추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략

이 절차의 전반적인 목표는 생체 세포 현미경을 통해 세포사멸 과정과 배양된 세포의 역전을 감지하고 추적하는 것입니다. 건강한 세포는 기질에 퍼져 핵 주위에 관상 필라멘트 미토콘드리아를 포함합니다. 그러나 세포가 세포사멸을 통해 자살할 때, 죽어가는 세포는 세포사멸의 역전을 감지하고 추적하기 위해 고유한 형태학적 특징을 나타냅니다.

세포는 유리 바닥 세포 배양 접시에 도금됩니다. 다음 단계는 미토콘드리아와 핵을 라벨링하기 위해 살아있는 세포 염색을 수행하는 것입니다. 이를 통해 건강한 세포와 세포사멸 세포의 형태학적 특징을 검출할 수 있습니다.

살아있는 세포 현미경 검사에 의해, 표지된 건강한 세포는 세포사멸을 유도하기 위해 사멸 자극에 노출됩니다. 세포사멸이 감지되면 죽어가는 세포를 세척한 다음 세포 회수를 위해 신선한 세포 배양 배지로 배양하고, 살아있는 세포 이미징을 사용하여 세포사멸의 반전과 세포 형태학적 회복 및 생존과 같은 결과를 감지하고 추적하며, 각각 세포 형태학적 회복 및 이동에 의해 각각 나타났습니다. 세포사멸(Apoptosis)은 우리 몸에서 원치 않거나 위험한 세포를 제거하는 데 필수적인 역할을 하는 프로그래밍된 세포 사멸의 한 유형입니다.

이러한 세포 합성 과정은 일단 세포가 죽기 시작하면 확실히 나중에 죽기 때문에 일반적으로 비가역적인 것으로 간주되지만, 실제로 죽어가는 세포는 세포 사멸 과정을 역으로 시작하고 나서 살아남아 파생될 수 있다는 것을 발견했습니다. 그들은 cyto C, release, case based activation, nuclear fragmentation 및 apoptotic body formation과 같이 낮은 수익률의 지점이 될 수밖에 없는 가능한 중요한 단계를 가지고 있습니다. 그리스 전문가들과 상의한 후, 우리는 생명으로 일어난다는 뜻의 '정지(stasis)'라는 용어를 채택합니다.

세포사멸(apoptosis)과 다른 세포 사멸 과정을 역전시키는 현상을 설명하자면, 세포사멸을 역전시키는 세포가 정상적인 중세포처럼 보이기 때문에 꽃자멸사(anthesis)를 감지하기가 어렵습니다. 그러나, 연속적인 살아있는 세포 현미경 검사로는, 세포의 많은 부분에서 발생하는 역착현상을 검출할 수 있습니다. 이 기술을 마스터하는 것은 우리가 anthesis의 레크리에이션을 연구 할 수 있기 때문에 중요합니다.

우리는 꽃밥이 손상된 조직을 치료할 수 있지만 손상된 세포가 살아남아 암을 형성할 수 있도록 할 수도 있다고 제안했습니다. 그러므로, 마취를 조절하는 기전을 규명하는 것은 세포 사멸 및 생존을 매개하여 암, 심부전 및 퇴행과 같은 주사 가능한 질병을 치료할 수 있는 새로운 접근법을 제공할 수 있으며, 아나스타시스를 검출하고 추적할 수 있습니다. 세포사멸 사건 후, 일시적 세포 사멸 유도 후 어떤 세포가 세포사멸을 역전시킬 수 있는지 추적하기 위해 타임 랩스 라이브 셀 현미경 검사를 수행합니다.

먼저 유리 바닥이 더 얇은 35mm 세포 배양 접시에 1ml의 폴리 드 리신 용액을 추가합니다. 유리 표면을 코팅하기 위해 1 분 배양 후, 용액을 흡인하고 인산염 완충 식염수 2 밀리리터로 유리를 세척하십시오 세포를 준비하기 위해 먼저 트립신 눈, 발뒤꿈치 세포를 80-90 % 합류 세포가 분리 된 후, 37 °C 배지 10 밀리리터를 첨가하여 세포를 현탁시킵니다. 그런 다음 세포 현탁액을 10ml 멸균 튜브에 넣고 1-2분 동안 160배 G로 원심분리합니다.

