Name: 단백질 기능에 2DE - 젤 지점에서 만성 림프 구성 백혈병에 HS1에서 배운 레슨 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 학습하세요 만성림프구성백혈병 연구를 위한 2차원전기영동 및 질량분석법을 활용한 단백질 기능 분석 방법입니다. HS1 단백질의 인산화 상태가 환자 예후와 관련된 바이오마커를 식별하는 데 활용됩니다.

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우리는 림프 악성 종양 단위, 엘리사 열 하켄, 리디아 Scarfò, 마시모 알레, 안토니오 콘티, 안젤라 BACHI, 안젤라 카타 네오 감사합니다. 이 프로젝트에 의해 지원되었다 : Associazione Italiana의 당 라 Ricerca 술 Cancro AIRC (탐정 그랜트와 특별 프로그램 분자 임상 종양 - 5 밀레 번호 당 9,965) CS 및 BA는 연구 설계 실험을 수행, 데이터를 분석하고 원고를 썼다. MTSB는 UR, FBPR 원고를 작성하는데 도움을. PG와 FCC는 연구 제공 환자의 샘플과 임상 데이터를 디자인했다.

참고 : 모든 조직 샘플이 산 라파엘 병원 (밀라노, 이탈리아)의 기관 심사위원회의 승인을 얻을 수 있었다. 1 인간의 조직 샘플 및 세포 정제 (그림 1) 참고 : 백혈병 림프구 멀리건 등에 따라, CLL 환자의 말초 혈액 (PB)에서 얻은 진단을받은 9. PB 1.1) 백혈병 세포 분리 <ol><li> 나트륨 헤파린과 vacutainer 혈액 수집 튜브에 PB를 수집합니다. </li><li> 15 ML 튜브에 혈액을 전송하고 전체 혈액의 50 μL / mL로에서 인간 B 세포 농축 칵테일을 추가합니다. 잘 혼합하고, 실온에서 20 분 배양한다. </li><li> , PBS + 2 % FBS 같은 부피로 샘플을 희석 있는지 인터페이스를 중단하지 않도록하고, 피콜 위에 부드럽게 조심스럽게 오버레이 피를 섞는다. 15 ML의 t에서 희석 된 시료의이 부분에 피콜의 적어도 한 부분을 사용하여 (즉, 4 ㎖의 피콜는 + 10 ml의 혈액우베). </li><li> 없이 브레이크와 20 분 동안 실내 온도 (20 ° C에서)에서 400 XG에 원심 분리기. 단핵 세포는 계면 것이다. </li><li> 조심스럽게 세포를 복구하고 새로운 튜브에 배치 할 수있는 인터페이스를 대기음. 5 분 동안 어둠 속에서, 300 XG에 PBS 원심 분리기 회 4 ° C를 세포를 씻으십시오. 펠렛은 아래에 있습니다. </li><li> 상층 액을 버린다. 앞뒤로 손가락 튜브를 가볍게 치면 남은 상등액 펠렛을 재현 탁. (10 % 태아 송아지 혈청 및 15 ㎎ / ㎖ 젠타 마이신으로 보충 된 RPMI 1640) 10 ml의 완전한 RPMI 배지로 희석하고 펠렛을 트리 판 블루 배제 방법을 사용하여 세포를 카운트. </li></ol> 1.2) 순도 평가 참고 : 모든 준비의 순도는 99 % 이상으로 항상 있어야합니다. <ol><li> 다음과 같은 항체 정제 된 세포 현탁액 100 ㎕를 품어 (시판, 재료의 표 참조) CD3 FITC를 (5 μL / TESt), CD14 PE (5 μL / 테스트), CD19 ECD (6 μL / 테스트), CD16-CD56 PC5 (2 μL / 테스트), CD5 PC7에서 4 ° C에서 20 분 동안 (4 μL / 테스트) FACS 튜브. </li><li> (300 XG에 5 분 동안 원심 분리기) PBS의 4 ㎖의 시료를 세척하고 음모에 그들의 표면에 CD19와 CD5-Express를 공동 CLL 세포 (&gt; 99 %)의 %를 흐름 cytometry.Check하여 순도를 확인 도 1에 나타내는 (6). 준비가 거의 0이어야한다 플롯에 CD3, CD14 및 CD16-56의 %를 확인하여 NK, T 림프구 및 단핵구의 거의없는 지 확인합니다. </li></ol> 1.3) 샘플 저장 <ol><li> 프로테오믹스 연구를 들어, 10 분 동안 300 XG에 25 × 10 6 1.5 ML 튜브에 세포, 원심 분리기 세포를 수집 4 시간 동안 뜨는 및 동결 건조 펠릿을 폐기합니다. -80 ° C에서 사용할 때까지 유지합니다. </li><li> 전체 RPMI에서 검증 분석, 재현 탁 세포 (수량이 더 분석에 따라 들어선택) 및 4 단계를 진행합니다. </li></ol> 2 이차원 전기 영동 (2-DE) (그림 2) 2.1) Isoelectrofocusing (IEF) <ol><li> 380 ㎕의 2-DE 버퍼 (RBthio 용액 344 μL의 최종 볼륨 CLL 세포 펠렛을 용해 (구 M 우레아, 10 mM 트리스, 4 % CHAPS), 65MM DTT의 30 ㎕의 2 % IPG 버퍼 ampholine의 6 μL 산도 4-7). </li><li> 18 IPG 스트립 (산도 4-7)에 단백질 시료 (1 mg)을 적용하고 콘티 외 의해 설명 된대로 표준 프로토콜 다음 IEF를 수행합니다. (10) </li><li> RT에서 15 분 동안 신선한 DTT의 2 %로 보충, (6 M 우레아, 30 % 글리세롤, 2 % SDS를 함유하는 50 mM의 pH를 8.8 트리스 - 염산 완충액 EB) 평형 완충액 2 ㎖에 스트립을 평형화. 취소 EB + DTT 및 EB 2 ㎖를 추가 2.5 % 요오도 아세트 아미드로 보충. 