Name: 골수 세포 역학의 실시간 영상 APC 최소 / + 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: 학습하세요 Apc Min/+ 췌장 종양에서 골수 세포 역학을 실시간으로 시각화하는 방법을. 회전 디스크 공초점 현미경을 활용하여 면역세포와 종양 미세환경의 상호작용을 연구할 수 있습니다.

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우리는 APC 최소 / + 마우스의 유전자형에 대한 잉 유에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 INSERM에서 자금과 국립 보건원에서 보조금 (CA057621 및 AI053194)에 의해 지원되었다.

주 : 모든 동물 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC), UCSF의 승인 절차에 따라 수행 하였다. 모든 촬상 실험 비 생존 절차이었고 동물은 화상 획득의 종료 후 즉시 안락사시켰다. 마우스의 1 세대 참고 : APC 유전자에 돌연변이를 들고 APC 최소 / + 마우스는, 자발적으로 소장에서 50 ~ 100 선종을 개발한다. <ol><li> 크로스 APC 최소 골수 세포를 감지하는 C-FMS 프로모터에서 EGFP을 표현하는 C-FMS-EGFP 라인 ACTB-ECFP의 액틴 프로모터에서 ECFP을 표현 라인, 또한과 / + 마우스. ACTB-ECFP 및 C-FMS-EGFP 이형 동물 형광을 감지하는 데 사용됩니다. </li><li> 이미지를 명확하게 검출 선종에 연령 3 ~ 4 개월에 마우스를 사용합니다. </li></ol> M의 2 준비수술 전에 aterials 참고 : 현미경 셋업의 세부 이전 된 6,7 설명했다. <ol><li> 현미경 <ol><li> 가열 담요를 켭니다. 488 nm의 여기 및 고체 405 nm의, 561 nm의 및 640 nm의 레이저에 대한 아르곤 레이저를 켭니다. 현미경의 전원을 켜고 회전 디스크 제어 장치, AOTF, 레이저 제어 장치, 카메라 컨트롤러. </li><li> LED가 빨간색으로 바뀌 현미경 셔터를 엽니 다. 컴퓨터와 카메라 소프트웨어를 켭니다. </li></ol></li><li> 이미징 플랫폼 <ol><li> 무대 인서트가 깨끗한 지 확인합니다. 그렇지 않으면, 비누와 물로 후 건조 깨끗. </li><li> 이 커버 슬립을 가지고 삽입물을 확보하기 위해 실험실 테이프를 사용합니다. 무대에서 삽입을 놓고 알코올 와이프로 청소. </li><li> 실험실 테이프를 이용하여, 상기 스테이지의 오른쪽으로 가열 블랭킷 첨부. </li><li> 코 콘에 고무 다이아 프램의 무결성을 확인하고 necessar하면 변경y를 입력합니다. 위치 및 거즈 랩 테이프를 사용하여 동물에 이소 플루 란 마취 전달을위한 코 콘을 수정합니다. </li></ol></li><li> 이소 플루 란 마취 시스템 <ol><li> 이소 플루 란 탱크를 채우십시오. </li><li> 진공 켜고 / 분 1.2 L로 조정합니다. </li><li> 분무기에 증류수를 추가하고 이소 플루 란 시스템에 분무기를 연결합니다. </li><li> 산소 분석기를 켜고 이소 플루 란 시스템에 연결합니다. 산소 탱크의 전원을 켜고 산소 분석기는 100 %가 표시되는지 확인합니다. / 분 0.2 L에 O이 흐름을 조정합니다. </li><li> 질소 탱크를 켜고 / 분 0.8 L의 흐름을 조정합니다. 산소 분석기는 21 %가 표시되는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 수술 도구 및 플랫폼의 준비 <ol><li> 비누와 물로 해부 집게와 가위의 청소 2 쌍. </li><li> 뜨거운 비드 살균기를 켜고는 250 ° C에 도달 할 수 있습니다. 30 초 동안 수술 도구를 소독. 이를 식혀 보자. </li><li> 수술 벤치에 실험실 담그는 배치. </li><li> 수술 플랫폼으로 스티로폼 뚜껑을 사용합니다. 실험실 술고래의 조각으로 커버. 마우스를 면도 후 변경 실험실 술고래의 두 번째 조각을 준비한다. </li><li> 덮여 스티로폼 뚜껑에 마취 라인 코 콘을 배치하고 일부 테이프 (안 실험실 담그는)에 스티로폼 뚜껑에 부착 장소에 보관하는 코 콘의 양쪽에 두 개의 바늘을 사용합니다. </li><li> betadine, 알코올 잎사귀, 멸균 거즈, 슈퍼 접착제, 현미경 슬라이드, 전기 면도기, 및 실험실 테이프 4 개를 조립합니다. </li></ol></li></ol> 주사의 3 준비 <ol><li> 후드에서 인슐린 주사기 준비 (28 G X ½)에 2,000 kDa의 로다 민 - 덱스 트란 (4 ㎎ / ㎖ 100 ㎕ 스톡의 AF647 - 복합 LY-6G (GR1) 항체 (1 ㎎ / ㎖)의 7 μL로 ) 복고풍 궤도 주입. 이 동물에서 개발 빈혈 꼬리 정맥 difficu를 만드는 것이므로 레트로 궤도 주사 APC 최소 / + 생쥐에서 권장지금이 피부를 통해 검색 할 수 있습니다. </li><li> 대장의 연동 운동을 저해 이미징 전에 1 ㎎ / ㎏ 피하 (SC)에 150 ㎕의 PBS에 희석 아트로핀 주사 초 인슐린 주사기를 준비합니다. </li></ol> 이미지에 대한 소장의 4 준비 <ol><li> 유도 챔버로 마취 회선이 오픈하고, 수술 테이블과 현미경에 라인이 닫혀 있는지 확인합니다. </li><li> 마취 챔버에 동물을 전송합니다. 마취 챔버를 닫고 (21 % O 2) 4 %로 이소 플루 란을 켭니다. </li><li> 마우스 깊이 천천히 (5-6 분 후) 통기성이 때, 그 측면에 수술 스테이지로 전송하고 GR1 항체 용액 및 / 또는 덱스 트란 용액 레트로 궤도 상을 주사. </li><li> 수술 플랫폼에 연결된 마취 라인을 엽니 다. 마취 실에 줄을 닫고 마취 콘에서 코와의 뒷면에 마우스를 넣어. </li><li> 이소 플루 란을 줄4 %에서 2.5 %로 농도. </li><li> 마우스가 아니라 그것의 발바닥을 곤란하게하고 각막 반사를 테스트하여 마취되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마취 동안 건조 함을 방지하기 위해 눈에 안과 윤활 연고를 추가합니다. </li><li> 실험실 테이프를 추가하여 수술 단계로 마우스의 사지를 고정합니다. </li><li> 전기 면도기를 사용하여 복부 표면에서 머리를 제거합니다. 또한 인수하기 전에 산소 측정기의 위치를​​ 왼쪽 뒷다리에서 머리를 제거합니다. 수술 단계에서 실험실 담그는를 제거하고 머리의 오염을 방지하기 위해 깨끗한 하나를 교체합니다. </li><li> 알코올 잎사귀와 betadine와 복부 표면을 소독. </li><li> 마우스의 한 측면에서 SC (3.2) 아트로핀 용액을 주입한다. </li><li> 피부를 통해 1cm 복부 정중선을 절개하여 가위에 의한 복막 및​​ 포셉 한 쌍을 확인합니다. 