Name: 생성 엔테로 박터 SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: 학습하세요 Enterobacter sp. YSU에서 트랜스포존 돌연변이 유발을 이용한 영양 요구 유전자 발굴 방법을. 복제 플레이팅과 DNA 시퀀싱으로 대사 경로를 규명합니다.

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저자는 2010-2014 봄 학기 동안 내 트랜스포존 돌연변이 유발 아이디어를 테스트 내 미생물 생리학 대학원생의 학부 독립적 인 연구의 모든 학생 모두에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 영스 타운 주립 대학의 생물학의 부에 의해 투자되었다.

관할 세포 5,11를 1. 일렉트로 <ol><li> 엔테로 박터 SP의 O / N LB 문화를 희석. 신선한 LB 배지 50 ㎖에 YSU 1/20 0.4과 0.6 사이의 OD (600 ㎚)을 30 ° C를 120 rpm으로 진탕과 함께 성장한다. 선택적으로, 최적의 성장 온도에서 다른 균주 성장. </li><li> 5 분 원심 분리기 4 ° C에서 5 분간 7,000 XG 얼음에 세포를 진정. </li><li> , 상층 액을 제거한다 4 ° C에서 멸균 얼음 냉수 및 원심 분리기 50 ㎖의 세포를 재현 탁하고 5 분 동안 7,000 XG. 이 단계를 반복합니다. </li><li> 상청액을 버리고 세포 펠렛 부피 동일 얼음 냉수의 부피로 세포를 재현 탁. 장기 저장을 위해, -80 ° C 및 해동에 빙냉 10 % (v / v) 글리세롤, 매장의 동일한 펠렛 부피 빙냉 10 % (v / v)의 글리세린,에 resuspend 10 ㎖로 세포를 씻어 전기하기 전에 얼음에. </li><li> 40 μL에 transposome의 0.5 μl를 추가세포. 시판 transposome 용액 0.33 ㎍ / ㎕의 DNA의 농도로 공급된다. 0.33 μg의 권장되지만, 0.165 μg의 DNA는 충분하다. </li><li> 얼음 감기, 0.2 mm, 전기의 큐벳에 셀 / transposome 혼합물을 놓고 큐벳의 바닥에 혼합물을 누릅니다. 25 μF 200 Ω, 2.5 kV의를 세포를 충격. 세포가 냉장 상태로 유지되도록 사용하기 전에 -20 ° C 냉동고에서 전기 큐벳을 저장합니다. </li><li> 즉시, catabolite 탄압 (SOC) 매체와 슈퍼 최적의 국물을 살균 필터의 960 μl를 추가합니다. 아래로 피펫 팅에 의해 혼합 및 멸균 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 세포를 전송합니다. NOTE : 세포 충격 후 죽기 시작하지만, SOC 배지 염들을 복구 할 수있다. 절약하기 위해, transposome를 추가하거나 음성 대조군 세포에 충격을 할 필요가 없다. 그냥 멸균 SOC 매체의 960 μl를 추가합니다. </li><li> 30 ° C F에서 세포를 품어120 rpm으로 흔들어으로 45 ~ 60 분. 이 카나마이신 저항을 표현하는 transposome는 세포 숙주 게놈과과에 대한 재결합을위한 시간을 제공합니다. </li><li> LB-관 한천 접시에 세포를 100 μl를 확산하고 30 ° C에서 판 O / N을 품어. 4 ° C의 냉장고에 남아있는 변환 믹스를 저장합니다. 필요한 경우 초기 전기 후 이주에 나중에 업에 추가 금액을 확산. </li></ol> 형질 전환 2. 리딩 <ol><li> 테이프 빈 100 × 15mm 페트리 접시의 뚜껑에 그리드. &quot;세균 유전학의 단기 코스&quot;12에서 그리드를 복사합니다. </li><li> LB-관 한천 플레이트의 하단에 선을 그립니다. 그리드 한천을 통해 볼 수 있도록 격자 덮개에 고정하는 테이프의 작은 조각을 사용한다. 접시의 바닥에있는 선이 그리드의 상단 중앙에 정렬되어 있는지 확인합니다. 테이프와 함께 접시를 정박에도 리딩을 허용, 슬라이딩에서 유지. 라인은 복제 도금 후 식민지의 식별을 용이하게한다. </li><li> 멸균 이쑤시개로 하나의 형질 전환 체를 선택하고 그리드의 사각형의 중심에 자리. 그냥 식민지 그 자리를 터치합니다. 한천에 이쑤시개를 발굴하지 마십시오. 플레이트가 오염되는 것을 방지하기 위해, 하나의 끝 부분에 이쑤시개를 처리합니다. </li><li> 단계 2.3에서와 같이 인접한 광장에서 다른 형질 전환 체를 스팟. 플레이트가 가득 차면, 30 ° C에서 / O N 그것을 품어. 이것은 마스터 플레이트이다. </li></ol> 3. 