Name: 추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 학습하세요 포유류 세포에서 아나스타시스를 실시간 현미경으로 감지하고 추적하는 방법을. 세포 사멸 역전 메커니즘과 질병 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 단어 &quot;아나스타시스&quot;세포 사멸의 반전을 설명하는 제안에 대해 목사 랄프 Bohlmann와 목사 제임스 Voelz 감사합니다; 안정적으로 시토크롬 C -GFP을 표현 헬라 세포에 대한 더글라스 R. 녹색; H446 세포 찰스 M. 루딘 에릭 E. 가드너; 비디오에서 만화 그리기에 도움을 헤더 어린 양; 이 원고의 가치있는 토론을위한 유 후이 여진. 이 작품은 선생님 에드워드 Youde 기념 원정대 (HLT), 박사 월터 제토 기념 장학금 (HLT), 풀 브라이트 부여 007-2009 (HLT), 생명 과학 연구 재단의 교제 (HLT)에 의해 지원되었다, NIH는 NS037402 (JMH) 부여 및 NS083373 (JMH), 그리고 홍콩의 대학 보조금위원회 광역 / B-07 / 99 (MCF). 호 램 당나라는 생명 과학 연구 재단의 Shurl와 케이 쿠 르치 재단 연구원이다.

저자는 공개할 것이 없습니다.

아나스타시스는 세포 사멸 경로를 활성화 한 세포가 계속해서 죽어가는 과정을 역 생존 현상을 의미한다. 여기서는 생균 촬상 사실 동일인 셀 늦은 단계에서 아폽토시스 세포 사멸의 과정을 역으로 한 후 생존 및 재생을 계속할 수 있음을 확인하기 위해 사용될 수 있다는 것을 증명하고있다. 우리 프로토콜은 아폽토시스를 유도 및 확인을위한 여러 가지 바이오 마커와 세포 사멸의 모니터링 반전 겪는 세포의 큰 비율을 허용하도록 최적화 여러 세포 유형 특정 처리 조건을 설명한다. 기술적 인 문제에 관해서는, 유리 바닥 요리 때문에 높은 배율에서 높은 품질의 촛점 또는 에피 형광 현미경을위한 긴 작동 거리를 수있는 세포와 현미경 목적의 투명성이 높은 얇은 유리,의, 영상 (12, 13)에 대한 배양 세포를 사용 하였다, 미토콘드리아의 분열을 포함하여 고전적인 세포 사멸의 관찰을 용이하게사이토 크롬 c 및 핵 응축과 분열의 릴리스. 유리는 또한 아폽토시스 동안 막에 blebbing, 세포의 세포 수축 및 세포 ...