락 플랫폼에서 실온에서 15 분 동안 품어. </li></ol> 2.2) SDS-PAGE <ol><li> 제거 젤을 건드리지 않고 종이에 스트립을 건조EB의 과잉. 9~16% 그라데이션 SDS-PAGE 겔의 상단에 각 스트립을로드합니다. SDS-전기 영동 버퍼 (25 mM의 트리스, 글리신 192 밀리미터, V / w SDS 0.1 %) 겔의 상단에이 스트립의 로딩을 용이하게하기의 작은 볼륨을 추가합니다. </li><li> 스트립의 부유를 방지 한천 용액 (0.8 %)의 ~ 5 ㎖를 첨가하여 겔을 봉쇄 한 다음, 전기 영동 장치를 조립하고 SDS-전기 영동 완충액으로 채운다. 4 ° C에서 4 시간 동안 60mA / 젤에서 실행을 수행합니다. </li><li> 전기 영동 장치에서 젤을 제거하고 적절한 염색 상자에 넣습니다. </li></ol> 제조 젤 2.3) 실버 스테인 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 해결사 </td><td> 50 % 메탄올 12 % 아세트산 0.05 % 포르말린 </td><td> 2 시간 (또는 야간) * </td></tr><tr><td> WASH BUFFER </td><td> 35 % Ehanol </td><td> 20 분 (단계를 세 번 반복) </td></tr><tr><td> 과민성 </td><td> 0.02 % 티오 황산나트륨 </td><td> 2 분 </td></tr><tr><td> WASH </td><td> H 2 O </td><td> 5 분 (단계를 세 번 반복) </td></tr><tr><td> 질산은 </td><td> 0.2 % 질산은 0,076퍼센트 포르말린 </td><td> 20 분 </td></tr><tr><td> WASH </td><td> H 2 O </td><td> 1 분 (두 번 단계를 반복) </td></tr><tr><td> 개발자 </td><td> 6 % 탄산나트륨 0,0004 % 티오 황산나트륨 0.05 % 포르말린 </td><td> 염색은 충분까지 </td></tr><tr><td> STOP </td><td> 50 % 메탄올 </td><td> 30 분 </td></tr><tr><td></td><td> * 둘의 시간은 최소 시간은 단백질 고정이 필요합니다 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 참고 : 단백질 반점은 MS 호환 실버 스테인 (11)와 젤을 염색하여 시각화 할 수 있습니다. 모든 솔루션은 필요실버 염색은 표 1에 나열되어 있습니다. <ol><li> 각 솔루션 / 겔의 약 200 ML을 준비하고 표 1과 같이 처리 할 것. 조심스럽게 겔을 포함하는 염색 상자에 각 솔루션을 추가합니다. 락 플랫폼에서 모든 인큐베이션을 수행합니다. </li><li> 염색 후 정지 용액을 제거 및 수집 될 때까지 1 % 아세트산 용액에 겔을 떠난다. </li></ol> 2.4) 젤 수집 및 분석 <ol><li> 염색 3 일 이내에 농도계를 사용하여 높은 해상도의 이미지를 획득. </li><li> 2-DE 젤 용 소프트웨어를 이용하여 2-D 단백질의 패턴을 분석한다. 참고 :이 소프트웨어는 빠르고 신뢰할 수있는 이미지 비교를 할 수 있습니다. <ol><li> 상황에 맞는 메뉴에서 "새 프로젝트를 만듭니다"를 선택하여 프로젝트를 만듭니다. 폴더를 생성하고,이 .tif와 "수입 젤 이미지"를 선택 .png를하여 젤을 가져옵니다. 또는 .gel 확장. </li><li> 젤은 수입 w​​orksp에 추가하면에이스, 메뉴에서 "검색 편집&gt; 자리를&gt;"자리 감지 젤을 선택하고 선택하여 자동 자리 감지를 수행합니다. </li><li> 다음으로, 메뉴 "빼기 배경"에서 선택하여 배경 빼기를 수행합니다. 주 : 여러 겔과 비교하고, 정량적 및 / 또는 정 성적 분석에 의한 차이 또는 유사성을 검출하는 것이 가능하다 후있다. </li></ol></li></ol> MALDI-TOF MS 분석에 의해 3 단백질 식별 (그림 3) 3.1) 단백질 소화 <ol><li> 중 (깨끗한 메스로 절단) 수동 또는 자동 절제하여 젤 관심의 물과 소비세 관광 명소와 젤을 씻어. </li><li> , 물 (100 ~ 150 μL)와 젤 입자를 세척 스핀 다운 (400 XG에 30 초)와 액체를 제거합니다. </li><li> 겔 조각 CH 3 CN의 (겔 볼륨에 따라 다름) 동일한 볼륨을 추가하고 젤 조각이 줄어들 때까지 10 ~ 15 분 동안 기다립니다. 겔 입자를 건조 전NA 진공 원심 분리기. </li><li> 50 mM의 NH 4 HCO 3에 희석 된 10 mM Dithioerythritol의 75 ~ 100 μl를 추가하고 56 ° C (감소 단계)에서 30 분 동안 배양한다. 단계 3.1.3에서 설명 된 바와 같이 다시 CH 3 CN으로 겔 부분을 수축. </li><li> mM의 요오도 아세트 아미드가 50 mM의 NH 4 HCO 3에 희석과 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양 용액 (55)의 75 ~ 100 μl를 추가하여 알킬화를 진행합니다. </li><li> 단계 3.1.3에서 설명 된 바와 같이 겔 조각을 커버하기에 충분한 양을 사용 CH 3 CN으로 한번 겔 조각 수축. 진공 원심 분리기에서 건조. </li><li> 20 분 동안 4 ° C에서 4 HCO 3 25 mM의 NH, 5 mM의 염화칼슘 2, 12,5 NG 트립신 / μl를 포함하는 버퍼에 입자를 재수. 겔 조각을 충당하기 위해 버퍼의 충분한 볼륨을 사용합니다. 겔 조각에서 해제 흡수 상층 액을 제거하고 25 mM의 NH 4 HCO 3, 5 mM의 염화칼슘이 트립신없이 외부 전문가위원회를 추가젤을 어. </li><li> 하룻밤 37 ° C에서 적어도 3 시간 (펩타이드 소화에 필요한 최소 시간)에에서 샘플을 둡니다. </li></ol> 3.2) 질량 분광법 분석 (말린 방울 기법) <ol><li> 스테인리스 MALDI 플레이트 상에 스팟의 각 샘플 1 ㎕를 분취하고 50 % CH 3 CN, 0.1 % TFA에서 제조 α-시아 노 -4 - 히드 록 시신 행렬로서 산의 1 μL와 혼합한다. </li><li> MALDI-TOF 질량 분석기에 질량 스펙트럼을 얻습니다. 레이저 강도 신호의 포화를 방지하기 위해 또는 신호를 증가시키기 위해 조정, 스폿 당 약 200 스펙트럼을 축적. 데이터 탐색기 소프트웨어를 통해 프로세스의 스펙트럼은 아래에 설명 된대로 <ol><li> .DAT 파일을 가져와 "과정&gt; 기준 수정"을 선택하여베이스 라인 보정을 수행합니다. "프로세스&gt; 질량 보정&gt; 수동 보정을 선택하여 트립신 자기 분해 제품 및 매트릭스 피크를 사용하여 질량을 보정; m / z 855.1와 2163.1 B에 가까운 피크를 선택y를 누른 후, "음모"를 클릭하고 수동 교정 창에 "교정을 적용", 드래그와 해당 참조 질량을 선택 떠났다. </li><li> ( "활성 추적을 중복&gt; 디스플레이") 활성 추적을 복제, 피크 검출에 대한 임계 값 ( "피크&gt; 피크 검출")을 조정 새 추적을 선택하고 deisotoping ( "피크&gt; deisotoping")을 수행합니다. 