복제 도금 영양 요구 표현형 (12)를 파악하기 위해 <ol><li> LB-관에 대한 M-9 칸에 대한 LB 관 하나, 둘, 셋 : 격자로 된 각 플레이트를 들어, 세 가지를 통해 하나의 번호가 세 가지 신선한 한천 플레이트의 스택을 확인합니다. 사용하기 전에 37 ° C에서, 거꾸로 O / N를 접시를 건조. </li><li> 단계 2.2에서 각 판의 상단에 선을 그립니다. </li><li> 70 % 에탄올로 복제 도금 도구를 닦아 복제 도금 가기에 멸균 벨벳 광장을 배치OL과 벨벳 광장을 단속. 손 심지어 세척 후 미생물로 가득합니다. 가장자리에 벨벳 광장을 처리하여 미생물 오염의 도입을 방지합니다. </li><li> 클램프에 그려진 선으로 마스터 접시에 선을 정렬하고 벨벳 광장의 상단에있는 플레이트에 배치합니다. 벨벳 광장 판에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 세균이 묻지 않도록주의하십시오. 벨벳 광장에서 마스터 플레이트를 제거합니다. </li><li> 클램프 라인 판 번호 하나에 그려진 선을 정렬하고 벨벳 광장의 상단에 배치합니다. 판에 벨벳 광장에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 판 번호 하나를 제거합니다. </li><li> 물을 비이커에 벨벳 광장 폐기 단계 3.3에서와 같이 복제 도금 도구에 깨끗하고 멸균 벨벳 광장을 배치합니다. 이 단계에 걸쳐 접종 획기적인 성장과 거짓 긍정적 인 결과를 발생 방지 할 수 있습니다. </li><li> 정렬클램프 라인 판 번호 하나에 라인과 새로운 벨벳 광장의 상단에 배치합니다. 벨벳 광장에 판 번호 하나에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 판 번호 하나를 제거합니다. </li><li> 클램프 라인 판 두 번째에 그려진 선을 정렬하고 벨벳 광장의 상단에 배치합니다. 판 두 번째로 벨벳 광장에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 번호판 두를 제거합니다. </li><li> 번호판 세 단계를 반복 3.8. 3 플레이트는 다른 두 판을 마스터 플레이트로부터 완전한 전송을위한 제어이다. 물을 비이커에 벨벳 광장을 폐기하십시오. 그들을 건조, 씻어 알루미늄 호일을 감아을 다시 압력솥, 오염 된 벨벳 사각형이 들어있는 비커를 오토 클레이브, 벨벳 사각형을 다시 사용합니다. </li><li> 30 ° CO / N에 번호판을 품어. 두 LB 칸 아가 플레이트상에서 성장하지만 M-9 칸 플레이트상에서 성장되지 콜로니 영양 요구 (것으로 간주 <st룽&gt; 그림 2). </li><li> 줄무늬와 신선한 LB 관 한천 판에 판 번호를 하나의 영양 요구하고, 30 ° CO / N에서 접시를 품어. </li><li> 격리 신선한 LB 칸 접시에 단계 3.11의 줄무늬 판 3 식민지 밖으로 행진. 30 ° CO / N에서 접시를 품어. 이 돌연변이가 잘 분리되어 있음을 보장합니다. 하나의 섹션에서 각 식민지 밖으로 분에 플레이트와 행진을 나눈다. </li><li> 신선한 LB 칸 접시에 단계 3.12에서 파생 된 아웃 줄무늬 식민지에서 스팟 식민지 단계 2.1-2.4 같이 격자를 형성한다. 각각의 돌연변이 중으로 다시 테스트되고있다. </li><li> 영양 요 표현형을 확인하는 단계 3.1-3.10 같이 다시 판을 복제합니다. </li></ol> 4. 유전자 구조 <ol><li> 30 ° C에서 액체 LB-관 매체에 단계 3.13에서 고립 된 돌연변이 식민지의 3 ㎖의 O / N 문화를 성장. 시판되는 게놈 DNA 정제 키트를 사용하여 배양액 1mL로부터 게놈 DNA를 정제. </li><li> 0.025 U의 혼합물을 설정BFU CI의 제한 효소와 얼음에 20 μL 반응에서 / μL 게놈 DNA 1 μg의 14 μL. BFU CI 열두 다른 사이트에서 트랜스포존을 인하하기 때문에, 제한 효소, BFA I 또는 각각 두 세 가지 다른 사이트에서 트랜스포존 인하 해일 III를 사용하는 것이 더 효율적일 수있다. </li><li> 25 분 동안 37 ° C에서 반응을 부화 한 후 80 ° C에서 20 분간 효소를 불 활성화하기 위해. 0.8 % 아가 로스 겔 (도 3)에 부분적으로 소화 DNA의 3 μl를 분석한다. 겔의 하단에 위에서 아래 10킬로바이트에서 도말 검사에서 성공적인 부분 소화 결과. </li><li> 500 ㎕의 반응에 T4 DNA 리가 제 (800)의 단위를 사용하여 부분적으로 소화 된 게놈 DNA의 15 μl를 결찰. 