조심스럽게 소장의 3-4센티미터을 끌어와 이미지에 하나 또는 여러 개의 종양을 식별합니다. </li><li> 유리 MICR을 가지고oscope 슬라이드와 위치를 상단에 종양 그것에 소장의 루프. </li><li> 슬라이드에 부착하는 소장을 따라 몇 위치에 어떤 슈퍼 접착제를 추가합니다. 접착제가 마를 때까지 한 분을 기다립니다. 공 초점과의 현지화를 촉진하기 위해 종양을 가리키는 슬라이드에 선을 그릴 수있는 마커를 사용합니다. </li></ol> (5) 위치 결정 스테이지에서 마우스 및 준비 이미지 획득을위한 <ol><li> 사지에서 랩 테이프를 제거합니다. </li><li> 현미경 단계에 마취 라인을 열고 수술 플랫폼을 닫습니다. </li><li> 아래로 복부 측면과 코 콘에서 코와 현미경 단계로 조심스럽게 마우스를 전송합니다. 일부 실험실 테이프로 마취 라인을 고정합니다. </li><li> 재 위치 커버 미끄러 창 중 하나의 중앙 부위를 위하여 마우스 및 / 또는 슬라이드. 조심스럽게 실험실 테이프로 슬라이드 아래로 테이프. </li><li> 마우스의 왼쪽 사지에 산소 농도계 프로브를 연결합니다그 마음과 호흡과 산소 포화도 수준을 따릅니다. </li><li> 저체온증을 피하기 위해 가열 블랭킷와 마우스를 포함한다. </li><li> 이미징 1.5 %로 2.5 %에서 이소 플루 란 농도를 낮 춥니 다. </li></ol> μManager 소프트웨어를 사용하여 이미지의 6 취득 <ol><li> 구성 설정에 이미지 품질을 개선하기 위해 2500 rpm으로 CSUX 속도를 증가시킨다. </li><li> 10X 0.5 NA 또는 20X 0.75 NA Fluar 렌즈 목표를 선택하는 목적 드롭 다운 메뉴를 사용합니다. </li><li> 색상 드롭 다운 메뉴에서 레이저 405 nm의를 선택합니다. </li><li> 라이브 클릭하고 현미경으로 초점을 조절합니다. </li><li> 자동 화상 극단적 화소 값에 기초하여 표시 화상의 최대 및 최소 픽셀 강도를 조정하는 자동 클릭. 디스플레이 이미지의 픽셀 세기의 히스토그램은 메인 윈도우의 하단의 그래프로 표시됩니다. </li><li> 에서 파이퍼 제어판 창에서 카메라 노출을 조정시계의 수를 (하나의 시계가 33.333 밀리 초입니다) 변경. </li><li> 신호가 낮은 노출 너무 밝은 경우, 현미경 제어부를 이용하여, 레이저 강도를 감소시킨다. </li><li> 488 nm의, 561 nm에서 640 nm의 레이저 라인에 대한 신호 강도를 확인합니다. 레이저 자체의 제어 유닛 (488 nm 내지 561 nm의) 또는 현미경 제어부와 레이저 강도를 조정한다. </li><li> 멀티 D 획득 창에서, 시점 박스에 체크 및 시점의 개수 및 원하는 시간 간격을 입력하세요. </li><li> , Z-스택 상자를 선택하십시오 &quot;상대 Z&quot;를 선택하고 현재 위치에 Z 스타트 및 Z 엔드 기준을 정의합니다. 참고 : 10 배 또는 20 배 목표를 들어, 떨어져 각각 3 Z 평면, 8 μm의 4 μm의 시작합니다. </li><li> 여러 위치 이미징의 복수 위치 (XY) 상자에 체크 표시를 한 후, 편집 위치 목록을 클릭 4-6 다른 위치를 표시합니다. </li><li> 채널 상자를 선택하고 새로운에서 채널을 추가하고 레이저에게 드롭 다운 메뉴와 일반에서 라인을 선택(33.333 밀리의 배수로) 각 채널에 대한 노출에 전자. </li><li> &quot;멀티 D 획득&quot;창에서 이미지를 저장을 선택합니다. </li><li> 폴더를 선택하고 획득 된 모든 이미지는 자동으로 주어진 이름 접두사와이 폴더에 저장됩니다. 참고 : 각 연속 수집은 각 시점에서 각 색상의 각 Z 슬라이스에 대한 개별 TIFF 파일과 같은 별도의 하위 폴더에 저장됩니다. </li><li> 멀티 D 취득 창에서 설정 저장을 클릭하여 모든 설정을 저장합니다. </li><li> 획득을 시작하기 위해 다차원 취득 창에 취득 클릭합니다. </li><li> 산소 농도계 프로브를 사용하지 않는 또는 잘 작동하지 않는 경우 (맥박이 안정 또는 검색 할 하드가 아닌 경우), 발바닥을 곤란하게하고 각막 반사를 확인하여 마취의 효율성에게 이미징 절차를 수행하는 동안 매 15 분을 확인합니다. 마우스가 이러한 자극에 반응하는 경우 마취를 조정합니다. </li><li> 인수 후, 이소 플루 란 concent를 증가시켜 마우스를 안락사5 % 배급. 더 호흡 운동이 검출 없으면, 무대에서 마우스를 제거하고 자궁 전위를 수행합니다. </li></ol> Imaris 소프트웨어를 사용하여 이미지의 7 분석 <ol><li> 변환 파일 (보충 그림 1A)를 .ims합니다 <ol><li> 카메라 소프트웨어를 열고 파일 다음 배치 변환기를 클릭합니다. </li><li> 클릭 파일을 추가하고 첫 번째 위치의 첫 번째 파일을 선택합니다. 각 위치에 대해 반복합니다. </li><li> 업로드 된 각 파일에 대해 설정을 클릭하고 Z-스택에 대한 시간 채널에 대해, &quot;C&quot;와 &quot;Z&quot;에 대한 설정 &quot;t&quot;는 그 순서대로 표시되는지 확인합니다. </li><li> 원하는 폴더에 저장합니다. 검색 및 변환으로 새 파일을 만듭니다. </li><li> 모든 설정을 클릭하고 시작합니다. </li></ol></li><li> 조정 (보충 그림 1B) <ol><li> 특정 변환 된 폴더로 이동하여 첫번째 파일을 엽니 다. </li><li> 디스플레이 조정 창에서 배경을 조정필요한 경우, 각 채널에 대한 최소 수를 수정하여 신호 차단. </li><li> 필요한 경우, 최대 개수 (하부 최대 값이 클수록 신호의 강도)을 변경하여 상기 신호 강도를 조절한다. 참고 : 신호 강도 / 콘트라스트 조정이 더 좋은 시각화를하기 위해 휴대 행동이나 구획의 하이라이트 수 있습니다. 이 결과 자체를 변경하지 않습니다. </li><li> 편집 및 이미지 속성을 클릭합니다. </li><li> x, y 및 z의 값을 변경 (10X 대물, X 및 Y = 0.712, Z = 8 μM를 들어, 20X 대물 렌즈의 경우 : X 및 Y = 0.36, Z = 4 μM). </li><li> 시점을 조정하는 모든 등거리을 클릭합니다. 시작 날짜를 추가하고 인수의 시간을 시작합니다. 종료 날짜를 추가하고 수집 (보충 그림 1C)의 종료 시간. </li><li> 영화를 감상하려면 재생 버튼을 클릭합니다. </li><li> 편집을 클릭하고 흐린 이미지를 삭제하는 시점을 삭제합니다. </li><li> 두 개의 분리 된 인수의 도게에 가입하려면거기는 한 영화로, 첫 번째 영화의 마지막 시점에 가서 편집 클릭&gt; 두번째 파일을 추가하는 데 시간이 포인트를 추가합니다. </li></ol></li><li> 동영상으로 저장 (보충 그림 1D) <ol><li> 녹음을 클릭 .MOV 확장과 공의 압축 요소를 선택합니다. </li><li> 저장을 클릭합니다. </li></ol></li></ol>

