문화를 유지한다. 배아의 원하는 단계에 따라 약 20 ~ 24 시간 포스트 수정에 주입 된 배아를 수집 할 계획입니다. 참고 :이 종종 정렬하고 일반적으로 개발 배아 쉽게 형태 학적으로 구별되지만, 아직 수영하지 않기 때문에 수집 할 수있는 이상적인 시간이다. </li><li> 배아가 부화하면 부드럽게 수영을 방지하기 위해 충격을 소금. 부드럽게 SW 소용돌이 치는 동안 주입 접시에 SW 10 ㎖에 5 M의 NaCl 200 μl를 추가합니다. 몇 분 후, 배아 접시의 바닥에 떨어질 것이다. 이러한를 수집하고 정상적인 염분 SW로 이동합니다. </li><li> injecti 사용 트레이서와 호환 적절한 형광 광원 하에서 주입 배아 모아서솔루션에. 더 추적을 사용하지 않은 경우, 정렬 배아 일반적인 형태에 대한 선택합니다. </li><li> 입 피펫을 사용하여, SW 사용하여 최소한의 배아를 형광 그릴 SW 가득 작은 배양 접시에 그들을 날려. 이상적인 입 피펫은 배아를 손상시키지 않고 및 철수하지만, 바람직하지 않은 배아와 관계없는 SW도 뽑아 아르 너무 크지 될 때까지 충분히 큰 구멍을 가지고있다. </li><li> 일단 원하는 배아의 모든 새 접시에 수집 된 형광 조명 아래 배아를 관찰하고 해제 주입 배아 또는 가난하게 개발 된 배아를 제거합니다. </li><li> 문화 인큐베이터에서 원하는 단계까지 배아를 정렬 및 이미징 또는 다른 원하는 프로토콜을 진행합니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌은 저자에 의해 선언하지 않습니다.

이 기술의 초보 사용자 어렵지만 성공적으로 morphant 배아를 만들기위한 필수적인 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 성숙하고 적절하게 비옥 것이다 건강한 난자를​​ 선택하는 것입니다. 배양 정상적인 발달의 비율이 계절에 따라, 동물의 건강과 난자들이 단일 개별에서 수확 된 횟수. 난 모세포 월 ~ 10 년 4 ~ 더 나은 품질의 경향이있다. 그것은 대부분의 그림 2A보다는 그림 2B처럼 수 있도록 진행하기 전에 난자을주의 깊게 보는 것이 중요하다. 그것은 그들이 난자가 처리 될 때 필터링하기에 충분히 작은 경우 특히 성숙되지 모세포의 수가 적은하도록 허용된다. 때때로, 미개발 난자의 성숙을위한 준비가 완벽하게 개발 된 난자만큼이나 크다. 그들은 그들의 거친 갈색 colorin의 구별하여g (그림 2E). 여과 미개발 난자에서 완전히 개발 된 난 모세포를 분리하지 않을 것이며 그들은 종종 그림 5에서 볼 수있는 결함을 나타낼...

(일반적으로 박쥐 스타로 알려진) 바다 스타, Patiria miniata는 6-8 진화 4,5 발달 세포 1 세의 다양한, 그리고 생태 학적 연구 9 11에 대한 재미 있고 다양한 모델 시스템으로 부상하고있다. 성인 P. miniata 바하 캘리포니아 12 싯카, 알래스카의 태평양 해안을 따라 분포하고 쉽게 해양 수족관에서 유지됩니다. 난 모세포를 얻을 연중 각 여성 수십 계란의 수천을 흘리다 수 있습니다. 난 모세포 쉽게 성숙 외부 13 기름지게한다. 생성 된 배아는 쉽게 관찰을 가능하게 투명; 그들은 기적으로 개발하고, 개발을 위해 만들어진 프로그램 만 바다 물을 필요로합니다. 전체 게놈 조립 및 여러 transcriptomes도 P. 사용할 수 있습니다 miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). 이러한 장점은 연구의 범위에 이상적및 교육 목적. 최근, P. miniata 발달 유전자 규제 네트워크에 대한 모델 시스템은 14 - 16를 분석되고있다. 이러한 연구의 목표는 조절 유전자의 전체 칭찬을 식별하고 그들의 상호 작용 네트워크를 결정하는 것이다. 이 작업의 대부분은 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 체외 합성의 mRNA의 도입을 통해 섭동 유전자 발현을 수반한다. 또한, 규제 시스 분석 규제 DNA (15)의 기능을 특성화하는 데 사용된다. 이러한 분석은 교란 시약 및 / 또는 DNA 기자 배아에 구축의 도입이 필요합니다. 또한, 이들 섭동의 하류 효과를 특성화하기 위해, 하나의 잠재적 인 표적 유전자 발현의 변화를 위해 많은 배아 세이한다. 접합자의 수백의 미세 주입하는 기술이 작업 중심입니다. P. 포함 극피 동물, miniata </엠&gt;, 성적 성숙에 도달하기 위해 몇 달이 필요합니다. 이 때문에 개발 및 실험에 대한 이들 동물의 유전자 변형 라인을 유지하는 것은 일반적으로 실용적이지 않다. 따라서, 유전자 변형 성인의 번식을 효율적으로 배아를 수정 만들 수 없습니다. 대신, 교란은 미세 주입을 통해 새로이 발생해야합니다. 미세 주입 세포 투과하지 않은 약으로 배아를 수정할 수있는 기회를 제공합니다. 다음 프로토콜은 한 2 ~ 3 시간이 미세 주입을 통해 앉아 수정란의 수백 DNA, mRNA의 세포 추적자, 및 모르 폴리 노의 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 소개하는 방법을 설명합니다. 이 포함 하류 다양한 실험에 충분한 재료를 생산하고 있지만, 현장 하이브리드, RNA-SEQ, 서부 모래 바닥에, qPCR에 바, 이에 한정되지는 않는다.