반응 O / N에서 4 ℃를 품어. 큰 반응 부피 자체로 하나의 단편의 결찰을 극대화하고, 두 개 이상의 DNA 단편 사이의 상호 작용을 최소화한다. </li><li> 강수테 3 M 아세트산 나트륨, pH가 5.5, 및 1 ml의 95 % 에탄올의 50 μl를 첨가하고 20 분 동안 -20 ° C에서 인큐베이팅하여 DNA 결찰. </li><li> 70 % 에탄올로 펠렛을 씻어 10 분 동안 4 ° C에서 DNA 및 13,500 XG를 미세 원심 원심 진공 농축기에서 건조하고, 뉴 클레아 무료 물 10 μL에서 그것을 재현 탁. 대안 적으로, DNA는 공기는 15 분 동안 RT에서 건조 될 수있다. </li><li> E.를 변환 재현 탁 DNA의 4 μL를 사용하여 제 1 절 R6K γ 복제 원점에서와 같이 전기에 의한 대장균 균주 ECD100D의 PIR 또는 ECD100D의 pir116 6을 복제하는 PIR 유전자와 균주가 필요합니다. 낮은 복사 플라스미드의 PIR 스트레인 결과 및 pir116 변형은 높은 사본 플라스미드 결과 PIR 돌연변이 유전자가 포함되어 있습니다. 각 형질 전환 트랜스포존과 중단 된 염색체 (그림 1E)의 영역으로 새로운 플라스미드가 포함되어 있습니다. </li><li> Inocul단일 콜로니로 LB 칸 배지 5 ㎖를 먹었다, 120rpm으로 37 ° C에서 진탕 / O N 그것을 성장하고, 상업용 키트를 사용하여 전체 O / N의 배양 물로부터 플라스미드 DNA를 정제. </li><li> 제한 엔도 뉴 클레아 제의 I.을 XhoI를 이용 플라스미드를 14 μl를 다이제스트 반응의 최종 부피가 20 μL 있는지 확인합니다. 이 효소는 카나마이신 내성 유전자의 5 &#39;말단에 트랜스포존의 중앙의 위치를​​ 인식한다. 소화되지 않은 10 μl를 분석하고 0.8 % 아가 로스 젤 (그림 3)에 플라스미드를 소화. 플라스미드는 2 킬로바이트 트랜스포존 플러스 측면에서는 숙주 DNA로 구성되어 있습니다. </li></ol> 5. DNA 시퀀싱 <ol><li> 시판의 시퀀싱 키트, 트랜스포존의 각 단부에 상동 프라이머 및 모세관 서열 분석 시스템을 이용하여 플라스미드를 시퀀싱. 또한, 플라스미드는 순서에 대한 외부 기관에 제공 할 수있다. </li><li> 분자량 표준 (1킬로바이트 사다리)으로 사용합니다겔 플라스미드의 크기를 추정한다. 이어서, 50 fmol에 필요한 플라스미드의 나노 그램 (NG)의 개수를 추정한다. </li><li> 260 nm의 (A 260)과 280 nm의 (A 280)의 파장에서 분광 광도계를 사용하여 플라스미드 DNA의 농도를 측정한다. 큐벳을 통해 빛의 경로 길이가 1cm 있는지 확인하십시오. 50 NG / μL로 260 nm에서 흡광도를 곱하여 농도를 결정합니다. 높은 품질의 플라스미드 DNA는 260 / 1.8과 2.0 사이의 280 비율이있을 것이다. </li><li> 각각의 시퀀싱 반응에 필요한 DNA의 부피는 플라스미드의 농도로 나눈 50 fmol 필요한 NG의 수이다. 10 μL로 총 부피를 가지고 물과 필요한 플라스미드의 볼륨을 섞는다. </li><li> 1 분 동안 96 ° C에서 플라스미드 DNA / 물 혼합물을 가열 한 후 RT로 냉각. </li><li> 시퀀싱 키트에서 마스터 믹스 8 μL 및 시퀀싱 프라이머 중 하나의 μM 1.6의 2 μL를 추가합니다. </li><li> FOL열 자전거 타는 프로그램과 반응 정리에 대한 시퀀싱 키트에서 낮은 프로토콜입니다. </li><li> 모세관 DNA 분석 시스템을 이용하여 각각의 샘플을 분석한다. </li><li> DNA 서열을 볼 수 상용 소프트웨어 패키지를 사용합니다. 트랜스포존 (그림 4)의 지난 7 BP되는 순서 &quot;5&#39;-GAGACAG-3 &#39;,&quot;를 검색합니다. 이 7 bp의 세그먼트의 5 &#39;말단 전에 시퀀스 트랜스포존에 속한다. 이 7 bp의 세그먼트의 3 &#39;말단 서열은 이후 중단 유전자에 속한다. </li><li> 기본 지역 맞춤 검색 도구 (BLAST) 7, 8을 사용하여 중단 된 유전자의 가능한 기능을 결정합니다. 다음을 사용하여 link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . 인터럽트의 순서를 붙여 넣기쿼리 상자에 ED 유전자 데이터베이스에서 &quot;기타&quot;를 선택하고 페이지 하단에 &quot;BLAST&quot;을 클릭합니다. 결과가 나타나면, 정렬 결과 (그림 5)을 볼 수 있도록 페이지를 아래로 스크롤합니다. </li></ol>

