단백질 기능에 2DE - 젤 지점에서 만성 림프 구성 백혈병에 HS1에서 배운 레슨

다음 실험의 전반적인 목표는 결합된 단백질체학 접근법을 사용하여 인간 질병의 잠재적인 예후 마커 및/또는 치료 표적을 식별하는 것입니다. 이는 환자의 말초 혈액에서 원발성 백혈병 세포를 분리하고, 예후가 좋거나 나쁘며, 두 번째 단계로 단백질체학 분석에 사용할 CD 19 및 CD 5 표면 마커를 모두 발현함으로써 달성됩니다. 백혈병 세포 용해물은 2차원 전기영동 또는 2de에 의해 분해되며, 단백질체 맵의 비교를 통해 예후가 양호한 환자와 나쁜 환자 간에 다르게 발현된 반점을 식별할 수 있으며, 이는 이후에 질량 분석기 또는 MS로 식별할 수 있습니다.

다음으로, 질병의 자연사에서 확인된 단백질의 역할을 검증하고 해부하기 위해 다른 분석을 사용할 수 있습니다. 결과는 두 개의 de gel에 의해 감지된 HS 1의 다른 인산화 상태가 환자의 임상 결과와 상관관계가 있음을 보여줍니다. 이 기술의 의미는 만성 림프구성 백혈병의 치료로 확장되는데, 그 이유는 예후 마커 및/또는 이 절차가 저와 함께 할 것임을 보여주는 치료 대상으로 활용할 수 있는 질병의 진행에 관여하는 단백질을 식별하는 데 도움이 될 수 있기 때문입니다.

Pamela는 실험실의 기술자와 외부 실험실의 박사후 연구원에게 달려갔습니다.이 절차를 시작하기 전에 헤파린이 함유된 액포 혈액 채취 튜브에서 말초 혈액을 채취하십시오. 혈액을 15ml 튜브로 옮기고 전혈 1ml당 50마이크로리터의 인간 B 세포 농축 칵테일을 추가합니다. 그런 다음 잘 섞어 실온에서 20분 동안 배양합니다.

배양 후 동일한 부피의 PBS와 2% FBS 혼합물로 샘플을 희석하고 인터페이스가 손상되지 않도록 플라이 콜 위에 혈액을 조심스럽게 오버레이합니다. 시료를 400배 G로 실온에서 20분 동안 중단 없이 원심분리합니다. 완료되면 계면을 조심스럽게 흡인하여 세포를 회수하고 새 튜브에 넣습니다.

원심분리 및 상등액 제거 후 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 소생. 희석 후 튜브를 앞뒤로 수동으로 튕겨 남은 상등액에 펠릿을 매달아 놓습니다. 완전한 RPMI 배지를 사용하여 Trian blue exclusion 방법을 사용하여 세포를 계수합니다.

다음으로, 팩스 튜브에 있는 정제된 세포 현탁액 100마이크로리터에 다음 항체를 추가합니다. 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 20분 동안 샘플을 배양합니다. PBS 4ml로 시료를 세척한 후 유세포 분석으로 순도를 확인합니다.

만성 림프구성 백혈병 또는 CLL 세포의 비율을 확인하십시오., Coex가 표면에 CD 19와 CD 5를 발현합니다. 플롯에서 CD 3, CD 14 및 CD 1656의 비율을 확인하여 제제에 NK t 림프구와 단핵구가 거의 없는지 확인합니다. CLL 세포 펠릿을 380마이크로리터의 최종 부피의 2차원 전기영동 완충액으로 용해합니다.

단백질 샘플 1mg을 18개의 IPG 스트립에 적용하여 iso 전기 집중을 수행합니다. 실행 후, 실온에서 15분 동안 2%의 신선한 DTT를 보충한 2ml의 평형 완충액으로 스트립을 평형화합니다. 용액을 버린 후 2.5%I oto 아세트아미드가 보충된 2ml의 평형 완충액을 첨가합니다.