<table><tbody><tr><td>1-메틸아데닌</td><td>아크로스 유기물(Fisher Scientific)</td><td>AC20131-1000</td><td></td></tr><tr><td>190미크론 니텍스 나일론 필터</td><td>소형 부품(원래 Sefar)</td><td>CMN-0185-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>100미크론 니텍스 나일론 필터</td><td>소형 부품(원래 Sefar)</td><td>CMN-0105-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 페트리 접시, 60mm x 15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>모세관 튜브</td><td>FHC, Inc</td><td>30-30-0</td><td>미세 주입 바늘</td></tr><tr><td>모델 P-97 바늘 풀러</td><td>셔터 악기</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Rhodamine Green</td><td>Life Technologies</td><td>D7163</td><td>GFP 발현 리포터를 주입하는 경우, 텍사스 레드 덱스트란을 주입 추적기로 대체하는 것이 도움이 됩니다</td></tr><tr><td>인스턴트 오션 씨 솔</td>트 <td>닥터 포스터 앤 스미스</td><td>CD-116528</td><td>많은 애완동물 가게에서도 구매 가능</td></tr><tr><td>: Microloader 팁</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr></tbody></table>

의 미세 주입을위한 방법 patiria의 minata 접합자

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

극피 동물은 긴 유전자 조절 및 개발 프로세스의 진화의 연구를 위해 최근 재생 및 개발 연구에 좋아하는 모델 시스템되어하고있다. 바다 스타, Patiria miniata는 이전에 성게, Strongylocentrotus의 purpuratus 및 Lytechinus의 variegatus에 거의 독점적으로 수행 된 이러한 유형의 연구를위한 모델 시스템으로 유행을 얻고있다. 이러한 모델 시스템의 장점은 어떤 특정 유전자, 또는 하향 조절 최대 인 셀 그룹 라벨링, 또는 리포터 유전자 도입 배아 변경됨 제조 용이성이다. 단일 마이크로 인젝션 법은 변형 된 배아의 다양한을 생성 할 수있다. 여기서는 P.에서 생식 세포를 얻기위한 방법을 제시 miniata,이 배아를 생산하고, 미세 주입을 통해가 혼란 시약을 도입. 건강 morphant 배아는 이후 GE의 양적 및 질적 연구에 고립 아르네브라스카 기능. 이 유기체의 게놈 및 사체 데이터의 가용성을 수행하고이를 실행의 용이성되는 연구의 종류가 증가하고있다.

이 프로토콜의 목적은 배아에 시약을 소개하는 것입니다. 우리는 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현을 구동하는 DNA 리포터 구조체를 주입하여 프로토콜의 효과를 보여준다. DNA가 초기 절단시 통합으로 주입 된 배아는 클론 패치 (그림 4A-B)에서 GFP를 표현한다. 배아에 도입하는 것이 바람직하다 많은 시약은 높은 수량 및 배아의 최적 배치에 독성이다. 개발 지연 수정란 단계 초기 절단 또는에서 발전을 체포하여 독성 매니페스트 또는 비정상적인 개발 (그림 5A-C)를 부과하여. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig1highres.jpg" width="500"> P.에서 그림 1 얻기 배우자 miniata</...

morphant 배아를 생성하는 방법은 발달 메커니즘과 유전자 규제 네트워크를 연구하는 것이 필수적이다. 바다 스타 Patiria miniata는 이러한 연구에 대한 새로운 모델 시스템입니다. 여기서 우리는 배아의 문화를, 배우자를 얻기 생산을위한 프로토콜,이 종 접합자의 빠른 미세 주입을 제시한다.