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본 논문에서는 상세한 프로토콜은 창자의 장막 측에서 몇 군데 살아있는 동물에서 몇 시간 동안 장내 종양에서 골수 세포 역학의 디스크 공 촛점 이미징 회전에 설명되어 있습니다. 염증을 방지하기 위해 최적의 생리 학적 조건을 가지고, 소장의 이미지는 그대로 기관에서 수행해야합니다. 광이 도달하기 전에 상피 평활근 같은 상이한 조직 층을 통과해야하기 때문에, 소장의 장막 측으로부터 촬상는 도전적이다. 말라가 매우 평활근 세포에 의해 표현되기 때문에 상피 세포에 초점을 맞춘 것은 특히 액틴 ECFP 기자 쥐, 일부 지역에서는 어려울 수 있습니다. 두 개의 광자 공 초점 현미경은 현미경에 비해 깊은 조직 관통하는 이점을 갖고 있지만, 우리는 회전 디스크 공 초점 현미경은 장내 상피 구조의 좋은 시각화를 획득하기에 충분히 강력하다 것을 알았다. 장점 오F 회전 디스크 현미경 공 초점 해상도 저하없이 매우 빠른 수집 및 고유 감도 능력을 포함한다. 이러한 특성은 몇몇 시점 인해 움직임 아...