매크로 "getpeaklist"를 사용하여, 식별을 위해 사용되는 대중의리스트를 생성한다. 필요한 경우 수동으로 목록을 정리하고 더 나은 식별을 얻을 수있는 봉우리로 고른 잡음 신호를 제거합니다. </li></ol></li><li> 검색 엔진 (12)으로 심오하고 마스코트를 사용하여 포괄적 인 비 중복 단백질 데이터베이스를 검색하여 단백질을 식별합니다. <ol><li> 모든 검색에 다음 매개 변수를 사용하여 하나는 고정 수정 및 initi 펩티드 당 분열, 변수 수정과 같은 메티오닌 산화, 시스테인 carbamidomethylation를 놓쳤다50 ppm으로 알 질량 공차. </li></ol></li></ol> (4) 세포 골격 활동 분석 실험 (그림 4) 참고 : 재현 탁 세포는 완전한 RPMI (10 6 세포 / 200 μL)에서 1 단계에서 정제. 4.1) 마이그레이션 분석. 이 테스트는 분석 세포 (림프구)의 철새 용량의 정량화 할 수 있습니다. 6.5 mm 직경과 5.0 μm의 세공 크기의 트랜스 웰 챔버를 사용 중으로 분석을 수행한다. 상이한 세포 유형의 경우 기공의 크기와 이동 시간 (단계 4.1.3)를 최적화한다. <ol><li> 각각 유발과 자발적인 이동을 측정하기 위해 또는 특정 자극 (즉, SDF-1)없이 완전한 RPMI 600 μl를 첨가하여 하부 챔버를 준비한다. </li><li> 그 위에 상부 챔버를 넣고 시스템이 배양기에서 37 ° C에서 30 분 동안 평형 수 있습니다. </li><li> 종자 10 6 세포 / 다락방에서 200 μL (총 세포 수)와 배양인큐베이터에서 37 ° C에서 4 시간 동안 접시입니다. </li><li> , 상부 챔버를 제거하고 하부 챔버에서 미디어를 수집하고 1 ml의 PBS로 한번 하부 챔버를 씻으십시오. 튜브에 PBS를 수집합니다. </li><li> 오분 300 XG에 원심 분리기, 500 ㎕의 PBS에서 뜨는에 resuspend 폐기합니다. </li><li> 유세포, 인수 1 분 후에 마이그레이션 셀의 개수를 카운트. 절연 세포군 경우에는 어떠한 표면 항체를 추가 할 필요가 없다. 셀 사이드 산란 및 계산에 사용하는 번호는 1 분, 시각화 이벤트의 수를 고려하여 BI 차원 도트 플롯에 셀의 수를 확인한다. </li><li> 마이그레이션 지수 (MI)을로 계산 : <img alt="식 (1)" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq1.jpg"></li></ol> 4.2) 접착 분석. 이 분석은 세포의 부착 능력을 측정한다. 회 반복 분석을 수행합니다. <ol><li> 사전 코트 96-아LS의 50 μL 플레이트 (바닥이 평평한) / 웰 중 하나 밤새 4 ° C에서, PBS에 희석 2 % BSA-PBS (배경) 또는 1 μg ICAM-1. </li><li> PBS로 두 번 접시를 세척하고 37 ℃에서 1 시간 동안 2 % BSA-PBS (100 μL / 웰)에 추가하여 비 특정 사이트를 차단합니다. </li><li> 전체 RPMI에서 5 × 10 6 / ㎖에서 그 동안의 재현 탁 세포에서 1 ㎜ CMFDA 녹색 세포 추적기로 레이블을 37 ° C에서 30 분을 품어. </li><li> 차단 솔루션 (스텝 4.2.2) 폐기 후 1 × 10 6 세포 / 웰 사전 코팅 된 웰에 추가하고 37 ° C에서 1 시간 배양. </li><li> ELISA 리더를 사용하여 접착 성을 정량화 (인가 전압 필터 : 485 nm의 방출 필터 : 535 nm의). 총 입력 (INPUT)에 첫 번째 측정을 수행합니다. </li><li> 2 % BSA-PBS 부드럽게 접시를 씻으 (200 μL / 웰)의 4 배 (배). 각 세척 단계 (접착 배) 후 판의 읽기를 수행합니다. </li><li> 각 측정에 대한 배경 공제 한 후, 특정 ADHES을 계산이온 (접착력) : <img alt="식 (1)" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq2.jpg"></li></ol> 4.3) 중합 분석. 이 F-액틴의 중합을 정량화 비색 분석이다. 회 반복 분석을 수행합니다. <ol><li> 재현 탁 1 × ^ 10 분 6 미리 예열 완료 RPMI 100 ㎕의 세포와 특정 자극을 추가 (즉, α-IgM 항체 20 μg / mL)에서 세척 하였다. </li><li> 4 % 파라 포름 알데히드의 400 μL로 반응을 중지하고 실온에서 10 분 동안 세포를 고정한다. </li><li> (5 분, 4 ° C에 300 XG에 원심 분리기) PBS로 3 회 반복한다. </li><li> 2 분 동안 얼음에 PBS-saponine 0.2 % (200 μL)와 함께 뜨는 Permeabilize 하시려면 세포를 폐기하십시오. </li><li> (5 분, 4 ° C 100 XG에 원심 분리기) PBS-saponine 0.1 %로 3 회 세척 100 ㎕의 PBS-saponine 0.1 %에서 뜨는에 resuspend 폐기합니다. </li><li> t 방에서 30 분 동안 Phalloidin Alexafluor-488 (3 μg / ml)으로 염색어둠 속에서 온도. </li><li> PBS-0.1 % saponine로 3 회 반복한다. 300 ㎕의 PBS에서 뜨는에 resuspend 폐기하십시오. </li><li> Phalloidin의 평균 형광 강도 (MFI)를 계산, 유동 세포 계측법에 의해 F-액틴의 양을 정량화. 형광 강도에 기초하여 히스토그램을 생성하기 위해 단일 ​​차원 플롯에서 생성 된 데이터를 분석하여, MFI 값 그래프 리포트에 나타낸다. </li><li> F-액틴의 중합 (Δ F-액틴) 등을 측정한다 : <img alt="식 (1)" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq3.jpg"></li></ol>