세포 사멸 ( &quot;죽음에 떨어지는&quot;에 대한 그리스어)는 일반적으로 세포 자살 1-7로 끝나는 단방향 프로세스로 간주됩니다. 이미 세포 사멸 경로의 8,9을 시작했다 세포를 포함, 그렇지 않으면 전체 동물에 죽을 것 여분의 세포의 생존에 프로 죽음 유전자 결과의 유전 중단. 마찬가지로, 유전자 조작 인위적으로 표시 신호를 &quot;날 먹고&quot;또는 자신의 세포 외 기질 접착 성을 잃게 건강한 포유 동물 세포는 모든 세포의 식균 작용 또는 entosis 각각 10, 11에 의해 죽음을 탈출 할 수 있습니다. 그러나, 우리와 다른 사람들은 또한 세포 사멸 12-15의 초기 단계에서 복구 할 수 있습니다 유전자 조작 정상적인 건강한 포유 동물 세포 및 세포 선없이 것을 보여 주었다. 세포는 전형적인 중요 체크 포인트를 통과 한 후 각각의 세포를 추적 할 수있는 도구를 사용하여, 우리는 또한, 세포 사멸 (12, 13)의 후반 단계에서 복구를 증명하고있다해동 2-6 &quot;니나&quot;를 표시합니다. 최종 단계의 세포 사멸이 체크 포인트는 미토콘드리아 시토크롬 C의 릴리스, 카스파의 활성화, 핵 분열 및 세포 사멸 기관의 형성을 포함한다. 우리는 세포 사멸 2-6의 위기에서 세포 사멸이 반전을 설명하기 위해, &quot;생활에 상승&quot;을 의미 그리스어 합성어 &quot;아나스타시스&quot;을 채택했다. 전체 죽어 복구 프로세스가 라이브 세포 이미징에 의해 관찰되지 않는 한,이 세포 사멸 이벤트를 경험하지 못한 세포에서 아나스타시스를받은 세포를 구별하기 위해 도전하고있다. 작품의 수십 년 세포 사멸에 의한 세포 자살의 형태 적 특징은 진화 적으로 보존 된 생화학 및 분자 이벤트 16-19에 의해 구동되는 것을 밝혀졌다. 이러한 이벤트는 손상 또는 d 제거하여 단세포와 다세포 생물의 발달과 homoeostatic 과정을 조절하는 세포의 자기 파괴를 촉진angerous 세포 16-19. 사멸 세포에 쉽게 사멸 1,5,6,16,20의 표준화, 형태 학적, 생화학 및 분자 발현에 의해 구별 될 수 있지만, 현재 아나스타시스 12, 13에 해당 알려진 마커가 없습니다. 중요한 것은, 아나스타시스를받은 세포는 정상적인 건강한 세포, 단지 세포 사멸을 반대로 시작 세포 표시와 같은 세포 사멸 죽어가는 세포 (12, 13)로 나타납니다. 따라서, 새로운 도구는 주어진 생존 세포가 이전의 활성 세포 사멸 과정을 경험했다 확실하게 결론을 내릴 필요가있다. 이 신속하고 대규모 파괴 과정이기 때문에 세포 사멸은 일반적으로 돌이킬 수없는 계단식으로 가정한다. 미토콘드리아는 세포질 (21, 22)에 시토크롬 C와 같은 apoptogenic 요인을 발표 한 후에는 일부 세포가 세포 사멸을 시작하는 것이 일 분 정도 걸릴 수 있지만, 카스파는 5 분 23, 24 내에서 활성화 세포질 다음에 할 수 있고,핵 10 분 25 ~ 27 내에서 응결 및 세포 사멸 잠시 후 25-27. 활성화 된 카스파은 절단과 같은 엔도 뉴 클레아 제 억제제 DFF45 / ICAD 29,30로서 셀룰러 철거 2,28의 주요 목적 구조적 및 기능적 구성 요소를 비활성화하여 아폽토시스를 조율. 카스파는 또한 31, 32 크롬 c의 미토콘드리아 방출을 촉진하는 미토콘드리아에 옭 BCL-2 가족의 BID, 같은 프로 세포 사멸 인자를 활성화합니다. 카스파 활동은 또한 탐식 33 대 식세포 또는 인접 세포에 의한 세포 죽음의 말림을 촉진하기위한 &quot;날 먹고&quot;신호로 포스파티딜 세린의 세포 표면에 노출되는 결과를 초래한다. 또한, 세포 사멸 이벤트는 세포 생체 에너지 대사의 34,35,36를 방해하는 역기능 미토콘드리아는, 렌더링합니다. 따라서, 이러한 파괴를 복구 직관적 아닌 것 같습니다. 원래는 달리 기대관리 포인트, 세포도 늦은 단계에서 사멸 세포 사멸 과정을 취소 할 수 있습니다. 지속적으로 배양 세포를 죽음의 운명을 모니터링함으로써, 우리는 일차 전지 및 세포주 12, 13의 범위에서 후기의 세포 사멸의 가역성을 관찰했다. 죽음의 자극의 제거는, 이러한 미토콘드리아의 분열, 염색질 응축, DNA 손상, 세포막에 blebbing, 포스파티딜 세린의 세포 표면에 노출, 미토콘드리아 시토크롬 C의 릴리스, 카스파 제 활성화, 핵 분열, 세포의 수축으로 세포 사멸의 명백한 기능에서 복구를 허용 세포 사멸 몸과 형성. 이러한 관찰은 아나스타시스의 기능, 결과, 및 메커니즘에 관한 대답없는 질문을 올립니다. 이러한 질문을 해결하기 위해, 전제 조건은 안정적 아나스타시스를받은 세포를 식별하는 것입니다. 여기서는 라이브 현미경 방법 및 이전 말기 아폽토시스 번째 반전 한 세포를 검출하기위한 바이오 센서를 카스파 서술욕실은 살아 남았다.