절대적인 증거 해주기 섬유 아세포, 내피 세포, 면역 및 염증 세포, 세포 외 기질, 및 가용성 인자를 포함한 이종 세포 집단 이루어진 종양 미세 환경은, 거의 모든 기여함으로써 개시 및 고형 종양의 진행에 중요한 역할을한다는 것을 보여 암 하나의 특징. 사실상, 종양 진행 중에, 악성 종양이 유리한 미세 환경을 생성하도록 형질 전환 된 진화 암세포 및 간질 세포 간의 일정한 동적 상호 작용이있다. 종양 미세 환경에 침투 면역 세포 중 골수 세포는 세 가장 풍부하다. (TAM) 종양 관련 대 식세포로 구성된 골수 유래 억제 세포 (MDSCs), 수지상 세포 (DC) 및 호중구 (백혈구), 골수 세포는 골수에서 모집하고 점진적으로 사이토 카인, 성장 인자 및 단백질 분해 효소 방출, 종양에 침투 홍보 할 수 있습니다종양의 성장 및 4를 확산. 암 세포와 골수 세포 사이의 크로스 토크는 복잡하지만 동적이다. 따라서, 상호 작용의 성질에 대한 이해는 이들 세포 대신 항 종양 면역 반응에 참여하는 암의 진행을 촉진 결정하는 중요한 이유이며, 그것을 제어하기위한 새로운 타겟을 찾는 데 도움이 될 수있다. 의 intravital 현미경으로 직접 관찰은 살아있는 쥐 5의 조직 내에서 세포 역학에 대한 정보를 제공합니다. 이 4 색은, 다중 영역은 마이크로 렌즈 효과 회전 디스크 촛점 시스템은 유방 종양 6 내의 간질 세포를 연구하기 위해 디자인되었다. 이 방법은 장기의 연속 영상을 구현하고 모션 아티팩트를 최소화하기 위해 (a) 급 이미지 획득, (b) 장기 마취, (c) 상이한 세포 유형을 따르는 네 가지 색상 취득, (D), 형광 표지 등의 여러 장점을 포함 다른 종양 구성 요소 및 다른 종양 미세 환경의 재치 (E) 관찰같은 마우스를 힌 것은 마우스 변동성 7-9로 마우스를 방지 할 수 있습니다. 이러한 기술을 통해 다른 세포 행동은 종양의 진보적 인 단계를 표시하는 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터 중심 폴리오 중간 T 종양 유전자 (PyMT) 모델에서보고되었다. (Foxp3의 EGFP 형질 전환 유전자에 의해 시각 Tregs) 혈관에 근접 우선적으로 마이그레이션 규제 T 림프구 수지상 (의 CD11c-DTR-EGFP), 암 관련 섬유 아세포 (Fsp1 + / +-EGFP) 및 골수 세포 (C-FMS 반면, -EGFP)은 종양 덩어리 내에보다 종양 주변부에서 높은 운동성을 나타낸다. 급성 전신 저산소증의 상태에서 세포는 다른 마이그레이션 : Tregs는 6 계속 이동 골수 세포는 대조적으로 마이그레이션 중지합니다. 또한, 동일 마우스 모델에서, 종양은 단계와 그 독소루비신 감도 변화를 도시 한 약물 분포를 약물 반응, 및 독소루비신 관련된치료는 종양 세포의 골수 CCR2 의존적 채용 리드. 따라서, 라이브 영상도 현장에서 약물 반응에 대한 통찰력과 chemoresistance 10, 11의 생물학을 높일 수 있습니다. 선종 성 용종증 대장균 (APC) 유전자 돌연변이는 일반적으로 인간의 대장 선종 및 암 (12)과 대장 암 (13)에 대한 매우 높은 위험을 수여 가족 성 선종 성 용종증 (FAP)에있는 APC 유전자 결과의 단일 사본의 돌연변이에서 발생합니다. 마우스 변형 APC 최소 / +는 APC 유전자의 코돈 850의 절단 돌연변이를 수행하고 자발적으로 모든 소장 14 ~ 16에 걸쳐 여러 장 선종을 개발하고 있습니다. 복강을 여는 부위에 액세스하기위한 필요가 있기 때문에 소장의 장기의 intravital 이미징 때문에 절차의 침습성의 도전이다. 단기 라이브 영상 성udies는 이전에 건강한 장 (17, 18)에 간행되었지만, 장내 종양의 장기 직접 관찰은보고되지 않았습니다. 수술 이전 화상 유방 종양 6,10 사용의 intravital 스피닝 디스크 현미경 시스템을 사용하여 설계 및 소장의 장막면을 통해 종양 시각화 정제되었다. 이 논문에서, 프로토콜은 하나의 APC 최소 / + 마우스를 사용하여 소장 종양 내 골수 세포의 행동을 수행 할 수 있다는 설명한다.