스핀을 따라 매체를 조심스럽게 흡인합니다. 튜브 바닥에 있는 세포 펠릿을 방해하지 마십시오. 부드러운 피펫팅으로 10ml의 세포 배양 배지로 세포를 재현탁시킵니다.

그런 다음 35mm 사전 코팅된 유리에 2밀리리터의 부유 셀을 확인합니다. 바닥 세포 배양 접시. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소를 함유한 세포를 하루 동안 배양합니다.

이미징 시 세포가 80%co 유창성을 달성할 수 있도록 세포 수를 조정해야 할 수 있습니다. 미토콘드리아 및 핵 단편화는 세포사멸의 형태학적 특징입니다. 미토콘드리아와 핵을 시각화하려면 살아있는 세포 이미징 직전에 염색을 수행합니다.

먼저 2마이크로리터의 미토콘드리아 염색을 추가하여 염색 프로토콜을 시작합니다. MIT tracker red 50 마이크로몰 원액 및 2마이크로리터의 DNA 염색 고리 3 3 3 4 2 10밀리리터당 밀리리터 원액을 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 세포 배양 접시에서 조절된 배양 배지 1밀리리터를 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 피펫팅으로 염색과 잘 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 배양 접시에 다시 추가합니다.

섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 접시를 20분 동안 배양한 후 배지를 흡인하고 1ml의 따뜻한 세포 배양, 배지 또는 인산염 완충 식염수로 염색된 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 세포 배양 배지와 5% 이산화탄소로 세포를 추가로 5분 동안 배양합니다. 과도한 염색으로 인해 염색 세포의 비특이적 배경 신호가 증가할 수 있으므로 염색 시간이 길어지지 않도록 하십시오.

배양 후, 배지를 흡인하고 세포를 다시 세척 한 다음 5 % 이산화탄소로 섭씨 37도에서 2 밀리리터의 세포 배양 배지로 세포를 계속 배양합니다. 현미경 구성 요소는 구성 요소의 열팽창 및 수축으로 인한 XY 평면의 초점 이동 및 이동을 피하기 위해 열 평형에 도달해야 합니다. 열 평형을 이루려면 이미징을 시작하기 최소 2시간 전에 환경 제어 챔버와 스테이지 인큐베이터를 켜서 현미경을 섭씨 37도로 예열합니다.

그런 다음 이산화탄소 조절기를 켜서 환경 제어 챔버에 5%의 이산화탄소를 공급합니다. 이산화탄소를 공급할 수 없는 경우 이산화탄소 독립 배지를 사용하여 세포 성장을 지원할 수 있습니다. 이미징하기 전에 1.4 개구수가 있는 40 x 대물렌즈에 이멀젼 오일 한 방울을 직접 떨어뜨립니다.

그런 다음 염색된 세포가 있는 배양 접시를 섭씨 37도의 스테이지 인큐베이터에 부드럽게 놓습니다. 시료의 증발 및 오염으로 인한 수분 손실을 방지하기 위해 투명한 냉각 호일로 접시를 덮고 미분 간섭 대비 현미경 검사를 수행합니다. 플라스틱이 빛의 극성을 방해할 수 있으므로 플라스틱 배양 접시 덮개를 사용하지 마십시오.

다음으로, 세뇨관 모양의 미토콘드리아와 둥근 핵이 있는 유리 표면에 퍼져 있는 건강한 세포 그룹을 찾아 초점을 맞춥니다. 배양 접시의 중앙 또는 그 근처에 있는 세포를 선택하여 세포가 제자리에 놓이면 동일한 초점면에 있는지 확인하고, 컨포칼 현미경으로 빠르게 노출하여 최소 레이저 강도와 노출 시간을 결정하여 세포와 세포소기관의 선명한 이미지를 얻습니다. 이 단계는 매우 중요합니다.

레이저 광은 세포에 광독성이 있으므로 최적화 및 조정이 필요합니다.초점 드리프트를 제거하려면 적외선 발광 다이오드를 사용하는 연속 자동 초점 드리프트 보정 장치를 사용하십시오. 또는 초점 평면을 수동으로 수정할 수 있습니다. 세포와 초점면이 식별되면 모든 매개변수를 최적화하고 살아있는 세포 이미징을 시작하기 전에 테스트 이미지를 촬영합니다.