<table><tbody><tr><td>LSM780 컨포칼 현미경 Carl</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 배양 접시</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>투명 CultFoi</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1116-084</td><td></td></tr><tr><td>CO2 독립 매체</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>형광 표지 아넥신 V</td><td>Biovision</td><td>K201</td><td></td></tr></tbody></table>

추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

아나스타시스 ( &quot;생활에 상승&quot;에 대한 그리스어) 죽어가는 세포의 회복을 의미한다. 이들 세포의 회복 전에, 미토콘드리아 단편화, 세포질 내로 미토콘드리아 사이토 크롬 C의 방출, 카스파 제 활성화, 크로 마틴 응축, DNA 손상, 핵 분열, 세포막에 blebbing, 세포 수축, 세포 표면 노출을 포함한 세포 사멸 중요한 체크 포인트를 통과 한 포스파티딜 세린, 및 세포 사멸 기관의 형성. 세포 사멸 자극함으로써 죽어가는 세포가 사멸하고 잠재적으로 다른 죽음의 메커니즘을 취소 할 수 있도록, 죽음 이전에 제거 될 때 아나스타시스가 발생할 수 있습니다. 따라서, 아나스타시스는 부적절하게 손상된 세포를 유지할 수있는 생리적 치유 과정을 포함 나타납니다. 기능 및 메커니즘 아나스타시스 명백하게 건강한 세포의 복구 후에 과거 사건을 검출하기위한 제한된 도구에 의해 부분적으로 방해, 여전히 불분명하다. 전략 anasta를 검출SIS는 아나스타시스를 변조 생리 메커니즘 연구, 질병 병리 언데드 세포의 유해성과 잠재적 인 치료제를 가능하게 할 것이다. 여기서 우리는 살아있는 세포 현미경 및 포유 동물 세포에 아나스타시스를 식별하고 추적하기위한 포유 동물 카스파 바이오 센서를 사용하여 효과적인 전략을 설명합니다.

세포 사멸의 반전을 연구하기 위해, 조직 배양 세포를 처음으로 세포 사멸을 유발하는 죽음의 자극에 노출되어있다. 세포가 세포 사멸의 특징을 표시 할 때, 신선한 배양액 후 자극을 씻어 후 복구 (그림 1A)를 허용하도록 죽어가는 세포를 배양 적용됩니다. 여기서 다루고있는 핵심 문제는 개별 죽어 배양 된 세포가 세포 사멸을 향해 진행 여전히 아나스타시스을받을 수있는 방법까지입니다. 이 질문은 명확하게 설명 된 방법을 이용하여 세포의 운명을 추적 할 수있는 바이오 마커 연속 모니터링함으로써 응답 할 수있다. 우리는 먼저 동안 추적에 필요한 시간 경과 생균 현미경을 사용 전에 개별 세포의 반응을 기록함으로써, 조직 배양 세포에서 아폽토시스의 역전을 검출하도록 우리의 전략을 설명하고 아폽토시스 자극 (12, 13)에 노출 된 후. 여기에 장착 된 기판에 확산 건강 부착 세포 (그림 1Bi) 12, 13, 그리고 사...

