Name: 측정 공간적 칼슘 2 + 신호 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 학습하세요 아라비도시스 식물에서 비생물적 스트레스 조건 하의 세포 및 전체 식물 수준 칼슘 신호 측정 방법을. 유전자 인코딩 칼슘 지시자를 활용한 이 기술은 식물 스트레스 반응 메커니즘 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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기술 지원을 해주신 B. Stevenson님과 Aequorin 유전자 변형 라인을 제공해 주신 Marc R. Knight 박사님께 감사드립니다. 이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 R01 GM059138의 지원을 받았습니다.

FAS 시스템을 사용하여 1 애큐 오린 기반 칼슘 이미징 <ol><li> 발광 이미징을위한 모종을 준비합니다. 0.01 % 트리톤-100를 포함하는 10 % 표백제 용액으로 애큐 오린을 표현 애기 장대 식물의 종자를 소독. 전체 강도 MS (무라 시게와 스쿡 기초 소금의 혼합물), 1 %의 자당, 1.2 % 한천을 포함하는 사각형 접시 (격자 10 × 10cm 사각형 페트리 접시)에 멸균 씨앗을 뿌리고. 수직으로 이일 4 ° C (그림 1A)에서 층화 후 성장 챔버에 넣어 판. </li><li> 필름에 묘목을 전송합니다. 접시에 성장 7-10일 된 모종의 상단에 접착 필름 (그림 1B)를 놓습니다. 조심스럽게 모종 필름 (그림 1C)을 준수하는지 확인하기 위해 손으로 필름을 밀어 넣습니다. 모종이 필름에 부착 된 상태로 유지되도록 조심스럽게 필름을 벗겨 (그림 1D 및 1E) </li><li> 보조 인자 (cofactor)로 모종을 품어. 배치포함 된 각 접시 (10 × 10cm) 상에 dhered 모종 2 μg의 15 ㎖ / ML의 H-CTZ 물 (coelenterazine). 하룻밤 (그림 1 층)에 4 시간 동안 실온에서 묘목을 품어. </li><li> 발광 이미지를 준비합니다. 두 조각을 형성, H-CTZ 솔루션에서 필름을 가지고 중간을 잘라. 모종은 두 개의 서로 다른 판에 얼굴 필름의 각 조각을 놓습니다. 5 분 동안 어둠 속에서 판을 둡니다. </li><li> 발광 이미지를 획득. 어둠 속에서 옆에 발광 이미징 시스템 (그림 1G)의 무대에서 서로 두 판을 배치합니다. 동시에 즉시 플레이트에 자극 용액 20 ㎖를 첨가시에 화상을 취득. </li><li> 발광 이미지를 분석합니다. 모든 발광 이미지에 대해 동일한 표시 범위를 선택합니다. 관심 (ROI)의 영역을 자르기 및 JPEG 파일 (그림 2A)와 같은 이미지를 생성합니다. 또한, SPE 형식 파일로 이미지를 내보내고로 가져ImageJ에 이미지 분석 소프트웨어. ROI의 평균 그레이 값의 계산을위한 설정 측정. ROI 영역의 같은 크기를 선택하고 막대 그래프 (그림 2B)로 평균 그레이와 현재의 데이터를 측정합니다. </li></ol> 2 라이브 셀 공 촛점 칼슘 이미징 <ol><li> 공 촛점 이미징을위한 모종을 준비합니다. 0.01 % 트리톤을 포함하는 10 % 표백제 용액으로 case12을 표현 애기 장대 식물의 종자를 소독. 풀 강도 MS 염, 1 % 자당, 1.2 % 한천을 포함하는 접시에 무균 씨앗을 뿌리고. 이일 4 ° C에서 층화 후 성장 챔버에서 수직으로 배치 접시. </li><li> 설치 이미징 챔버 <ol><li> 슬라이드와 커버 슬립 (상공 회의소)를 사용하여 이미징 챔버를 조립합니다. 