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<html> 이 원고의 목적은이 방법은 다른 질병 및 / 또는 다른 종류의 시료 16 ~ 18로 확장 될 수있다하더라도, CLL의 병인에 관여하는 분자의 식별을 위해 최적화 된 프로토콜을 설명하는 것이다. 나쁜 예후 19 대 좋은 CLL 환자의 두 부분 집합의 프로테옴 프로파일을 비교함으로써, 우리는 그들이 HS1의 인산화 상태에 차이가 있고 정품 인증은 백혈병 세포의 부착 및 이동 용량 영향을 미친다는 것을 보여 주었다. 다른 방법에 대해서는, 원고, 2DE 젤, MS에서 제시 단백체 기술의 주요 장점은, 그들이 셀 프로테옴의 전체 지문을 제공하며, 가장 중요한 그들이 단백질의 번역 후 변형에 대한 정보를 제공한다는 것이다. 차등 적 인산화 또는 당화 아르 단백질은 젤에서 자신의 위치를​​ 변경하고, 가능성이 세포에 자신의 활동을 변경합니다. &quot;ove_content는&gt; 또한, 우리는 세포 골격 기능을...

만성 림프 구성 백혈병 (CLL), 서양 국가에서 가장 일반적인 성인 백혈병, 단일 클론 양성 CD5 + B 림프구의 축적에서 파생 임상 적으로 매우 이질적이다. 그것은 단일 클론 B 세포 림프구 (MBL) 1,2,3 정의 사전 백혈병 형태로서 존재할 수있다. 질병 중 하나 나태한 임상 경과와 함께 나타날 수있는 다른 경우에, 그 치료를 필요로하기 전에 년 동안 안정적으로 유지하거나 실력을 예후 진보적 chemorefractory 질환 등의 치료에도 불구하고. 마지막으로, 자주 치명적인 고 등급 림프종 ​​(리히터 증후군-RS) 2,3,4로 진행 할 수 있습니다. 좋고 나쁜 예후, 질병의 결과 및 생존 예측 인자에 대한 보완적인 정보를 제공 예후 인자의 집합을 기반으로 : 환자는 일반적으로 두 가지 주요 부분 집합으로 분류된다. 임상 적 이질성 가능성이 생물학적 이질성을 반영한다. 유전, 미세 환경 및 CE의 수llular 요인은 더 통합 메커니즘 5 발견되고 있지만 질병의 발병 기전에 동의하는 것으로 나타났다. 상세하게는, 몇몇 연구는 질병의 임상 경과의 차이가 부분적으로 예후 값 6,7,8있는 일부 생물학적 마커의 존재 (또는 부재)에 의해 설명 될 수 있음을 증명하고있다. 이러한 데이터는 질병의 생물학을 더 잘 이해가 예후 표지자 및 치료 대상 모두의 식별 정보를 이용하여, 임상 병리학의 관리를 위해 추가적인 힌트를 제공 할 수 있다는 것을 보여 주었다. 본 연구의 목표는 다른 단백체 기법의 조합은 CLL의 발병과 진행에 관여하는 단백질의 동정에 사용할 수있는 방법을 보여주기위한 것이다. 우리의 접근은 함께 기본적인 단백질체 및 임상 데이터 (5)에 가입 할 수 있음을 보여준다. 선택된 환자에서 본 워크 플로우에서, 주 백혈병 세포(나쁜 예후가 좋은 VS) 격리하고 세포 용 해물이어서 단백체 맵을 얻기 위해 사용된다. 2DE 따라서 각 단백질의 생물학적 활성에 대한 간접적 인 정보를주는 번역 후 변형을 포함하는 세포 집단의 프로테옴 프로파일의 특성화를 허용한다. 전체 세포 용 해물은 그들의 분자량에 기초하여 단백질을 해결 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 실행 번째 차원이어서, 등전점에 기초하여 제 적합 실행에 의해 해결된다. 프로테오믹스 맵의 비교 분석은 차등 발현 된 단백질의 동정을 허용 (모두 풍부하고 번역 후 변형의 관점에서) 절단 및 질량 분광법에 의해 분석 될 수 겔 반점. 각 후보의 역할은 다음 서로 다른 분석에 의해 악용 될 수 있습니다. 현재 원고 CLL에 제한이 방식은, 쉽게 따라서 proteomi에 대한 정보를 제공하는 다른 질병 / 샘플로 확장 될 수있다(최저 대 비자극, 야생형 대 자극 정상 대 병리 즉,) 두 군 사이에 C / 생물학적 차이.