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transposome을 사용하여 트랜스포존 돌연변이 유발 엔테로 SP의 영양 요구를 생성하기위한 효과적인 도구이다. YSU과 그람 음성의 다른 유형과 그람 양성 세균 3,4. 프로세스는 일렉트로 의해 숙주에 테네시 5 유래 transposome 도입함으로써 개시 하였다. 인서트 콜로니를 확인하기 위하여, 변형되지 않은 대상 균주는 트랜스포존에 의해지지 저항 마커 선택하기 위해 카나마이신에 민감했다. 일부 호스트는 숙주 게놈 재결합 전에 트랜스포존 DNA를 제한 엔도 뉴 클레아 저하 생산. 일렉트로 믹스 제한 효소 억제제를 첨가 저하를 최소화하고 변환 수율 (3)을 증가시킬 수있다. 일렉트로 유능한 박테리아를 제조하는 동안 염의 존재로 인한 박테리아를 전기 아크 또는 스파크를 방지 할 수있다, 그것은 많은 염을 제거하는 것이 중요했다. 도의 부재하에전기 아크는, 세포는 그들을 충격적인 후에 급속 죽기 시작했다. SOC의 성장 배지를 함유하는 염을 추가하면 즉...

Prototrophic 박테리아 생합성 1, 아미노산, 핵산, 비타민 등의 전구체를 생성하도록 중앙 탄소 대사 경로를 통해 글루코즈 변환 매체 글루코스 (M-9 매체)를 포함하는 M-9 최소 염 성장. M-9 매체는 탄소 및 에너지 원으로서 황 공급원 및 글루코스 버퍼 및 인 소스, 황산 마그네슘 등의 질소원, 나트륨 및 인산 칼륨 등의 암모늄 클로라이드를 포함한다. 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지 트립에서 효모 추출물 비타민과 성장 인자의 아미노산이 풍부하다. 그것은 M-9 매체 상 성장에 필요한 아미노산, 비타민 및 다른 성장 인자를 합성 할 수없는 영양 요구의 성장을 지원한다. 영양 요구는 M-9 매체에 LB 배지에서 성장할 수 있지만 반면 따라서 prototrophs는 LB 및 M-9 배지에서 성장할 것이다. 영양 요 구성 돌연변이 표현형을 야기하는 유전자를 박테리아 prototrophic 인구에 돌연변이를 도입하고 식별함으로써, 포는균주의 대사의 더 나은 이해를 얻을 ssible. 트랜스포존 돌연변이는 M-9 배지에서 포도당에서의 성장에 필요한 유전자의 대부분을 식별하는데 사용될 수있다. 트랜스포존는 숙주 게놈 2에 무작위로 자신을 삽입합니다. M-9 배지 아가 플레이트 상에 LB 아가 플레이트 및 이들을 도금 복제본 트랜스포존 형질을 스폿 팅함으로써, 영양 요구 스크리닝 할 수있다. 중단 된 유전자는 유전자 구조를 통해 확인된다. 본 연구는 시판 테네시 5 트랜스 단백질과 혼합 선형 트랜스포존 DNA 세그먼트의 용액으로서 제공되는 transposome - 유래를 이용한다. DNA 세그먼트는 트랜스 유전자가 부족하지만 카나마이신 저항성 유전자, R6K γ 복제 원점과 세그먼트 3,4의 각 끝 부분에 결합 트랜스에 대한 DNA 서열 두 개의 모자이크 모티브가 포함되어 있습니다. 트랜스 단백질은 DNA 단독 DNA 세그먼트에 직접 첨가되어 있기 때문에트랜스포존으로 정의되고, DNA / 트랜스 단백질 복합체 transposome로서 정의된다. transposome은 카나마이신 민감한 호스트 (그림 1A)에 전기 (5)에 의해 변환된다. 카나마이신 (LB 칸)을 함유하는 LB 아가 플레이트상에서 성장 콜로니를 카나마이신 (M-9 칸) 영양 요구 아르 함유 M-9 배지 아가 플레이트상에서 성장되지 트랜스포존 삽입 (도 1B), 및 복제 도금 형질 (Figire있을 1C). 돌연변이로부터 게놈 DNA 정제 부분적 4베이스 절삭 제한 엔도 뉴 클레아 제, BFU CI (도 1D)로 분해된다. DNA 라이 게이션은 그 PIR 유전자 (도 1E)를 포함 대장균 (E. 콜라이)의 균주에 형질 전환된다. 이 유전자는 새로운 플라스미드 트랜스포존을 포함하고 E.에서 복제 호스트 염색체 영역을 측면에서는 수 있습니다 대장균 6. 카나마이신 내성 유전자와 같은 역할새로운 플라스미드에 대한 electable 마커. 마지막으로, 중단 유전자의 신원을 결정하는 데 사용되는 트랜스포존 얻어진 시퀀스의 기본 로컬 검색 정렬 도구 (BLAST) 분석 7,8의 각 단부에 상보적인 프라이머를 이용하여 시퀀싱. 이 transposome 돌연변이 유발 전략은 세 가지 장점 (3)를 제공한다. 트랜스 단백질 트랜스포존에 직접 결합되기 때문에 먼저, 삽입 호스트 내의 트랜스 유전자의 발현에 의존하지 않는다. 트랜스포존은 숙주 게놈 내로 그 자체를 포함하면 트랜스는 트랜스포존의 추가적인 이동을 방지 저하된다. 호스트가 내인성 테네시 5 transpositional 요소를 소유하는 경우에는, 추가 이동이 방지 될 수 없다. 둘째로, 전기 천공에 의해 도입 transposome은 가능한 호스트 다양한 그것을 사용한다. 또한 접합하여 또는 VI를하여 트랜스포존을 도입 할 필요성을 제거RAL 감염. 두 프로세스는 호스트 감수성을 필요로한다. 셋째, 카나마이신 내성 유전자 및 transposome에서 γ R6K 복제 기원의 포함은 쉽게 중단 유전자를 식별 할 수있다. 트랜스포존 중단 영역 저장 및 유전자 식별을위한 역 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용할 필요가 없어, 플라스미드로 서열화 될 수있다. 이 비디오에 제시된 프로토콜은 엔테로 박터 SP의 트랜스포존 돌연변이 유발을위한 각 단계를 설명합니다. YSU 9는 중단 추정되는 유전자의 식별에 박테리아 세포에 도입에서 transposome를 사용하여. 이전에 출판 프로토콜 3,4,10 이외에 영양 요구에 대해 스크리닝 복제본 도금을 사용하는 상세한 방법이 제시된다. 이 돌연변이 유발 기술은 식별자에 대한 박테리아의 다른 유형에서, 그러한 항생제 저항과 금속과 같은 다른 표현형을 조사하기 위해 사용될 수있다또는 유전학 또는 미생물 생리학 코스의 실험실 구성 요소를 가르치는 합성 생물학 연구에서 정의 된 배양 조건에서 성장에 필요한 유전자의 최소한의 수를 ifying.