<table><tbody><tr><td>ApcMin/+ 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>ACTB-ECFP 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>3773</td><td></td></tr><tr><td>cfms-EGFP 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated</td><td>Invitrogen</td><td>D7139</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>29450</td><td></td></tr><tr><td>질소</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>산소</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>UCSF 세포 배양 시설</td><td></td><td></td></tr><tr><td>식염수 완충액</td><td>UCSF 세포 배양 시설</td><td></td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 Ly-6G (GR1) 항체 AF647</td><td>UCSF 단클론 항체 코어</td><td></td><td>재고 1 mg/ml. 7 &mu에서 사용; g/마우스</td></tr><tr><td>아트로핀</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td>1mg/kg 마우스</td></tr><tr><td>알코올 물티슈</td><td>Becton Dickinson</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>28G x 1/2인치 인슐린 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>329465</td><td></td></tr><tr><td>레뮴 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td>24x50-1</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>열 담요</td><td>Gaymar에서 사용 산업</td><td></td><td></td></tr><tr><td>핫 비드 살균기</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td>사용 30 분 전 켜기</td></tr><tr><td>코튼 팁 애플리케이터 6 인치</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72310-10</td><td></td></tr><tr><td>마취 시스템</td><td>Summit 마취 지원</td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Zeiss Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>스테이지 인서트</td><td>적용된 Sientific Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ox 산소 농도계, 소프트웨어 및 센서</td><td>Starr Life Sciences</td><td>MouseOx</td><td></td></tr><tr><td>Nebulizer</td><td>Summit 마취 지원</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&mu; 관리자</td><td>Vale lab, UCSF</td><td></td><td>오픈 소스 소프트웨어</td></tr><tr><td>ICCD 카메라</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR-Mega-10EX S-30</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk confocal sacan-head</td><td>Yokogawa</td><td>Corporation CSU-10b</td><td></td></tr></tbody></table>