슬라이드의 중간에 물을 적신 탈지면의 조각을 놓습니다. 그런 다음 물에 적신 탈지면의 상단에 접시에서 하나 또는 두 개의 오일 된 모종을 전송합니다. 커버 슬립,의 각 모서리에 점토의 작은 조각 스틱커버 슬립 및 슬라이드 사이의 간격 (챔버) (그림 3A, 왼쪽 패널)를 만들 수있는 모종의 상단에 D 장소 coverslip에. 1 ML의 주사기에 폴리에틸렌 관 (0.58 mm 직경)의 한쪽 끝을 연결하고 챔버에 바로 인접 튜브의 다른 쪽 끝을 배치합니다. 테이프 (그림 3A, 오른쪽 패널)와 장소에 튜브를 잡습니다. </li><li> 플렉시 글라스 챔버 (챔버 B)를 사용하여 촬상 챔버를 조립한다. <ol><li> 플렉시 글라스 챔버의 양쪽에있는 채널로 코팅 된 튜브를 두 폴리에틸렌 관 (0.58 mm 직경)의 주위에 실리콘 그리스를 얇게 확산 누릅니다 (그림 3b는 왼쪽 패널). 튜브 홈을 포함하는 챔버의 표면 상에 실리콘 그리스를 얇게 펴고 챔버 개구 (잘라)의 한쪽을 밀봉하는 그리스로 커버 슬립을 누른다. </li><li> 챔버로 판에서 오일 된 묘목을 전송하고 상단 오에 물에 흠뻑 탈지면의 조각을 배치묘목 바. 챔버의 다른 표면에 실리콘 그리스를 확산하고, 인감 위에 다른 커버 슬립을 누릅니다. 1 ML의 주사기에 튜브 중 하나의 끝을 연결합니다. 다른 관 오픈 (그림 3B 오른쪽 패널)의 끝을 둡니다. </li></ol></li><li> 챔버 커버 유리 (챔버 C)를 사용하여 촬상 챔버를 준비한다. 70 % 에탄올로 챔버 커버 유리를 소독하고 건조까지 후드에 두십시오. 0.6 ML 또는 각각이 잘 챔버의 각 웰 또는 8 잘 챔버로 (그림 3C 오른쪽 패널)를 1 % 자당 및 0.5 % phytagel를 포함하는 전체 강도 MS 매체의 0.2 ML을 추가합니다. 종자를 소독하고 명확한 젤의 얇은 층을 포함하는 챔버 커버 유리에 직접 씨앗을 뿌리고 그들을 오일 (그림 3C)에 대해 수직으로 성장 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득. 얼음-COL 천천히 150 mM의 NaCl을 약 200 μl를 주입, 염분, 감기 나 과산화수소와 같은 스트레스 자극을 적용하려면직전에 각각의 이미지를 획득하거나 부드럽게 2 또는 8 잘 챔버의 웰에 자극 용액 500 ㎕를 100 μl를 추가로 실 (챔버 A 또는 B)에 D 물 또는 1 ㎜ H 2 O이 솔루션 . 이미지 캡처 즉시 20X 물 침지 렌즈 (개구 수 0.75) 반전 니콘 A1R 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 자극 솔루션을 적용한 후. 각각 550 나노 미터, 512 X 512 픽셀의 해상도에서 - 488 nm 내지 500의 여기 및 발광 파장의 4 초 간격으로 화상의 시계열을 모은다. </li><li> 이미지 분석 니콘 요소를 사용하여, ROI를 원하는 각 셀 (또는 영역)의 주위에 그려졌다. 각 투자 수익 (ROI) 내에서 전체 강도는 시간 측정 대화 상자 (ImageJ에 대신 사용될 수있다)를 사용하여 시간이 지남에 따라 측정 하였다. 전체 강도 측정은 수출 및 DataGraph에서 처리되었다. 칼슘 스파이크 진폭 번째로 피크 강도 마이너스 휴식 강도, 지속 기간으로 정의 하였다이 스파이크의 스파이크 인접한 피크 사이의 시간 간격 등의 개시 및 종료 스파이크 및 기간 간의 전자 시간. -test는 수단과 비교하는 데 사용 된 T. </li></ol>