의 미세 주입을위한 방법 Patiria의 minata 접합자

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

이 절차의 전반적인 목표는 미세 주입을 통해 침투 시약으로 Piter Miata 배아를 변형하는 것입니다. 이것은 먼저 성인 동물에서 배우자를 수집하고 성숙시킴으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 성숙한 난모세포를 수정시키는 것입니다.세 번째 단계는 접합자를 제거하고 주사 접시에 일렬로 놓는 것입니다. 마지막 단계는 접합자에 원하는 교란 시약을 주입하는 것이며, 궁극적으로 GFP Reporter와 같은 외부 시약은 주입된 배아의 형광 이미징을 통해 볼 수 있습니다. 마이크로 주입 방법, 특히 3차원 공간에서 바늘의 방향을 잡는 방법과 올바른 크기의 볼루스를 난자에 주입하는 방법을 배우기가 어렵기 때문에 이 기술을 시각적으로 시연하는 것이 정말 중요합니다.그래서 오늘 이 기술을 시연할 사람은 제 연구실의 대학원생인 Elise tla가 할 것입니다. 동물 컬렉션으로 시작하십시오. 섹스는 배우자를 절제하여 수행됩니다.P Miata와 마찬가지로 불가사리는 성적으로 이형성되지 않습니다. 생식선을 제거하려면 칼날을 사용하여 팔 측면을 따라 1cm 이하의 작은 구멍을 자릅니다. 뭉툭한 끝 집게를 사용하여 가장자리를 뒤로 당길 수 있습니다.느슨한 회색, 갈색의 장 조직을 제거하지 마십시오. 난소는 주황색에서 밝습니다. 갈색. 물 몇 밀리리터와 함께 작은 유리 접시에 모으십시오.이 연조직을 떼어내면 안에 있는 세포가 방출됩니다. cyte가 제대로 성숙하는지 확인하기 위해 cyte의 품질을 확인하십시오. 그런 다음 난모세포를 걸러냅니다.난소 조직과 작은 미성숙 난모세포를 제거하려면 바닷물에 200마이크로몰 5밀리리터, 메틸 레인 100밀리리터를 넣고 난모세포가 섭씨 15도에서 45-90분 동안 용액에서 성숙하도록 합니다.SA 품질은 배양이 적절하게 성숙하고, 비옥해지고, 발달할 것인지 여부를 결정하는 데 중요합니다. 대부분의 달걀이 크고 갈색이며 투명하고 노란색이거나 밝은 갈색이고 착색된 계란 배치만 사용하십시오. 대부분의 배아가 작은 배아 배치는 폐기합니다.갈색 또는 녹색의 고환은 흰색 또는 베이지색이며 방해를 받으면 물을 흐리게 합니다. 가능한 한 적은 바닷물이 담긴 1.5ml 튜브에 고환을 모아 얼음 위에 보관하십시오. 바닷물 1밀리리터에 완두콩 크기의 고환 조직 덩어리를 다지는 것으로 시작합니다.생성된 유백색 바닷물 2-3방울을 배양 접시에 있는 100ml의 성숙한 난모세포로 옮깁니다. 이 비율은 다발성 정자를 예방해야 합니다. 티슈 조각을 옮기지 마십시오.믹스를 GAMT로 소용돌이치세요. 몇 분 후 해부 현미경으로 수정란을 GAMT를 확인합니다. 난자 주위에 투명한 거품처럼 보이는 수정 봉투가 있어야 합니다.수정이 확인되면 먼저 100미크론 필터 컵에 접합자를 모은 다음 필터에서 씻어내어 깨끗한 바닷물이 담긴 깨끗한 접시에 담아 물을 변경합니다. 이제 접합자를 섭씨 15도에서 15분 동안 옮깁니다. 준비 과정에서 일반 염산 1개를 적방울로 첨가하여 바닷물을 약 4의 pH로 산성화합니다.pH를 모니터링하고 추가하기 전에 각 방울을 완전히 혼합하십시오. 다음. 또한 개구부가 있는 입 피펫이 필요합니다.45도 각도로 움푹 들어간 곳이있는 하나의 접합자의 지름보다 약간 큽니다. 이제 접합자를 젤리로 만들어 플라스틱 접시에 잘 붙을 수 있습니다. 젤리 코드는 성게보다 더 광범위하지만 산성 바닷물로 제거할 수 있습니다.먼저 100미크론 메쉬로 물에서 접합자를 걸러냅니다. 그런 다음 최소한의 바닷물로 200ml 비커로 옮깁니다. 그런 다음 산성화된 바닷물 150ml를 비커에 넣고 3분 동안 그대로 두십시오.4분과 5분에 산성화된 바닷물과 함께 200미크론 그물망을 통해 접합자를 부어 젤리 코팅을 벗겨냅니다. 이 과정을 5회에서 10회 정도 반복한다. 5분이 지난 후.100미크론 메쉬에서 증서 접합자를 수집합니다. 