<table><tbody><tr><td>EZ-TN5 R6K&감마; ori/KAN-2 Tnp 트랜스포좀 키트</td><td>진원지(Illumina)</td><td>TSM08KR</td><td></td></tr><tr><td>EC100D pir+ Electrocompetent E. coli</td><td>Epicentre (Illumina)</td><td>ECP09500</td> 낮은 복제 번호 EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli Epicentre (Illumina)<td>에서 R6K&gamma; 복제 기원을 가진 플라스미드를 복제할 수 있음</td></tr><tr><td></td><td></td><td>EC6P095H</td><td>R6K&감마로 플라스미드를 복제할 수 있습니다. 높은 복제 번호에서 복제 기원</td></tr><tr><td>5X M-9 염</td><td>Thermo Fisher</td><td>DF048517</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Broth</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J637-1KG</td><td>고체 매체는 1.6% (w/v) 한천</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate를</td> 함유하고 있습니다.<td>Amresco, Inc.</td><td>0408-25G</td><td>필요한 경우 미디어에는 50 &mu; g/ml 카나마이신 설페이트</td></tr><tr><td>D-글루코스 모노하이드레이트</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0643-1KG</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J850-500G</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J859-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4504-500G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NaCl Amresco, Inc.</td><td>X190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>CATABOLITE REPRESSION(SOC) 배지</td><td></td><td></td><td>0.5%(w/v) 효모 추출물, 2%(w/v) 트립톤, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2, 20 mM MgSO4 및 20 mM 포도</td></tr>당 <tr><td>BfuC I</td><td>NEB</td><td>R0636S</td><td>게놈 DNA의 부분 분해</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td>플라스미드 분해</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제 자유 수</td><td>Amresco, Inc.</td><td>E476-1L</td><td>침전 DNA 및 제한 엔도뉴클레아제 반응 용해용</td></tr><tr><td>GenomeLab DTCS - 퀵 스타트 키트</td><td>Beckman Coulter</td><td>608120</td><td>DNA 염기서열분석</td></tr><tr><td>마법사 게놈 DNA 정제 키트</td><td>Promega</td><td>A1120A</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps DNA 정제 시스템</td><td>Promega</td><td>A1460</td><td>플라스미드 정제</td></tr><tr><td>복제 도금 블록</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-1</td><td></td></tr><tr><td>Velveteen Squares</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-2</td><td>복제 도금</td></tr><tr><td>PetriStickers</td><td>다양 한 생명 공학</td><td>PSTK-1100</td><td>그리드 복제 도금</td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II</td><td>BioRad</td><td></td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes &ndash; 2 mm</td><td>BioExpress</td><td>E-5010-2</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap DNA 진공 농축기</td><td>Labconco</td><td>7970010</td><td>건조 DNA</td></tr><tr><td>CEQ 2000XL DNA 분석 시스템</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>DNA 염기서열분석</td></tr><tr><td>Vector NTI Advance 11.5.0</td><td>Life Technologies</td><td>12605099</td><td>DNA 염기서열 분석</td></tr></tbody></table>

생성 엔테로 박터 sp. ysu 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic 박테리아는 탄소 및 에너지 원으로 사용되는 배지 글루코오스 (M-9 배지)로 보충 M-9 최소 염에 성장. 영양 요구는 transposome를 이용하여 생성 될 수있다. 이 프로토콜에 사용되는 상용, 테네시 (5) 유도 된 transposome은 트랜스 결합 부위의 역할을 R6K γ 복제 기원, 카나마이신 저항과 두 개의 모자이크 순서 종료하는 유전자를 포함하는 DNA의 선형 세그먼트로 구성되어 있습니다. DNA / 트랜스 단백질 복합체로서 제공 transposome는, prototrophic 균주, 엔테로 SP는 일렉트로로 도입된다. YSU, 그리고 무작위로이 숙주의 게놈에 자신을 통합합니다. 형질 전환 체는 카나마이신 (LB 칸)을 함유하는 한천 플레이트 루리아 - 베르 타니에 도금 복제본 카나마이신 (M-9 칸)을 함유하는 M-9 배지 아가 플레이트 상이다. M-9 칸 접시에 LB-관 판에 성장하지만 형질 전환 영양 요구로 간주됩니다. 정제 게놈영양 요구로부터 DNA는 부분적으로 소화 PIR + 대장균 (E. 콜라이) 균주에 결찰 및 변환된다. R6Kγ 복제 원점은 플라스미드 PIR + E.에 복제 할 수 있습니다 콜라이 균주 및 카나마이신 저항 마커 플라스미드의 선택을 허용한다. 각 형질 전환 중단 된 염색체 영역에 의해 측면에 트랜스포존을 포함하는 새로운 플라스미드를 보유하고있다. 생거 시퀀싱 및 기본 지역 맞춤 검색 도구 (BLAST)는 중단 된 유전자의 추정 정체성을 제안한다. 이 transposome 돌연변이 유발 전략을 사용하는 세 가지 이점이있다. 첫째, 호스트에 의한 트랜스 유전자의 발현에 의존하지 않는다. 둘째, transposome는 전기에 의하여보다는 접합 또는 형질 도입에 의하여 대상 호스트에 도입하고, 따라서보다 효율적이다. 셋째, R6Kγ 복제 원점 쉽게 돌연변이 g을 식별 할 수있게부분적으로 재조합 플라스미드에 복구 에너지. 이 기술은 엔테로 박터 (SP)의 다른 특성에 관여하는 유전자를 조사하기 위하여 사용될 수있다. YSU 또는 균주의 넓은 다양한.

엔테로 박터 SP의 변환. transposome와 일렉트로 의해 YSU는 숙주 게놈 (도 1A, B)에 임의의 게놈 삽입을 개시. 성공적인 전기는 LB-관 판에 성장 수천 개의 형질 전환 체를 얻었다. 300 ~ 400를 얻으려면, 판 당 식민지를 잘 간격, 각 LB 관 한천 접시에 변환 혼합 확산의 양을 최적화했다. 각 형질 전환 체는 적어도 하나의 트랜스포존 삽입물을 포함하지만, M-9 매체상의 성장에 중요한 유전자가 복제 도금에 의해 선별없이 중단 된 경우는 명확하지 않았다. 형질 전환은 M-9 매체에 도금 (88)의 그리드 및 복제에 신선한 LB 칸 접시에 옮겨졌다. 트랜스포존이 프로토콜 부분은 M-9 매체 판에 카나마이신을 추가 할 것을 권장 형질 전환에 유지할 수 있도록 유의하십시오. M-9 매체는이 경우의 카나마이신이 보충 된, 그러나 그것없이 영양 요구를 획득하는 것이 여전히 가능했다되지 않았다. 에 (도 1C)에 LB 배지...