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우리는 애기 장대 모종의 공간 - 시간 칼슘 응답을 기록하는 FAS 시스템을 증명하고있다. 이 FAS 칼슘 기록 시스템은 칼슘 여기되게됩니다 비 생물 적 스트레스 자극뿐만 아니라 다양한 자극에 의해 발생 2 + 역 동성을 측정하기 위해 적용 할 수있는, 간단한 민감하고 강력한 접근 방식을 제공합니다. 이 시스템을 사용하여, 우리는 쉽게 전체 플랜트 레벨에서 조직 - 또는 자극 특정 시공간 칼슘 역학을 비교할 수있다. FAS의 고감도 고강도 응력을 사용할 때 셀에 물리적 손상으로 인한 아티팩트를 방지하는 것이 중요하다 칼슘 응답을 조사하기위한 저 강도의 자극을 사용할 수있다. 다른 생리 학적 단계에서 모종은 주어진 자극에 대한 응답으로 다른 민감도와 특이도를 가질 수 있지만 십일 애기 모종 세븐, 조직 또는 자극 특정 칼슘 반응을 보였다. 따라서이다약 100 모종 필름의 한 조각에 부착 될 수있는 FAS 측정의 ...

식물 세포는 세포의 행동을 통해 시그널링 좌표 환경에 응답한다. 환경 자극에 대한 응답으로 이벤트를 신호 초기 셀은 일시적인 칼슘 증가이다. 자유 칼슘 농도의 패턴, 또는 일시적인 증가의 서명은 그 진폭, 주파수 및 시간에 의해 특징된다. 고유 시공간 칼슘 서명은 다른 세포 활동 한을 조절한다. 열, 냉기, 소금, 가뭄, 빛, 또는 식물 호르몬과 같은 특정 자극, 미세 조정할 수 막 화 된 칼슘 채널 및 / 또는 수송의 시공간적 활동을, 특정 칼슘 서명 결과. 칼슘 수송이 잘 특징으로되어 있지만, 작은 식물 하나의 칼슘 채널의 분자 정체성과 기능에 대한 알려져있다. 자극을 강조하는 변경 칼슘 반응과 돌연변이에 대한 유전 스크린은 효과적인 APPR 수 있습니다칼슘 서명을 구성하는 구성 요소를 식별하기위한 oach. 최근 몇 애큐 오린 기반 칼슘 탐지 시스템은 병원균의 공격과 비 생물 적 스트레스 2-4에 대한 응답으로 구성 요소를 신호 칼슘 2에 대한 유전 화면을 용이하게 개발되었다. 애큐 오린 처음 1990 년대 초에 5 칼슘보기 식물체에서 2 + 신호를 검출하는데 사용되었다. 그 이후로, 애큐 오린은 같은 칼슘이 특정 세포를 모니터링 할 수있는 루트에서 8 tonoplast 세포질 5, 핵 6, 엽록체 7, 미토콘드리아 9, 간질 열뿐만 아니라, 서로 다른 종류의 세포 등 다양한 세포 구획을 타겟으로하고있다 + 신호 11. 애큐 오린 기반 칼슘 측정은 자극을 강조하는 세포 집단의 공간과 시간 칼슘 반응을 알 수있다. 그러나 대부분의 경우, 하나의 셀의 칼슘 반응 unsynchroni 아르응답 조직 사에 데이빗. 따라서, 애큐 오린 칼슘 기록은 반드시 각각의 세포에서 칼슘 신호를보고하지 않습니다. 최근 몇 년 동안, 유전자 인코딩 형광 단백질 (FP)는 높은 해상도로 세포 내 신호 칼슘 2를 연구하는 데 사용 된 칼슘에게 같은 노란색 카멜레온 (YCS) 12 CASEs12 (13) 등 2 + 지표를 기반. YCS는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)는 CFP를 포함, 칼슘에게 2 + 지표를 기반 및 YFP이 단백질 칼 모듈 린과 칼 모듈 린 결합 펩티드 M13을 -binding 2 + 칼슘에 의해 연결된 변종입니다. 이 칼슘 결합으로 칼 모듈 린함으로써 증가 된 에너지 전달 (FRET 강화)의 결과로, 더 가깝게 CFP와 YFP을 제공, 구조적 변화를 겪는다. CFP 신호 강도에 YFP의 비율로 대략적으로 계산 된 시간에 따른 FRET 레벨은, 내 Ca 2 +보기 역학을 반영한다. 여러 YC 버전은 식물에서 사용되어왔다. YC3.6은 t이었다세포질 14, 15, 16 핵, 미토콘드리아 (17) 및 세포막 (18), 그리고 YC4.6 및 D4ER에 argeted는 ER 15,19를 대상으로하고, D3cpv는 퍼 옥시 솜 (20)을 대상으로 하였다. YCS를 발현하는 형질 전환 식물은 서로 다른 세포 유형의 서로 다른 세포 구획 내 칼슘 역학의 라이브 세포 이미징을 할 수 있습니다. 케이스 (아마도 칼슘 lcium 자체 nsor)는 칼 모듈 린과 칼 모듈 린 결합 펩티드 M13을 품고 하나의 원 순열 형광 단백질 (cpFPs)입니다. 칼슘 이온에 결합되면, 경우는 형광 강도의 증가로 이어지는 구조 변화를 겪는다. CASE의 형광 반응과 칼슘 이온 농도의 상관 관계는 세포 내 칼슘 역학을 정량적으로 측정 할 수 있습니다. Case12 변형이 12 배는 칼슘 포화 지방 형태로 형광을 증가했다. N. benthiminana 식물 일시적으로 EXPR싱 Case12 또는 안정적으로 케이스 (12)를 표현하는 애기 장대 식물은 방어와 비 생물 적 스트레스 4,21에서 칼슘 신호 전달을 연구하는 데 사용되었다. 또는 탈수 스트레스에 병원균의 공격에 대응하는 세포에서 비동기 공간과 시간 칼슘 진동은 Case12 기반의 칼슘 이미징 공개되었다. 여기서 우리는 애기 모종 2 + 역학 칼슘 특정하고, 세포질의 공 초점 이미징 및 핵 CA의 조직 -와 자극의 애큐 오린 기반 발광 이미징에 대한 자세한 지침을 제시 FAS의 케이스 (12) 발광 영상을 표현 애기 루트 세포 2 + 역학 그대로 식물 또는 여기에 설명되지 않은 조직에서 스트레스에 의한 칼슘 역학을 분석하기 위해, 또는 2 + 신호 칼슘에 의한 변형 된 스트레스와 돌연변이에 대한 돌연변이 애기 장대 식물 집단을 선별 적용 할 수있다. 라이브 세포 칼슘 영상 설정은 칼슘을 분석하기에 적합 할 수다른 칼슘 지표를 사용하여 다른 subcelluar 구획 내에서 또는 서로 다른 세포 유형에서 2 + 역학.

