에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험 C. 엘레

다음 실험의 전반적인 목표는 상처를 입었을 때 우아함을 느끼는 데 사용되는 방법을 보여주고, 상처에 대한 표피 반응을 시각화하는 것입니다. 이것은 미세 주사 바늘의 찌르기로 인한 작은 구멍으로 표피에 상처를 입혀 달성할 수 있습니다. 두 번째 상처 입히기 방법은 레이저 방사선 조사를 사용하는 것입니다.

이는 현미경 검사를 위해 장착된 동물에서 수행할 수 있으며 상처 반응을 즉시 이미징할 수 있습니다. 그 결과, 상처는 표피 칼슘의 급격한 상승을 유발하고, 이어서 상처 부위 주위에 액틴 고리가 축적되어 몇 시간 내에 닫히는 상처가 바늘을 치유할 수 있음을 보여줍니다. 그리고 여기에 표시된 레이저 상처 방법은 현재 선충 C Elgan에서 가장 널리 사용되는 피부 상처 방법입니다.

이러한 방법은 피부 세포가 손상을 감지하고 반응하는 방법과 같은 상처 신장 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 사용됩니다. 어린 성인 벌레가 들어있는 접시를 얼음 위에 약 30 분 동안 놓아 동물의 속도를 늦춥니다. 이 오싹하게 유도된 토르포는 정확한 바늘 상처에 중요합니다.

웜은 일반적으로 너무 빨리 움직여서 실체 현미경으로 상처를 입힐 수 없으므로 웜을 보고 곡괭이를 사용하여 모두 플레이트의 중앙으로 이동합니다. 그런 다음 100 마이크로 리터 피펫 팁으로 마이크로 주입에 사용되는 것과 같은 당긴 바늘을 잡습니다. 바늘 홀더로서 바늘 끝을 생식선을 피하고 생식선을 피하고 후방 pH 인두와 내부 생식선 사이 또는 후방 생식선과 직장 사이로 가져갑니다.

그런 다음 큐티클에 대략 직각을 추가합니다. 약 5-10미크론을 벌레 안으로 침투하는 짧고 부드럽게 찌르십시오. 이러한 바늘 상처는 장과 같은 내부 장기를 손상시킬 수도 있습니다.

잠시 기다렸다가 상처에서 세포 내용물이 새어 나오는 것을 관찰하십시오. 몇 초의 누출은 괜찮지만 그 이상은 상처가 치명적일 것임을 암시합니다. 상처 반응을 영상화하는 것은 상처가 외측 표피 세포융합 또는 외측 이음새에 만들어진 경우 가장 쉬울 것입니다.

바늘에 찔릴 때는 크게 찌르는 것보다 작은 구멍을 뚫는 것이 중요합니다. 사다리는 지렁이를 빠르게 죽일 수 있기 때문에 상처 반응을 유도하는 데 필요한 최소한의 손상을 재현 가능하게 유발하는 연습이 필요합니다: 각 동물이 부러지거나 더러워질 때까지 동일한 바늘을 사용하여 상처를 입힙니다. 경험에 비추어 볼 때, 5분 안에 접시에 있는 25마리의 동물을 모두 다치게 하는 것은 매우 실현 가능합니다.

이 프로토콜은 회전 디스크 초점 현미경 라인에 부착된 펨토 세그먼트 레이저를 사용하거나 두 개의 사진 현미경과 같은 펨토 펨토초 리터를 사용하는 포인트 스캔을 사용합니다. 그것도 충분해야 합니다. 오거 패드에 10명의 청년을 모으는 것으로 시작하십시오.

12 밀리 몰 라일 용액의 2 마이크로 리터 방울로 마비시킵니다. 그런 다음 커버 슬립으로 덮고 마비될 때까지 몇 분 동안 기다립니다. 동물을 완전히 마비시키는 것이 중요합니다.

12 밀리 이상은 반응에만 영향을 미치지 않습니다. 그러나, 고정화의 다른 방법도 사용될 수 있다. 펨토초 레이저 출력이 대물렌즈 전에 측정된 대로 140밀리와트로 설정되어 있고 레이저 반복률이 80메가헤르츠인지 확인합니다.