아나스타시스라는 용어는 죽어가는 세포가 말기에 세포 자살 과정을 역전시키고 스스로 회복하여 궁극적으로 살아남는 현상을 말합니다. 여기에서는 아나스타시스를 겪는 세포를 검출하고 추적하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

이 절차의 전반적인 목표는 생체 세포 현미경을 통해 세포사멸 과정과 배양된 세포의 역전을 감지하고 추적하는 것입니다. 건강한 세포는 기질에 퍼져 핵 주위에 관상 필라멘트 미토콘드리아를 포함합니다. 그러나 세포가 세포사멸을 통해 자살할 때, 죽어가는 세포는 세포사멸의 역전을 감지하고 추적하기 위해 고유한 형태학적 특징을 나타냅니다.세포는 유리 바닥 세포 배양 접시에 도금됩니다. 다음 단계는 미토콘드리아와 핵을 라벨링하기 위해 살아있는 세포 염색을 수행하는 것입니다. 이를 통해 건강한 세포와 세포사멸 세포의 형태학적 특징을 검출할 수 있습니다.살아있는 세포 현미경 검사에 의해, 표지된 건강한 세포는 세포사멸을 유도하기 위해 사멸 자극에 노출됩니다. 세포사멸이 감지되면 죽어가는 세포를 세척한 다음 세포 회수를 위해 신선한 세포 배양 배지로 배양하고, 살아있는 세포 이미징을 사용하여 세포사멸의 반전과 세포 형태학적 회복 및 생존과 같은 결과를 감지하고 추적하며, 각각 세포 형태학적 회복 및 이동에 의해 각각 나타났습니다. 세포사멸(Apoptosis)은 우리 몸에서 원치 않거나 위험한 세포를 제거하는 데 필수적인 역할을 하는 프로그래밍된 세포 사멸의 한 유형입니다.이러한 세포 합성 과정은 일단 세포가 죽기 시작하면 확실히 나중에 죽기 때문에 일반적으로 비가역적인 것으로 간주되지만, 실제로 죽어가는 세포는 세포 사멸 과정을 역으로 시작하고 나서 살아남아 파생될 수 있다는 것을 발견했습니다. 그들은 cyto C, release, case based activation, nuclear fragmentation 및 apoptotic body formation과 같이 낮은 수익률의 지점이 될 수밖에 없는 가능한 중요한 단계를 가지고 있습니다. 그리스 전문가들과 상의한 후, 우리는 생명으로 일어난다는 뜻의 '정지(stasis)'라는 용어를 채택합니다.세포사멸(apoptosis)과 다른 세포 사멸 과정을 역전시키는 현상을 설명하자면, 세포사멸을 역전시키는 세포가 정상적인 중세포처럼 보이기 때문에 꽃자멸사(anthesis)를 감지하기가 어렵습니다. 그러나, 연속적인 살아있는 세포 현미경 검사로는, 세포의 많은 부분에서 발생하는 역착현상을 검출할 수 있습니다. 이 기술을 마스터하는 것은 우리가 anthesis의 레크리에이션을 연구 할 수 있기 때문에 중요합니다.우리는 꽃밥이 손상된 조직을 치료할 수 있지만 손상된 세포가 살아남아 암을 형성할 수 있도록 할 수도 있다고 제안했습니다. 그러므로, 마취를 조절하는 기전을 규명하는 것은 세포 사멸 및 생존을 매개하여 암, 심부전 및 퇴행과 같은 주사 가능한 질병을 치료할 수 있는 새로운 접근법을 제공할 수 있으며, 아나스타시스를 검출하고 추적할 수 있습니다. 세포사멸 사건 후, 일시적 세포 사멸 유도 후 어떤 세포가 세포사멸을 역전시킬 수 있는지 추적하기 위해 타임 랩스 라이브 셀 현미경 검사를 수행합니다.먼저 유리 바닥이 더 얇은 35mm 세포 배양 접시에 1ml의 폴리 드 리신 용액을 추가합니다. 유리 표면을 코팅하기 위해 1 분 배양 후, 용액을 흡인하고 인산염 완충 식염수 2 밀리리터로 유리를 세척하십시오 세포를 준비하기 위해 먼저 트립신 눈, 발뒤꿈치 세포를 80-90 % 합류 세포가 분리 된 후, 37 °C 배지 10 밀리리터를 첨가하여 세포를 현탁시킵니다. 