<table><tbody><tr><td>10 cm x 10 cm 사각형 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>60872-310</td><td></td></tr><tr><td>접착 필름</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙</td><td>PerkinElmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>VWR</td><td>53548-000</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 그리스</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>2-웰 챔버 커버 유리&nbsp;</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td></td></tr><tr><td>8-well 챔버 커버 유리</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>발광 이미징 시스템</td><td>Princeton Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>도립 공초점 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>니콘 A1R&nbsp;</td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>니콘 엘리먼트&nbsp;</td></tr><tr><td>DataGraph</td><td>Visual Data Tools Inc</td><td>N/A</td><td>DataGraph 3.1.1은 최신 버전입니다.</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>NanoLight Technolgies</td><td>#301B NF-BCTZ-FB</td><td></td></tr><tr><td>다목적 표백제</td><td>Any local store N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151500</td><td></td></tr><tr><td>MS salt</td><td>Phytotechnology Labs</td><td>M524-50L</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR</td><td>BDH8029-12KG</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>시그마</td><td>A1296-5KG</td><td></td></tr><tr><td>피타젤</td><td>시그마</td><td>P8169-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

측정 공간적 칼슘 2 + 신호

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

발육 및 환경 단서 칼슘보기 식물 세포에서 2+ 변동을 유도한다. 자극 특정 시공간 칼슘 패턴이 칼슘 신호 폭포를 시작 세포의 칼슘 결합 단백질에 의해 감지된다. 그러나, 우리는 여전히 특정 칼슘 신호가 생성되는 자극 방법에 대한 약간 알고있다. 칼슘 신호의 특이성은 주어진 자극에 응답하여 칼슘 이온 채널들 및 / 또는 전송기의 활동 정교한 조절에 기인 할 수있다. 이들 세포 성분을 식별하고 그들의 기능을 이해하기 위해서는 조직 및 세포 수준에서 모두 칼슘 신호를 구분하고 강력한 기록을 허용 시스템을 사용하는 것이 중요하다. 서로 다른 세포 구획을 대상으로 유전자 인코딩 칼슘 지표 세포 칼슘 신호의 라이브 세포 공 촛점 이미징을위한 플랫폼을 제공하고 있습니다. 여기에서 우리는 명령을 설명이 칼슘 감지 시스템의 용도들 : FAS (필름 점착 모종), 발광 칼슘 이미징 기반 case12 생균 공 초점 형광 칼슘 이미징 기반의 애큐 오린. Case12를 이용한 생균 공 촛점 이미지는 높은 해상도 세포질과 핵 칼슘 신호의 동시 검출을 제공하면서 FAS 시스템을 사용하여 발광 이미징은 조직 수준에서 시공간적 칼슘 신호의 단순 견고하고 민감한 검출을 제공한다.

