생성 엔테로 박터 SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

다음 실험의 전반적인 목표는 포도당이 보충된 최소 염 배지에서 자라는 야생형 박테리아 균주의 TRO를 생산하는 것입니다. 이것은 transpo zone을 야생형 숙주 균주로 변환하여 삽입물에 무작위 전치를 가진 박테리아의 칸나 마이신 내성 집단을 얻음으로써 달성됩니다. 다음 형질전환체는 복제 도금에 의해 스크리닝되며, 이는 풍부한 배지에서 성장하지만 포도당이 보충된 배지인 최소 염에서 성장하지 못하는 TRO를 식별합니다.

다음으로 유전체학적으로, 돌연변이의 DNA는 절단된 유전자의 분절에 의해 양쪽 끝에 있는 트랜스포손을 포함하는 플라스미드를 얻기 위해 소화, 결찰 및 대장균으로 형질전환됩니다. DNA 염기서열분석 및 기본적인 국소 정렬 검색 도구 분석을 기반으로 중단된 유전자의 추정 동일성을 보여주는 결과를 얻습니다. 이 기술에 사용된 트랜스포손은 복제 기원, 카나마이신 저항성 유전자 및 모자이크 말단을 가지고 있습니다.

를 위해 단백질 바인딩을 전치합니다. 그것은 단백질 유전자를 전치하지 않기 때문에 우리는 transposon DNA 파편을 가진 이 전치 유전자를 추가해야 하고, 그 후에 transpos DNA와 단백질 사이 복합물은 숙주로 전기학공됩니다. electroporation의 주요 이점은 transduction 또는 conjugation를 위한 필요의 삭제입니다.

전치(transpose) 유전자가 없으면 일반적으로 안정적인 삽입물이 생성되며, 복제 기원(replication origin)과 CIN 저항성 유전자(CIN resistance gene)가 있으면 돌연변이된 유전자를 쉽게 식별할 수 있으며, 이 유전자는 재조합 플라스미드(recombinant plasmid)로 회수됩니다. 이 방법은 아미노산, 핵산 및 비타민의 생합성에 필요한 유전자를 식별하는 것과 같은 미생물 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저는 엔테로박터 종인 YSU에서 금속 저항성 유전자를 검색하던 중 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸고, 엔테로박터 종의 하룻밤 배양을 사용하여 유능한 세포를 전기천공하는 방법을 개발 중이던 미생물 생리학 실험실에 이를 통합하기로 결정했습니다.

YSU는 새로운 LB 배지에 1-20 희석액을 준비하고 섭씨 30도 및 120RPM에서 0.4-0.6 사이의 OD 600으로 배양합니다. 세포가 적당한 조밀도를 도달할 때, 5분 동안 얼음에 그(것)들을 차갑게 한 후에 4 섭씨 온도와 7, 5 분 동안 000 GS에 원심분리하십시오. 상층액을 버리고 같은 양의 얼음물을 Resus에 사용합니다.

세포 원심분리기를 섭씨 4도, 7, 5분 동안 000G로 중단합니다. 세척을 반복한 후 상등액을 버리고 얼음 냉수로 세포 펠릿의 부피와 동일한 부피로 세포를 현탁시킵니다. 다음으로, 0.5마이크로리터의 트랜스포 영역을 40마이크로리터의 세포에 추가합니다.

그런 다음 세포 transpo zone 혼합물을 얼음처럼 차가운 electroporation 수의사에 넣고 혼합물을 Q Vet의 바닥에 두드려 25 마이크로 phs, 200 옴 및 2.5 킬로 볼트에서 세포를 충격을 가합니다. 세포를 멸균 1.5ml 마이크로 퍼지 튜브로 옮기기 전에 위아래로 피펫팅하여 혼합된 960마이크로리터의 필터 멸균 SOC 매체를 즉시 추가합니다. 섭씨 30도 및 120rpm에서 45-60분 동안 세포를 배양합니다.