그런 다음 세포 현탁액을 10ml 멸균 튜브에 넣고 1-2분 동안 160배 G로 원심분리합니다.스핀을 따라 매체를 조심스럽게 흡인합니다. 튜브 바닥에 있는 세포 펠릿을 방해하지 마십시오. 부드러운 피펫팅으로 10ml의 세포 배양 배지로 세포를 재현탁시킵니다.그런 다음 35mm 사전 코팅된 유리에 2밀리리터의 부유 셀을 확인합니다. 바닥 세포 배양 접시. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소를 함유한 세포를 하루 동안 배양합니다.이미징 시 세포가 80%co 유창성을 달성할 수 있도록 세포 수를 조정해야 할 수 있습니다. 미토콘드리아 및 핵 단편화는 세포사멸의 형태학적 특징입니다. 미토콘드리아와 핵을 시각화하려면 살아있는 세포 이미징 직전에 염색을 수행합니다.먼저 2마이크로리터의 미토콘드리아 염색을 추가하여 염색 프로토콜을 시작합니다. MIT tracker red 50 마이크로몰 원액 및 2마이크로리터의 DNA 염색 고리 3 3 3 4 2 10밀리리터당 밀리리터 원액을 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 세포 배양 접시에서 조절된 배양 배지 1밀리리터를 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 피펫팅으로 염색과 잘 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 배양 접시에 다시 추가합니다.섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 접시를 20분 동안 배양한 후 배지를 흡인하고 1ml의 따뜻한 세포 배양, 배지 또는 인산염 완충 식염수로 염색된 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 세포 배양 배지와 5% 이산화탄소로 세포를 추가로 5분 동안 배양합니다. 과도한 염색으로 인해 염색 세포의 비특이적 배경 신호가 증가할 수 있으므로 염색 시간이 길어지지 않도록 하십시오.배양 후, 배지를 흡인하고 세포를 다시 세척 한 다음 5 % 이산화탄소로 섭씨 37도에서 2 밀리리터의 세포 배양 배지로 세포를 계속 배양합니다. 현미경 구성 요소는 구성 요소의 열팽창 및 수축으로 인한 XY 평면의 초점 이동 및 이동을 피하기 위해 열 평형에 도달해야 합니다. 열 평형을 이루려면 이미징을 시작하기 최소 2시간 전에 환경 제어 챔버와 스테이지 인큐베이터를 켜서 현미경을 섭씨 37도로 예열합니다.그런 다음 이산화탄소 조절기를 켜서 환경 제어 챔버에 5%의 이산화탄소를 공급합니다. 이산화탄소를 공급할 수 없는 경우 이산화탄소 독립 배지를 사용하여 세포 성장을 지원할 수 있습니다. 이미징하기 전에 1.4 개구수가 있는 40 x 대물렌즈에 이멀젼 오일 한 방울을 직접 떨어뜨립니다.그런 다음 염색된 세포가 있는 배양 접시를 섭씨 37도의 스테이지 인큐베이터에 부드럽게 놓습니다. 시료의 증발 및 오염으로 인한 수분 손실을 방지하기 위해 투명한 냉각 호일로 접시를 덮고 미분 간섭 대비 현미경 검사를 수행합니다. 플라스틱이 빛의 극성을 방해할 수 있으므로 플라스틱 배양 접시 덮개를 사용하지 마십시오.다음으로, 세뇨관 모양의 미토콘드리아와 둥근 핵이 있는 유리 표면에 퍼져 있는 건강한 세포 그룹을 찾아 초점을 맞춥니다. 배양 접시의 중앙 또는 그 근처에 있는 세포를 선택하여 세포가 제자리에 놓이면 동일한 초점면에 있는지 확인하고, 컨포칼 현미경으로 빠르게 노출하여 최소 레이저 강도와 노출 시간을 결정하여 세포와 세포소기관의 선명한 이미지를 얻습니다. 이 단계는 매우 중요합니다.레이저 광은 세포에 광독성이 있으므로 최적화 및 조정이 필요합니다.