엔테로 박터 SP. YSU는 포도당 최소 염 배지에서 성장한다. 영양 요구 임의로 숙주 게놈 내로 그 자체를 삽입 transposome로 변환함으로써 생성된다. 돌연변이는 최소 배지에 복잡한 매체로부터 복제 도금에 의해 발견된다. 중단 된 유전자는 유전자 구조 및 시퀀싱에 의해 식별됩니다.

생성 엔테로 박터 SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

다음 실험의 전반적인 목표는 포도당이 보충된 최소 염 배지에서 자라는 야생형 박테리아 균주의 TRO를 생산하는 것입니다. 이것은 transpo zone을 야생형 숙주 균주로 변환하여 삽입물에 무작위 전치를 가진 박테리아의 칸나 마이신 내성 집단을 얻음으로써 달성됩니다. 다음 형질전환체는 복제 도금에 의해 스크리닝되며, 이는 풍부한 배지에서 성장하지만 포도당이 보충된 배지인 최소 염에서 성장하지 못하는 TRO를 식별합니다.다음으로 유전체학적으로, 돌연변이의 DNA는 절단된 유전자의 분절에 의해 양쪽 끝에 있는 트랜스포손을 포함하는 플라스미드를 얻기 위해 소화, 결찰 및 대장균으로 형질전환됩니다. DNA 염기서열분석 및 기본적인 국소 정렬 검색 도구 분석을 기반으로 중단된 유전자의 추정 동일성을 보여주는 결과를 얻습니다. 이 기술에 사용된 트랜스포손은 복제 기원, 카나마이신 저항성 유전자 및 모자이크 말단을 가지고 있습니다.를 위해 단백질 바인딩을 전치합니다. 그것은 단백질 유전자를 전치하지 않기 때문에 우리는 transposon DNA 파편을 가진 이 전치 유전자를 추가해야 하고, 그 후에 transpos DNA와 단백질 사이 복합물은 숙주로 전기학공됩니다. electroporation의 주요 이점은 transduction 또는 conjugation를 위한 필요의 삭제입니다.전치(transpose) 유전자가 없으면 일반적으로 안정적인 삽입물이 생성되며, 복제 기원(replication origin)과 CIN 저항성 유전자(CIN resistance gene)가 있으면 돌연변이된 유전자를 쉽게 식별할 수 있으며, 이 유전자는 재조합 플라스미드(recombinant plasmid)로 회수됩니다. 이 방법은 아미노산, 핵산 및 비타민의 생합성에 필요한 유전자를 식별하는 것과 같은 미생물 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저는 엔테로박터 종인 YSU에서 금속 저항성 유전자를 검색하던 중 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸고, 엔테로박터 종의 하룻밤 배양을 사용하여 유능한 세포를 전기천공하는 방법을 개발 중이던 미생물 생리학 실험실에 이를 통합하기로 결정했습니다.YSU는 새로운 LB 배지에 1-20 희석액을 준비하고 섭씨 30도 및 120RPM에서 0.4-0.6 사이의 OD 600으로 배양합니다. 세포가 적당한 조밀도를 도달할 때, 5분 동안 얼음에 그(것)들을 차갑게 한 후에 4 섭씨 온도와 7, 5 분 동안 000 GS에 원심분리하십시오. 상층액을 버리고 같은 양의 얼음물을 Resus에 사용합니다.세포 원심분리기를 섭씨 4도, 7, 5분 동안 000G로 중단합니다. 세척을 반복한 후 상등액을 버리고 얼음 냉수로 세포 펠릿의 부피와 동일한 부피로 세포를 현탁시킵니다. 다음으로, 0.5마이크로리터의 트랜스포 영역을 40마이크로리터의 세포에 추가합니다.그런 다음 세포 transpo zone 혼합물을 얼음처럼 차가운 electroporation 수의사에 넣고 혼합물을 Q Vet의 바닥에 두드려 25 마이크로 phs, 200 옴 및 2.5 킬로 볼트에서 세포를 충격을 가합니다. 세포를 멸균 1.5ml 마이크로 퍼지 튜브로 옮기기 전에 위아래로 피펫팅하여 혼합된 960마이크로리터의 필터 멸균 SOC 매체를 즉시 추가합니다. 섭씨 30도 및 120rpm에서 45-60분 동안 세포를 배양합니다.그런 다음 LB 캔 한천 플레이트에 100마이크로리터의 세포를 펴고 섭씨 30도에서 밤새 플레이트를 그리드 형질전환체로 배양합니다. 빈 100 x 15mm 페트리 접시의 뚜껑에 그리드를 테이프로 붙입니다. LB 캔 한천 플레이트의 바닥에 선을 긋고 작은 테이프 조각을 사용하여 격자 뚜껑에 고정하여 멸균 이쑤시개로 오거를 통해 그리드가 보이도록 합니다.단일 변환자를 선택하여 그리드의 사각형 중앙에서 찾은 다음 인접한 사각형에서 다른 변환자를 찾은 다음 플레이트가 가득 찰 때까지 계속합니다. 그런 다음 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다. 이것은 그리드가 있는 각 플레이트에 대한 마스터 플레이트입니다.1부터 3까지 번호가 매겨진 세 개의 새 오거 플레이트를 쌓습니다. LB의 1번은 M의 2번, 9번은 캔입니다. 그리고 LB의 세 번째는 사용하기 전에 섭씨 37도에서 밤새 접시를 거꾸로 건조시킬 수 있습니다.앞에서 설명한 것처럼 각 플레이트의 상단에 선을 그린 후 70% 에탄올을 사용하여 복제 도금 도구를 닦고 그 위에 멸균 벨틴 사각형을 놓고 벨틴 사각형을 고정합니다. 다음으로, 마스터 플레이트의 선을 클램프에 그려진 선에 정렬하고 플레이트를 veltin 사각형 위에 놓습니다. 부드러운 압력을 가하여 박테리아를 플레이트에서 veltin square로 옮깁니다.그런 다음 플레이트 번호 1에 그려진 선을 클램프의 선과 정렬하고 veltin 사각형 위에 놓습니다. 