그런 다음 일반 바닷물과 함께 작은 유리 접시에 헹굽니다. 접시에 넣으면 더 많은 젤리를 생산하기 전에 즉시 접합자를 탔습니다.구강 피펫의 흡인을 사용하여 접합자를 처리합니다. 유리 접시에서 준비된 플라스틱 주입 플레이트로 옮깁니다. 접합자는 약간 부력이 있습니다.접합자가 배출될 때 표면에 부드럽게 눌러지도록 피펫을 배치합니다. 각진 끝은 이 과정에 도움이 됩니다. 접합자가 플라스틱 접시에 달라붙지 않으면 몇 분 동안 산성 바닷물에 다시 옮기고 다시 시도하십시오.Unstuck zygotes는 원하는 만큼 많은 접합자를 주입할 수 없습니다. 관통력은 시간이 지나도 변하지 않습니다. 메이크업에 관계없이 모든 주사 용액을 200 밀리 몰 염화칼륨으로 준비하십시오.Morpho oligonucleotide는 400-800 마이크로 몰이어야하며 DNA는 400-800 마이크로 몰이어야하며 DNA는 morph ano oligonucleotides가 포함 된 헤티 주입 용액을 마이크로 리터 당 약 2.5 나노 그램으로 사용하기 직전 5 분 동안 섭씨 65 도에 첨가해야하며, 나중에 시각화하기 위해 주입 용액에 0.1 %Rod domine DExT strand tracer를 추가합니다. 주사 바늘은 마이크로 로더 피펫을 통해 1-2마이크로리터의 주입 용액이 적재된 1mm 외경, 3/4mm 내경 유리 모세관에서 뽑을 수 있습니다. 그런 다음 매니퓰레이터에 부착하십시오.제곱인치당 100파운드에서 40밀리초 펄스로 설정된 피코 스프리처로 배출을 제어합니다. 풋 페달을 사용하여 배출 각도를 트리거하고 피펫을 접시 표면에 대해 약 60도에서 트리거합니다. 접시의 선으로 튀어나온 플라스틱에 팁을 부드럽게 밀어 넣어 팁을 부수십시오.그런 다음 계란에 정렬하십시오. 바늘은 접합자를 쉽게 관통해야 합니다. 첫 번째 주입을 기준으로 볼루스를 배출합니다.방출 시간을 조정하여 볼루스가 평균 접합자 직경의 약 20-30%가 되도록 합니다. 원하는 볼루스에 도달할 때까지 지속 시간을 계속 조정하십시오. 그런 다음 타이밍 설정을 그대로 둡니다.바늘이 막히면 바늘을 다시 부러뜨리십시오. 그런 다음 100밀리초 펄스로 돌아가 볼루스를 다시 조정합니다. 적절한 볼루스를 얻기 위해 주입 시간이 200밀리초 이상인 경우 바늘을 다시 부러뜨립니다.주입 시간이 20밀리초 이하여야 하는 경우 바늘을 교체하십시오. 접합자가 바늘에 걸렸을 경우, 물에서 바늘을 제거하여 제거한다. 첫 번째 분열 전에 주입을 완료하십시오.그렇지 않으면 배아의 일부만 교란 시약의 영향을 받습니다. 일단 분열이 시작되면, 단일 신성모독자를 주입할 수 있는데, 이는 기술된 기술을 사용하는 일부 실험 라인에 이상적일 수 있다. GFP를 발현하는 DNA 리포터 구조물을 배아 불가사리에 주입했습니다.주입된 배아는 예상대로 요약 시약이 과다 주입될 때 배아에 독성이 있는 것으로 추정되는 구성물 발현의 클론 패치를 보여주었습니다. 여기서, 과도하게 주입된 배아는 하나의 세포 단계에서 멈췄습니다. 다른 경우에는 주입된 물질이 비대칭 조기 분열과 같은 비정상적인 분열을 초래했습니다.독성은 비정상적인 발달에서도 나타날 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 viter mini 외부 접합자를 배양하고 마이크로 주입하는 방법을 정말 잘 이해하게 될 것입니다. 다양한 다운스트림 실험을 수행하기 위해 배아를 모핑합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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트렌스 제닉 모기를 구하는 A. aegypti의 태아의 Microinjection

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의 미세 주입을위한 방법 Patiria의 minata 접합자

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