<table><tbody><tr><td>아세토니트릴</td><td>머크</td><td>61830025001730&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 바이카보네이</td>트 <td>SIGMA</td><td>A6141-500G</td><td></td></tr><tr><td>1,4-디티오에리스리톨</td><td>SIGMA</td><td>D9680-5G</td><td></td></tr><tr><td>요오도아세트아미드</td><td>SIGMA</td><td>I6125-25G</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>SIGMA</td><td>223506-25G</td><td></td></tr><tr><td>트립신, 시퀀싱 등급</td><td>ROCHE</td><td>11418475001</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;- 시아노-4-하이드록시신남산</td><td>SIGMA</td><td>C2020-10G</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>SIGMA</td><td>T6580</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip&micro;-C18</td><td>MILLIPORE</td><td>ZTC18M096</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep 인간 B 세포 농축 칵테일</td><td>STEMCELL</td><td>15064</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>EUROCLONE</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>DOMINIQUE DUTSCHER</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>림포렙</td><td>SENTINEL DIAGNOSTICS</td><td>1114547</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루</td><td>SIGMA</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07770</td><td>ECD</td></tr><tr><td>CD5</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07754</td><td>PC5</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07746</td><td>FITC</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD</td><td>345785</td><td>PE</td></tr><tr><td>CD16</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07767</td><td>PC5</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07789</td><td>PC5</td></tr><tr><td>Ettan IPGphor 3 등전 초점 장치</td><td>GE-Healthcare</td><td>11-0033-64&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>SIGMA</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hcl 버퍼</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>SIGMA</td><td>C2020-10G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>SIGMA</td><td>D9163-5G</td><td></td></tr><tr><td>IPGstrips</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-1233-01&nbsp;</td><td>선형 pH 4-7 18cm</td></tr><tr><td>IPGbuffer</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-6000-86</td><td>pH 4-7</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>SIGMA</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>PROTEAN II XL 세포</td><td>BIO-RAD</td><td>165-3188</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>INVITROGEN</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamide</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>INVITROGEN</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>SIGMA</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>VWR</td><td>631000</td><td></td></tr><tr><td>포르말린</td><td>BIO-OPTICAL</td><td>05-K01009</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>9832500</td><td></td></tr><tr><td>티오황산나트륨</td><td>FLUKA</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>질산은</td><td>FLUKA</td><td>85228</td><td></td></tr><tr><td>분자 역학 개인 SI 레이저 농도계</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageMaster 2D Platinum 5.0</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>탄산나트륨</td><td>MERCK</td><td>A0250292</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF Voyager-DE STR</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data Explorer 소프트웨어(버전 3.2)&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트랜스웰 챔버 6.6mm 직경</td><td>CORNING</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>유로클론</td><td>ECB2000L</td><td>L-글루타</td></tr><tr><td>민 겐타마이신</td><td>SIGMA</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1</td><td>PREPROTECH</td><td>300-28A</td><td></td></tr><tr><td>평면 바닥 96웰 플레이트</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>산타 크루즈</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R & D Systems</td><td>720-IC</td><td></td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>Life Thechnology</td><td>C7025</td><td>Green</td></tr><tr><td>IgM</td><td>SOUTHERNBIOTECH</td><td>2020-02</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>SIGMA</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>SIGMA</td><td>S-7900</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&nbsp;</td><td>생명 Thechnology</td><td>A12379</td><td>알렉사 플루어 488</td></tr></tbody></table>