그런 다음 흔들 플랫폼에서 실온에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 젤을 건드리지 않고 종이에 스트립을 건조시켜 과도한 용액을 제거하십시오. 건조되면 9-16% gradient SDS 페이지 젤 위에 각 스트립을 로드합니다.

스트립의 로딩을 용이하게 하기 위해 겔 위에 소량의 SDS 전기영동 버퍼를 추가합니다. 다음으로, 스트립이 뜨는 것을 방지하기 위해 약 5 밀리리터의 0.8 % 한천 용액을 첨가하여 젤을 밀봉합니다. 전기영동 장치가 조립되면 SDS 전기영동 버퍼로 채웁니다.

그런 다음 젤당 60밀리암페어에서 섭씨 4도, 4시간 동안 또는 냉각 시스템을 사용하여 실행합니다. 전기영동 장치에서 겔을 제거한 후 적절한 염색 상자에 넣습니다. 각 용액을 약 200 밀리리터 준비하십시오.

젤이 들어 있는 염색 상자에 각 용액을 조심스럽게 첨가합니다. 흔들리는 플랫폼에서 모든 인큐베이션을 수행하십시오. 얼룩이 지면 정지 용액을 제거하고 획득할 때까지 1%아세트산 용액에 겔을 그대로 두십시오.

이동 분석의 경우, resus는 이전에 정제된 세포를 현탁시킵니다. 완전한 RPMI에서는 특정 자극의 유무에 관계없이 600마이크로리터의 완전한 RPMI를 추가하여 하부 트랜스웰 챔버를 준비합니다. 유도 이동과 자발적 이동을 각각 측정하려면 상부 챔버를 맨 위에 놓고 시스템이 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 30분 동안 평형을 이루도록 합니다.

완료되면 상부 챔버의 200마이크로리터당 6개 셀에 10개를 파종하고 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 4시간 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후 상부 챔버를 제거하고 하부 챔버에서 배지를 수집합니다. 그런 다음 PBS 1ml로 하부 챔버를 한 번 세척합니다.

튜브에 PBS를 채취한 후 상층액 제거 후 300배 G에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 유세포 분석을 통해 500마이크로리터의 PBS에 시료를 재현탁합니다. 획득 후 1분 후에 마이그레이션된 셀의 수를 계산합니다.

bidimensional dot plot에서 셀의 측면 산란과 계산에 사용할 숫자인 1분 동안 시각화된 이벤트의 수를 고려하여 확인합니다. CLL 환자로부터 분리된 1차 백혈병 세포 샘플을 각 환자의 임상적 특징에 따라 두 개의 주요 하위 집합으로 그룹화하고 특정 질량 허용 오차 내에서 두 개의 DE 및 MS 질량으로 분석했습니다. 데이터베이스의 펩타이드 염기서열에 할당된 후 특정 확률 점수를 통과하면 식별된 것으로 간주되는 단백질로 조립되었습니다.

이 분석을 통해, 주로 세포골격 활성과 대사 과정에 관여하는 단백질이 이들 단백질에서 확인되었다. 조혈 계통, 세포 특이적 단백질 또는 hs. 질병의 임상 경과와 밀접한 관련이 있는 차등 인산화가 차등적으로 발현된 것.

특히 한 군데를 가진 환자는 나쁜 임상 결과를 경험하는 반면, 두 군데를 가진 환자는 예후가 좋습니다. HS 1을 하나의 반점으로 운반하는 CLL 세포는 하이포인산화된 HS에 비해 이동, 접착 및 액틴 중합 측면에서 세포골격 활성이 손상된 것으로 밝혀졌습니다. 하나, 두 개의 스폿 샘플. 따라서 다른 임상 행동을 설명합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 단백질체학을 사용하여 예후 마커 및/또는 치료 표적으로 사용할 수 있는 질병의 진행과 관련된 생물학적 후보를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.