그런 다음 라이브 이미징을 시작하여 10주기 동안 1분 간격으로 건강한 세포를 이미지화하여 세포사멸을 유도합니다. 투명 피펫으로 세포 매체를 제거합니다. 섭씨 37도의 세포 배양 배지와 미리 혼합된 세포 사멸 자극을 접시에 적용합니다.

투명한 컬트 호일로 접시를 계속 덮으십시오. 세포 사멸 자극을 적용한 후 타임 랩스 이미징 중에 처리된 세포를 이미징할 시간 간격을 조정하여 원형질막 블롭빙, 미토콘드리아 단편화, 핵 응축 및 단편화, 세포질 응축, 세포 수축 및 세포사멸체 형성과 같은 세포사멸의 형태학적 특징을 포착하여 세포사멸을 감지합니다. 세포사멸(apoptosis)이 관찰되면 세포 사멸 자극이 있는 배지를 제거하고 2ml의 신선한 세포 배양 배지를 적용하여 세포를 배양합니다.

타임 랩스 이미징을 계속하여 세포의 형태학적 회복과 아나스타시스의 결과를 관찰합니다. 인간 폐암으로 죽어가는 세포 사멸 자극을 제거한 후 H 4 46 세포는 세포사멸을 역전시킬 수 있습니다. 세포는 세포 수축, 막 블랩, 미토콘드리아 단편화, 핵 응축, 단열 및 세포사멸과 같은 세포사멸의 특징을 나타내지만, 아나스타시스 세포 분열 후 신체 형성은 비정상적일 수 있습니다.

이 예에서는 두 개의 점 핵 대신 세포 분열 후에 세 개의 주요 핵이 형성되어 점 세포의 유전적 변화를 나타내는 미세 핵이 형성됩니다. 이것은 아나스타시스가 세포를 세포 사멸 자극에 노출시킨 후 돌연변이 유발성이 될 수 있음을 시사합니다. 프로 세포사멸 인자는 미토콘드리아로 전좌하여 시토크롬 C의 방출을 유발하며, 이는 세포 파괴를 위한 프로토솜 및 캐스트 기반 활성화의 조립으로 이어지고 세포 사멸이 표시됩니다.

다음은 세포사멸 유도 후 미토콘드리아에 국한되는 GFP 표지 시토크롬 C를 발현하는 HELOC 세포입니다. 사이토크롬 C는 사이토졸로 방출됩니다. 그러나, 세포를 세척한 후 신선한 배지 사이토졸로 배양한 후, ex 사이토크롬 C는 정상 수준으로 다시 감소하여 사이토크롬 C 방출 후 아나스타시스가 발생할 수 있음을 나타냅니다.

여기에 표시된 것은 CA 기반 바이오센서 N-E-S-D-E-V-D-Y-F-P-N-L-S를 발현하는 헬라 세포이며, 예상대로 세포사멸 유도 후 세포질에 먼저 국한됩니다. Y-F-P-N-L-S는 활성화된 캐스트 염기에 의한 DEVD의 분열로 인해 핵으로 전위됩니다. 그러나 사멸 자극이 씻겨 나가고 세포가 새로운 배지로 배양된 후 Y-F-P-N-L-S는 핵에 남아 있는 반면 세포는 정상적인 형태를 회복하여 캐스트 염기 활성화 후 반전 VA 안검하수가 발생할 수 있음을 나타냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 살아있는 세포 이미징을 사용하여 앤테시스와 그 결과를 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 시연에서는 에탄올을 ATO 유도제로 사용합니다. 동시에 세포는 teso DMSO 및 sporin과 같은 다른 사멸 자극에 의해 유도되는 세포 사멸 과정을 역전시킬 수 있습니다.형광등은 세포에 대한 포토토릭이므로 살아있는 세포 이미징 중에 샘플을 가열하는 밤을 최소화하는 것이 중요합니다.

세포사멸(apoptosis)과 야간 아나스타시스(anastasis)의 과정은 온도에 민감하고 세포적인 활동에 의존합니다. 따라서 반복 가능한 결과를 보장하기 위해 실험을 위해 셀을 동일한 온도로 유지하는 것이 중요합니다.