단백질 기능에 2de - 젤 지점에서 만성 림프 구성 백혈병에 hs1에서 배운 레슨

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

종양의 개시 및 진행에 관여하는 분자의 확인은 환자의 임상 적 관리를 위해, 그 결과로서, 질병의 이해를위한 기초 생물학이고. 본 연구에서 우리는 만성 림프 구성 백혈병 (CLL)의 진행에 관여하는 분자의 식별을위한 최적화 프로테오믹스 방법을 설명한다. 구체적으로, 백혈병 세포 용 해물은 2 차원 전기 영동 (2DE)에 의해 해결되고 2DE 젤의 &quot;명소&quot;로 시각화. 단백질체지도의 비교 분석은 질량 분석 (MS)에 의해 격리 포착하고 식별 (풍부하고 번역 후 변형의 관점에서) 서로 다르게 발현 된 단백질의 식별을 할 수 있습니다. 확인 된 후보의 생물학적 기능은 우리가 주 백혈병 세포에 최적화 된 것으로, 다른 분석 (즉, 마이그레이션, 접착력과 F-액틴의 중합)에 의해 테스트 할 수 있습니다.

우리는 차 백혈병 B 세포 만성 림프 구성 백혈병 환자의 PB를 형성 고립 된 우리는 프로테옴지도를 분석 하였다. 샘플 (N = 104)는 각 환자 (좋은 예후 대 나쁜 예후)과 2DE 젤의 비교 분석이 수행 된 임상 기능에 따라 두 가지 주요 부분 집합으로 그룹화 하였다. 분석을 허용 차등이 부분 집합 사이에 표현 명소의 식별 (번역 후 변형의 변화를 암시하는 존재 / 부재 또는 겔에 변화의 관점에서, n은 ≈ 16). 우리는 MALDI 판에 발견 된 2DE 젤에서 감소 및 알킬화되고, 단백질은 트립신 상층 액에서 펩타이드로 분해 된 후 선택한 지점을 절제. 스펙트럼은 MALDI-TOF 보이저 DE에서 획득 하였다. 그 결과 피크 목록은 마스코트와 심오한에 제출했다. 특정 질량 공차 내의 대중 간주 단백질로 데이터베이스의 펩티드 서열을 할당하고 조립이 특정 확률 점수 (그림 3)을 통과하면 확인했다. 이 분석함으로써 우리는 주로...

여기에서 우리는 커플이 프로테오믹스 기술, 즉 전기 영동 (2DE)와 질량 분석기 (MS) 2 차원, 차동 차 샘플 두 개 이상의 그룹 중 / 번역 후 변형 된 단백질을 발현 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은, 실험과 함께 기능성, 예후 마커 / 치료 대상의 식별 및 특성을 허용한다.