골수 세포 역학의 실시간 영상 apc 최소 / + 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

골수 세포는 종양 내에서 가장 풍부한 면역 세포이며 종양 진행을 촉진하는 것으로 나타났다. 현대의 intravital 이미징 기술은 기관 내부의 살아있는 세포 행동의 관찰을 가능하게되지만, 소장으로 인한 장기 및 종양 접근성 일부 암에서 문제가 될 수 있습니다. 장내 종양의 직접적인 관찰은 이전에보고되지 않았습니다. 여기에 설명 된 수술은 형질 전환 형광 기자 마우스와 주사 추적자 또는 항체를 사용하여 살아있는 생쥐의 장내 종양 내에서 골수 세포 역학의 직접 관찰 할 수 있습니다. 이를 위해, 신속한 화상 취득 장기 연속 촬상을 허용 4 색 멀티 영역, 마이크로 렌즈 효과 스피닝 디스크 공 촛점 현미경을 사용하고있다. 교차 소장의 여러 선종 개발 APC 최소 / + 마우스 골수 세포를 시각화하는 C-FMS-EGFP 마우스와 ACTB-ECFP 마우스와 함께지하실의 장 상피 세포를 시각화합니다. 이러한 혈관 및 호중구 및 장막 표면을 통해 이미징 종양을 위치시키기위한 절차와 다른 종양 성분을 라벨링하는 절차도 설명된다. 영상의 몇 시간에서 컴파일 시간 경과 영화는 장 미세 환경에서 현장에서 골수 세포 행동의 분석을 할 수 있습니다.

ACTB-ECFP; APC 최소 / +의 소장에서 회전 디스크 초점 현미경, 비 종양 및 종양 조직을 이용하여 C-FMS-ECFP 마우스는 장막 표면에서 시각화 될 수있다. 촬영 후, 카메라 소프트웨어 분석 및 수집 (보충 그림 1)을 조정하는 데 사용됩니다. 형광 2,000 kDa의 덱스 트란 - 로다의 정맥 주입 및 LY-6G 항체 컨쥬 게이트 647, 후 혈관과 백혈구가 각각 (도 1)을 검출 할 수있다. 림프 조직의 집계하고 골수 세포의 전체를 쉽게 볼 수 있습니다 Peyer의 패치 (그림 1A). 소장의 지하실은 혈관 및 골수 세포 (도 1A 및 1B)에 의해 둘러싸여있다. 종양 조직 혈관 종종 더 많은 골수 세포 침투 및 소낭의 구조 w 이하엘 종양의 크기에 따라 <...