그런 다음 LB 캔 한천 플레이트에 100마이크로리터의 세포를 펴고 섭씨 30도에서 밤새 플레이트를 그리드 형질전환체로 배양합니다. 빈 100 x 15mm 페트리 접시의 뚜껑에 그리드를 테이프로 붙입니다. LB 캔 한천 플레이트의 바닥에 선을 긋고 작은 테이프 조각을 사용하여 격자 뚜껑에 고정하여 멸균 이쑤시개로 오거를 통해 그리드가 보이도록 합니다.

단일 변환자를 선택하여 그리드의 사각형 중앙에서 찾은 다음 인접한 사각형에서 다른 변환자를 찾은 다음 플레이트가 가득 찰 때까지 계속합니다. 그런 다음 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다. 이것은 그리드가 있는 각 플레이트에 대한 마스터 플레이트입니다.

1부터 3까지 번호가 매겨진 세 개의 새 오거 플레이트를 쌓습니다. LB의 1번은 M의 2번, 9번은 캔입니다. 그리고 LB의 세 번째는 사용하기 전에 섭씨 37도에서 밤새 접시를 거꾸로 건조시킬 수 있습니다.

앞에서 설명한 것처럼 각 플레이트의 상단에 선을 그린 후 70% 에탄올을 사용하여 복제 도금 도구를 닦고 그 위에 멸균 벨틴 사각형을 놓고 벨틴 사각형을 고정합니다. 다음으로, 마스터 플레이트의 선을 클램프에 그려진 선에 정렬하고 플레이트를 veltin 사각형 위에 놓습니다. 부드러운 압력을 가하여 박테리아를 플레이트에서 veltin square로 옮깁니다.

그런 다음 플레이트 번호 1에 그려진 선을 클램프의 선과 정렬하고 veltin 사각형 위에 놓습니다. 부드러운 압력을 가하여 박테리아를 veltin square에서 플레이트로 옮깁니다. 플레이트 번호 1을 제거합니다.

벨벳 틴 스퀘어를 물 비커에 버리고 복제 도금 도구에 깨끗하고 멸균 벨벳 스퀘어를 놓습니다. 이전과 마찬가지로 플레이트 번호 1의 선을 클램프의 선과 정렬하고 새 벨벳 사각형 위에 놓습니다. 박테리아를 1번 플레이트에서 벨벳 사각형으로 옮기기 위해 부드러운 압력을 가합니다.

1번 플레이트를 제거하고 2번 플레이트에 그려진 선을 클램프의 선과 정렬하고 벨벳 사각형 위에 놓습니다. 부드러운 압력을 가하여 벨벳 틴 스퀘어에서 플레이트 2로 박테리아를 옮기고, 플레이트 3에 대한 과정을 반복한 후 플레이트 2를 제거하고, 플레이트를 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다. 두 LB 캔 플레이트에서 자라지만 M 9 플레이트에서 성장하지 못하는 콜로니는 trove로 간주됩니다.

1번 플레이트에서 TRO를 선택하고 새 LB 캔 플레이트에 줄무늬를 그립니다. 하룻밤 동안 배양한 후, 줄무늬 플레이트에서 3개의 콜로니를 선택하고 다음날 새로운 LB 캔 플레이트에 줄무늬를 만듭니다. 새로 줄무늬가 있는 플레이트의 콜로니를 LB 캔 그리드 플레이트에 배치하고 이 플레이트를 사용하여 방금 시연한 대로 복제 도금을 반복합니다.

유전자 구출을 수행합니다. 고립된 돌연변이 군체를 사용하여 3밀리리터 파운드를 성장시킵니다. 섭씨 30도에서 하룻밤 배양 할 수 있습니다.

그런 다음 시판되는 게놈 DNA 정제 키트를 사용하여 얼음에서 20 마이크로 리터 반응에서 0.025 단위의 BFUC 1 제한 엔도뉴클레아제 1 밀리리터에서 1 마이크로 그램의 게놈 DNA 1 마이크로 그램 14 마이크로 리터로 DNA를 정제합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 25분 동안 반응을 배양한 후 20분 동안 섭씨 80도로 옮깁니다. 효소를 비활성화하려면 0.8% AROS 겔에서 부분적으로 소화된 DNA의 3마이크로리터를 분석합니다.