단백질 기능에 2DE - 젤 지점에서 만성 림프 구성 백혈병에 HS1에서 배운 레슨

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

다음 실험의 전반적인 목표는 결합된 단백질체학 접근법을 사용하여 인간 질병의 잠재적인 예후 마커 및/또는 치료 표적을 식별하는 것입니다. 이는 환자의 말초 혈액에서 원발성 백혈병 세포를 분리하고, 예후가 좋거나 나쁘며, 두 번째 단계로 단백질체학 분석에 사용할 CD 19 및 CD 5 표면 마커를 모두 발현함으로써 달성됩니다. 백혈병 세포 용해물은 2차원 전기영동 또는 2de에 의해 분해되며, 단백질체 맵의 비교를 통해 예후가 양호한 환자와 나쁜 환자 간에 다르게 발현된 반점을 식별할 수 있으며, 이는 이후에 질량 분석기 또는 MS로 식별할 수 있습니다.다음으로, 질병의 자연사에서 확인된 단백질의 역할을 검증하고 해부하기 위해 다른 분석을 사용할 수 있습니다. 결과는 두 개의 de gel에 의해 감지된 HS 1의 다른 인산화 상태가 환자의 임상 결과와 상관관계가 있음을 보여줍니다. 이 기술의 의미는 만성 림프구성 백혈병의 치료로 확장되는데, 그 이유는 예후 마커 및/또는 이 절차가 저와 함께 할 것임을 보여주는 치료 대상으로 활용할 수 있는 질병의 진행에 관여하는 단백질을 식별하는 데 도움이 될 수 있기 때문입니다.Pamela는 실험실의 기술자와 외부 실험실의 박사후 연구원에게 달려갔습니다.이 절차를 시작하기 전에 헤파린이 함유된 액포 혈액 채취 튜브에서 말초 혈액을 채취하십시오. 혈액을 15ml 튜브로 옮기고 전혈 1ml당 50마이크로리터의 인간 B 세포 농축 칵테일을 추가합니다. 그런 다음 잘 섞어 실온에서 20분 동안 배양합니다.배양 후 동일한 부피의 PBS와 2% FBS 혼합물로 샘플을 희석하고 인터페이스가 손상되지 않도록 플라이 콜 위에 혈액을 조심스럽게 오버레이합니다. 시료를 400배 G로 실온에서 20분 동안 중단 없이 원심분리합니다. 완료되면 계면을 조심스럽게 흡인하여 세포를 회수하고 새 튜브에 넣습니다.원심분리 및 상등액 제거 후 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 소생. 희석 후 튜브를 앞뒤로 수동으로 튕겨 남은 상등액에 펠릿을 매달아 놓습니다. 완전한 RPMI 배지를 사용하여 Trian blue exclusion 방법을 사용하여 세포를 계수합니다.다음으로, 팩스 튜브에 있는 정제된 세포 현탁액 100마이크로리터에 다음 항체를 추가합니다. 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 20분 동안 샘플을 배양합니다. PBS 4ml로 시료를 세척한 후 유세포 분석으로 순도를 확인합니다.만성 림프구성 백혈병 또는 CLL 세포의 비율을 확인하십시오., Coex가 표면에 CD 19와 CD 5를 발현합니다. 플롯에서 CD 3, CD 14 및 CD 1656의 비율을 확인하여 제제에 NK t 림프구와 단핵구가 거의 없는지 확인합니다. CLL 세포 펠릿을 380마이크로리터의 최종 부피의 2차원 전기영동 완충액으로 용해합니다.단백질 샘플 1mg을 18개의 IPG 스트립에 적용하여 iso 전기 집중을 수행합니다. 실행 후, 실온에서 15분 동안 2%의 신선한 DTT를 보충한 2ml의 평형 완충액으로 스트립을 평형화합니다. 용액을 버린 후 2.5%I oto 아세트아미드가 보충된 2ml의 평형 완충액을 첨가합니다.그런 다음 흔들 플랫폼에서 실온에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 젤을 건드리지 않고 종이에 스트립을 건조시켜 과도한 용액을 제거하십시오. 건조되면 9-16% gradient SDS 페이지 젤 위에 각 스트립을 로드합니다.스트립의 로딩을 용이하게 하기 위해 겔 위에 소량의 SDS 전기영동 버퍼를 추가합니다. 다음으로, 스트립이 뜨는 것을 방지하기 위해 약 5 밀리리터의 0.8 % 한천 용액을 첨가하여 젤을 밀봉합니다. 전기영동 장치가 조립되면 SDS 전기영동 버퍼로 채웁니다.그런 다음 젤당 60밀리암페어에서 섭씨 4도, 4시간 동안 또는 냉각 시스템을 사용하여 실행합니다. 전기영동 장치에서 겔을 제거한 후 적절한 염색 상자에 넣습니다. 각 용액을 약 200 밀리리터 준비하십시오.젤이 들어 있는 염색 상자에 각 용액을 조심스럽게 첨가합니다. 흔들리는 플랫폼에서 모든 인큐베이션을 수행하십시오. 얼룩이 지면 정지 용액을 제거하고 획득할 때까지 1%아세트산 용액에 겔을 그대로 두십시오.이동 분석의 경우, resus는 이전에 정제된 세포를 현탁시킵니다. 완전한 RPMI에서는 특정 자극의 유무에 관계없이 600마이크로리터의 완전한 RPMI를 추가하여 하부 트랜스웰 챔버를 준비합니다. 유도 이동과 자발적 이동을 각각 측정하려면 상부 챔버를 맨 위에 놓고 시스템이 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 30분 동안 평형을 이루도록 합니다.완료되면 상부 챔버의 200마이크로리터당 6개 셀에 10개를 파종하고 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 4시간 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후 상부 챔버를 제거하고 하부 챔버에서 배지를 수집합니다. 그런 다음 PBS 1ml로 하부 챔버를 한 번 세척합니다.튜브에 PBS를 채취한 후 상층액 제거 후 300배 G에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 유세포 분석을 통해 500마이크로리터의 PBS에 시료를 재현탁합니다. 획득 후 1분 후에 마이그레이션된 셀의 수를 계산합니다.bidimensional dot plot에서 셀의 측면 산란과 계산에 사용할 숫자인 1분 동안 시각화된 이벤트의 수를 고려하여 확인합니다. CLL 환자로부터 분리된 1차 백혈병 세포 샘플을 각 환자의 임상적 특징에 따라 두 개의 주요 하위 집합으로 그룹화하고 특정 질량 허용 오차 내에서 두 개의 DE 및 MS 질량으로 분석했습니다. 데이터베이스의 펩타이드 염기서열에 할당된 후 특정 확률 점수를 통과하면 식별된 것으로 간주되는 단백질로 조립되었습니다.이 분석을 통해, 주로 세포골격 활성과 대사 과정에 관여하는 단백질이 이들 단백질에서 확인되었다. 조혈 계통, 세포 특이적 단백질 또는 hs. 질병의 임상 경과와 밀접한 관련이 있는 차등 인산화가 차등적으로 발현된 것.특히 한 군데를 가진 환자는 나쁜 임상 결과를 경험하는 반면, 두 군데를 가진 환자는 예후가 좋습니다. HS 1을 하나의 반점으로 운반하는 CLL 세포는 하이포인산화된 HS에 비해 이동, 접착 및 액틴 중합 측면에서 세포골격 활성이 손상된 것으로 밝혀졌습니다. 하나, 두 개의 스폿 샘플. 따라서 다른 임상 행동을 설명합니다.이 비디오를 시청한 후에는 단백질체학을 사용하여 예후 마커 및/또는 치료 표적으로 사용할 수 있는 질병의 진행과 관련된 생물학적 후보를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 프로토콜은 딥 시퀀싱(deep-sequencing)을 통해 림프종의 재조합된 면역글로불린 중쇄 VDJ 영역을 조사하고 VDJ 재배열 및 체세포 과돌연변이 상태를 검색하여 개별 종양의 클론 구조를 설명하는 방법을 설명합니다. 쌍을 이룬 진단과 재발 샘플 사이의 클론 구조를 비교하면 림프종 재발 클론 진화 모드가 밝혀집니다.