초점 드리프트를 제거하려면 적외선 발광 다이오드를 사용하는 연속 자동 초점 드리프트 보정 장치를 사용하십시오. 또는 초점 평면을 수동으로 수정할 수 있습니다. 세포와 초점면이 식별되면 모든 매개변수를 최적화하고 살아있는 세포 이미징을 시작하기 전에 테스트 이미지를 촬영합니다.그런 다음 라이브 이미징을 시작하여 10주기 동안 1분 간격으로 건강한 세포를 이미지화하여 세포사멸을 유도합니다. 투명 피펫으로 세포 매체를 제거합니다. 섭씨 37도의 세포 배양 배지와 미리 혼합된 세포 사멸 자극을 접시에 적용합니다.투명한 컬트 호일로 접시를 계속 덮으십시오. 세포 사멸 자극을 적용한 후 타임 랩스 이미징 중에 처리된 세포를 이미징할 시간 간격을 조정하여 원형질막 블롭빙, 미토콘드리아 단편화, 핵 응축 및 단편화, 세포질 응축, 세포 수축 및 세포사멸체 형성과 같은 세포사멸의 형태학적 특징을 포착하여 세포사멸을 감지합니다. 세포사멸(apoptosis)이 관찰되면 세포 사멸 자극이 있는 배지를 제거하고 2ml의 신선한 세포 배양 배지를 적용하여 세포를 배양합니다.타임 랩스 이미징을 계속하여 세포의 형태학적 회복과 아나스타시스의 결과를 관찰합니다. 인간 폐암으로 죽어가는 세포 사멸 자극을 제거한 후 H 4 46 세포는 세포사멸을 역전시킬 수 있습니다. 세포는 세포 수축, 막 블랩, 미토콘드리아 단편화, 핵 응축, 단열 및 세포사멸과 같은 세포사멸의 특징을 나타내지만, 아나스타시스 세포 분열 후 신체 형성은 비정상적일 수 있습니다.이 예에서는 두 개의 점 핵 대신 세포 분열 후에 세 개의 주요 핵이 형성되어 점 세포의 유전적 변화를 나타내는 미세 핵이 형성됩니다. 이것은 아나스타시스가 세포를 세포 사멸 자극에 노출시킨 후 돌연변이 유발성이 될 수 있음을 시사합니다. 프로 세포사멸 인자는 미토콘드리아로 전좌하여 시토크롬 C의 방출을 유발하며, 이는 세포 파괴를 위한 프로토솜 및 캐스트 기반 활성화의 조립으로 이어지고 세포 사멸이 표시됩니다.다음은 세포사멸 유도 후 미토콘드리아에 국한되는 GFP 표지 시토크롬 C를 발현하는 HELOC 세포입니다. 사이토크롬 C는 사이토졸로 방출됩니다. 그러나, 세포를 세척한 후 신선한 배지 사이토졸로 배양한 후, ex 사이토크롬 C는 정상 수준으로 다시 감소하여 사이토크롬 C 방출 후 아나스타시스가 발생할 수 있음을 나타냅니다.여기에 표시된 것은 CA 기반 바이오센서 N-E-S-D-E-V-D-Y-F-P-N-L-S를 발현하는 헬라 세포이며, 예상대로 세포사멸 유도 후 세포질에 먼저 국한됩니다. Y-F-P-N-L-S는 활성화된 캐스트 염기에 의한 DEVD의 분열로 인해 핵으로 전위됩니다. 그러나 사멸 자극이 씻겨 나가고 세포가 새로운 배지로 배양된 후 Y-F-P-N-L-S는 핵에 남아 있는 반면 세포는 정상적인 형태를 회복하여 캐스트 염기 활성화 후 반전 VA 안검하수가 발생할 수 있음을 나타냅니다.이 비디오를 시청한 후에는 살아있는 세포 이미징을 사용하여 앤테시스와 그 결과를 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 시연에서는 에탄올을 ATO 유도제로 사용합니다. 동시에 세포는 teso DMSO 및 sporin과 같은 다른 사멸 자극에 의해 유도되는 세포 사멸 과정을 역전시킬 수 있습니다.형광등은 세포에 대한 포토토릭이므로 살아있는 세포 이미징 중에 샘플을 가열하는 밤을 최소화하는 것이 중요합니다.세포사멸(apoptosis)과 야간 아나스타시스(anastasis)의 과정은 온도에 민감하고 세포적인 활동에 의존합니다. 따라서 반복 가능한 결과를 보장하기 위해 실험을 위해 셀을 동일한 온도로 유지하는 것이 중요합니다.