만니톨, 염화나트륨 및 H 2 O 2는 각각, 탈수, 소금 및 산화 스트레스 자극에 대한 프록시로서 사용 하였다. 중금속 이온의 Cu 2 +이 세 스트레스 자극 중 어느 synergizes 여부를 확인하기 위해, 우리는 2 +의 Cu의 존재 또는 부재의 각 자극에 칼슘 응답을 비교 하였다. 그림 2에 나타낸 바와 같이, FAS 발광 이미징 Arabidoposis 모종 탈수, 소금, 산화 스트레스에 다르게 반응 것으로 나타났습니다. 1 ㎜ H 2 O 2가 유도하는 동안 우리는이 연구에서 조사 자극의 농도를 들어, 75 mM의 염화나트륨은, 노출 (그림 2A 가운데 패널 및도 2b)의 처음 40 초 동안 잎과 뿌리에서 가장 강력한 칼슘 반응을 유도 제 1 및 제 2 40 초 <stron...

칼슘 신호는 식물에서 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 여기에 우리가 공간과 시간 칼슘에 의한 비 생물 적 스트레스를 모니터링하기위한 방법을 제시 애기 세포와 유전자 인코딩 칼슘 지표 애큐 오린 또는 Case12를 사용하여 조직에 2 + 신호.

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

이 절차의 전반적인 목적은 세포 및 전체 식물 수준 모두에서 칼슘 신호를 모니터링하는 방법을 시연하는 것입니다. 이는 먼저 MS 한천 플레이트에서 묘목을 성장시키거나 이미징 챔버 내에서 직접 성장시킴으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 묘목을 접착 필름으로 옮기거나 이미징 챔버에 보관하는 것입니다.다음으로 칼슘 신호를 유도하기 위해 묘목에 가해지는 자극. 궁극적으로, 라이프스타일 발광 또는 형광 이미징은 서로 다른 자극에 대한 전체 묘목 또는 세포질 핵 칼슘 반응을 각각 보여주는 데 사용됩니다. 단일 식물이 발생하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 필름 접착 묘목 분석이 간단하고 민감하며 견고하다는 것입니다.따라서 이 기술은 칼슘 신호 반응이 변경된 돌연변이에 대한 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있습니다. 또한 평면 기반 칼슘 이미징과 비교하여 GFP 기반 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용하면 복잡한 현미경 설정 및 계산을 피할 수 있습니다. 이 방법은 애기장대에서 스트레스 반응 중 칼슘 신호에 대한 통찰력을 제공하지만 다른 식물 모델의 개발 또는 방어 중과 같은 다른 상황에서도 사용할 수 있습니다.이 방법을 보여주는 것은 빛날 것입니다. 우리 연구실의 한 학생이 이 절차를 시작하기 위해 0.01%Triton 100을 함유한 10% 표백제 용액으로 콰인을 발현하는 토끼 옵시스 식물의 씨앗을 살균하고 최대 강도 MS 1%자당과 1.2%한천이 들어 있는 정사각형 접시에 씨앗을 파종합니다. 다음으로, 플레이트를 이틀 동안 섭씨 4도의 층화 후 성장 챔버에 수직으로 놓습니다.그런 다음 묘목을 필름에 옮깁니다. 접시에서 자라는 7-10일 된 묘목 위에 접착 필름을 놓습니다. 묘목이 필름에 부착되도록 손으로 필름을 부드럽게 밀어 넣습니다.그런 다음 묘목이 필름에 부착되지 않도록 필름을 부드럽게 벗겨냅니다. 다음으로, A 접착 묘목을 물에 15 밀리리터 2 마이크로 그램 HCTZ가 들어있는 사각형 플레이트에 배치하여 보조 인자로 묘목을 배양합니다. 묘목을 실온에서 4시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.발광 이미징을 준비하기 위해 HCTZ 용액에서 필름을 꺼내 가운데를 잘라 두 조각을 만듭니다. 묘목이 위를 향하도록 두 개의 필름 조각을 두 개의 다른 접시에 놓습니다. 그런 다음 플레이트를 5분 동안 어둠 속에 두어 어둠 속에서 발광 이미지를 획득합니다.발광 이미징 시스템의 스테이지에 두 개의 플레이트를

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

의 세포 구체적인 분석<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

이 문서 RootChip의 Arabidopsis 모종 배양을위한 프로토콜, 미세한 루트 모니터링 및 세포내 신진 대사 단계의 걱정 기반의 측정과 성장 조건의 자동 제어를 결합한 microfluidic 이미징 플랫폼을 제공합니다.

RootChip를 사용하여 루트 환경의 신속한 조작과 Arabidopsis 루트 성장의 시간 저속 형광 이미징

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실시간 Vivo에서 녹음 애기 칼슘 신호의 곤충 먹이 형광 바이오 센서를 사용 하 여 중

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다른 빛 자질에 애기 thaliana 성장 행동의 분석

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측정 공간적 칼슘^{2 +} 신호

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