VDJ-SEQ : B 세포 림프종의 클론 진화 패턴을 나타 내기 위해 재 배열 면역 글로불린 무거운 체인 유전자의 깊은 시퀀싱 분석

여기에 설명된 프로토콜은 다양한 조건에서 배양된 만성 림프구성 백혈병(CLL) 세포의 퓨린 대사를 측정하기 위해 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하는 쉽고 재현 가능한 방법을 나타냅니다.

HPLC 기반 분석은 인간의 만성 림프 구성 백혈병 세포에 세포 외 뉴클레오티드 / 뉴 클레오 시드 신진 대사를 모니터링하기

기존 알고리즘 바이오 마커 검출 데이터 집합에 대 한 하나의 솔루션을 생성합니다. 이 프로토콜의 여러 마찬가지로 효과적인 솔루션의 존재 및 고 생물 의학 연구원 제안된 과제에 대 한 데이터 세트를 조사 수 있도록 사용자 친화적인 소프트웨어를 제공. 컴퓨터 과학자 들은 팬 들은이 기능에 그들의 바이오 마커 검출 알고리즘의 정보를 제공할 수도 있습니다.

마찬가지로 효과적인 이진 분류 공연으로 여러 바이오 마커 하위 집합 선택

여기, 우리 제시 내용은 기술적인 측면 및 만성 림프모구 백혈병 (CLL) 환자에서 강력한 IG 유전자 순서 분석을 위해 필수적인 요구 사항에 유럽 연구 이니셔티브의 축적 된 경험에 기반 하는 프로토콜 CLL (에릭)입니다.

만성 림프모구 백혈병에서 면역 글로불린 유전자 순서 분석: 시퀀스 해석 환자 자료에서

만성 림프모구 백혈병 (CLL)은 서방 세계에서 가장 흔한 백혈병이 이다. NFAT 녹음 방송 요인 개발 및 많은 세포 유형에 활성화의 중요 한 레 귤 레이 터는. 여기, 우리 NFAT2의 소설 대상 유전자를 식별 하기 위해 인간의 CLL 세포에 chromatin immunoprecipitation (칩)의 사용에 대 한 프로토콜을 제시.

만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

생체 외에서 B 세포 플라즈마 세포 차별화 모델을 보고 다단계 문화 시스템을 사용 하 여, 우리.

수명이 긴 플라즈마 세포에 인간의 정상적인 메모리 B 세포의 체 외 분화 모델

여기서 우리는 IS의 형성 동안 B 림프구에서 세포 편광 사건을 특성화하는 두 가지 접근법을 기술한다. 첫 번째, 세포 기관 모집 및 시 냅 스 막에서 세포 골격 재배열의 정량화 포함. 두 번째는 면역 시냅스에 대한 편광을 겪는 중심도의 조성의 변화를 특성화하는 생화학적 접근법입니다.

면역 시 냅 스 형성 하는 동안 B 세포에서 세포 역학 공부

이 프로토콜은 1 차적인 만성 림프구성 백혈병 세포에서 핵 및 세포질 분획의 최적화 그리고 연속적인 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이 견본은 세포 자극 및 약 처리에 핵과 세포질 구획 사이에서 일어나는 단백질 인신 매매에 있는 단백질 현지화 그리고 변경을 결정하기 위하여 이용됩니다.

핵/세포질 단백질 인신 매매를 모니터링하기 위한 1차 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 분열

여기서 우리는 B 세포에 견인력 현미경 실험을 수행하는 데 사용되는 프로토콜을 제시한다. 우리는 연약한 폴리 아크릴아미드 젤의 준비와 그 기능성, 현미경에서의 데이터 수집 및 데이터 분석의 요약을 설명합니다.

B 림프구 활성화를 연구하는 견인력 현미경 검사법

여기에서 우리는 비드 지원 지질 Bilayers를 사용하여 합성 항원 제시 세포의 단계별 재구성을 위한 프로토콜을 제시하고 활성화된 T 세포에서 시냅스 출력을 심문하는 그들의 사용.

T 세포 면역 시냅스의 미립자 출력을 연구하기 위해 비드 지원 지질 이중층의 준비

우리는 세포 증식 염색을 사용하여 제브라피시 T-급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포를 식별했습니다. 염색은 분열하지 않는 세포에 유지되고 세포 증식 중에 감소하여 추가 조사를 위해 휴면 세포를 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포 정지의 맥락에서 자가 재생을 연구하기 위한 기능적 도구를 제공합니다.

세포 증식 염색을 사용한 제브라피시 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포 식별 

학습하세요 만성림프구성백혈병 연구를 위한 2차원전기영동 및 질량분석법을 활용한 단백질 기능 분석 방법입니다. HS1 단백질의 인산화 상태가 환자 예후와 관련된 바이오마커를 식별하는 데 활용됩니다.

단백질 기능에 2DE - 젤 지점에서 만성 림프 구성 백혈병에 HS1에서 배운 레슨

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