형질전환 리포터 마우스와 주사 가능한 형광 라벨을 사용함으로써, 장기 생체 내 회전 디스크 컨포칼 현미경 검사는 ApcMin/+ 대장암 모델에서 장 선종에 대한 골수성 세포 거동을 직접 시각화할 수 있습니다.

골수 세포 역학의 실시간 영상 APC 최소 / + 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 동물의 장 종양 내에서 골수성 세포 역학을 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 PC min 마우스에 형광 분자와 아트로핀을 주입하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 장을 이미징을 준비하고 마우스를 현미경 스테이지에 배치합니다.마지막 단계에서는 살아있는 동물 내의 종양 이미지를 획득하여 최종적으로 회전 디스크 컨포칼을 만듭니다. 현미경 검사는 몇 시간 동안 살아있는 PC min 마우스의 종양 내 골수성 세포의 거동을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 대장암에서 인간 세포의 역할은 무엇입니까?먼저 실험실 테이프를 사용하여 현미경 이미징 플랫폼의 스테이지 인서트에 두 개의 커버 슬립을 고정합니다. 그런 다음 인서트를 무대에 놓고 알코올 물티슈로 닦습니다. 그런 다음 핫 비드 살균기를 섭씨 250도로 돌린 다음 도구가 냉각되는 동안 30초 동안 수술 기구를 살균합니다.이 스티로폼 뚜껑을 수술대에 있는 두 개의 실험실 담그는 도구 사이에 놓습니다. 그런 다음 쥐가 깊고 천천히 숨을 쉴 때 동물을 옆구리와 후안와에 있는 수술 무대에 놓습니다. DExT strand, rod Domine 및 GR one 항체 용액을 주입합니다.주사 후 마취 원뿔에 코를 대고 마우스를 등을 대고 전기 면도기를 사용하여 동물의 복부 표면과 왼쪽 뒷다리의 털을 제거합니다. 털이 제거되면 모발 오염을 방지하기 위해 수술 단계에 새 실험실 담그는 도구를 놓은 다음 알코올 물티슈와 베타딘으로 동물의 복부 표면을 소독합니다. 다음으로, 아트로핀 용액을 마우스의 한쪽 측면에 주입한 다음 가위와 집게를 사용하여 피부와 복막을 통해 1cm 복부 정중선을 절개합니다.3-4cm의 장을 조심스럽게 뽑아내고 하나 또는 여러 개의 종양을 식별하여 영상화합니다. 그런 다음 관심 종양이 포함된 장의 루프를 유리 현미경 슬롯 위에 놓습니다. 접착제가 1분 동안 건조된 후 장을 따라 슈퍼 접착제 몇 방울을 떨어뜨려 슬라이드에 부착하고, 마커를 사용하여 종양을 가리키는 슬라이드에 선을 그려 이미징 중 종양의 국소화를 용이하게 합니다.이제 마우스를 현미경 스테이지로 조심스럽게 옮깁니다.tage 배쪽이 아래를 향하고 코가 콧방울 안에 있습니다. 실험실 테이프로 마취 라인을 고정한 다음 장이 덮개 미끄러진 창문 중 하나의 중앙에 있도록 설정을 재배치합니다. 슬라이드를 부드럽게 테이프로 감고 산소 농도계 프로브를 마우스의 왼쪽 팔다리에 부착하여 심장 박동수와 호흡수, 동맥 산소 포화도 수준을 따릅니다.그런 다음 저체온증을 피하고 이미징을 위한 ISO 불소 농도를 낮추기 위해 가열 담요로 마우스를 덮습니다. 마지막으로 다차원 수집 창에서 획득을 클릭하여 획득을 시작합니다. 획득이 완료되면 Mars 소프트웨어를 사용하여 동영상을 기록하고 저장합니다.스피닝 디스크 컨포칼 현미경, 비종양 및 종양 조직을 사용합니다. PC의 소장에서는 형광 덱스트란 로딘과 림프구 항원 6 복합 유전자좌 G6 47 접합 항체, 혈관 및 다형성 핵 세포를 각각 정맥 주사 한 후 혈청 표면에서 마우스를 시각화 할 수 있습니다. 림프 조직의 집합체이며 골수성 세포로 가득 찬 PI 패치도 쉽게 관찰할 수 있습니다.소장의 크립스(Crips)는 혈관과 골수성 세포로 둘러싸여 있습니다. 종양 조직은 종종 더 혈관화되고 골수성 세포에 의해 더 많이 침투하며, 종양의 크기에 따라 크립스의 구조가 덜 잘 조직되어 있습니다. 평활근층에 의한 actin ECFP의 발현은 이 이미지에서 관찰할 수 있듯이 때때로 장 상피의 날카로운 초점을 달성하기 어렵게 만들 수 있으며, 이 영화에서 볼 수 있듯이 종양의 골수성 세포 역학을 몇 시간 동안 실시간으로 추적할 수 있는 반면, G one 양성 호중구는 혈관을 순환하며 조직을 순회합니다.다른 골수성 세포(대부분 대식세포)는 크립스를 둘러싸고 있으며 양상이 적습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 살아있는 동물의 장 종양 내에서 골수성 세포 역학을 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 GFP 형질 전환 말라리아 기생충이 장기 내에 기생충의 이동성과 혈액 흐름의 부량를 사용하여 비장의 intravital 현미경을 수행하는 방법을 보여줍니다.