이제 표피 세포의 정점 표면에 초점을 맞추고 표적 웜의 측면, 전방 또는 후방 세포융합 표피에 높은 개구수를 가진 100 x 대물렌즈를 사용하여 회전 디스크 컨포칼 현미경 아래에서 웜을 찾습니다. 20밀리초로 분리된 두 개의 200밀리초 펄스에 레이저를 비춥니다. 이것은 표피에 상처를 입히기에 충분해야 합니다.

잠시 기다렸다가 거품으로 나타나는 세포질의 국소적 파괴를 관찰하십시오. 형광 마커가 있는 경우 국부적인 표백을 관찰할 수 있습니다. 이 프로토콜은 G Camp three와 같은 표피에서 칼슘 센서를 발현하고 TD 토마토와 같은 적색 형광 단백질을 전이유전자 발현 수준에 대한 내부 대조군으로 발현하는 C elegance를 사용합니다.

두 가지 상처 방법 모두 회전 디스크 컨포칼 현미경으로 이를 이미지화하기 위해 칼슘 상승을 트리거하지만, 상처가 2초의 간격 시간과 114밀리초의 여기 및 레이저 노출로 타임 랩스 이미지를 획득한 후 레이저 상처를 사용해야 합니다. 레이저 상처에 사용되는 것과 동일한 배율이 30초 이상마다 2시간 동안 이미지를 촬영할 수 있는 것과 같이 장시간에 적합합니다. 텍스트 프로토콜은 분석 루틴을 제안합니다.

이 프로토콜은 바늘 상처 배양 후 call 19와 같은 표피 특이적 프로모터의 제어 하에 F actin marker GFP mosin을 발현하는 웜을 사용합니다. 부상당한 벌레는 섭씨 20도의 인큐베이터에서 한 시간 동안 부상당한 벌레를 관찰한 다음 Zacks를 액틴 링의 이미지 형성으로 데려가 바늘 상처 직후 액틴 역학을 조사하고 부상당한 동물을 슬라이드의 오거 패드로 옮기고 레일로 마취합니다. 그런 다음 기존의 컨포칼 현미경을 사용하여 동물을 이미지화합니다.

1-2시간 동안 0.5마이크로미터 간격으로 Zacks를 획득하여 액틴 고리를 측정하고 고리 직경을 정량화합니다. 먼저 Z 스택의 최대 강도 투영을 만들고 GFP MOI와 링에 대해 서로 45도에서 4개의 라인 스캔을 그립니다. 그런 다음 고리의 직경을 닫힌 고리에 대한 4개의 스캔의 평균 피크 토프 거리로 계산합니다.

직경은 0 O 레이저 또는 바늘 상처로 정의되며, 칼슘 센서 G 캠프에 의해 시각화된 바와 같이 표피 칼슘 수치의 빠르고 지속적인 상승을 유발합니다. 전방체의 표피의 측면은 표피핵인 X와 N으로 표시된 레이저 상처를 보여줍니다. 칼슘 상승은 상처 부위에서 빠르게 퍼져 나갑니다: 한 상처 부위에서 2040 및 60미크론의 칼슘 수치를 정량화하면 이러한 초기 칼슘 반응 역학을 설명하는 데 도움이 됩니다.

칼슘 상승은 수십 분 동안 유지되고 바늘 상처는 안정적으로 유지됩니다. 그 결과 2시간 이내에 상처 부위에서 점차적으로 닫히는 f 액틴 고리가 형성됩니다. 이는 동물에서 P call 19 GFP MOI를 사용하여 시각화되었습니다.

이 링은 정밀한 레이저 상처에 의해 생성되는 경우가 적습니다. 액톤 링의 직경은 4개의 라인 스캔을 사용하여 정량화되었습니다. 라인 스캔의 정량화는 액틴 고리가 상처에서 다양한 거리에서 어떻게 다른 강도를 갖는지 보여줍니다. 사이트.

이러한 상처 치유 방법의 개발을 통해 연구자들은 선천성 면역 반응 및 상처 봉합을 포함한 상처 복구의 여러 측면에 대한 모델로 바다의 우아함을 활용할 수 있게 되었습니다. 펨토 세그먼트 레이저는 위험하다는 것을 잊지 마십시오. Femto 세그먼트 레이저로 작업하는 모든 사람은 레이저 안전 교육을 이수해야 합니다.