부드러운 압력을 가하여 박테리아를 veltin square에서 플레이트로 옮깁니다. 플레이트 번호 1을 제거합니다.벨벳 틴 스퀘어를 물 비커에 버리고 복제 도금 도구에 깨끗하고 멸균 벨벳 스퀘어를 놓습니다. 이전과 마찬가지로 플레이트 번호 1의 선을 클램프의 선과 정렬하고 새 벨벳 사각형 위에 놓습니다. 박테리아를 1번 플레이트에서 벨벳 사각형으로 옮기기 위해 부드러운 압력을 가합니다.1번 플레이트를 제거하고 2번 플레이트에 그려진 선을 클램프의 선과 정렬하고 벨벳 사각형 위에 놓습니다. 부드러운 압력을 가하여 벨벳 틴 스퀘어에서 플레이트 2로 박테리아를 옮기고, 플레이트 3에 대한 과정을 반복한 후 플레이트 2를 제거하고, 플레이트를 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다. 두 LB 캔 플레이트에서 자라지만 M 9 플레이트에서 성장하지 못하는 콜로니는 trove로 간주됩니다.1번 플레이트에서 TRO를 선택하고 새 LB 캔 플레이트에 줄무늬를 그립니다. 하룻밤 동안 배양한 후, 줄무늬 플레이트에서 3개의 콜로니를 선택하고 다음날 새로운 LB 캔 플레이트에 줄무늬를 만듭니다. 새로 줄무늬가 있는 플레이트의 콜로니를 LB 캔 그리드 플레이트에 배치하고 이 플레이트를 사용하여 방금 시연한 대로 복제 도금을 반복합니다.유전자 구출을 수행합니다. 고립된 돌연변이 군체를 사용하여 3밀리리터 파운드를 성장시킵니다. 섭씨 30도에서 하룻밤 배양 할 수 있습니다.그런 다음 시판되는 게놈 DNA 정제 키트를 사용하여 얼음에서 20 마이크로 리터 반응에서 0.025 단위의 BFUC 1 제한 엔도뉴클레아제 1 밀리리터에서 1 마이크로 그램의 게놈 DNA 1 마이크로 그램 14 마이크로 리터로 DNA를 정제합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 25분 동안 반응을 배양한 후 20분 동안 섭씨 80도로 옮깁니다. 효소를 비활성화하려면 0.8% AROS 겔에서 부분적으로 소화된 DNA의 3마이크로리터를 분석합니다.다음으로, 500 마이크로리터 반응에서 부분적으로 분해된 게놈 DNA 15 마이크로리터에 800 단위의 T 4 DNA 리가아제를 첨가하고 다음 날 밤새 섭씨 4도에서 반응을 배양합니다. pH 5.5 3 몰 아세트산 나트륨 50 밀리리터와 95 % 에탄올 1 밀리리터를 첨가하여 20 분 동안 섭씨 20 도에서 배양하여 결찰 DNA를 침전시킵니다. DNA를 섭씨 4도, 13도, 500G에서 10분 동안 마이크로 퍼지합니다.펠릿을 세척하기 위해 7 개의 70 % 에탄올을 쏟아 붓습니다. 원심 진공 농축기에서 건조시키고 10마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 사용합니다. DNA를 재현탁시키려면 4마이크로리터의 재현탁 DNA를 사용하여 전기천공법, 대장균 균주, ECD 100 DPIR 또는 ECD 100 DPIR 16을 단일 콜로니로 5ml의 LB 캔 배지에 접종합니다.하룻밤 동안 섭씨 37도, 120RPM으로 성장시킵니다. 전체 배양액에서 DNA를 정제한 다음 날, Joe one을 사용하여 14마이크로리터의 플라스미드를 분해합니다. 0.8% 아가로 겔에서 10마이크로리터의 소화되지 않은 플라스미드와 소화된 플라스미드를 분석합니다.염기서열 분석 후 서열 5 프라임 GA, G-A-C-A-G 3 프라임에 대한 플라스미드 검색은 전치의 마지막 7개 염기쌍이며 중단된 유전자에 대한 서열이 뒤따를 것입니다. blast를 사용하여 중단된 유전자의 가능한 기능을 확인합니다. 성공적인 electroporation은 이 그림에 있는 삽입에 적어도 1개의 전치를 가진 각각 수천개의 형질전환자를 수득했다.검은색 사각형은 LB 캔 플레이트에서 자란 두 개의 콜로니를 보여주지만 M nine 최소 중간 플레이트에서는 자라지 않습니다. 이러한 TRO는 아마도 아미노산, 핵산 또는 비타민의 합성에 관여하는 유전자의 중단을 포함했을 것이며, 이는 모두 lb에서 발견되지만 M nine, 최소 배지에서는 발견되지 않습니다. 다른 86개 군체는 M nine의 성장에 필요한 유전자에 중단이 없었다.여기에서 볼 수 있듯이 최소 배지, 분리된 TRO에서 부분적으로 소화된 게놈 DNA는 크기가 10 kilobase 이상에서 0.5 kilobase 미만까지 분포합니다. 구출된 플라스미드는 2개의 킬로베이스 트랜스포손과 측면 숙주 DNA로 구성됩니다. 이 그림은 tro에서 분리된 플라스미드에 대한 blast 결과를 보여줍니다.중단된 염기서열은 여러 번의 하룻밤 성장 단계로 인해 L 티로신, L 페닐알라닌 및 L 트립토판의 생합성에 관여하는 아테 돌연변이효소에 대한 엔테로박터 클로이 유전자와 유사합니다. 이 기술은 적절하게 수행되면 10일 또는 11일 안에 완료할 수 있습니다. pla를 복제하는 동안 플레이트를 더럽히지 않도록 기억하는 것이 중요하며, 드라이 플레이트를 사용하고 veltin square에 플레이트를 놓은 후 플레이트를 움직이지 않음으로써 이를 방지할 수 있습니다.이 절차에 따라 복제 또는 보완 실험과 같은 다른 방법을 수행하여 확인된 유전자의 기능을 확인할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 transposon mutagenesis를 사용하여 TRO를 생성하는 방법과 돌연변이된 유전자를 잠정적으로 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