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

이 비디오는 인간 폐 종양 절편 내에서 형광 결합 항체로 표지된 상주 종양 침투 CD8 T 세포의 이미징을 설명합니다. 이 기술을 사용하면 컨포칼 현미경을 사용하여 CD8 T 세포 이동을 실시간으로 분석할 수 있습니다.

컨포칼 현미경을 사용한 다양한 종양 영역에서의 상주 T 세포 이동에 대한 실시간 분석

적응 면역은 T 세포와 항원 제시 세포 사이에 형성된 역동적인 '면역학적 시냅스'에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜은 연구가 부족한 생리학적 APC이자 새로운 유형의 '평면 세포 APC 모델'로서 내피 세포를 조사하는 방법을 설명합니다.

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는​​ 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

신속 하 고 높은 해상도 허용 하는 고급 현미경, 고립 된 플라즈마 멤브레인와 주변 세포내 볼륨의 이미지를 제시 한다. 회전 디스크 및 총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 한 설정의 통합 3.5까지 높은 수집 속도에서 라이브 이미징 실험을 허용 이미지 스택 당 s.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

여기에서 우리는 살아있는 세포 회전 디스크 공초점 현미경 검사법 및 MATLAB 기지를 둔 심상 처리를 사용하여 prometaphase에서 동기화된 세포에 있는 microtubule 역학 분석의 강력하고 상세한 방법을 제시합니다.

단극성 미토틱 스핀들에서 디스크 현미경 검사법에 의한 미세소관 역학 측정

우리는 쥐 췌장의 세포 내 해상도 이미징을 위한 안정화된 유치 광학 창의 외과적 이식을 위한 프로토콜을 제시하여 건강한 췌장과 병든 췌장에 대한 연속 및 종단 연구를 가능하게 합니다.

쥐 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창

이 프로토콜은 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 생체 내 이미징을 단순화하는 새로운 도구를 제공합니다.

도립 컨포칼 현미경에서 상피 조직 역학의 장기 모니터링을 위한 간소화된 생체 내 이미징 접근 방식

본 논문은 회전 원반 공초점 현미경을 사용하여 망막에서 미세아교세포 운동성과 시냅스 후 눈점과의 접촉을 시각화하고 정량화하는 방법을 시연합니다.

병든 쥐 망막에서 미세아교세포 역학과 시냅스와의 상호작용에 대한 실시간 영상 및 특성 분석

학습하세요 Apc Min/+ 췌장 종양에서 골수 세포 역학을 실시간으로 시각화하는 방법을. 회전 디스크 공초점 현미경을 활용하여 면역세포와 종양 미세환경의 상호작용을 연구할 수 있습니다.

골수 세포 역학의 실시간 영상 APC^{최소 / +} 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

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