다음으로, 500 마이크로리터 반응에서 부분적으로 분해된 게놈 DNA 15 마이크로리터에 800 단위의 T 4 DNA 리가아제를 첨가하고 다음 날 밤새 섭씨 4도에서 반응을 배양합니다. pH 5.5 3 몰 아세트산 나트륨 50 밀리리터와 95 % 에탄올 1 밀리리터를 첨가하여 20 분 동안 섭씨 20 도에서 배양하여 결찰 DNA를 침전시킵니다. DNA를 섭씨 4도, 13도, 500G에서 10분 동안 마이크로 퍼지합니다.

펠릿을 세척하기 위해 7 개의 70 % 에탄올을 쏟아 붓습니다. 원심 진공 농축기에서 건조시키고 10마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 사용합니다. DNA를 재현탁시키려면 4마이크로리터의 재현탁 DNA를 사용하여 전기천공법, 대장균 균주, ECD 100 DPIR 또는 ECD 100 DPIR 16을 단일 콜로니로 5ml의 LB 캔 배지에 접종합니다.

하룻밤 동안 섭씨 37도, 120RPM으로 성장시킵니다. 전체 배양액에서 DNA를 정제한 다음 날, Joe one을 사용하여 14마이크로리터의 플라스미드를 분해합니다. 0.8% 아가로 겔에서 10마이크로리터의 소화되지 않은 플라스미드와 소화된 플라스미드를 분석합니다.

염기서열 분석 후 서열 5 프라임 GA, G-A-C-A-G 3 프라임에 대한 플라스미드 검색은 전치의 마지막 7개 염기쌍이며 중단된 유전자에 대한 서열이 뒤따를 것입니다. blast를 사용하여 중단된 유전자의 가능한 기능을 확인합니다. 성공적인 electroporation은 이 그림에 있는 삽입에 적어도 1개의 전치를 가진 각각 수천개의 형질전환자를 수득했다.

검은색 사각형은 LB 캔 플레이트에서 자란 두 개의 콜로니를 보여주지만 M nine 최소 중간 플레이트에서는 자라지 않습니다. 이러한 TRO는 아마도 아미노산, 핵산 또는 비타민의 합성에 관여하는 유전자의 중단을 포함했을 것이며, 이는 모두 lb에서 발견되지만 M nine, 최소 배지에서는 발견되지 않습니다. 다른 86개 군체는 M nine의 성장에 필요한 유전자에 중단이 없었다.

여기에서 볼 수 있듯이 최소 배지, 분리된 TRO에서 부분적으로 소화된 게놈 DNA는 크기가 10 kilobase 이상에서 0.5 kilobase 미만까지 분포합니다. 구출된 플라스미드는 2개의 킬로베이스 트랜스포손과 측면 숙주 DNA로 구성됩니다. 이 그림은 tro에서 분리된 플라스미드에 대한 blast 결과를 보여줍니다.

중단된 염기서열은 여러 번의 하룻밤 성장 단계로 인해 L 티로신, L 페닐알라닌 및 L 트립토판의 생합성에 관여하는 아테 돌연변이효소에 대한 엔테로박터 클로이 유전자와 유사합니다. 이 기술은 적절하게 수행되면 10일 또는 11일 안에 완료할 수 있습니다. pla를 복제하는 동안 플레이트를 더럽히지 않도록 기억하는 것이 중요하며, 드라이 플레이트를 사용하고 veltin square에 플레이트를 놓은 후 플레이트를 움직이지 않음으로써 이를 방지할 수 있습니다.

이 절차에 따라 복제 또는 보완 실험과 같은 다른 방법을 수행하여 확인된 유전자의 기능을 확인할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 transposon mutagenesis를 사용하여 TRO를 생성하는 방법과 돌연변이된 유전자를 잠정적으로 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.