strategies-for-tracking-anastasis-cell-survival-phenomenon-that

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 마우스 배아의 프로그래밍 세포 죽음의 영역 (PCD)와 LysoTracker라는 높은 가용성 염료를 사용하여 배아 줄기 (ES) 세포 문화를 차별화를 시각화하는 간단한 프로토콜을 제시한다.

태아의 프로그래밍 셀 죽음을 감지 할 LysoTracker의 이용 및 배아 줄기 세포를 차별화

E4orf4 유도 세포 죽음에 ACF 염색질 리모델링 요소의 기여가 측정되었다. 프로토콜은 doxycycline 치료는 ACF subunits Acf1과 SNF2h의 조건 최저를 유도하는 세포 클론의 선택이 포함되어 있으며, inducible 세포 라인에 E4orf4 유발 세포 죽음을 측정 할 수있는 DAPI 분석을 사용합니다.

E4orf4 - 유도 세포 사망에 최저 효과의 유전자 발현 및 측정의 조건부 최저위한 셀 라인의 작성

이 프로토콜은 특정 시점에서 S 상에 있었던 셀의 시간 추적을 허용 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 흡수의 사용을 설명한다. DNA 염료 및 표지 항체의 첨가는 이후 시간에 S 상 세포의 운명의 상세한 분석을 용이하게한다.

동기화를 필요로하지 않고 유동 세포 계측법을 사용하여 세포주기 진행의 시간적 추적

여기에서는 항암 치료제에 반응하는 단일 세포를 종단으로 추적하는 장기 타임 랩스 현미경 검사 방법을 설명합니다.

유리를 통해 보면 : 시간 ​​경과 현미경 및 단일 세포의 종 추적 항암 치료를 공부하기

Anastasis는 vivo에서 감지 하는 세포 죽음 프로세스를 반대로 세포 형태학 상으로 정상적인 건강 한 세포와 구별할 수 있기 때문에 기술적으로 도전적 이다. 여기 우리는 감지 하 고 우리의 새로 개발 된 vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에서 anastasis 받아야 하는 셀 추적에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Anastasis에서 Vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지

여기에서는 인접한 사멸 또는 죽어가는 세포와의 물리적 상호 작용에 의해 생존 가능한 세포에서 유도되는 세포 내 신호 전달 이벤트를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 죽은 세포의 식세포 흡수 또는 용해성 매개체의 방출과 대조적으로 죽은 세포의 수용체 매개 인식에 의해 유도되는 신호 전달 이벤트에 중점을 둡니다.

세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별

라이브 셀 이미징 고정된 셀 이미징 혼자 여 달성 하지 않은 단일 셀 이나 전체 인구에 풍부한을 정보를 제공 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 프로토콜 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하는 설명 합니다.

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

여기, 선물이 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 유방암 apoptotic 세포를 분리 하 고 추가 cytometry에 의해 apoptosis 반전 후 유방암 줄기 세포와 같은 세포에 유 방 비 줄기 암 세포의 전이 감지 하는 프로토콜.

새로 형성 된 유방암 줄기 세포와 같은 세포 Apoptosis 반전 후 흐름 Cytometric 감지

제시된 방법은 DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs), 세포 주기 분포 및 세포 자멸의 정량 분석을 결합하여 DSB 유도 및 수리의 세포 주기 별 평가뿐만 아니라 수리 실패의 결과를 가능하게합니다.

유세포측정에 의한 유독성 응력 후 γH2AX 및 세포자멸의 세포 주기별 측정

이 프로토콜은 형광 이미징에 의해 mitochondrial 칼슘 fluxes의 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 이 메서드는 선택 mitochondria로 표현 circularly permutated YFP 기반 듀얼 여기 ratiometric 칼슘 센서 (ratiometric pericam - MT)을 활용합니다.

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

학습하세요 포유류 세포에서 아나스타시스를 실시간 현미경으로 감지하고 추적하는 방법을. 세포 사멸 역전 메커니즘과 질병 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략

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