generation-enterobacter-sp-ysu-auxotrophs-using-transposon

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

체계적인 대규모 합성 유전자 (유전자 유전자 또는 epistasis) 상호 작용 화면은 유전 이중화 및 경로 간 대화를 탐험하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 높은 처리량 정량 합성 유전자 배열 검사 기술을 설명, eSGA 우리는 epistatic 관계를 elucidating과의 유전 적 상호 작용 네트워크를 탐험하기 위해 개발이...

에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑<em&gt; 대장균</em&gt; 합성 유전자 배열을 사용하여

출처: Kazi, M. I., et. al., 고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에서 트랜스포존 삽입 라이브러리 생성. J. Vis. Exp. (2020년)이 비디오는 카나마이신 내성을 기반으로 트랜스포존 삽입을 운반하는 그람 음성 수용자 박테리아의 선택, 정량화 및 보존을 보여줍니다.

게놈 트랜스포존 삽입을 통한 그람 음성 박테리아의 분리

여기서 우리는, 화면 고밀도 삽입 돌연변이 체 라이브러리를 생성하기위한 미니 himar1 마리너 트랜스포존-매개 돌연변이 유발을 사용하여 프로토콜을 설명 분리 및 프로토 타입 녹농균 스트레인 PAO1 참신한 알긴산 레귤레이터를 식별한다.

에 알긴산 생산과 관련된 새로운 유전자의 식별<em&gt; 녹농균</em&gt; 사용 미니<em&gt; himar1</em&gt; 마리너 트랜스포존 매개 돌연변이 유발

Coxiella burnetii의는 인수 공통 질병 Q 열병에 대한 책임 의무적 세포 내 그람 음성 세균이다. 여기에서 우리는 Coxiella 형광 트랜스포존 돌연변이의 발생뿐만 아니라 자동 식별 및 결과 국제화, 복제 및 세포 독성 표현형의 분석 방법을 설명합니다.

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

여기, 비 코딩 DNA 요소의 transposon 중재 무작위 삽입의 힘의 최적의 염색체 위치를 해결 하기 위해 사용 되었다.

소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

여기에 제시 된 대장균 또는 Shigella flexneri 세균성 활용을 사용 하 여 고밀도 transposon 삽입 라이브러리를 만들기 위한 간단한 방법이입니다. 이 의정서는 transposon의 임의의 게놈 삽입 하 여 독특한 돌연변이 박테리아에 수천의 수백의 컬렉션의 창조를 허용 한다.

밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

여기를 식별 하 여 조직에서 transposon leptospiral 돌연변이 햄스터의 도전 후 계량 높은 처리량 시퀀싱 transposon mutagenesis 결합 기술을 설명 합니다. 이 프로토콜 생존 및 동물에 보급에 대 한 화면 돌연변이를 사용할 수 있습니다 하 고 생체 외에서 연구에도 적용 될 수 있습니다.

높은 처리량 측정 적합성 Leptospira interrogans Transposon 삽입 돌연변이 중 황금 시리아 햄스터 감염의 병렬 시퀀싱

녹 농 균 감염에 취약 한 호스트 중요 한 병 적 상태를 발생합니다. P. 농 균 스트레인 PA14NR 설정으로 지정 하는 PA14의 비중복 transposon 삽입 돌연변이 라이브러리 수많은 프로세스에서 유전자 기능 분석을 촉진 한다. 여기에 제시 된 높은 품질 PA14NR 설정 돌연변이 라이브러리의 복사본을 생성 하는 프로토콜이입니다.

주문, 녹 농 균 스트레인 PA14 Transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제

시퀀싱 (RH-seq)을 통한 상호 반심은 종 간의 특성 차이의 유전적 기초를 매핑하는 강력한 새로운 방법입니다. hemizygotes의 풀은 트랜스포종 돌연변이 발생에 의해 생성되고 그들의 체력은 높은 전반에 걸쳐 시퀀싱을 사용하여 경쟁적인 성장을 통해 추적됩니다. 결과 데이터의 분석은 특성의 근본적인 유전자를 찾아낸다.

게놈 전체 상호 Hemizygosity 분석을 통해 사카로 마이스 효모의 종 간의 열내성 차이의 유전 매핑

당사는 그람 음성 박테리아에 있는 포화 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하고 고처리량 시퀀싱을 위한 DNA 증폭기 라이브러리의 후속 준비를 생성하는 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 ESKAPE 병원체, 아신토박터 baumannii에초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜은 그람 음성 유기체의 넓은 범위에 순종.

고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성

학습하세요 Enterobacter sp. YSU에서 트랜스포존 돌연변이 유발을 이용한 영양 요구 유전자 발굴 방법을. 복제 플레이팅과 DNA 시퀀싱으로 대사 경로를 규명합니다.

생성 엔테로 박터 SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

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